Rekomendacje Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego

Transkrypt

1 1

2 Rekomendacje doboru testów do oznaczania wra liwoêci bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki Waleria Hryniewicz 1,2,4, Agnieszka Sulikowska 1,2, Katarzyna Szczypa 1,2, Anna Skoczyƒska 2, Agnieszka uczak-kad ubowska 4, Marek Gniadkowski 3 1 Krajowy OÊrodek Referencyjny ds. Lekowra liwoêci Drobnoustrojów 2 Zak ad Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej 3 Zak ad Mikrobiologii Molekularnej Warszawa, ul. Che mska 30/34, tel.: ; fax/tel.: Centralny OÊrodek Badaƒ JakoÊci w Diagnostyce Mikrobiologicznej Warszawa, ul. Che mska 30/34 tel fax/tel

3 Redakcja: Prof. dr hab. n. med. Waleria Hryniewicz Dr n. med. Agnieszka Sulikowska 2006,, Warszawa Wszelkie prawa zastrze one. Przenoszenie w jakiejkolwiek formie na jakiekolwiek noêniki informacji bez zezwolenia wydawcy zabronione. Wydanie pierwsze ISBN Nak ad: 700 egzemplarzy Wydawca:, Warszawa, ul. Che mska 30/34 tel ; fax Projekt ok adki: Miros aw Lekasa Jan Jakub towski Sk ad: Beata Rosa Druk: Drukarnia RAPID ul. Wisniowa 18A Piaseczno Publikacja cz Êciowo sfinansowana z Narodowego Programu Ochrony Antybiotyków 3

4 SPIS TREÂCI Wst p...str.5 Krajowy OÊrodek Referencyjny ds. Lekowra liwoêci Drobnoustrojów (KORLD)...str.6 Przydatne definicje...str.6 Metody oznaczania wra liwoêci...str.8 Najwa niejsze mechanizmy opornoêci bakterii oraz ich uwarunkowania genetyczne (wybrane przyk ady)...str.9 Oznaczanie wra liwoêci bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki...str.13 Oznaczanie wra liwoêci Staphylococcus spp....str.13 Oznaczanie wra liwoêci Enterococcus spp...str.20 Oznaczanie wra liwoêci Streptococcus pneumoniae...str.22 Oznaczanie wra liwoêci Streptococcus spp. innych ni S. pneumoniae...str.23 Oznaczanie wra liwoêci Moraxella catarrhalis...str.26 Oznaczanie wra liwoêci Neisseria meningitidis...str.26 Oznaczanie wra liwoêci Haemophilus influenzae...str.27 Oznaczanie wra liwoêci pa eczek z rodziny Enterobacteriaceae...str.28 Oznaczanie wra liwoêci pa eczek niefermentujàcych...str.34 U yte skróty...str.38 PiÊmiennictwo...str.40 Szczepy, które nale y przesy aç do KORLD w celu potwierdzenia fenotypu opornoêci...str.42 Lista szczepów kontrolnych z kolekcji MIKROBANK...str.43 Szczepy kontrolne z kolekcji MIKROBANK ryciny...str.44 Warunki przesy ania szczepów do KORLD ankieta...str.49 4

5 Wst p AntybiotykoopornoÊç sta a si jednym z najwa niejszych problemów zdrowia publicznego na ca ym Êwiecie, w zwiàzku z czym wzros a jeszcze bardziej rola i odpowiedzialnoêç mikrobiologa za wydawany wynik antybiogramu i jego interpretacj. Oznaczanie lekowra liwoêci wymaga wdro enia w aêciwej, wystandaryzowanej procedury. U ywane metody sà zró nicowane dla poszczególnych gatunków bakteryjnych i mechanizmów opornoêci. W obecnej sytuacji optymalnà metodà jest oznaczanie najmniejszego st enia hamujàcego leku (ang. minimal inhibitory concentration, MIC), jednak ciàgle znajduje uzasadnienie powszechnie stosowana metoda dyfuzji antybiotyku z krà ka w pod o u agarowym, opracowana na poczàtku lat szeêçdziesiàtych (wg Kirby-Bauera). Metoda ta pozwala nie tylko na okreêlenie wra liwoêci na konkretny, znajdujàcy si w krà ku bibu owym lek, ale pozwala tak e niekiedy okreêlaç wra liwoêç na ca à grup antybiotyków (np. oznaczanie wra liwoêci na ß-laktamy u Staphylococcus spp. przy u yciu oksacyliny lub cefoksytyny). Nale y zaznaczyç, e mikrobiolog nastawiajàc antybiogram nak ada krà ek z takim lekiem, który najlepiej wykrywa danà opornoêç. Nie zawsze jest to antybiotyk majàcy zastosowanie w lecznictwie, i tak np. najbardziej wiarygodne wyniki wykrywania opornoêci Streptococcus pneumoniae na penicylin w metodzie krà kowej uzyskuje si przy u yciu krà ka z oksacylinà. Trzeba jednak pami taç, i interpretacja oznaczenia zamieszczona na wyniku badania musi byç zrozumia a dla lekarza klinicysty. W przypadku identyfikacji mechanizmów opornoêci szczególnie groênych z punktu widzenia terapeutycznego bàdê epidemiologicznego, niejednokrotnie niezb dne jest tak e rutynowe stosowanie innych metod, takich jak: metody przeglàdowe (krà kowe lub rozcieƒczeniowe), oznaczanie MIC, identyfikacja genu warunkujàcego opornoêç lub produktu (bia ka) jego ekspresji. W przewidywaniu i weryfikowaniu wyniku niezb dna jest jednoczeênie prawid owa identyfikacja gatunku badanego drobnoustroju. Zjawisko opornoêci drobnoustrojów na leki jest procesem dynamicznym i zmiennym w czasie, wobec czego wymaga ciàg ego weryfikowania i doskonalenia metod diagnostycznych. Z tego powodu Krajowy OÊrodek Referencyjny ds. Lekowra liwoêci Drobnoustrojów opracowuje i publikuje corocznie uaktualniane zalecenia, które majà pomóc laboratoriom medycznym w uzyskiwaniu wiarygodnych wyników oznaczania lekowra liwoêci. Rekomendacje tworzone sà w oparciu o zalecenia CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, d. NCCLS), zalecenia Francuskiego Towarzystwa Mikrobiologicznego (Comite de l Antibiogramme de la Societe Francaise de Microbiologie), EUCAST (European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing), dane publikowane w czasopismach naukowych a tak e w oparciu o doêwiadczenia w asne OÊrodka. W niniejszym opracowaniu uwzgl dniono nast pujàcy podzia : Antybiogram podstawowy zawiera antybiotyki stosowane jako leki pierwszego rzutu. Antybiogram podstawowy dla szczepów izolowanych z moczu zawiera antybiotyki stosowane jako leki pierwszego rzutu wobec szczepów izolowanych z zaka eƒ uk adu moczowego. Antybiogram rozszerzony zawiera rozszerzonà list antybiotyków stosowanych wobec drobnoustrojów (równie dla szczepów z zaka eƒ uk adu moczowego) wieloopornych lub izolowanych z ci kich zaka eƒ. Uwaga: w celu u atwienia laboratoriom korzystania ze szczepów kontrolnych OÊrodek wprowadzi w asne dobrze scharakteryzowane szczepy, mogàce stanowiç kontrole pozytywne w oznaczaniu wybranych mechanizmów opornoêci. Szczepy te sà zdeponowane w Polskiej Kolekcji MIKROBANK (finansowane w ramach SPUB Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wy szego). 5

6 Krajowy OÊrodek Referencyjny ds. Lekowra liwoêci Drobnoustrojów (KORLD) Krajowy OÊrodek Referencyjny ds. Lekowra liwoêci Drobnoustrojów zosta powo any w 1997r. przez Ministra Zdrowia i Opieki Spo ecznej (decyzja MZiOS z dnia r.) w Centralnym Laboratorium Surowic i Szczepionek (CLSiS) w Warszawie w celu monitorowania stanu wra liwoêci na antybiotyki i chemioterapeutyki istotnych klinicznie patogenów bakteryjnych w Polsce. Wiedza na temat lokalnej wra liwoêci drobnoustrojów pozwala na optymalizacj empirycznego leczenia zaka eƒ, obni anie kosztów terapii oraz ograniczanie szerzenia si szczepów opornych. Dane dotyczàce zmian zachodzàcych w lekowra liwoêci drobnoustrojów pozwalajà równie na ukierunkowywanie badaƒ nad poszukiwaniem nowych metod zapobiegania i zwalczania zaka- eƒ. G ówne za o enia i cele KORLD: 1. ocena wra liwoêci na leki szczepów bakteryjnych, 2. monitorowanie rozprzestrzeniania si szczepów opornych, 3. monitorowanie nosicielstwa istotnych klinicznie patogenów bakteryjnych, 4. wykrywanie i identyfikacja nowych mechanizmów opornoêci, 5. pomoc w identyfikacji i opracowaniu (metodami fenotypowymi i genotypowymi) epidemii szpitalnych i pozaszpitalnych, 6. standaryzacja metod w badaniach mikrobiologicznych, stosowanych przez polskie laboratoria, skutkiem czego wyniki analiz otrzymywane w ró nych laboratoriach w Polsce i na Êwiecie mogà byç porównywalne; g ówny nacisk po o ony jest na ujednolicenie procedur oznaczania wra liwoêci bakterii na leki oraz wykrywanie mechanizmów opornoêci, 7. dostarczanie danych potrzebnych do sporzàdzania rekomendacji i zaleceƒ terapeutycznych, 8. edukacja mikrobiologów w zakresie metod oznaczania lekowra liwoêci i mechanizmów opornoêci, 9. edukacja lekarzy i mikrobiologów w zakresie klinicznej interpretacji antybiogramów, 10. coroczne opracowywanie aktualnych Rekomendacji doboru testów do oznaczania wra liwoêci bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki. Przydatne definicje W celu lepszego zrozumienia zagadnieƒ dotyczàcych oznaczania lekowra liwoêci drobnoustrojów zamieszczono w niniejszym opracowaniu podstawowe definicje terminów powszechnie u ywanych w mikrobiologii i farmakologii odnoszàcych si do zagadnieƒ lekowra liwoêci, opracowane na podstawie koƒcowego dokumentu EUCAST z 2000 roku [9]. Antybiotyk substancja o pochodzeniu biologicznym, pó syntetycznym lub syntetycznym (chemioterapeutyk) posiadajàca wybiórczà aktywnoêç przeciwdrobnoustrojowà i w zwiàzku z tym potencjalnie przydatna w leczeniu zaka eƒ. Ârodki dezynfekcyjne, antyseptyczne i konserwujàce nie sà zaliczane do antybiotyków. Wra liwoêç termin ten jest u ywany w dwóch znaczeniach mikrobiologicznym i klinicznym Wra liwoêç mikrobiologiczna oznacza, e dany szczep nale y do najbardziej wra liwej populacji (szczep dziki) i nie posiada mechanizmów oporno- Êci nabytej. Wra liwoêç kliniczna oznacza wra liwoêç drob- 6

7 noustroju na standardowe dawki leku. Niektórzy autorzy oddzielajà w pe ni wra liwe (ang. fully susceptible) drobnoustroje od granicznie wra liwych (ang. borderline / moderately susceptible), które pomimo posiadania opornoêci niskiego stopnia, zwykle sà wra liwe na standardowe dawki terapeutyczne. Istnieje wiele czynników modulujàcych odpowiedê drobnoustroju na leczenie, w zwiàzku z tym trudno jest czasem przewidzieç efekt kliniczny. Dlatego te definicja oparta jest na ocenie wra liwoêci in vitro na dany antybiotyk, jego w aêciwo- Êciach farmakokinetycznych i farmakodynamicznych, a zw aszcza na okreêleniu mo liwego do osiàgni cia st enia antybiotyku w miejscu zaka enia (praktycznie bierze si pod uwag st enie mo liwe do osiàgni cia w surowicy krwi). Kategorie wra liwoêci, wed ug których interpretujemy wynik oznaczania lekowra liwoêci sà oparte na skutecznoêci klinicznej, potwierdzonej w badaniach randomizowanych z podwójnie Êlepà próbà (ang. double blind, randomised trials). Ârednia wra liwoêç bakterie sà klasyfikowane jako, Êredniowra liwe, jeêli nale à do grupy szczepów, które znajdujà si pomi dzy klinicznie wra liwymi i klinicznie opornymi. Sukces kliniczny w takich zaka eniach jest trudny do przewidzenia, ale mo e byç osiàgni ty w przypadku niektórych antybiotyków, jeêli mo emy je zastosowaç w wy szej dawce, zwi kszymy cz stotliwoêç ich podawania lub jeêli ulegajà zag szczeniu w miejscu toczàcego si zaka enia osiàgajàc tam wysokie st enia (np. w uk adzie moczowym). Wra liwoêç w tym przypadku powinna byç potwierdzona oznaczeniem MIC. OpornoÊç termin ten jest u ywany w dwóch znaczeniach: mikrobiologicznym i klinicznym. OpornoÊç mikrobiologiczna oznacza, e organizm posiada mechanizm opornoêci, demonstrowany fenotypowo lub genotypowo. Mo e byç to opornoêç niskiego lub wysokiego stopnia. OpornoÊç kliniczna oznacza, e sukces terapeutyczny jest niemo liwy do osiàgni cia pomimo zastosowania maksymalnych dawek antybiotyku. OpornoÊç krzy owa oznacza niewra liwoêç na wszystkie lub niektóre antybiotyki nale àce do tej samej grupy chemicznej (np. antybiotyki ß-laktamowe, aminoglikozydy, makrolidy) lub czasem niespokrewnionej grupy chemicznej, gdy miejsca uchwytu dla antybiotyków znajdujà si blisko siebie (np. opornoêç na makrolidy i linkozamidy). Mechanizmy opornoêci wynikajàce z braku przepuszczalnoêci b ony komórkowej lub aktywnego wypompowywania leku z komórki mogà powodowaç opornoêç na wi cej ni jednà grup chemicznà, zjawisko to jest niekiedy okreêlane jako opornoêç skojarzona. MIC (ang. minimal inhibitory concentration) okreêla najmniejsze st enie leku, wyra one w μg/ml (mg/l), okreêlane w warunkach in vitro, hamujàce wzrost bakterii przy okreêlonej g stoêci inokulum i w okreêlonym czasie. MBC (ang. minimal bactericidal concentration) okre- Êla minimalne st enie leku, wyra one w μg/ml (mg/l), oznaczone w warunkach in vitro, przy którym ginie 99,9% komórek bakteryjnych, przy okreêlonej g stoêci inokulum i w okreêlonym czasie. Tolerancja jest wynikiem braku aktywacji enzymów autolitycznych przez antybiotyk ß-laktamowy, który wykazuje spadek lub brak dzia ania bakteriobójczego bez utraty dzia ania hamujàcego (nie zmienia si wartoêç MIC). Przyj ta definicja tolerancji oznacza stosunek MBC/MIC 32 lub wi cej. Zjawisko tolerancji powoduje, e antybiotyki o pierwotnie bakteriobój- 7

8 czej aktywnoêci wykazujà jedynie aktywnoêç bakteriostatycznà. OpornoÊç naturalna (gatunkowo-specyficzna) sta a cecha gatunku, rodzaju, rodziny (itd.) drobnoustroju. OpornoÊç nabyta nowa cecha szczepu wynikajàca ze zmian w materiale genetycznym. Metody oznaczania wra liwoêci: Opracowano na podstawie koƒcowego dokumentu EUCAST z 2000 roku [9]. Dyfuzja w agarze dyfuzja antybiotyku z krà ka bibu- owego, tabletek lub pasków na pod o u sta ym, na które naniesiono zawiesin bakteryjnà o okreêlonej g stoêci. Miarà wra liwoêci badanego szczepu jest wielkoêç Êrednicy strefy zahamowania wzrostu, która cz sto, ale nie zawsze koreluje z wartoêcià MIC. Metoda rozcieƒczeƒ w bulionie wykonywana w probówkach (metoda makrorozcieƒczeƒ minimalna obj toêç bulionu wynosi 2 ml) lub p ytkach titracyjnych (metoda mikrorozcieƒczeƒ, obj toêç bulionu w ka dej studzience wynosi 500 μl). Buliony zawierajàce antybiotyk o znanych malejàcych st eniach (zazwyczaj stosuje si podwójne rozcieƒczenia) sà zaszczepione okreêlonà liczbà komórek bakteryjnych. Odczyt polega na obserwacji zm tnienia pod o a po okreêlonym czasie. Celem tej metody jest okreêlenie najmniejszego st enia hamujàcego (MIC) lub najmniejszego st enia bakteriobójczego (MBC). Metoda rozcieƒczeƒ w agarze w metodzie tej antybiotyk jest obecny w pod o u agarowym w malejàcych st eniach (jedno st enie na jednà p ytk z agarem), na które posiewana jest zawiesina bakteryjna o okre- Êlonym inokulum. Celem badania jest okreêlenie najmniejszego st enia hamujàcego (MIC). Inokulum liczba komórek bakteryjnych w jednostce obj toêci zawiesiny wyra ana liczbà jednostek tworzàcych kolonie na mililitr (ang. colony-forming unit per millilitre CFU/ml). Mo e byç równie okreêlane w jednostkach zm tnienia lub g stoêci optycznej. Efekt inokulum oznacza zmian wra liwoêci drobnoustroju w zale noêci od wielkoêci inokulum. St enie graniczne (ang. breakpoint) okreêlona wartoêç MIC lub okreêlona wielkoêç strefy zahamowania wzrostu b dàca podstawà do zakwalifikowania danego szczepu do jednej z trzech kategorii klinicznych: wra liwy, Êredniowra liwy lub oporny. Aby dok adnie okreêliç st enie graniczne u ywamy znaków: < oznacza mniejszy ni, oznacza mniejszy lub równy, > oznacza wi kszy ni, oznacza wi kszy lub równy. 8

9 Najwa niejsze mechanizmy opornoêci bakterii oraz ich uwarunkowania genetyczne (wybrane przyk ady) I. Enzymatyczna inaktywacja leku 1. ß-laktamazy (opornoêç na antybiotyki ß-laktamowe) [1,3] a). grupa 1 (klasa C) AmpC cefalosporynazy, niehamowane przez inhibitory ß-laktamaz (kw. klawulanowy, sulbaktam, tazobaktam): gatunkowo-specyficzne (kodowane chromosomalnie, o ekspresji indukowanej lub konstytutywnej na niskim poziomie, mutacje lub inne zmiany genetyczne powodujàce derepresj ekspresji indukowanej lub podwy szenie ekspresji konstytutywnej Æ ekspresja konstytutywna na wysokim poziomie) lub nabyte (kodowane plazmidowo lub chromosomalnie, ekspresja najcz Êciej konstytutywna). nabyta opornoêç na penicyliny (i po àczenia z inhibitorami), cefalosporyny (w tym III generacji), aztreonam mutanty zdereprymowane np. Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Serratia spp., Pseudomonas aeruginosa; mutanty lub rekombinanty o podwy szonej ekspresji konstytutywnej u Escherichia coli, Acinetobacter baumannii; szczepy wytwarzajàce nabyte AmpC u ró nych gatunków Enterobacteriaceae (np. E. coli, Klebsiella spp., Proteus mirabilis, Salmonella spp.); naturalna opornoêç na aminopenicyliny, cefalosporyny I i II generacji u np. Enterobacter spp., C. freundii, Serratia marcescens, Morganella morganii, Acinetobacter spp., Pseudomonas spp. b). grupa 2a (klasa A) penicylinazy hamowane przez inhibitory: gatunkowo-specyficzne (kodowane chromosomalnie) lub nabyte (kodowane chromosomalnie lub plazmidowo). nabyta opornoêç na penicyliny u Staphylococcus spp. c). grupa 2b (klasa A) - ß-laktamazy o szerokim spektrum substartowym hamowane przez inhibitory: (kodowane plazmidowo lub chromosomalnie). nabyta opornoêç na penicyliny u Enterobacteriaceae (przy wysokim poziomie ekspresji opornoêç tak e na cefalosporyny wczesnych generacji i po àczenia penicylin z inhibitorami); opornoêç na aminopenicyliny u Haemophilus influenzae, naturalna opornoêç na aminopenicyliny u Klebsiella pneumoniae. d). grupa 2be (klasa A) ESBL ß-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym, hamowane przez inhibitory gatunkowo-specyficzne (kodowane chromosomalnie) lub (g ównie) nabyte (kodowane plazmidowo lub chromosomalnie). nabyta opornoêç na penicyliny, cefalosporyny (w tym III i IV generacji, z wyjàtkiem cefamycyn) i aztreonam g ównie u Enterobacteriaceae, rzadziej u Gram-ujemnych pa eczek niefermentujàcych (P. aeruginosa, Acinetobacter spp.); jeêli wysoka ekspresja to opornoêç te na po àczenia penicylin z inhibitorami; gatunkowo-specyficzne ESBL nadajà opornoêç jak wy ej (np. Chryseobacterium meningosepticum), niekiedy tylko w szczepach o mutacyjnie podwy szonej ekspresji (np. Klebsiella oxytoca). e). grupa 2br (klasa A) - ß-laktamazy o szerokim spektrum substratowym, niepodatne na inhibitory nabyte (kodowane z regu y plazmidowo). nabyta opornoêç Enterobacteriaceae (g ównie E. coli, P. mirabilis) na penicyliny i po àczenia penicylin z inhibitorami. f). grupa 2c (klasa A) karbenicylinazy nabyte (kodowane plazmidowo lub chromosomalnie). nabyta opornoêç P. aeruginosa na karboksypenicyliny, opornoêç Moraxella catarrhalis na penicyliny. g). grupa 2d (klasa D) oksacylinazy, w tym tak e 9

10 ESBL lub karbapenemazy z regu y s abo hamowane przez inhibitory ß-laktamaz - najcz Êciej nabyte (kodowane plazmidowo lub chromosomalnie); niekiedy gatunkowo-specyficzne (eksprymowane na niskim poziomie). nabyta opornoêç P. aeruginosa, Acinetobacter spp., Enterobacteriaceae na penicyliny; jeêli enzym ma aktywnoêç ESBL opornoêç jak w przypadku grupy 2be z wyjàtkiem po àczeƒ z inhibitorami; jeêli enzym ma aktywnoêç s abej karbapenemazy (najcz Êciej u Acinetobacter spp.) opornoêç na karbapenemy, naturalna karbapenemaza A. baumannii nadaje opornoêç na karbapenemy tylko w szczepach o podwy szonej ekspresji wskutek zmian genetycznych. h). grupa 2e (klasa A) cefalosporynazy hamowane przez inhibitory ß-laktamaz gatunkowo-specyficzne (kodowane chromosomalnie, cz sto o ekspresji indukowanej) lub nabyte (kodowane chromosomalnie lub plazmidowo). opornoêç podobna jak w przypadku ESBL (grupa 2be), cz sto obserwowana w szczepach o podwy szonej ekspresji; Proteus vulgaris, Citrobacter koseri, Stenotrophomonas maltophilia, Bacteroides spp. i). grupa 2f (klasa A) karbapenemazy hamowane przez inhibitory ß-laktamaz nabyte (kodowane chromosomalnie lub plazmidowo). nabyta opornoêç Enterobacteriaceae (g. Enterobacter cloacae, S. marcescens, K. pneumoniae) na penicyliny, cefalosporyny (w ró nym zakresie), aztreonam i karbapenemy. j). grupa 3(klasa B) karbapenemazy metalo-ß-laktamazy, niehamowane przez inhibitory ß-laktamaz, hamowane przez EDTA gatunkowo-specyficzne (kodowane chromosomalnie) lub nabyte (kodowane chromosomalnie lub plazmidowo). naturalna (np. S. maltophilia) lub nabyta (g. P. aeruginosa, Acinetobacter spp., równie Enterobacteriaceae) opornoêç na penicyliny (i ich po àczenia z inhibitorami), cefalosporyny i karbapenemy. 2. Enzymy modyfikujàce aminoglikozydy (AME), mogà wyst powaç pojedynczo lub kilka jednoczeênie (ró ne fenotypy opornoêci): acetylotransferazy (AAC), fosfotransferazy (APH), nukleotydylotransferazy (ANT) nabyte (kodowane plazmidowo lub na transpozonach). nabyta, wysoka opornoêç enterokoków na aminoglikozydy (HLAR), opornoêç gronkowców i pa eczek Gram-ujemnych (np. Enterobacteriaceae, P. aeruginosa) na aminoglikozydy. 3. Acetylotransferaza chloramfenikolu (CAT) nabyta (kodowana plazmidowo lub chromosomalnie). nabyta opornoêç na chloramfenikol ró nych drobnoustrojów Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. 4. Esterazy, fosfotransferazy, glikozylotransferazy - gatunkowo-specyficzne (kodowane chromosomalnie). naturalna opornoêç Enterobacteriaceae na makrolidy. II. Mechanizmy zwiàzane z przepuszczalnoêcià os on komórkowych bakterii dla leku lub wypompowywaniem leku. 1. Naturalna nieprzepuszczalnoêç Êciany komórkowej dla leku gatunkowo-specyficzne (kodowane chromosomalnie). niska opornoêç enterokoków na aminoglikozydy; naturalna opornoêç pa eczek Enterobacteriaceae i Gram-ujemnych pa eczek niefermentujàcych na makrolidy (patrz te : esterazy, fosfotransferazy) i glikopeptydy. 2. Obni enie przepuszczalnoêci b ony zewn trznej 10

11 bakterii Gram-ujemnych wskutek zahamowania lub zmniejszenia produkcji kana ów porynowych - nabyta (kodowana chromosomalnie). nabyta opornoêç niektórych Enterobacteriaceae na cefoksytyn (g. Klebsiella spp.), zwi kszenie wynikajàcej z produkcji ß-laktamaz opornoêci Enterobacteriaceae na ró ne ß-laktamy; nabyta opornoêç P. aeruginosa, Acinetobacter spp. na karbapenemy; zwi kszenie wynikajàcej z produkcji ß-laktamaz oporno- Êci P. aeruginosa, Acinetobacter spp. na ró ne ß-laktamy, opornoêç bakterii Gram-ujemnych na tetracykliny. 3. Aktywne usuwanie (wypompowywanie) leku z komórki gatunkowo-specyficzne (kodowane chromosomalnie) lub nabyte (kodowane chromosomalnie lub plazmidowo). naturalna opornoêç P. aeruginosa na tetracykliny i chloramfenikol, naturalna obni ona wra liwoêç P. aeruginosa (i innych bakterii, tak e Gram-dodatnich) na ß-laktamy i chinolony ( opornoêç w asna ); nabyta opornoêç P. aeruginosa na ß-laktamy (w tym karbapenemy), aminoglikozydy i chinolony; zwi kszenie wynikajàcej z produkcji ß-laktamaz opornoêci P. aeruginosa, Acinetobacter spp. na ró ne ß-laktamy; nabyta opornoêç gronkowców i paciorkowców (w tym pneumokoków) na makrolidy; nabyta opornoêç gronkowców i enterokoków na tetracykliny. III. Brak miejsca docelowego dla leku lub jego niskie powinowactwo gatunkowo-specyficzne (kodowane chromosomalnie). naturalna opornoêç Mycoplasma spp. i Chlamydia spp. na ß-laktamy i glikopeptydy (brak peptydoglikanu i PBP); naturalna opornoêç bakterii Gram-dodatnich na aztreonam; naturalna opornoêç enterokoków na penicyliny izoksazolilowe i cefalosporyny (PBP o niskim powinowactwie do wymienionych ß-laktamów). IV. Zmiana miejsca docelowego dla leku (opornoêç receptorowa). 1. Zmiany w bia kach wià àcych penicylin (PBP), produkcja zmodyfikowanych PBP lub nowych, niewytwarzanych w szczepach dzikich nabyte (kodowane chromosomalnie) nabyta opornoêç gronkowców na wszystkie ß-laktamy (tzw. opornoêç na meticylin lub oksacylin ), opornoêç Enterococcus faecium na wszystkie ß-laktamy; opornoêç pneumokoków na penicylin lub cefalosporyny, opornoêç H. influenzae na penicyliny, penicyliny z inhibitorami ß-laktamaz, cefalosporyny I i II generacji (BLNAR). 2. Wytwarzanie prekursorów peptydoglikanu o niskim powinowactwie do wankomycyny D- Ala-Dmleczanu (VanA, VanB, VanD) lub D-Ala-D-seryny (VanC, VanE) zamiast D-Ala-D-alaniny (szczepy wra liwe). Enzymy te kodowane sà przez zespo y genów gatunkowo-specyficznych (kodowane chromosomalnie) lub nabytych (kodowane chromosomalnie lub plazmidowo). naturalna opornoêç Enterococcus casseliflavus i Enterococcus gallinarum na wankomycyn (fenotyp VanC), nabyta opornoêç E. faecium i E. faecalis i in. gatunków enterokoków oraz S. aureus na wankomycyn. 3. Zmiany w rybosomie: mutacje w genach rrna nabyte (kodowane chromosomalnie) lub modyfikacje enzymatyczne rrna nabyte (kodowane chromosomalnie lub plazmidowo) nabyta opornoêç paciorkowców (w tym pneumokoków) i gronkowców na makrolidy, linkozamidy, streptograminy, ketolidy; nabyta opornoêç enterokoków na streptomycyn. 4. Mutacje w genach gyrazy lub topoizomerazy IV. nabyta opornoêç bakterii Gram-dodatnich i Gramujemnych na chinolony. 11

12 5. Punktowa mutacja w genie kodujàcym podjednostk ß polimerazy RNA. nabyta opornoêç bakterii Gram-ujemnych i Gramdodatnich na rifampicyn. 6. Mutacje w genach syntetazy dihydropteronianu lub produkcja nowej syntetazy. nabyta opornoêç bakterii Gram-dodatnich i Gramujemnych na sulfonamidy. 7. Mutacje w genach reduktazy kwasu dihydrofoliowego lub produkcja nowej reduktazy. nabyta opornoêç bakterii Gram-dodatnich i Gramujemnych na trimetoprim. V. Nabycie zdolnoêci wykorzystywania egzogennego êród a zwiàzku (folian), którego synteza jest blokowana przez lek. nabyta opornoêç enterokoków na trimetoprim. 12

13 Oznaczanie wra liwoêci bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki 1. Oznaczanie wra liwoêci Staphylococcus spp. Pod o e MHA, zawiesina bakteryjna o g stoêci 0,5 McFarlanda inkubacja w atmosferze tlenowej 16-18h w temp o C, nie przekraczaç 35 o C. W przypadku cefoksytyny, oksacyliny i wankomycyny inkubacja 24h. Tab ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY Tab ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY DLA SZCZEPÓW IZOLOWANYCH Z MOCZU Uwaga: Dla Staphylococcus saprophyticus izolowanego z moczu nie jest konieczne rutynowe oznaczanie lekowra liwoêci. 13

14 Tab ANTYBIOGRAM ROZSZERZONY * Oznaczajàc MIC tigecykliny metodà mikrorozcieƒczeƒ w bulionie lub rozcieƒczeƒ w agarze, standard tigecykliny nale y dodaç do pod o a w dniu badania. Ponadto, jeêli oznaczamy MIC metodà mikrorozcieƒczeƒ w bulionie pod o e musi byç przygotowane nie wczeêniej ni w ciàgu 24 godz. przed badaniem lub, jeêli jest starsze, powinno zostaç zagotowane (i ostudzone) tu przed dodaniem tigecykliny w celu usuni cia tlenu z pod o a [17]. 14

15 1.1.Oznaczanie wra liwoêci na antybiotyki ß-laktamowe W zwiàzku z wysokim odsetkiem szczepów gronkowców wytwarzajàcych penicylinazy mo na pominàç rutynowe oznaczanie wra liwoêci na penicylin. W przypadku oznaczania wytwarzania penicylinaz nale y stosowaç krà ek z nitrocefinà (test cefinazowy) lub oznaczaç wra liwoêç na penicylin metodà dyfuzyjnà krà kiem z penicylinà 10 IU. Ze wzgl dów klinicznych istotna jest opornoêç gronkowców na meticylin (MRSA ang. methicillin-resistant S. aureus, MRCNS - methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci). W piêmiennictwie opornoêç ta nazywana jest tak e okreêleniem: opornoêç na oksacylin lub szczepy oporne na oksacylin ORSA, ORCNS. Poj cia te sà równowa ne z MRSA i MRCNS. Szczepy oporne na meticylin (MRSA i MRCNS) sà oporne in vivo na wszystkie antybiotyki ß-laktamowe, tj. penicyliny, penicyliny skojarzone z inhibitorami ß-laktamaz, cefalosporyny i karbapenemy. Ekspresja opornoêci na meticylin mo e mieç charakter homogenny lub heterogenny, co oznacza, e w badaniach in vitro, odpowiednio wszystkie lub jedynie niektóre komórki populacji danego szczepu b dà prezentowaç fenotyp opornoêci. Dlatego w razie wàtpliwoêci nale- y wykonaç oznaczenie metodà przeglàdowà lub potwierdziç obecnoêç genu meca. Wra liwoêç S. aureus na meticylin nale y oznaczaç w przypadku wszystkich izolatów, nie tylko szpitalnych HA-MRSA (ang. hospital acquired MRSA), poniewa coraz cz Êciej izoluje si szczepy MRSA z zaka eƒ pozaszpitalnych CA-MRSA (ang. community acquired MRSA). HA-MRSA sà zwykle wielooporne, niewra liwe na tetracykliny, aminoglikozydy, makrolidy, linkosamidy, cz sto te na fluorochinolony chloramfenikol i trimetoprim/sulfametoksazol [18], Opisano równie gronkowce oporne na wankomycyn, linezolid, chinupristyn /dalfopristyn i daptomycyn [16,36,39,40,43]. Natomiast CA-MRSA z definicji sà oporne na wszystkie ß-laktamy a dodatkowo na tetracykliny, niekiedy na makrolidy [33]. Szczepy CA-MRSA wywo ujà najcz - Êciej pierwotne zaka enia skóry i tkanek mi kkich a tak e martwicze zapalenie p uc. Zwiàzane jest to z wytwarzaniem toksyny leukocydyny Panton-Valentine (PVL). CA-MRSA sà trudne w diagnostyce, poniewa wykazujà bardzo wysoce heterogennà ekspresj opornoêci na meticylin. Oznaczajàc wra liwoêç na antybiotyki ß-laktamowe (meticylin ) stosujemy jednà z poni ej wymienionych metod: Metoda dyfuzyjno-krà kowa z cefoksytynà lub oksacylinà l Pod o e: MHA l Zawiesina bakteryjna g stoêci 0,5 McFarlanda. l NanieÊç krà ek z cefoksytynà 30 μg lub oksacylinà 1 μg. l Inkubacja: 24h dla oksacyliny i cefoksytyny w temp o C, w atmosferze tlenowej. l Odczyt: wykonaç pomiar strefy zahamowania wzrostu (zwróciç szczególnà uwag na pojedyncze kolonie w strefie). W przypadku cefoksytyny odczyt przeprowadziç w Êwietle odbitym, a dla oksacyliny w Êwietle przechodzàcym. Interpretowaç wg zaleceƒ CLSI patrz tabela 1.4. Uwaga: W przypadku S. aureus wyniki badania lekowra liwoêci z u yciem krà ka z oksacylinà sà porównywalne do tych uzyskiwanych z krà kiem z cefoksytynà i dobrze korelujà z obecnoêcià genu meca, jednak e uwa a si, e odczyt strefy jest atwiejszy w przypadku krà ka z cefoksytynà. Wykazano tak e, i cefoksytyna wykrywa równie tzw. szczepy premrsa, które posiadajà gen meca, lecz mogà pozostaç niezidentyfikowane krà kiem z oksacylinà [10]. Dla identyfikacji opornoêci na meticylin S. lugdunensis nale y u ywaç jedynie krà ka z cefoksytynà. W przypadku innych gronkowców koagulazoujemnych zalecana jest równie metoda dyfuzyjnokrà kowa z cefoksytynà. Uzyskane dla oksacyliny wartoêci stref dobrze korelujà z obecnoêcià lub brakiem genu meca jedynie dla szczepów z gatunku S. epidermidis. Uwa a si, e cefoksytyna przy porównywalnej czu oêci, jest bardziej specyficzna dla gronkowców koagulazo-ujemnych w porównaniu z oksacylinà [32,38]. Wykrywanie obecnoêci genu 15

16 Tab Interpretacja wyników oznaczenia wra liwoêci na meticylin izolatów Staphylococcus spp. w metodzie dyfuzyjno-krà kowej. 1 Do oznaczania wra liwoêci na meticylin nale y stosowaç wy àcznie krà ki z cefoksytynà lub oksacylinà. 2 W ka dym przypadku otrzymania wyniku Êredniowra liwy dla S. aureus w metodzie dyfuzyjno-krà kowej z oksacylinà, nale y bezwzgl dnie wykonaç oznaczenie wra liwoêci innymi metodami, tj.: oznaczyç wartoêç MIC lub wykonaç badanie weryfikujàce obecnoêç bia ka PBP 2a (PBP 2 ) lub obecnoêç genu meca metodà PCR. meca pozostaje nadal metodà uznawanà za z oty standard i powinno byç stosowane w przypadku uzyskania niejednoznacznych wyników w metodach fenotypowych. JeÊli laboratorium nie ma mo liwoêci wykonania tego typu badania, izolaty z ci kich zaka- eƒ inwazyjnych mo na przes aç w celu potwierdzenia do KORLD Metoda przeglàdowa z oksacylinà dla S. aureus (nie zaleca si stosowania tej metody dla gronkowców koagulazo-ujemnych) l Pod o e: MHA z oksacylinà w st eniu 6 μg/ml i dodatkiem 4% NaCl. l Zawiesina bakteryjna o g stoêci 0,5 McFarlanda. l Sposób wykonania: (1) zanurzyç wykalibrowanà ez (1 μl) w zawiesinie bakteryjnej, a nast pnie nanieêç jà na pod o e i rozprowadziç w postaci plamki o Êrednicy mm; lub (2) zanurzyç wymazówk w zawiesinie bakteryjnej i rozprowadziç w postaci plamki o Êrednicy mm lub na ca ej p ytce. l Inkubacja: 24h w 35 o C, w atmosferze tlenowej. l Odczyt: wzrost wi cej ni jednej kolonii oznacza opornoêç na meticylin ; odczytywaç w Êwietle przechodzàcym [32]. meca, warunkujàcego opornoêç na meticylin (np. MRSA-Screen Denka Seiken [23], Slidex MRSA Detection- BioMerieux, Oxoid PBP2a latex Oxoid) Inne testy Etest - AB BIODISK [8] 1.2. Oznaczanie wra liwoêci na makrolidy i linkosamidy l Pod o e MHA. l Zawiesina bakteryjna o g stoêci 0,5 McFarlanda. l Nanosimy zawiesin na pod o e ja owà wymazówkà, nak adamy krà ki z erytromycynà 15 μg i klindamycynà 2 μg w odleg oêci mm od kraw dzi krà ków. l Inkubacja: 16-18h w temp o C, w atmosferze tlenowej. l Odczyt i interpretacja kliniczna patrz rycina Testy polegajàce na wykrywaniu bia ka PBP 2a (PBP2 ) (jedynie dla S. aureus) produktu genu 16

17 Ryc Identyfikacja i interpretacja kliniczna fenotypów opornoêci na makrolidy, linkosamidy i streptograminy B u Staphylococcus spp. [11,24]. 17

18 1.3. Oznaczanie wra liwoêci S. aureus na glikopeptydy. Najmniejsze wartoêci hamujàce wankomycyny typowe dla populacji szczepów S. aureus w Polsce zawierajà si w granicach 0,5-2 μg/ml [29]. Wszystkie szczepy MRSA powinny byç bezwzgl dnie badane w kierunku obni onej wra liwoêci na glikopeptydy, choç optymalnym post powaniem by oby badanie wszystkich izolatów S. aureus. Schematem proponowanym przez KORLD jest zamieszczony poni ej algorytm rekomendowany przez CDC (ang. Centers for Disease Contol and Prevention). (Ryc. 1.2.) Metoda przeglàdowa z wankomycynà. l Pod o e: BHIA z wankomycynà o st eniu 6 μg/ml. l Zawiesina bakteryjna o g stoêci 0,5 McFarlanda. l NanieÊç punktowo 10 μl zawiesiny na agar z antybiotykiem, lub zanurzyç ja owà wymazówk w zawiesinie bakteryjnej i rozprowadziç w postaci plamki o Êrednicy mm lub na ca ej p ytce. l Inkubowaç: 24h, w temp. 35 o C, w atmosferze tlenowej. l Odczyt: oceniaç w Êwietle przechodzàcym, wzrost wi cej ni jednej kolonii lub delikatny wzrost podejrzenie VISA/VRSA. (dawniej S. aureus MIKROBANK MR16) s u y do kontroli jakoêci oznaczania wra liwoêci na oksacylin w metodzie przeglàdowej z oksacylinà w pod o u, szczep o homogennej ekspresji opornoêci na meticylin (kontrola dodatnia) Ryc.F Metoda dwóch krà ków oznaczanie wra liwoêci na makrolidy i linkosamidy: Staphylococcus aureus ATCC BAA-977 Staphylococcus aureus ATCC BAA Metoda przeglàdowa z wankomycynà w pod- o u oraz oznaczanie MIC wankomycyny: Enterococcus faecalis ATCC wra liwy na glikopeptydy Enterococcus faecalis ATCC oporny na glikopeptydy 1.4. Szczepy wzorcowe: Metoda dyfuzyjno-krà kowa: Staphylococcus aureus ATCC wra liwy na meticylin Metoda przeglàdowa z oksacylinà w pod o u: Staphylococcus aureus ATCC wra liwy na meticylin Staphylococcus aureus ATCC oporny na meticylin lub Staphylococcus aureus MIKROBANK (dawniej S. aureus MIKROBANK MR3) s u y do kontroli jakoêci oznaczania wra liwoêci na oksacylin w metodzie przeglàdowej z oksacylinà w pod o u, szczep o heterogennej ekspresji opornoêci na meticylin (kontrola dodatnia) Ryc.E Staphylococcus aureus MIKROBANK

19 1. Metoda dyfuzyjno-krà kowa z wankomycynà jest niewiarygodna w przypadku szczepów o obni onej wra liwoêci na glikopeptydy (hvisa, VISA) 2. VSSA - ang. vancomycin susceptible S. aureus S. aureus wra liwy na wankomycyn. 3. Wynik badania nale y potwierdziç w laboratorium referencyjnym dodatkowymi metodami, jeêli stan kliniczny pacjenta tego wymaga (ci ki stan, brak poprawy w trakcie terapii glikopeptydami). 4. Metody referencyjne: metoda mikrorozcieƒczeƒ w bulionie, rozcieƒczeƒ w agarze, Etest (MHA 0,5 Mc Farlanda). W przypadku uzyskania wartoêci MIC 2 μg/ml (CLSI VSSA), kiedy stan kliniczny pacjenta tego wymaga (ci ki stan, brak poprawy w trakcie terapii glikopeptydami), wynik nale y potwierdziç w laboratorium referencyjnym dodatkowymi metodami, w celu zweryfikowania fenotypu hvisa. W przypadku uzyskania wartoêci MIC 4 μg/ml, nale y BEZWZGL DNIE przes aç izolat do laboratorium referencyjnego. 5. hvisa-ang. vancomycin hetero-intermediate S. aureus S. aureus z obni onà wra liwoêcià na wankomycyn ; VISA (ang. vancomycinintermediate S. aureus) S. aureus Êredniowra liwy na wankomycyn ; VRSA (ang. vancomycin resistant S. aureus) S. aureus oporny na wankomycyn. Ryc Algorytm post powania w przypadku oznaczania wra liwoêci S. aureus na wankomycyn (VA) 19

20 2. Oznaczanie wra liwoêci Enterococcus spp. Pod o e MHA, zawiesina bakteryjna o g stoêci 0,5 McFarlanda, inkubacja 16-18h w temp. 35 o C±2 o C, w atmosferze tlenowej. Inkubacja dla wankomycyny pe ne 24h. Tab ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY Tab ATYBIOGRAM PODSTAWOWY DLA SZCZEPÓW IZOLOWANYCH Z MOCZU 20

21 Tab ATYBIOGRAM ROZSZERZONY *W zwiàzku z ograniczeniem opcji terapeutycznych wobec enterokoków opornych na glikopeptydy, stosowanie chloramfenikolu, tetracykliny i rifampicyny mo e byç rozwa ane w leczeniu zaka eƒ wywo anych tymi drobnoustrojami, jednak e zawsze po uprzednim oznaczeniu MIC tych leków. **Oznaczajàc MIC tigecykliny metodà mikrorozcieƒczeƒ w bulionie lub rozcieƒczeƒ w agarze, standard tigecykliny nale y dodaç do pod o a w dniu badania. Ponadto, jeêli oznaczamy MIC metodà mikrorozcieƒczeƒ w bulionie pod o e musi byç przygotowane nie wczeêniej ni w ciàgu 24 godz. przed badaniem lub, jeêli jest starsze, powinno zostaç zagotowane (i ostudzone) tu przed dodaniem tigecykliny w celu usuni cia tlenu z pod o a [17]. Uwaga: Nale y pami taç, aby nie oznaczaç wra liwo- Êci dla szczepów Enterococcus spp. na niskie st enia aminoglikozydów, cefalosporyny, klindamycyn i trimetoprim/sulfametoksazol, poniewa enterokoki posiadajà naturalnà opornoêç na te leki. Informacje te mo na umieszczaç pod wynikiem antybiogramu. Z powodu ró nic w opornoêci na leki, jakie wyst pujà u izolatów E. faecalis i E. faecium oraz naturalnej opornoêci na glikopeptydy u Enterococcus casseliflavus i Enterococcus gallinarum, istotne jest, aby laboratorium prawid owo rozró nia o te gatunki Oznaczanie opornoêci wysokiego stopnia na antybiotyki aminoglikozydowe (HLAR) metoda przeglàdowa l Pod o e: BHIA z gentamicynà 500 μg/ml lub streptomycynà 2000 μg/ml. l Zawiesina bakteryjna o g stoêci 0,5 McFarlanda. l Nanosimy 10 μl zawiesiny bakteryjnej w postaci kropli na agar z antybiotykiem. l Inkubacja: 24h, w temp. 35 o C, atmosferze tlenowej; w przypadku streptomycyny, je eli szczep jest wra liwy, inkubacj przed u amy do 48h. l Odczyt: wzrost wi cej ni jednej kolonii oznacza opornoêç Oznaczanie wra liwoêci na glikopeptydy - metoda przeglàdowa l Pod o e: BHIA z wankomycynà 6 μg/ml. l Zawiesina bakteryjna o g stoêci 0,5 McFarlanda. 21

22 l Nanosimy 10 μl zawiesiny bakteryjnej w postaci kropli. l Inkubacja: 24h, w temp. 35 o C, w atmosferze tlenowej. l Odczyt: wzrost co najmniej jednej kolonii mo e oznaczaç opornoêç. W takim przypadku konieczne jest wykonanie oznaczenia MIC oraz testu na ruch i wytwarzanie pigmentu w celu rozró nienia czy nie mamy do czynienia z gatunkami z naturalnà oporno- Êcià na wankomycyn (E. gallinarum i E. casseliflavus). Gatunki te cz sto rosnà na pod o u z 6 μg/ml wankomycyny (fenotyp VanC zakres MIC 232 μg/ml) [4,6], natomiast sà wra liwe na teikoplanin Szczepy wzorcowe: Staphylococcus aureus ATCC szczep zalecany do kontroli jakoêci oznaczania lekowra liwoêci w metodzie dyfuzyjno-krà kowej Enterococcus faecalis ATCC szczep wra liwy na aminoglikozydy i wankomycyn zalecany do kontroli jakoêci: oznaczania MIC dla Enterococcus spp, oznaczania fenotypu HLAR w metodzie przeglàdowej i w metodzie dyfuzyjno-krà kowej oraz w metodzie przeglàdowej z wankomycynà w pod o u. S u y tak e do oznaczania zawartoêci tyminy i tymidyny w pod o u (przy prawid owej zawartoêci strefa wokó krà ka z trimetoprimem/sulfametoksazolem powinna byç 20 mm). Enterococcus faecalis ATCC szczep oporny na aminoglikozydy i wankomycyn, zalecany do kontroli jakoêci oznaczania fenotypu HLAR w metodzie przeglàdowej oraz dyfuzyjno-krà kowej, a tak e do wykrywania opornoêci na glikopeptydy w metodzie przeglàdowej z wankomycynà w pod o u. Enterococcus faecalis MIKROBANK s u y do kontroli jakoêci oznaczania fenotypu HLAR w metodzie przeglàdowej, a tak e do kontroli jakoêci oznaczania opornoêci na wankomycyn w metodzie przeglàdowej z wankomycynà w pod o u (kontrola dodatnia szczep oporny na aminoglikozydy i wankomycyn, VanB) 3. Oznaczanie wra liwoêci Streptococcus pneumoniae Pod o e KBMHA, zawiesina bakteryjna o g stoêci 0,5 McFarlanda, inkubacja 20-24h w temp. 35 o C ± 2 o C, w atmosferze 5% CO2. Tab ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY 1 MIC penicyliny mo na oznaczyç metodà rozcieƒczeƒ w agarze, mikrorozcieƒczeƒ w bulionie lub Etestu (najlepiej o zakresie st eƒ 0, μg/ml [7]. 22

23 Tab Interpretacja wartoêci MIC dla penicyliny i cefalosporyn III-generacji [32] 1 Dla szczepów izolowanych z materia ów innych ni p yn mózgowo-rdzeniowy nale y podawaç tak e interpretacj dla cefotaksymu i ceftriaksonu w aêciwà dla izolatów z p ynu. Uwaga: Pojawi y si na Êwiecie szczepy S. pneumoniae wra liwe na penicylin i jednoczeênie oporne na cefalosporyny III-generacji [35]. Do tej pory nie izolowano takich szczepów w Polsce. Tab ANTYBIOGRAM ROZSZERZONY 4. Oznaczanie wra liwoêci Streptococcus spp. innych ni S. pneumoniae Dotyczy paciorkowców ß-hemolizujàcych grup: A (Streptococcus pyogenes), B (S. agalactiae), C i G oraz paciorkowców z grupy zieleniàcych. Pod o e KBMHA, zawiesina bakteryjna o g stoêci 0,5 McFarlanda, inkubacja 20-24h w temp. 35 o C±2 o C, w atm. 5% CO2. 23

24 *Uwaga: Nie jest konieczne oznaczanie w rutynowej diagnostyce wra liwoêci na penicylin i inne antybiotyki ß-laktamowe szczepów ß-hemolizujàcych paciorkowców grup A, B, C i G, jeêli identyfikacja drobnoustroju zosta- a przeprowadzona prawid owo [34]. Tab ANTYBIOGRAM ROZSZERZONY 4.1. Oznaczanie wra liwoêci na makrolidy metoda dwóch krà ków (dla S. pyogenes, S. agalactiae i paciorkowców ß-hemolizujàcych grupy C i G). l Pod o e KBMHA. l Zawiesina bakteryjna o g stoêci 0,5 McFarlanda. l Nanosimy zawiesin na pod o e ja owà wymazówkà, nak adamy krà ki z erytromycynà 15 μg i klindamycynà 2 μg w odleg oêci 15 mm pomi dzy brzegami krà ków. l Inkubacja: 20-24h w temp. 35 o C±2 o C, w atmosferze 5% CO2. l Odczyt: 1). strefa zahamowania wzrostu wokó krà ka z erytromycynà wskazujàca na Êrednià wra liwoêç (16-20 mm) lub opornoêç ( 15 mm) i sp aszczenie strefy przy krà ku z klindamycynà (tzw. D strefa) oznacza opornoêç na makrolidy, linkosamidy i streptograminy B typu indukcyjnego imlsb; 2). Strefa zahamowania wzrostu wokó krà ka z erytromycynà i klindamycynà wskazujàca na opornoêç ( 15 mm) oznacza opornoêç na makrolidy, linkosamidy i streptograminy B typu konstytutywnego kmlsb; 3). Strefa zahamowania wzrostu wokó krà ka z erytromycynà wskazujàca na Êrednià wra liwoêç (16-20 mm) lub opornoêç ( 15 mm) oraz brak sp aszczenia strefy wokó krà ka z klindamycynà oznacza opornoêç typu M rycina

25 Ryc. 4.1 Identyfikacja i interpretacja kliniczna fenotypów opornoêci na makrolidy, linkosamidy i streptograminy B u Streptoccus spp.[24,42]. 25

26 4.2. Szczepy wzorcowe: Streptococcus pneumoniae ATCC Szczepy kontrolne do metody dwóch krà ków: Streptococcus pyogenes MIKROBANK (dawniej S. pyogenes MIKROBANK SP-M1) s u y do kontroli jakoêci oznaczania wra liwoêci na makrolidy metodà dwóch krà ków, szczep o fenotypie imlsb Ryc. G Streptococcus pyogenes MIKROBANK (dawniej S. pyogenes MIKROBANK SP-M2) s u y do kontroli jakoêci oznaczania wra liwoêci na makrolidy metodà dwóch krà ków, szczep o fenotypie kmlsb Ryc. H Streptococcus pyogenes MIKROBANK (dawniej S. pyogenes MIKROBANK SP-M3) s u y do kontroli jakoêci oznaczania wra liwoêci na makrolidy metodà dwóch krà ków, szczep o fenotypie M Ryc. I 5. Oznaczanie wra liwoêci Moraxella catarrhalis Wszystkie izolaty M. catarrhalis nale y uznaç jako klinicznie oporne na amoksycylin, ampicylin, piperacylin i penicylin (ponad 90% szczepów M. catarrhalis wytwarza ß-laktamaz ). Rutynowe oznaczanie lekowra liwoêci dla szczepów M. catarrhalis nie jest konieczne [41]. 6. Oznaczanie wra liwoêci Neisseria meningitidis Rutynowe oznaczanie wra liwoêci na leki szczepów N. meningitidis nie jest zalecane. W przypadku koniecznoêci oznaczenia wra liwoêci meningokoków nie stosowaç metody dyfuzyjno-krà kowej; oznaczyç MIC antybiotyków jednà z metod: 1). rozcieƒczeƒ w agarze, stosujàc pod o e KBMHA, 2). Etestem (wg instrukcji producenta). Zawiesin bakteryjnà o g stoêci 0,5 McFarlanda nale y przygotowaç z 20-24h hodowli na pod o u czekoladowym. Nale y pami taç, e w przypadku stosowania wst pnej hodowli na agarze krwawym zawiesina o g stoêci 0,5 McFarlanda zawiera tylko po ow jednostek tworzàcych koloni w porównaniu z pod o em czekoladowym. Inkuba- Tab Interpretacja wartoêci MIC antybiotyków dla N. meningitidis [32] *antybiotyki u ywane w profilaktyce zaka eƒ o etiologii N. meningitidis,**antybiotyki u ywane w profilaktyce i leczeniu zaka eƒ o etiologii N. meningitidis cja 20 24h w temp. 35 o ±2 o C, w atmosferze 5% CO Szczepy wzorcowe: Streptococcus pneumoniae ATCC inkubacja w warunkach tlenowych lub w atmosferze 5% CO 2, z wyjàtkiem azytromycyny, dla której inkubacja musi byç prowadzona w warunkach tlenowych. Escherichia coli ATCC szczep s u y do kontroli jakoêci oznaczania wra liwoêci na ciprofloksacyn i minocyklin. Inkubacja powinna byç prowadzona w warunkach tlenowych lub w atmosferze 5% CO 2. 26

27 7. Oznaczanie wra liwoêci Haemophilus influenzae Pod o e HTM, zawiesina bakteryjna o g stoêci 0,5 McFarlanda (na posiane p ytki o Êrednicy 9-10 cm z pod o em HTM nak adaç nie wi cej ni 4 krà ki), inkubacja 16-18h w temp. 35 o ±2 o C, w atmosferze 5% CO 2. Odczyt strefy zahamowania wzrostu dla szczepów Haemophilus spp. wokó krà ków z antybiotykami mo e sprawiaç trudnoêci. Wa ne jest, aby odczytywaç wielkoêç strefy zahamowania wzrostu zasadniczego bakterii z pomini ciem s abego wzrostu bardzo ma ych kolonii lub wzrostu mg awicowego. Tab ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY *Uwaga: Szczepy H. influenzae oporne na ampicylin, ß-laktamazo-ujemne (BLNAR) wyst pujà w Polsce coraz cz - Êciej. Szczepy BLNAR powinny byç traktowane jako klinicznie oporne na amoksycylin z kw. klawulanowym, ampicylin z sulbaktamem, cefaklor, cefprozil, cefuroksym i cefetamet [32], pomimo i in vitro niektóre z tych szczepów mogà wykazywaç wra liwoêç na wymienione leki. Mechanizm ten wynika ze zmian w PBP i jest trudny do wykrycia. Obni ona wra liwoêç na ampicylin, brak wytwarzania ß-laktamazy w teêcie cefinazowym, a zw aszcza niepowodzenie terapeutyczne, powinny sk oniç do przypuszczenia, e mo emy mieç do czynienia ze szczepem BLNAR. Jak do tej pory nie ma jednolitego schematu wykrywania tej opornoêci w oparciu o testy fenotypowe. Optymalnym post powaniem by oby zastosowanie metod biologii molekularnej (PCR) w celu wykrycia mutacji w genie ftsi, kodujàcym PBP2. Z metod fenotypowych najlepsze wyniki uzyskiwano stosujàc jednoczeênie krà ki z ampicylinà (2 μg) oraz z amoksycylinà/kw. klawulanowym (2 μg/1 μg). Strefa zahamowania wzrostu dla szczepów BLNAR (dla obu krà ków) jest 13 mm, dla szczepów wra liwych 17 mm [22,45]. MIC ampicyliny dla szczepów BLNAR ma na ogó wartoêç 1 μg/ml, jednak opisywano szczepy tzw. lowblnar z wartoêciami MIC=0,5 μg/ml [15]. Dla szczepów wra liwych MIC ampicyliny ma zazwyczaj wartoêç 0,25 μg/ml lub mniejszà. Na Êwiecie, a ostatnio w Polsce opisano ju tak e szczepy H. influenzae dysponujàce jednoczeênie dwoma mechanizmami opornoêci na ampicylin : zmianami w bia kach PBP (BLNAR) i wytwarzajàce ß-laktamaz, tzw. szczepy BLPACR (ang. ß-lactamase-producing, amoxicillin-clavulanic acid-resistant). Szczepy BLNAR nale y przesy aç do KORLD [13]. 27

28 Tab ANTYBIOGRAM ROZSZERZONY* *Stosowaç do oznaczeƒ lekowra liwoêci izolatów pochodzàcych z p ynu mózgowo-rdzeniowego, krwi oraz od pacjentów z zagro eniem ycia. Dla izolatów z p ynu mózgowo-rdzeniowego nale y rutynowo raportowaç wyniki badania lekowra liwoêci jedynie dla ampicyliny, jednej z cefalosporyn III-generacji, chloramfenikolu i meropenemu Szczepy wzorcowe: Haemophilus influenzae ATCC s u y do kontroli jakoêci oznaczania wra liwoêci na wybrane cefalosporyny (cefaklor, cefamandol, cefprozil, cefuroksym) w metodzie dyfuzyjno-krà kowej oraz karbapenemy w metodach rozcieƒczeniowych (oznaczenie MIC). Haemophilus influenzae ATCC szczep BLNAR, s u y do kontroli jakoêci oznaczania wra liwoêci na pozosta e antybiotyki (w tym karbapenemy w metodzie dyfuzyjno-krà kowej). Haemophilus influenzae ATCC szczep s u àcy do kontroli jakoêci pod o a HTM. Escherichia coli ATCC szczep s u y do kontroli jakoêci oznaczania wra liwoêci na amoksycylin / kw. klawulanowy. W przypadku pe zajàcych szczepów Proteus spp. ignorowaç wtórny wzrost w strefach zahamowania wzrostu, je eli nie przekracza on 20% wzrostu zasadniczego. 8. Oznaczanie wra liwoêci pa eczek z rodziny Enterobacteriaceae. Pod o e MHA, zawiesina bakteryjna o g stoêci 0,5 McFarlanda, inkubacja 16-18h w temp. 35 o C± 2 o C, w atmosferze tlenowej. 28

29 Tab ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY Tab ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY DLA SZCZEPÓW IZOLOWANYCH Z MOCZU 29

30 Tab ANTYBIOGRAM ROZSZERZONY * Oznaczajàc MIC tigecykliny metodà mikrorozcieƒczeƒ w bulionie lub rozcieƒczeƒ w agarze, standard tigecykliny nale y dodaç do pod o a w dniu badania. Ponadto, jeêli oznaczamy MIC metodà mikrorozcieƒczeƒ w bulionie pod o e musi byç przygotowane nie wczeêniej ni w ciàgu 24 godz. przed badaniem lub, jeêli jest starsze, powinno zostaç zagotowane (i ostudzone) tu przed dodaniem tigecykliny w celu usuni cia tlenu z pod o a [17]. 30

31 Tab Oznaczanie wra liwoêci pa eczek Salmonella spp. Uwaga: W przypadku zaka eƒ uogólnionych wywo anych przez Salmonella spp. nale y oznaczaç wra liwoêç na cefalosporyny III-ej generacji i chloramfenikol. Nie oznaczaç wra liwoêci na cefalosporyny I i II generacji oraz na aminoglikozydy, poniewa mimo wra liwoêci in vitro nie ma skutecznoêci klinicznej [30,32] Wykrywanie ß-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym ESBL Szczepy wytwarzajàce ESBL nale y traktowaç z definicji jako szczepy oporne na wszystkie penicyliny (bez po àczeƒ z inhibitorami), cefalosporyny (z wyjàtkiem cefamycyn i po àczeƒ z inhibitorami) i monobaktamy [14,27,32]. W przypadku ci kich zaka eƒ oraz w przypadku chorych z czynnikami ryzyka, szczepy ESBL+ nale y traktowaç jako klinicznie oporne równie na po àczenia antybiotyków ß-laktamowych (penicylin i cefalosporyn) z inhibitorami ß-laktamaz. Nale y rutynowo oznaczaç wytwarzanie ESBL u wszystkich Enterobacteriaceae. JeÊli szczep wytwarza ESBL to Êrednica strefy wokó krà ka zawierajàcego ceftazydym z kwasem klawulanowym lub cefotaksym z kwasem klawulanowym, jest wi ksza o 5 mm lub wi cej od Êrednicy strefy wokó krà ka, odpowiednio z samym ceftazydymem lub cefotaksymem. W przypadku testów potwierdzajàcych wykonanych ze szczepem wzorcowym K. pneumoniae ATCC ró nica Êrednic stref wokó krà ków z ceftazydymem/kw. klawulanowym i ceftazydymem powinna byç nie mniejsza ni 5 mm oraz nie mniejsza ni 3 mm dla krà ków z cefotaksymem/kw. klawulanowym i cefotaksymem. Dla szczepu E. coli ATCC analogiczne ró nice Êrednic stref nie powinny byç wi ksze ni 2 mm Oznaczanie ESBL wg CLSI Oznaczaç wy àcznie u szczepów E. coli i Klebsiella spp. (oraz Proteus mirabilis, przy czym w przypadku tego gatunku CLSI zaleca oznaczanie ESBL jedynie u izolatów pochodzàcych z ci kich zaka eƒ oraz wykonywanie testu przeglàdowego wy àcznie z cefpodoksymem, ceftazydymem i cefotaksymem) tabela 8.5. Warunki hodowli, tzn. g stoêç zawiesiny, temperatura, czas hodowli i pod o a pozostajà bez zmian (punkt 8.). 31

32 Tab Oznaczanie ESBL wg. CLSI. 1 Dla zwi kszenia czu oêci testu powinno si oznaczaç wra liwoêç dla kilku antybiotyków. Tab Zakresy stref zahamowania wzrostu w milimetrach dla wybranych antybiotyków dla szczepów wzorcowych ATCC. 32

33 Oznaczanie ESBL metodà dwóch krà ków: Do wykrywania ESBL mo e byç stosowany tzw. test dwóch krà ków (DDST) [20]. Za jego pomocà ESBL mo na oznaczaç u wszystkich gatunków Enterobacteriaceae (a tak e pa eczek niefermentujàcych). W wariancie podstawowym tej metody stosuje si krà ki z ceftazydymem 30 μg i cefotaksymem 30 μg u o one w odleg oêci 2 cm (pomi dzy Êrodkami) od krà ka z amoksycylinà z kwasem klawulanowym 20/10 μg. W celu zwi kszenia czu oêci testu mo na dodawaç krà ki z cefpodoksymem 10 μg lub aztreonamem 30 μg. Wynik pozytywny testu polega na wyraênym powi kszeniu strefy zahamowania wzrostu wokó krà ka z ceftazydymem lub cefotaksymem (cefpodoksymem, aztreonamem) od strony krà ka zawierajàcego kwas klawulanowy. Powi kszenie to mo e mieç bardzo ró ny kszta t. W niektórych szczepach bakteryjnych, obecnoêç ESBL mo e byç maskowana przez inne mechanizmy opornoêci na ß-laktamy, niepodatne na dzia anie inhibitorów ß-laktamaz. Sà to na przyk ad szczepy, które wytwarzajà konstytutywnie na wysokim poziomie ß-laktamazy AmpC lub majà obni onà przepuszczalnoêç os on dla antybiotyków ß-laktamowych. Wykazujà one zdecydowanà opornoêç na ceftazydym i cefotaksym i sà negatywne w klasycznych testach na obecnoêç ESBL. Wykrywanie ESBL w takich szczepach mo na prowadziç za pomocà testu DDS, w którym dodaje si krà ek z cefepimem 30 μg. Podstawà tego podejêcia jest fakt, e cefepim jest z regu y bardzo s abym substratem ß-laktamaz AmpC, przez co zmniejszenie wra liwoêci lub opornoêç na ten antybiotyk jest cz Êciej wynikiem dzia ania ESBL. Alternatywà jest test DDS w swojej podstawowej wersji, wykonywany na pod o u MHA z kloksacylinà w st - eniu μg/ml. Kloksacylina jest dobrym inhibitorem enzymów AmpC, przez co na uzupe nionym nià pod o u ods aniane sà fenotypy opornoêci maskowane przez AmpC. Nale y podkreêliç, e omawiane modyfikacje testu DDS (cefepim, kloksacylina) s u à wy àcznie wykrywaniu ESBL w kontekêcie AmpC, a nie innych mechanizmów opornoêci niezale nych od inhibitorów ß-laktamaz Oznaczanie ESBL za pomocà Etestu Na polskim rynku dost pne sà Etesty zawierajàce ceftazydym i ceftazydym z kwasem klawulanowym, cefotaksym i cefotaksym z kwasem klawulanowym pozwalajàce wykrywaç ESBL. Dost pne sà tak e obecnie Etesty zawierajàce cefepim i cefepim z kwasem klawulanowym Szczepy wzorcowe: Escherichia coli ATCC s u y do kontroli jako- Êci lekowra liwoêci oraz do kontroli jakoêci oznaczenia ESBL (kontrola ujemna) Escherichia coli ATCC s u y do kontroli jakoêci krà ków antybiogramowych z antybiotykami ß-laktamowymi w po àczeniu z inhibitorami ß-laktamaz (kwas klawulanowy, sulbaktam, tazobaktam) Klebsiella pneumoniae ATCC s u y do kontroli jakoêci oznaczenia ESBL (kontrola dodatnia) Citrobacter freundii MIKROBANK s u y do kontroli jakoêci oznaczania ESBL testem dwóch krà ków - DDST (kontrola dodatnia, szczep ESBL+, CTX M-3) Ryc. A Enterobacter cloacae MIKROBANK s u y do kontroli jakoêci oznaczania ESBL testem dwóch krà ków - DDST (kontrola dodatnia, szczep ESBL+, CTX M-3, derepresja AmpC) Ryc. B Klebsiella pneumoniae MIKROBANK s u y do kontroli jakoêci oznaczania ESBL testem dwóch krà ków - DDST (kontrola dodatnia, szczep ESBL+, TEM-47) Ryc. C 33

34 9. Oznaczanie wra liwoêci pa eczek niefermentujàcych. Pod o e MHA, zawiesina bakteryjna o g stoêci 0,5 McFarlanda, inkubacja 16-18h (20-24h dla Stenotrophomonas maltophilia i Burkholderia cepacia; 24h dla Pseudomonas aeruginosa izolowanych od pacjentów z mukowiscydozà) w temp. 35 o C±2 o C, w atmosferze tlenowej. SpoÊród pa eczek niefermentujàcych, metoda dyfuzyjno-krà kowa mo e byç stosowana szeroko jedynie wobec P. aeruginosa i Acinetobacter spp. (punkt 9.1.). W przypadku S. maltophilia i B. cepacia mo na t metod wykorzystywaç dla wybranych antybiotyków (punkt 9.2.). W oznaczeniach wra liwoêci S. maltophilia i B. cepacia na inne ni wymienione w tabelach 9.4. i 9.5. antybiotyki oraz w przypadku innych gatunków pa eczek niefermentujàcych nale y oznaczaç MIC Oznaczanie wra liwoêci P. aeruginosa i Acinetobacter spp. (tabele 9.1. do 9.3.) 9.2. Oznaczanie wra liwoêci S. maltophilia, B. cepacia metodà dyfuzyjno-krà kowà (tabele 9.4. do 9.5.) Tab ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY Tab ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY DLA SZCZEPÓW IZOLOWANYCH Z MOCZU 34

35 Tab ANTYBIOGRAM ROZSZERZONY *W ci kich zaka eniach, niepowodzeniach terapeutycznych oraz w przypadku szczepów wieloopornych zawsze oznaczaç MIC, ze wzgl du na mo liwoêç nie wykrycia opornoêci przy u yciu metody dyfuzyjno-krà kowej. W przypadku kolistyny i polimyksyny B interpretacja MIC (dla obu leków) jest nast pujàca: szczep wra liwy: MIC 2 μg/ml, szczep oporny MIC 4 μg/ml) [12, 32]. Tab Oznaczanie wra liwoêci S. maltophilia metodà dyfuzyjno-krà kowà 35

36 Tab Oznaczanie wra liwoêci B. cepacia metodà dyfuzyjno-krà kowà 9.3. Oznaczanie wytwarzania metalo-ß-laktamaz (MBL) W ostatnich latach coraz cz Êciej izolowane sà szczepy niefermentujàcych pa eczek Gram-ujemnych, zw aszcza P. aeruginosa, dysponujàcych nabytà opornoêcià na karbapenemy. OpornoÊç ta jest uwarunkowana wieloma ró nymi mechanizmami (np. ß-laktamazy, ograniczenie przepuszczalnoêci os on komórkowych, wypompowywanie leku z komórki) [26, 28, 31], które mogà tak e dotyczyç innych antybiotyków. Typ i wariant mechanizmu, poziom jego ekspresji oraz ewentualne wspó wyst powanie kilku mechanizmów w pojedynczym szczepie decydujà o du ej ró norodnoêci fenotypów opornoêci takich szczepów. WÊród znanych obecnie mechanizmów opornoêci P. aeruginosa na karbapenemy szczególne zagro enie stanowià ß-laktamazy o aktywnoêci karbapenemaz, zaliczane do grupy 3 lub klasy B w systemach klasyfikacyjnych ß-laktamaz [3] i zwane te metalo-ß-laktamazami (MBL), ze wzgl du na wykorzystywanie jonów Zn 2 + jako kofaktorów reakcji hydrolizy ß-laktamów. Geny kodujàce MBL mogà byç przekazywane horyzontalnie pomi dzy szczepami P. aeruginosa, a tak e szczepami innych gatunków bakterii (np. Pseudomonas putida, Acinetobacter baumannii), w àcznie z gatunkami z rodziny Enterobacteriaceae. W ciàgu ostatnich 5 lat szczepy wytwarzajàce MBL (g ównie P. aeruginosa) pojawi y si w wielu krajach na Êwiecie, tak e w Polsce i stàd wynika potrzeba wykrywania ich w laboratoriach mikrobiologicznych. Szczepy wytwarzajàce ß-laktamazy typu MBL sà oporne lub wykazujà obni- onà wra liwoêç na penicyliny, po àczenia z inhibitorami ß-laktamaz (brak wp ywu inhibitorów), cefalosporyny i karbapenemy, a ze wzgl du na wspó wyst powanie innych mechanizmów, cz sto sà oporne na wszystkie dost pne dzisiaj ß-laktamy (zw aszcza P. aeruginosa). Jak dotàd, nie opracowano atwego do wykonania testu na obecnoêç MBL, który mo na by uznaç za referencyjny (odpowiednio czu y i specyficzny) i adna metoda nie znalaz a si jeszcze w zaleceniach CLSI. Niemniej, istniejà metody, które sà w stanie wykrywaç zdecydowanà wi kszoêç szczepów MBL-dodatnich i które mogà byç stosowane w laboratoriach. Szczepy podejrzewane o wytwarzanie MBL powinny byç przesy ane do laboratorium referencyjnego w celu potwierdzenia oznaczenia za pomocà metod biochemicznych (spektrofotometryczne oznaczenie hydrolizy imipenemu w ekstrakcie bia kowym z badanego szczepu) i molekularnych. Wykrywaniu MBL powinno si poddawaç: 1) szczepy P. aeruginosa oporne lub o obni onej wra liwoêci na karbapenemy i wysoce oporne na tikarcylin i tikarcylin z kwasem klawulanowym, 2) szczepy Acinetobacter spp. i inne Pseudomonas spp. wykazujàce obni- onà wra liwoêç na karbapenemy. W krajach, w których stwierdza si obecnoêç MBL u pa eczek z rodziny Enterobacteriaceae zalecane jest wykrywanie MBL tak e u tych drobnoustrojów. W Polsce sytuacja ta nie jest jeszcze rozpoznana. Wykrycie szczepu wytwarzajàcego ß-laktamaz MBL, choçby w nosicielstwie, powinno stanowiç przes ank do wszcz cia przez zespól zaka eƒ szpitalnych odpowiednich dzia- aƒ interwencyjnych w szpitalu. Test wykonuje si metodà dyfuzyjno-krà kowà, a p ytki MHA z posianym szczepem bakterii przygotowuje si jak w rutynowych badaniach wra liwoêci na leki wg zaleceƒ CLSI. Na p ytce uk ada si w znacznej odleg oêci od siebie dwa zestawy krà ków, z których ka dy przypomina test dwóch krà ków (DDST) do 36

37 wykrywania ESBL. Pierwszy zestaw zawiera krà ek z EDTA (10μl 0,5M EDTA, ph 7,3-7,4) i po jego obu stronach krà ki z ceftazydymem 30 μg i imipenemem 10 μg, odleg e od krà ka z EDTA o 2 cm (mi dzy Êrodkami krà ków) [25]. W drugim zestawie, krà ek Êrodkowy zawiera kwas 2-merkaptopropionowy zamiast EDTA (2-MPA; 2-3 μl nierozcieƒczonej substancji) [2]. Krà ki z EDTA i 2-MPA nale y przygotowaç samodzielnie na kilka minut przed u o eniem na p ytce. 2-MPA i EDTA sà inhibitorami MBL, w zwiàzku z czym, o produkcji tych enzymów Êwiadczy pojawienie si i wyraêne powi kszenie strefy wokó krà ka z ceftazydymem i/lub imipenemem od strony krà ka zawierajàcego inhibitor (obraz bardzo podobny do dodatniego wyniku oznaczania ESBL metodà dwóch krà ków, DDST). Istnieje poglàd, e o ile EDTA dzia- a lepiej w przypadku P. aeruginosa, to 2-MPA daje lepsze wyniki w przypadku Acinetobacter spp. Nale y równie dodaç, e w sprzeda y znajduje si Etest s u àcy do wykrywania MBL, w którym wykorzystywane sà imipenem i EDTA Szczepy wzorcowe: Escherichia coli ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC s u y tak e do kontroli jakoêci prawid owej zawartoêci Ca 2+ i Mg 2+ w pod o u MHA Escherichia coli ATCC s u y do kontroli jako- Êci krà ków antybiogramowych z antybiotykami ß-laktamowymi w po àczeniu z inhibitorami ß-laktamaz (kwas klawulanowy, sulbaktam, tazobaktam) Pseudomonas aeruginosa MIKROBANK s u y do kontroli jakoêci oznaczania MBL (kontrola dodatnia, szczep MBL+) Ryc. D 37

38 U yte skróty BHIA BLNAR BLPACR 2-MPA CA-MRSA CDC CFU CLSI (d. NCCLS) DDST EDTA ESBL HA-MRSA He-MRSA HLAR Ho-MRSA HTM KBMHA KORLD ang. brain- heart infusion agar agar z wyciàgiem mózgowo-sercowym ang. ß-lactamase negative ampicillin resistant szczepy H. influenzae ß-laktamazo-ujemne oporne na ampicylin ang. ß-lactamase-producing, amoxicillin-clavulanic acid-resistant szczepy H. influenzae ß-laktamazo-dodatnie i oporne na amoksycylin z kw. klawulanowym ang. 2-mercaptopropionic acid kwas 2-merkaptopropionowy ang. community acquired MRSA MRSA pozaszpitalne ang. Centers for Disease Control and Prevention ang. colony forming unit jednostka tworzàca koloni ang. Clinical and Laboratory Standards Institute ang. double disk synergy test, test synergizmu dwóch krà ków wersenian dwusodowy ang. extended-spectrum ß-lactamase ß-laktamaza o rozszerzonym spektrum substratowym ang. hospital acquired MRSA MRSA szpitalne ang. heterogeneously MRSA szczepy S. aureus o heterogennej ekspresji opornoêci na meticylin ang. high-level aminoglycoside resistance wysoka opornoêç na aminoglikozydy ang. homogenously MRSA szczepy S. aureus o homogennej ekspresji opornoêci na meticylin ang. Haemophilus Test Medium Mueller-Hinton agar z dodatkiem 5 % krwi baraniej Krajowy OÊrodek Referencyjny ds. Lekowra liwoêci Drobnoustrojów 38

39 MBL MHA MHBCA MIC MLS B MRSA MS B MSCNS MSSA ORCNS ORSA OUN PBP PMR TSA TSB hvisa VISA VRE VRSA ang. metallo-ß-lactamase, metalo-ß-laktamaza Mueller-Hinton agar Mueller-Hinton broth cation adjusted bulion Mueller-Hinton wzbogacony kationami ang. minimal inhibitory concentration najmniejsze st enie hamujàce ang. resistance to macrolide, lincosamide and streptogramin B; opornoêç na makrolidy, linkosamidy i streptograminy B ang. methicillin-resistant S. aureus S. aureus oporny na meticylin ang. macrolides, streptogramines-b efflux mechanizm wypompowywania makrolidów i streptogramin B ang. methicillin-susceptible coagulase-negative staphylococci wra liwe na meticylin gronkowce koagulazo-ujemne ang. methicillin-susceptible S. aureus S. aureus wra liwy na meticylin ang. oxacillin -resistant coagulase-negative staphylococci oporne na oksacylin gronkowce koagulazo-ujemne ang. oxacillin- resistant S. aureus S. aureus oporny na oksacylin oêrodkowy uk ad nerwowy ang. penicillin-binding protein bia ko wià àce penicylin p yn mózgowo-rdzeniowy agar tryptozowo-sojowy bulion tryptozowo-sojowy ang. heteroresistant vancomycin-intermediate S. aureus S. aureus Êredniowra liwy na wankomycyn o heterogennej ekspresji opornoêci ang. vancomycin-intermediate S. aureus S. aureus Êredniowra liwy na wankomycyn ang. vancomycin resistant enterococci enterokoki oporne na wankomycyn ang. vancomycin resistant S. aureus S. aureus oporny na wankomycyn 39

40 PiÊmiennictwo 1. Ambler RP. The structure of ß-lactamases. Philos Trans R Soc London. Series B: Biological Sciences 1980; 289: Arakawa Y., Shibata N., Shibayama K., Kurokawa H., Yagi T., Fujiwara H., Goto M.. Convent test for screening metallo-ß- lactamase-producting Gram-negative bacteria by using thiol compounds. J. Clin. Microbiol., 38, (2000) 3. Bush K., Jacoby G. A., Medeiros A. A. A functional classification scheme for ß-lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob. Agents Chemother., 39, (1995) 4. Centikaya Y., Falk P., Mayhall C. G. Vancomycin-resistant enterococci. Clin. Microbiol. Rev., 13, (2000) 5. Comité de l Antibiogramme de la Société Fran aise de Microbiologie (2005) 6. Dargere S., Vergnaud M., Verdon R., Saloux E., Le Page O., Leclercq R., Bazin C. Enterococcus gallinarum endocarditis occuring on native heart valves. J. Clin. Microbiol., 40, (2002) 7. EARSS protocol for testing of Streptococcus pneumoniae: 8. ETM, Etest Techical Manual, AB BIODISK, Dalvägen 10, S Solna, Sweden, Edition (2000) 9. Eucast Definitive Document. Terminology relating to methods for the determination of susceptibility of bacteria to antimicrobial agents. Clin. Microbiol. Infect. 6: (2000) 10. Felten A., B. Grandry, P. H. Lagrange, I. Casin. Evaluation of three techniques for detection of low-level methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA): a disk diffusion method with cefoxitin and moxalactam, the Vitek 2 system, and the MRSA-screen latex agglutination test. J. Clin. Microbiol., 40, (2002) 11. Fiebelkorn K. R., Crawford S. A., McElmeel M. L., Jorgensen J. H. Practical disk-diffusion method for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci. J. Clin. Microbiol., 41, (2003) 12. Gales A. C., Reis A. O., Jones R. N. Contemporary assessment of antimicrobial susceptibility testing methods for polymyxin B and colistin: review of available interpretative criteria and quality control guidelines. J. Clin. Microbiol., 39, (2001) 13. Gazagne L., Delmas C., Bingen E., Dabernat H. Molecular epidemiology of ampicillin-resistant non-ß-lactamase-producing Haemophilus influenzae. J. Clin. Microbiol. 36, (1998) 14. Gniadkowski M., Mrówka A., Baraniak A., Fiett J., Hryniewicz W. Wykrywanie ß-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) w laboratoriach mikrobiologicznych: ocena testu Vitek ESBL. Diagn. Lab., 37, (2001) 15. Hasegawa K., Chiba N., Kobayashi R., Murayama S. Y., Iwata S., Sunakawa K., Ubukata K. Rapidly increasing prevalence of ß-lactamasenonproducing, ampicillin-resistant Haemophilus influenzae type b in patients with meningitis. Antimicrob. Agents Chemother., 48, (2004) 16. Hayden M. K., Rezai K., Hayes R. A., Lolans K., Quinn J. P., Weinstein R. A. Development of daptomycin resistance in vivo in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol., 43, ( a. Hiramatsu K., Hanaki H., Ino T., Yabuta K., Oguri T., Tenover F. C. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical strain with reduced vancomycin susceptibility. J. Antimicrob. Chemother. 40, (1997) 17. Hope R., M. Warber, S. Mushtaq, M. E. Ward, T. Parsons, D. M. Livermore. Effect of medium type, age and aeration on the MICs of tigecycline and classical tetracyclines. J. Antimicrob. Chemother., 56, (2005) 40

41 18. Hryniewicz W. Epidemiology of MRSA. Infections., 27 (supl. 2), (1999) 19. Ida T., Okamato R., Shimauchi C., Okubo T., Kuga A., Inoue M. Identification of aminoglycoside-modifying enzymes by susceptibility testing: epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Japan. J. Clin. Microbiol., 39, (2001) 20. Jarlier V., Nicolas M., Fournier G., Philippon A. Extended broad-spectrum ß-lactamases conferring transferable resistance to newer ß-lactam agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and susceptibility patterns. Rev. Infect. Dis., 10, (1988) 21. Jones R. N. Prediction of enterococcal imipenem susceptibility using ampicillin or penicillin MICs: mere evidence for a class concept. J. Clin. Microbiol., 39, (2001) 22. Karpanoja P., Nissinen A., Huovinen P., Sarkkinen H. Disc diffusion susceptibility testing of Haemophilus influenzae by NCCLS methodology using low-strength ampicillin and co-amoxiclav discs. J. Antimicrob. Chemother., 53, (2004) 23. Krzysztoƒ-Russjan J., Mrówka A., Hryniewicz W. Szybka identyfikacja opornoêci Staphylococcus spp. na meticylin przy u yciu testu lateksowego MRSA-Screen. Diag. Lab., 36, (2000) 24. Leclercq R. Mechanisms of resistance to macrolides and linkosamides: nature of the resistance elements and their clinical implications. Clin. Infect. Dis., 34, (2002) 25. Lee K., Chong Y., Shin H. B., Kim Y. A., Yum J. H.. Modified Hodge and EDTA-disk synergy tests to screen metallo-ß-lactamase-producing strains of Pseudomonas and Acinetobacter species. Clin. Microbiol. Infect., 7, (2000) 26. Livermore D. M. Of Pseudomonas, porins, pumps and carbapenems. J. Antimicrob. Chemother., 47, (2001) 27. Livermore D. M. ß-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin. Microbiol. Rev., 8, (1995) 28. Livermore D. M., Woodford N. Carbapenemases; a problem in waiting? Curr. Opin. Microbiol., 3, (2000) 29. Matynia B., M odziƒska E., Hryniewicz W. Antimicrobial susceptibility patterns of Staphylococcus aureus in Poland obtained by the National Quality Assurance Programme. Clin. Microbiol. Infect., 11, (2005) 30. usuni to 31. Nordmann P., Poirel L. Emerging carbapenemases in Gram-negative aerobes. Clin. Microbiol. Infect., 8, (2002) 32. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; sixteenth informational supplement. CLSI M100-S16, Vol. 26, No.3 (2006) 33. Rybak M. J., Pharm D. K. L. Community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus: a review. Pharmacotherapy, 25, (2005) 34. Schrag S., Growitz R., Fultz-Butts K., Schuchat A. Prevention of perinatal Group B streptococcal disease. Revised guidelines from CDC. Morb. Mortal. Wkly Rep., 51, 1-22 (2002) 35. Smith A. M., Botha R. F., Koornhof H. J., Klugman K. P. Emergence of pneumococcal clone with cephalosporin resistance and penicillin susceptibility. Antimicrob. Agents. Chemother., 45, (2001) 36. Srinivasan A, Dick J. D., Perl T. M. Vancomycin resistance in staphylococci. Clin. Microbiol. Rev., 15, (2002) 37. Sutclife J., Tait-Kamradt A., Wondrack L. Streptococcus pneumoniae and Streptococcus pyogenes resistant to macrolides but sensitive to clindamycin: a common resistance pattern mediated by an efflux system. Antimicrob. Agents Chemother., 40, (1996) 38. Swenson J. M., Tenover F. C. and Cefoxitin Disk Study Group. Results of disk diffusion testing with cefoxitin correlate with presence of meca on Staphylococcus spp. J. Clin. Microbiol., 43, (2005) 39. Trakulsomboon S., Danchaivijitr S., Rongrun- 41

42 gruang Y., Dhiraputra C., Susaemgrat W., Ito T., Hiramatsu K. First report of methicillin-resistant Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin in Thailand. J. Clin. Microbiol., 39, (2001) 40. Tsiordas S., Gold H. S., Sakoulas G. Linezolid resistance in clinical isolate of Staphylococcus aureus. Lancet., 358, (2001) 41. Verduin C. M., Hol C., Fleer A., van Dijk H., van Belkum A. Moraxella catarrhalis: from emerging to established pathogen. Clin. Microbiol. Rev., 15, (2002) 42. Weinstein M. P. Comparative evaluation of penicillin, ampicillin and imipenem MICs and susceptibility breakpoints for vancomycin- susceptible and vancomycin-resistant Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium. J. Clin. Microbiol., 39, (2001) 43. Werner G., Cuny C., Schmitz F. J., Witte W. Methicillin-resistant, quinupristin-dalfopristinresistant Staphylococcus aureus with reduced sensitivity to glycopeptides. J. Clin. Microbiol., 39, (2001) Zerva L., Biedenbach D. J., Jones R. N. Reevaluation of interpretive criteria for Haemophilus influenzae by using meropenem (10-microgram), imipenem (10-microgram), and ampicillin (2- and 10-microgram) disks. J. Clin. Microbiol., 34, (1996) Szczepy, które nale y przesy aç do KORLD w celu potwierdzenia fenotypu opornoêci: 1. szczepy S. aureus oporne na wankomycyn VRSA 2. szczepy S. aureus Êredniowra liwe na wankomycyn o heterogennej ekspresji opornoêci hvisa oraz Êredniowra liwe na wankomycyn VISA 3. szczepy S. aureus oporne na linezolid 4. enterokoki oporne na penicylin lub na ampicylin 5. enterokoki oporne na wankomycyn VRE 6. szczepy S. pyogenes oporne na penicylin 7. szczepy S. pneumoniae oporne na wankomycyn 8. szczepy H. influenzae o fenotypie BLNAR 9. szczepy H. influenzae oporne na fluorochinolony 10. szczepy H. influenzae oporne na cefalosporyny III-generacji 11. szczepy N. meningitidis oporne na penicylin 12. szczepy ró nych gatunków wytwarzajàce nabyte ß-laktamazy MBL 13. szczepy ró nych gatunków oporne na tigecyklin 42

43 Lista szczepów kontrolnych z kolekcji MIKROBANK Citrobacter freundii MIKROBANK s u y do kontroli jakoêci oznaczania ESBL (kontrola dodatnia, szczep ESBL+, CTX M-3) Ryc. A Enterococcus faecium MIKROBANK s u y do kontroli jakoêci oznaczania fenotypu HLAR w metodzie przeglàdowej a tak e do kontroli jakoêci oznaczania opornoêci na wankomycyn w metodzie przeglàdowej z wankomycynà w pod o u (kontrola dodatnia szczep oporny na aminoglikozydy i wankomycyn VanB) Enterobacter cloacae MIKROBANK s u y do kontroli jakoêci oznaczania ESBL (kontrola dodatnia, szczep ESBL+, CTX M-3, derepresja AmpC) Ryc. B Streptococcus pyogenes MIKROBANK (dawniej S. pyogenes MIKROBANK SP-M1) s u y do kontroli jakoêci oznaczania wra liwoêci na makrolidy i linkosamidy metodà dwóch krà ków, szczep o fenotypie imlsb Ryc. G Streptococcus pyogenes MIKROBANK (dawniej S. pyogenes MIKROBANK SP-M2) s u y do kontroli jakoêci oznaczania wra liwoêci na makrolidy i linkosamidy metodà dwóch krà ków, szczep o fenotypie kmlsb Ryc. H Streptococcus pyogenes MIKROBANK (dawniej S. pyogenes MIKROBANK SP-M3) s u y do kontroli jakoêci oznaczania wra liwoêci na makrolidy i linkosamidy metodà dwóch krà ków, szczep o fenotypie M Ryc. I Klebsiella pneumoniae MIKROBANK s u y do kontroli jakoêci oznaczania ESBL (kontrola dodatnia, szczep ESBL+, TEM-47) Ryc. C Pseudomonas aeruginosa MIKROBANK s u y do kontroli jakoêci oznaczania MBL (kontrola dodatnia, szczep MBL+) Ryc. D Staphylococcus aureus MIKROBANK (dawniej S. aureus MIKROBANK MR3) s u y do kontroli jakoêci oznaczania wra liwoêci na oksacylin w metodzie przeglàdowej z oksacylinà w pod o u, szczep o heterogennej ekspresji opornoêci na meticylin (kontrola dodatnia) Ryc. E Staphylococcus aureus MIKROBANK (dawniej S. aureus MIKROBANK MR16) s u y do kontroli jakoêci oznaczania wra liwoêci na oksacylin w metodzie przeglàdowej z oksacylinà w pod o u, szczep o homogennej ekspresji opornoêci na meticylin (kontrola dodatnia) Ryc. F 43

44 Szczepy kontrolne z kolekcji MIKROBANK ryciny CAZ 30 AMC 30 CTX 30 Ryc. A Citrobacter freundii MIKROBANK szczep ESBL+(CTX M-3); test dwóch krà ków (DDST). 1 2 FEP 30 FEP 30 CAZ 30 AMC 30 CTX 30 CAZ 30 AMC 30 CTX 30 Ryc. B. Enterobacter cloacae MIKROBANK szczep ESBL+ ( CTX M-3, derepresja AmpC); 1. test dwóch krà ków (DDST) z dostawionym dodatkowo krà kiem z cefepimem (FEP 30 μg); 2. test DDS wykonany na pod o u MHA z dodatkiem kloksacyliny 250 μg/ml. 44

45 2 1 CPD 10 ATM 30 CAZ 30 CRO 30 CTX 30 CAZ 30 AMC 30 CTX 30 3 CTX 30 CTX 30 + klawulanian Ryc. C. Klebsiella pneumoniae MIKROBANK szczep ESBL+ (TEM-47), 1. test dwóch krà ków (DDST), 2. test przeglàdowy (wst pny) wg CLSI, 3. test potwierdzajàcy wg CLSI CAZ 30 CAZ 30 + klawulanian IPM 10 EDTA CAZ 30 IPM 10 2-MPA CAZ 30 Ryc. D. Pseudomonas aeruginosa MIKROBANK szczep MBL+; schemat wykrywania metalo-ß-laktamaz (MBL) metodà dyfuzyjno-krà kowà przy u yciu krà ka z wersenianem dwusodowym (EDTA) oraz kwasem 2-merkaptopropionowym (2-MPA). 45

46 Ryc. E Staphylococcus aureus MIKROBANK (d. S. aureus MIKROBANK MR3) szczep o heterogennej ekspresji opornoêci na meticylin (HeMRSA); metoda przeglàdowa z oksacylinà (6 μg/ml) w pod o u (MHA z dodatkiem 4% NaCl). Ryc. F. Staphylococcus aureus MIKROBANK (d. S. aureus MIKROBANK MR16) szczep o homogennej ekspresji opornoêci na meticylin (HoMRSA); metoda przeglàdowa z oksacylinà (6 μg/ml) w pod o u (MHA z dodatkiem 4% NaCl) 46

47 CC 2 E 15 Ryc. G. Streptococcus pyogenes MIKROBANK (d. S. pyogenes MIKROBANK SP-M1) szczep o indukowanej opornoêci na makrolidy, linkosamidy i streptograminy B (imlsb); oznaczanie wra liwoêci na makrolidy i linkosamidy metodà dwóch krà ków. CC 2 E 15 Ryc. H. Streptococcus pyogenes MIKROBANK (d. S. pyogenes MIKROBANK SP-M2) szczep o konstytutywnej opornoêci na makrolidy, linkosamidy i streptograminy B (kmlsb); oznaczanie wra liwoêci na makrolidy i linkosamidy metodà dwóch krà ków. 47

48 CC 2 E 15 Ryc. I. Streptococcus pyogenes MIKROBANK (dawniej S. pyogenes MIKROBANK SP-M3) szczep oporny na makrolidy w zwiàzku z istnieniem systemu aktywnego wypompowywania leku z komórki - opornoêç typu M (M- fenotyp); oznaczanie wra liwoêci na makrolidy i linkosamidy metodà dwóch krà ków. 48