POLMICRO 2015 Ogólnopolski Zewnątrzlaboratoryjny Sprawdzian Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2016; 52(1): ISSN Praca oryginalna Original Article POLMICRO 2015 Ogólnopolski Zewnątrzlaboratoryjny Sprawdzian Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej POLMICRO 2015 Polish National External Quality Assessment Scheme in Microbiological Diagnostics Elżbieta Stefaniuk 1,2, Karolina Bosacka 1, Ewa Młodzińska 1, Anna Mikołajczyk 1, Monika Fortuna 1, Waleria Hryniewicz 1,2 1 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej, Warszawa 2 Narodowy Instytut Leków, Warszawa Streszczenie W roku 2015 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej (COBJwDM) przeprowadził Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności w Diagnostyce Mikrobiologicznej Program POLMICRO zgodnie z wymaganiami normy PN-EN ISO/IEC 17043:2011. Zorganizowano dwa typy sprawdzianów: jeden przeznaczony dla laboratoriów świadczących diagnostykę szerokoprofilową oraz drugi oddzielny sprawdzian przeznaczony dla pracowni/laboratoriów schorzeń jelitowych. Celem programu POLMICRO 2015 była ocena biegłości laboratoriów w identyfikacji drobnoustrojów, oznaczaniu i klinicznej interpretacji wrażliwości bakterii na antybiotyki, wykrywaniu różnych mechanizmów oporności, oceny mikroskopowej preparatów barwionych metodą Grama. Praca przedstawia wyniki XXII edycji Programu POLMICRO Summary In 2015 Centre for Quality Control in Microbiology (CQCM) conducted Polish National External Quality Assessment Scheme in Microbiological Diagnostics according to the requirements of PN-EN ISO/IEC 17043:2011. The CQCM organized two different types of proficiency programmes: one was designed for laboratories providing a broad spectrum of microbiological diagnostics and the second one was prepared for laboratories dealing with enteric infections only. The aim of the POLMICRO 2015 programme was to evaluate proficiency of laboratories in the identification of microorganisms, determination and clinical interpretation of bacterial susceptibility to antibiotics, detection of different resistance mechanisms and interpretation of Gram slides. The paper presents the results of the XXII edition of the Programme POLMICRO Słowa kluczowe: Key words: POLMICRO, zewnątrzlaboratoryjny sprawdzian wiarygodności, identyfikacja, lekowrażliwość, mechanizmy oporności, barwienie metodą Grama POLMICRO, external quality assessment scheme, identification, susceptibility to antimicrobial agents, resistance mechanisms, Gram stain Wstęp Organizatorem Programu Badań Biegłości POLMICRO, Ogólnopolskiego Zewnątrzlaboratoryjnego Sprawdzianu Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej, od roku 1997 jest Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej (COBJwDM) w Warszawie. Uczestnictwo medycznych laboratoriów mikrobiologicznych (MLM) w Programie POLMICRO jest obowiązkowe i wynika z Rozporządzenia Ministra Zdrowia z dnia 21 stycznia 2009 r. zmieniającego rozporządzenie w sprawie standardów jakości dla medycznych laboratoriów diagnostycznych i mikrobiologicznych (Dz. U. Nr 22, poz. 128). Celem Programu jest ocena kompetencji uczestników w zakresie diagnostyki mikrobiologicznej, w tym identyfikacji czynników etiologicznych zakażeń, oznaczania lekowrażliwości i wykrywania mechanizmów oporności na leki drobnoustrojów wywołujących zakażenia u człowieka oraz oceny i interpretacji preparatów mikroskopowych z materiałów klinicznych i hodowli. Do zadań COBJwDM należą także, standaryzacja i ujednolicanie rutynowo stosowanych metod w laboratoriach, promowanie nowych metod diagnostycznych w tym obszarze oraz edukacja. W roku 2015 odbyła się XXII edycja programu POLMICRO. Łącznie w roku 2015 COBJwDM zorganizował osiem rund sprawdzianów, w tym sześć w edycji ogólnej (diagnostyka szerokoprofilowa) i dwie dotyczące identyfikacji pałeczek jelitowych odpowiedzial- 29

2 nych za zakażenia przewodu pokarmowego. W poszczególnych rundach sprawdzianu skupiono uwagę na różnych etapach diagnostycznych, wykorzystano izolaty bakteryjne różnych gatunków, o różnych fenotypach wrażliwości na leki przeciwdrobnoustrojowe oraz mikroskopię optyczną. W roku 2015 COBJwDM wprowadził nowe zasady oceny poszczególnych rund Programu Badań Biegłości POLMICRO, w oparciu o międzynarodową normę dla organizatorów badań biegłości: PN-EN ISO/IEC 17043:2011. Tematem niniejszego opracowania jest przedstawienie wyników programu Edycji Ogólnej POMICRO Materiał i metody W ramach Programu Badań Biegłości POLMICRO 2015 wykorzystującego porównania międzylaboratoryjne (Edycja Ogólna) zorganizowano sześć rund sprawdzianów obejmujących różne obiekty badane, metody i techniki badawcze. Szczegóły przedstawiono w tabeli 1. Wszystkie obiekty badań pochodziły z kolekcji COBJwDM i zostały przygotowane na potrzeby Sprawdzianu. Ocenę wyników oznaczeń przekazywanych przez uczestników Programu POLMICRO, po raz pierwszy w roku 2015, prowadzono zgodnie z wymaganiami międzynarodowej normy PN-EN ISO/ IEC 17043:2011 Ocena zgodności Ogólne wymagania dotyczące badania biegłości [7], wg której za kryterium przyznania oceny pozytywnej bądź oceny negatywnej przyjęto wskaźnik z (z-score): z 2,0 ocena pozytywna wskazuje wynik działania jako zadawalający i nie wywołuje żadnego sygnału ostrzegawczego; 2,0 < z <3, ocena pozytywna, ale wskazuje wynik działania jako wątpliwy i wywołuje sygnał ostrzegawczy; z 3,0 ocena negatywna wskazuje wynik działania niezadawalający. Wynik ten jest sygnałem ostrzegawczym i jednocześnie wskazaniem elementów, które laboratorium powinno doskonalić. z jest obliczany zgodnie z równaniem (R.1): z = x X σ gdzie: x wynik uzyskany przez uczestnika w danej rundzie POLMICRO; X wartość przypisana w danej rundzie POLMICRO; σ odchylenie standardowe dla oceny biegłości (w danej rundzie POLMICRO. Tabela I. Obiekty badań wykorzystane w poszczególnych rundach Programu POLMICRO 2015 (edycja XXII). Obiekty badań nr kolekcji POLMICRO Mechanizmy oporności / fenotyp wrażliwości / opis obiektów badań POLMICRO 2015 runda I Staphylococcus aureus PM-235 MSSA, MLS B indukcyjny [LZD, RF, CIP, SXT]=S; [E, CL]=R Escherichia coli PM-236 ESBL [AMC, CXM, CTX, NIT, SXT]=S; [AMP]=R Streptococcus pyogenes PM-237 MLS B indukcyjny [E, CL]=R Acinetobacter baumannii PM [AK, TOB, IMP, MEM, COL]=S [GE, SXT]=R POLMICRO 2015 runda II Staphylococcus haemolyticus PM-241 MRSCN, MLS B indukcyjny [VA, TET]=S; [GE, TEC]=R Staphylococcus haemolyticus PM-242 MRSCN, MLS B indukcyjny [TEC, VA, TGC]=S; [GE, TET]=R POLMICRO 2015 runda III Streptococcus pneumoniae PM [P]=R (zakażenia inne niż ZOMR); [P]=R (zakażenia ZOMR); [CXM po]=s/i/r*; [CXM iv]=s/i*; [CTX/CRO iv]=s ; [MEM, LEV, VA, E, CL, TET, SXT]=S Streptococcus pneumoniae PM [P (inne niż ZOMR, ZOMR)]=R; [CXM po, iv]=r; [CTX/CRO iv]=r; [MEM (inne niż ZOMR)=S; [MEM (ZOMR)]=I; [LEV, VA, E, CL, TET]=S; [SXT]=R Haemophilus influenzae PM-245 BLNAR [AMP, AMC, CXM po, iv, TET]=R; [CTX/CRO, MEM, CIP, SXT]=S Streptococcus agalactiae PM-246 M-fenotyp [P, CL]=S; [E, TET]=R POLMICRO 2015 runda IV Preparaty mikroskopowe z dodatniej hodowli krwi A Ziarenkowce Gramdodatnie Z posiewu krwi wyhodowano Streptococcus pneumoniae PM-247 Z posiewu krwi wyhodowano Staphylococcus aureus PM-248 B Pałeczki Gram-ujemne Z posiewu krwi wyhodowano Escherichia coli PM-249 Ziarenkowce gram-ujemne Z posiewu krwi wyhodowano Neisseria meningitidis PM-250 C-E Pałeczki Gram-dodatnie Preparat z hodowli Corynebacterium diphteriae PM-251 Laseczki Gram-dodatnie Preparat z hodowli Bacillus subtilis PM-252 Pałeczki Gram-ujemne Preparat z hodowli Capnocytophaga canimorsus PM-253 POLMICRO 2015 runda V Stapylococcus aureus PM-255 MRSA [E, CL, LZD, RF, CIP, TET, VA, SXT]=S Enterococcus casseliflavus PM Izolat tylko do identyfikacji Enterococcus gallinarum PM Izolat tylko do identyfikacji 30

3 Diagn Lab 2016; 52(1): Tabela I. cd. POLMICRO 2015 runda VI (wersja elektroniczna) Klebsiella pneumoniae PM-258 ESBL-dodatni; MBL-ujemny Pyt. 1. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller-Hinton testy w kierunku ESBL i MBL+ pytanie testowe Klebsiella pneumoniae PM-259 KPC-dodatni Pyt. 2. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller-Hinton test w kierunku KPC + pytanie testowe Klebsiella pneumoniae PM-260 OXA-48 Pyt. 3. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller-Hinton test w kierunku OXA-48 (krążek z temocyliną 30 µg) + pytanie testowe Enterobacter cloacae PM-261 ESBL-dodatni; KPC-ujemny; MBL-ujemny Pyt. 4. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller-Hinton testy w kierunku ESBL, KPC i MBL + pytanie testowe Pseudomonas aeruginosa PM-262 ESBL-ujemny; MBL-dodatni Pyt. 5. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller-Hinton testy w kierunku ESBL i MBL + pytanie testowe Staphylococcus aureus PM-263 MLS B indukcyjny Pyt. 6. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller- Hinton oznaczanie wrażliwości na makrolidy, linkozamidy i streptograminy + pytanie testowe Staphylococcus aureus PM-264 MLS B konstytutywny Pyt. 7. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller- Hinton oznaczanie wrażliwości na makrolidy, linkozamidy i streptograminy + pytanie testowe Streptococcus agalactiae PM-265 M-fenotyp Pyt. 8. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller-Hinton z krwią końską oznaczanie wrażliwości na makrolidy, linkozamidy i streptograminy + pytanie testowe Staphylococcus epidermidis PM-266 Fenotyp MS B Pyt. 9. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller- Hinton oznaczanie wrażliwości na makrolidy, linkozamidy i streptograminy + pytanie testowe Staphylococcus epidermidis PM-267 L-fenotyp Pyt. 10. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller- Hinton oznaczanie wrażliwości na makrolidy, linkozamidy i streptograminy + pytanie testowe Enterococcus faecalis PM-268 Fenotyp HLAR + wrażliwość na glikopeptydy Pyt. 11. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller-Hinton oznaczanie wrażliwości na gentamicynę i glikopeptydy + pytanie testowe Enterococcus gallinarum PM-269 Fenotyp VanC i VanA Pyt. 12. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller-Hinton oznaczanie wrażliwości na glikopeptydy + pytanie testowe Enterococcus faecium PM-270 Fenotyp VanB Pyt. 13. Zdjęcie płytki z podłożem agarowym Mueller-Hinton oznaczanie wrażliwości na glikopeptydy + pytanie testowe BLNAR szczep nie wytwarzający β-laktamazy, oporny na ampicylinę; HLAR oporność wysokiego stopnia na aminoglikozydy; L-fenotyp wrażliwość na erytromycynę, wrażliwość/średnia wrażliwość/oporność na klindamycynę, oporność na linkomycynę in vitro; M-fenotyp oporność na erytromycynę, wrażliwość na klindamycynę; MLS B (indukcyjny, konstytutywny) in vitro, MS B oporność na erytromycynę, wrażliwość lub oporność na klindamycynę in vitro; MSSA methicillin-sesceptible Stapylococcus aureus, Staphylococcus aureus wrażliwy na meticylinę; MRSA methicillin-resistant Stapylococcus aureus, Staphylococcus aureus oporny na meticylinę; MRSCN methicillin-resistant Stapylococcus coagulase-negative, gronkowiec koagulazo-ujemny meticylinooporny; VanA indukcyjna oporność na wankomycynę i teikoplaninę; VanB oporność na niskie stężenia wankomycyny i wrażliwość na teikoplaninę; VanC naturalna oporność na wankomycynę przy zachowanej wrażliwości na teikoplaninę. AK-amikacyna, AMP-ampicylina, CIP-ciprofloksacyna, COL-kolistyna, CRO-ceftriakson, CTX-cefotaksym, CXM-cefuroksym, GE-gentamicyna, IPM-imipenem, LEV-lewofloksacyna, LZD-linezolid, MEM-meropenem, P-penicylina, RF-rifampicyna, SXT-trimetoprim/sulfametoksazol, TEC-teikoplanina, TET-tetracyklina, TOB-tobramycyna, VA-wankomycyna. S (susceptible) wrażliwy, I (intermediate) średniowrażliwy, R (resistant) -oporny * S. pneumoniae ATCC 49619; QC MIC cefuroksymu 0,25-1 mg/l Przedmiotem przeprowadzanych porównań międzylaboratoryjnych była identyfikacja, oznaczenie fenotypu wrażliwości i identyfikacja mechanizmów oporności na leki przeciwbakteryjne izolatów klinicznych, zgodnie z aktualnymi rekomendacjami [1, 2, 3, 8]. W czwartej turze poddano kontroli wstępny etap diagnostyki mikrobiologicznej jakim jest ocena bezpośredniego preparatu mikroskopowego. I i VI runda sprawdzianu POLMICRO 2015 zostały przeprowadzone w wersji elektronicznej. Runda I składała się z dwóch części. Pierwsza część polegała na wypełnieniu ankiety elektronicznej, zamieszczonej na stronie internetowej Ośrodka, złożonej z 4 zadań. W każdym zadaniu przedstawiono zdjęcia testów lekowrażliwości (metoda dyfuzyjno-krążkowa oraz metoda pasków z gradientem stężeń) wykonane dla czterech szczepów bakteryjnych. Zadaniem Laboratoriów było podanie właściwej interpretacji klinicznej wrażliwości szczepu na leki wskazane w tabeli oraz wskazanie wersji zaleceń, które były podstawą interpretacji testów. Druga część I tury polegała na opracowaniu Sprawozdań z badań na podstawie wyników identyfikacji i lekowrażliwości szczepów przedstawionych w części I Sprawdzianu. Ocenie punktowej, zgodnie z regulaminem oceny wyników sprawdzianów POLMICRO, podlegała tylko I część, natomiast brak rozwiązania zadań którejkolwiek części sprawdzianu skutkował wykluczeniem laboratorium z oceny w I turze POLMICRO Rundy II, III i V sprawdzianu POLMICRO 2015 miały charakter praktyczny (laboratoryjny); polegały na identyfikacji gatunku i oznaczeniu lekowrażliwości oraz wykryciu mechanizmów oporności 31

4 przesłanych izolatów. W ramach V tury POLMICRO 2015 Laboratoria otrzymały dwa obiekty badań, spośród wskazanych w tabeli I, oznaczone jako A i B. Zadaniem laboratoriów była identyfikacja szczepów bakteryjnych A i B oraz oznaczenie lekowrażliwości szczepu A. IV tura POLMICRO 2015 była sprawdzianem praktycznym; uczestnicy Programu POLMICRO otrzymali szkiełka podstawowe z utrwalonymi preparatami mikroskopowymi, zadaniem ich było zabarwienie preparatów metodą Grama (poza jednym, zabarwionym przez COBJwDM), a następnie ocena mikroskopowa preparatów. W rundzie VI POLMICRO 2015 zadaniem Laboratoriów było udzielenie odpowiedzi na trzynaście pytań zamieszczonych na stronie internetowej (sprawdzian w wersji elektronicznej). Pytania dotyczyły wykrywania mechanizmów oporności u pałeczek Gram- -ujemnych oraz ziarenkowców Gram-dodatnich. Program POLMICRO już od kilku lat przeprowadzany jest z wykorzystaniem specjalnie przygotowanej strony internetowej www. polmicro.edu.pl. Wyniki testów wrażliwości podlegały ocenie wyłącznie dla izolatów poprawnie zidentyfikowanych. Analizie poddano także rutynowo stosowane w laboratoriach metody oznaczania lekowrażliwości oraz realizację wewnętrznej kontroli jakości testów wrażliwości. Wyniki analizy miały wyłącznie charakter edukacyjny i nie miały wpływu na końcową ocenę kompetencji laboratoriów. Szczegółowe wyniki poszczególnych rund sprawdzianu oraz interpretacja wyników każdorazowo były zamieszczane na stronie internetowej Ośrodka. Laboratoria, które uczestniczyły we wszystkich turach sprawdzianu POLMICRO 2015 uzyskując wyłącznie wyniki pozytywne otrzymały Świadectwa Ogólnopolskiego Zewnątrzlaboratoryjnego Sprawdzianu Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej. Świadectwa te posiadają indywidualny numer i zachowują ważność w terminie jednego roku od dnia wystawienia. Wyniki i omówienie W poszczególnych turach sprawdzianów POLMICRO w roku 2015 uczestniczyła różna liczba laboratoriów mikrobiologicznych (tabela II). Uzyskane przez laboratoria oceny w poszczególnych rundach Programu przedstawiono w tabeli II. Identyfikacja drobnoustrojów O identyfikację szczepów kontrolnych laboratoria zostały poproszone w rundach II, III i V Programu POLMICRO W turze II Sprawdzianu POLMICRO 2015 gatunek badanych izolatów (Staphylococcus haemolyticus PM-241 i PM-242) poprawnie określiły czterysta czterdzieści dwa laboratoria (99,3%). Trzy laboratoria popełniły błędy w identyfikacji. Jedno z nich niepoprawnie zidentyfikowało obydwa szczepy PM-241 i PM-242, jako Staphylococcus lugdunensis. Pozostałe dwa laboratoria popełniły błąd w identyfikacji jednego ze szczepów jedno zidentyfikowało szczep PM-241 jako Staphylococcus saprophyticus, drugie szczep PM 242 jako Staphylococcus aureus. Laboratoriom tym przyznano oceny negatywne i tym samym nie oceniano testów lekowrażliwości. Pozytywny wynik I tury sprawdzianu POLMICRO 2015 uzyskało 425 (96,8% z 439) laboratoriów biorących udział w programie. 2. W ramach III tury POLMICRO 2015 laboratoria otrzymały cztery izolaty: Streptococcus pneumoniae PM-243, Streptococcus pneumoniae PM-244, Haemophilus influenzae PM-245 i Streptococcus agalactiae PM-246. Czterysta czterdzieści jeden z 442 laboratoriów (99,8%) prawidłowo określiło gatunek szczepu Streptococcus pneumoniae PM-243. Jednemu laboratorium nie udało się uzyskać wzrostu drobnoustrojów w badanej próbce. Drugi izolat S. pneumoniae, szczep kontrolny o numerze PM-244 został prawidłowo zidentyfikowany przez wszystkich uczestników Sprawdzianu. Szczep Haemophilus influenzae PM-245 prawidłowo zidentyfikowało czterysta trzydzieści siedem laboratoriów (98,9%); trzem ośrodkom nie udało się ożywić izolatu, a dwa podały niepoprawną identyfikację (Haemophilus parainfluenzae n=1 i Streptococcus agalactiae n=1). 99,1% uczestników Sprawdzianu prawidłowo określiło gatunek szczepu S. agalactiae PM-246. Dwa laboratoria podały, że szczep należy do gatunku Streptococcus pyogenes, jedno S. pneumoniae, a jednemu nie udało się otrzymać wzrostu drobnoustrojów w badanej próbce. 3. W V rundzie POLMICRO 2015 zadaniem każdego uczestnika była identyfikacja Staphylococcus aureus PM-255 oraz odpowiednio jednego z dwóch szczepów enterokoków (Enterococcus casseliflavus PM-256 lub Enterococcus gallinarum PM-257). Odpowiedzi udzieliło czterysta czterdzieści siedem laboratoriów (99,1%). Tabela II. Liczba laboratoriów biorących udział w Programie Badań Biegłości POLMICRO w roku 2015 i uzyskujących ocenę pozytywną w poszczególnych rundach Sprawdzianu Liczba (n) Liczba i % Laboratoriów, Liczba i % Laboratoriów, Liczba i % Runda Programu Laboratoriów, które które uzyskały które uzyskały Laboratoriów, które POLMICRO otrzymały obiekty ocenę pozytywną: ocenę negatywną: udzieliły odpowiedzi badań z 2 i 2,0 < z <3,0 z 3,0 POLMICRO 2015/I (94,8%) 425 (96,8%) 14 (3,2%) POLMICRO 2015/II (96,7%) 421 (94,6%) 23 (5,2%) POLMICRO 2015/III (95,9%) 416 (94,1%) 16 (3,6%) POLMICRO 2015/IV (99,1%) 358 (79,7%) 100 (22,3%) POLMICRO 2015/V (99,1%) 376 (84,1%) 71 (16%) POLMICRO 2015/VI (98,9%) 378 (88,7%) 47 (11%) 32

5 Diagn Lab 2016; 52(1): Rycina 1. Rozkłady wartości MIC (mg/l) teikoplaniny dla szczepów Staphylococcus haemolyticus PM-241 i PM-242 (POLMICRO 2015/II). Spośród 447 Laboratoriów, które wzięły udział w tej turze Sprawdzianu, szczep Enterococcus casseliflavus PM-256 otrzymało 224 uczestników, natomiast Enterococcus gallinarum PM Szczep Staphylococcus aureus PM-255, prawidłowo zidentyfikowało 100% laboratoriów (n=447). Szczepy z rodzaju Enterococcus poprawnie zidentyfikowało 378/447 uczestników (tj. 84,6%). Lekowrażliwość i mechanizmy oporności 1. W ramach I tury POLMICRO 2015 najwięcej błędów wynikało z nieprawidłowej oceny fenotypów oporności. Pięć laboratoriów uznało, że szczep E. coli PM-236 nie produkuje β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL). Dwa laboratoria nie zidentyfikowały indukcyjnej oporności na klindamycynę zarówno w szczepie S. aureus PM-235 jak i S. pyogenes PM-237. Natomiast jedno laboratorium nie wykryło ani mechanizmu ESBL w szczepie E. coli PM-236, ani indukcyjnego MLS B w izolacie S. pyogenes PM-238. Badane szczepy S. haemolyticus PM-241 i PM-242 (POLMICRO 2015/II) charakteryzowały się opornością na meticylinę. Tylko jedno laboratorium popełniło błąd oznaczając szczep S. haemolyticus PM-241 jako wrażliwy na meticylinę. Wszystkie laboratoria prawidłowo oznaczyły fenotyp wrażliwości badanych szczepów na makrolidy, linkozamidy i streptograminy B (MLS B indukcyjny). Czterysta trzydzieści siedem laboratoriów (437/445) oznaczyło wrażliwość obu szczepów na wankomycynę, wszystkie wyniki były prawidłowe (wrażliwy). Badanie wrażliwości szczepów na teikoplaninę przeprowadziło czterysta trzynaście laboratoriów (413/445). Szczep S. haemolyticus PM-241 był oporny na teikoplaninę wartość MIC 16 mg/l, dwieście trzydzieści pięć laboratoriów (56,9%) uzyskało prawidłowy wynik oporny. Drugi szczep PM-242 charakteryzował się wrażliwością na teikoplaninę MIC 3 mg/l; czterysta jeden laboratoriów (97,1%) uzyskało wynik zgodny z oczekiwanym wrażliwy. Rycina 1. przedstawia rozkłady wartości MIC (mg/l) teikoplaniny dla szczepów S. haemolyticus PM-241 i S. haemolyticus PM-242 uzyskane przez laboratoria. Pozytywny wynik II tury sprawdzianu POLMICRO 2015 uzyskało czterysta dwadzieścia jeden (94,6%) laboratoriów biorących udział w programie. 2. Przekazany w ramach III rundy POLMICRO 2015 Streptococcus pneumoniae PM-243 charakteryzował się obniżoną wrażliwością na benzylpenicylinę. Pięć laboratoriów nie wykonało oznaczenia wrażliwości szczepu na ten antybiotyk, zaś prawidłową odpowiedź udzieliło 407 laboratoriów (93,1%). Dwadzieścia laboratoriów oceniło wrażliwość badanego izolatu na penicylinę oznaczając zgodnie z rekomendacjami EUCAST (v.5.0) wartość MIC (mg/l), ale także strefę zahamowania wzrostu wokół krążka z antybiotykiem (mm). Podobna sytuacja miała miejsce w przypadku innych antybiotyków, takich jak cefalosporyny III generacji oraz meropenem. Wszystkie laboratoria prawidłowo oceniły wrażliwość izolatu na fluorochinolony, tetracykliny, glikopeptydy oraz makrolidy i linkozamidy. Mechanizmy oporności paciorkowców na makrolidy, linkozamidy i streptograminy grupy B mogą być wyrażone jako fenotypy: MLS B indukcyjny, konstytutywny lub jako M- -fenotyp i czterysta trzydzieści osiem laboratoriów (99,1%) prawidłowo odpowiedziało, że szczep nie wytwarza żadnego z wymienionych fenotypów oporności, dwa laboratoria nie wykonały takiego oznaczenia. Streptococcus pneumoniae PM-244 Czterysta trzydzieści osiem laboratoriów (99,1%) poprawnie oceniło kliniczną oporność szczepu na penicylinę benzylową, interpretując wynik dla izolatów wyhodowanych z płynu mózgowo-rdzeniowego. Dwa laboratoria podały, że szczep jest wrażliwy na benzylpenicylinę niezależnie od postaci klinicznej zakażenia, natomiast trzy ośrodki zinterpretowały szczep jako oporny/ wrażliwy odpowiednio dla zakażeń ZOMR i innych niż ZOMR. 33

6 Cztery laboratoria nie podały interpretacji klinicznej antybiotyku dla zakażeń innych niż ZOMR, a jedno z nich także dla ZOMR. Prawidłową interpretację lekowrażliwości szczepu na cefalosporyny III generacji podało trzystu dziewięćdziesięciu -MRSA) (patrz tabela I). Mechanizm oporności na leki z grupy β-laktamowych prawidłowo wykryło 100% laboratoriów (n=447). Błędy w oznaczeniu wrażliwości na pozostałe leki wskazane w ankiecie, dotyczyły ciprofloksacyny (jedno la- dwóch uczestników (89,1%). Sześć laboratoriów nie oceniło boratorium oznaczyło szczep jako oporny), a w pięciu przypadkach erytromycyny, klindamycyny, tetracykliny i trimeto- wrażliwości badanego izolatu na III generację cefalosporyn, co jest niepokojące ze względu na to, że penicyliny i cefalosporyny III generacji są głównymi lekami stosowanymi w le- nie oznaczyły wrażliwości izolatu na wankomycynę, a dwa primu z sulfametoksazolem. Trzy spośród 447 laboratoriów czeniu zakażeń pneumokokowych. Oporność szczepów S. na tetracyklinę. pneumoniae na β-laktamy jest wynikiem różnego stopnia Pozytywny wynik V tury sprawdzianu POLMICRO 2015 uzyskało 376 spośród 447 (84%) laboratoriów biorących udział zmian w białkach PBP, w przebiegu których powstają białka o tzw. mozaikowej strukturze. Zmiany te powodują różny w tej edycji. stopień oporności na penicylinę i cefalosporyny, dlatego 4. Runda VI Programu Badań Biegłości POLMICRO 2015 polegała w przypadku S. pneumoniae należy oznaczać wartości MIC na ocenie wytwarzania mechanizmów oporności przez 13 jednocześnie dla penicyliny antybiotyków oraz jednej z dożylnych postaci cefalosporyn III gen (cefotaksym lub ceftriak- zdjęć płytek antybiogramowych z odpowiednimi testami. szczepów bakteryjnych różnych gatunków, na podstawie son). Laboratoria nie miały trudności z interpretacją oznaczenia wrażliwości szczepu na fluorochinolony, glikopeptydy, nicznej, a Laboratoria udzielały odpowiedzi na pytania Sprawdzian ten został przeprowadzony w wersji elektro- tetracykliny, makrolidy i linkozamidy (liczba prawidłowych umieszczone pod zdjęciami. Pytania dotyczyły wykrywania odpowiedzi 99,8%). mechanizmów oporności u pałeczek Gram-ujemnych oraz Kolejny szczep kontrolny w III rundzie POLMICRO 2015, H. influenzae PM-245 nie wytwarzał β-laktamazy i był oporny na laboratoriów otrzymało ocenę negatywną z 3,0, z czego 32 ziarenkowców Gram-dodatnich. Czterdzieści siedem (11,0%) ampicylinę (BLNAR). Mechanizm ten jest związany ze zmianami w białkach PBP. Większość laboratoriów prawidłowo spośród trzynastu pytań, a 15 ośrodków na trzy pytania. laboratoria udzieliły nieprawidłowych odpowiedzi na dwa oceniła oporność szczepu na te antybiotyki. Dwadzieścia dwa Na rycinie 2. przedstawiono odpowiedzi udzielone przez laboratoria podały błędną interpretację kliniczną dla amoksycyliny z kwasem klawulanowym. U połowy tych laboratoriów testowe umieszczone w ankiecie. uczestników sprawdzianu VI tury POLMICRO 2015 na pytania (n=12) błąd był wynikiem zastosowania krążka antybiogramowego o nieprawidłowym stężeniu antybiotyku (30 µg zamiast 3 µg). Pojedyncze laboratoria popełniły błędy przy oznaczeniu pozostałych antybiotyków: ciprofloksacyna 99,8% prawidłowych odpowiedzi, meropenem 98,2%, trimetoprim/sulfametoksazol 98,9%; tetracyklina 98,6%. Streptococcus agalactiae PM-246 Wszystkie laboratoria prawidłowo oceniły wrażliwość badanego szczepu na penicylinę i tetracyklinę. Szczep jest producentem genu mefa (M-fenotyp), jest oporny na erytromycynę przy zachowanej wrażliwości na klindamycynę. Trzynaście laboratoriów (2,9%) popełniło błąd oznaczając klindamycynę jako Rycina 2. Analiza poprawności odpowiedzi udzielonych na poszczególne pytania w Sprawdzianie elektronicznym POLMICRO 2015/runda VI. oporny, cztery laboratoria (0,9%) niepoprawnie określiły szczep jako wrażliwy na erytromycynę. Pięć laboratoriów nieprawidłowo podało, że szczep wytwarza Dwanaście laboratoriów nieprawidłowo rozwiązało pierwsze zadanie (pytanie 1.) dotyczące wykrywania β-laktamaz fenotyp MLS B indukcyjny lub konstytutywny, a pięć innych podało, że badany szczep nie wytwarza żadnego mechanizmu oporności. β-laktmaz (MBL) u Klebsiella pneumoniae PM-258. Wszystkie o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) oraz metalo- Pozytywny wynik III tury sprawdzianu POLMICRO 2015 uzyskało czterysta szesnaście (94,1%) laboratoriów biorących mechanizmu ESBL. W omawianym mechanizmie, na zdjęciu nieprawidłowe odpowiedzi związane były z błędną oceną udział w programie. zamieszczonym w ankiecie widoczne były przejaśniania pomiędzy krążkami amoksycyliny z kw. klawulanowym (30µg), 3. W V turze POLMICRO 2015 należało oznaczyć lekowrażliwość tylko jednego badanego szczepu S. aureus PM-255. a cefotaksymem (30µg) i ceftazydymem (30µg) (rycina 3.). Szczep ten był oporny na meticylinę (MRSA), przy zachowanej wrażliwości na pozostałe grupy leków (szczep CA- zanych z opornością szczepów Staphylococcus Błędne odpowiedzi pojawiały się także w pytaniach zwią- epidermidis 34

7 Diagn Lab 2016; 52(1): Rycina 3. Testy w kierunku wytwarzania ESBL i MBL przez Klebsiella pneumoniae PM-258 szczep ESBL-dodatni, MBL-ujemny (VI runda POLMICRO 2015 pytanie 1). PM-266 (pytanie 9.) oraz Streptococcus agalactiae PM-265 (pytanie 8.) na makrolidy, linkozamidy i streptograminy B. Szczep Staphylococcus epidermidis PM-266 prezentował fenotyp MS B (erytromycyna 15µg Ø=6mm oporny, klindamycyna 2µg Ø=30mm wrażliwy, brak spłaszczenia strefy zahamowania wzrostu). 48 laboratoriów podało błędną odpowiedź, że szczep prezentuje M-fenotyp. Taki fenotyp występuje u paciorkowców. Dwa laboratoria błędnie określiły oporność szczepu jako MLS B indukcyjny; na przedstawionym zdjęciu nie było spłaszczenia strefy zahamowania wzrostu przy krążku z klindamycyną (2µg) od strony krążka z erytromycyną (15µg). W pytaniu 8. przedstawiono zdjęcie szczepu Streptococcus agalactiae PM-265 o fenotypie M (M-fenotyp). Dwadzieścia cztery laboratoria błędnie podały, że prezentowany mechanizm to MSB (fenotyp ten występuje u Staphylococcus spp.), a jedno, że jest to fenotyp MLS B indukcyjny. Najwięcej błędnych odpowiedzi pojawiło się w zadaniu 12. Pytanie dotyczyło szczepu Enterococcus gallinarum PM-269, który był oporny na glikopeptydy, oprócz naturalnej oporności typu VanC, izolat ten charakteryzował się dodatkowo nabytą opornością typu VanA. Pozytywny wynik VI tury sprawdzianu POLMICRO 2015 uzyskało 379 spośród 426 (89%) laboratoriów. Stosowane metody oznaczania lekowrażliwości W codziennej pracy laboratoria uczestniczące w Programie POLMICRO wykorzystują różne metody oznaczania wrażliwości na leki w zależności od potrzeb diagnostycznych. W ankiecie II tury POLMICRO 2015 udzielano informacji dotyczących stosowanych rutynowo metod oznaczania lekowrażliwości. Spośród 445 uczestniczących w sprawdzianie laboratoriów czterysta dwadzieścia osiem (96,2%) zadeklarowało stosowanie metody dyfuzyjno-krążkowej, w tym siedemnaście laboratoriów (3,8 %) wskazało, że była to jedyna metoda oznaczania lekowrażliwości, co nie było zgodne z zaleceniami oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów, gdyż np. wrażliwość gronkowców na glikopeptydy oznacza się wyłącznie na podstawie wartości MIC. Laboratoriom, które oznaczyły wrażliwość na teikoplaninę i wankomycynę metodą dyfuzyjno-krążkową przyznano oceny negatywne. Pozostałe laboratoria wskazały zastosowanie następujących metod do oznaczenia wrażliwości badanych w II rundzie POLMICRO 2015 szczepów gronkowców: metoda dyfuzyjno-krążkowa i pasek gradientowy MIC dwieście jeden laboratoriów (45,2%), metoda dyfuzyjno-krążkowa, pasek gradientowy MIC i metoda automatyczna sto sześćdziesiąt pięć laboratoriów (37,1%), metoda dyfuzyjno-krążkowa i metoda automatyczna czterdzieści pięć laboratoriów (10,1%), wyłącznie metodę automatyczną zastosowało dwanaście laboratoriów (2,7%), metodę automatyczną oraz paski gradientowe MIC wykorzystały cztery laboratoria (0,9%). 227 laboratoriów podało nazwę systemu automatycznego/półautomatycznego stosowanego rutynowo do oznaczania wrażliwości na leki: Vitek 2 (n=183); Phoenix (n=18); MicroScan (n=21); Miditech (n=3); WalkAway (n=1); Lisa Scan (n=1). W ankiecie III tury POLMICRO 2015 Laboratoria oprócz informacji dotyczących stosowanych rutynowo metod oznaczania lekowrażliwości, podawały także nazwy producentów stosowanych w laboratorium krążków, pasków z gradientem stężeń oraz podłoży antybiogramowych. Czterysta trzydzieści dziewięć laboratoriów (99,3%) zadeklarowało, że w rutynowej diagnostyce wykorzystuje metodę dyfuzyjno-krążkową. Najwięcej laboratoriów używało krążków bibułowych firmy Oxoid oraz Becton Dickinson. Czterysta szesnaście laboratoriów (94,1%) stosowało także metodę pasków z gradientem stężeń; zdecydowana większość korzystała z pasków E-test oraz M.I.C.E. Na polskim rynku dostępne są podłoża antybiogramowe wielu producentów, ośrodki najczęściej korzystały z podłoży firm biomérieux, Oxoid, Becton Dickinson, Graso oraz Emapol. Sto dziewięćdziesiąt trzy laboratoria (43,7%) oznaczały lekowrażliwość metodą automatyczną. 35

8 Ocena preparatów mikroskopowych W ramach IV tury sprawdzianu POLMICRO 2015 wszystkie laboratoria otrzymały pięć preparatów mikroskopowych opisanych jako A, B, C, D i E. Preparaty A i B były preparatami z dodatnich hodowli krwi na podłożach bulionowych (tzw. dodatnich butelek), a preparaty C, D i E były wykonane z jednorodnych hodowli bakteryjnych na podłożu krwawym. Preparaty zostały utrwalone 98% alkoholem etylowym. Zadaniem laboratoriów było zabarwienie preparatów B, C, D i E metodą Grama, z wyjątkiem preparatu A, który był już zabarwiony w COBJwDM i gotowy do oglądania, oraz ocena wszystkich preparatów pod mikroskopem. Na potrzeby IV tury przygotowano 24 różne zestawy preparatów. Materiały kontrolne rozesłano do 453 laboratoriów, odpowiedzi udzieliło 449 uczestników (99,1%). Preparat A ziarenkowce Gram-dodatnie prawidłową interpretację preparatu A podało 324 z 449 laboratoriów, tj. 72,2%. Dwieście dwadzieścia siedem (50,6%) laboratoriów otrzymało na szkiełku A preparat z dodatniej hodowli krwi z wykorzystaniem szczepu Streptococcus pneumoniae PM- 247; prawidłową odpowiedź obecne ziarenkowce Gram-dodatnie zaznaczyło 156 z 227 laboratoriów (68,7%). Dwieście dwadzieścia dwa (49,6%) laboratoria otrzymały rozmaz dodatniej kropli krwi zawierający szczep Staphylococcus aureus PM-248; sto sześćdziesiąt osiem z 222 ośrodków (75,23%) prawidłowo podało, że w preparacie widoczne są ziarenkowce Gram-dodatnie. Preparat B bakterie Gram-ujemne (pałeczki Gram-ujemne lub ziarenkowce Gram-ujemne) prawidłową interpretację preparatu B podało 304 z 449 laboratoriów, tj. 67,7%. Preparaty B przygotowane zostały z dwóch dodatnich hodowli krwi, w których stwierdzono obecność bakterii Gram-ujemnych. Laboratoria zostały losowo podzielone na dwie grupy. Grupa I dwieście dwadzieścia osiem (50,8%) laboratoriów otrzymało zestaw zawierający w preparacie B (rozmaz krwi) pałeczki Gram-ujemne (szczep Escherichia coli PM-249); preparat został oceniony poprawnie przez 155 spośród 228 laboratoriów (68,0%). Grupa II dwieście dwadzieścia jeden (49,2%) ośrodków otrzymało rozmaz dodatniej kropli krwi zawierający ziarenkowce Gram-ujemne Neisseria meningitidis PM-250. Preparat ten prawidłowo oceniło sto czterdzieści dziewięć z grupy 221 laboratoriów (67,4%). Preparaty C, D, E pałeczki Gram-dodatnie/ laseczki Gram- -dodatnie/pałeczki Gram-ujemne. Do przygotowania wykorzystano zawiesiny w soli fizjologicznej trzech szczepów kontrolnych: Corynebacterium diphteriae PM-251, Bacillus subtilis PM-252 i Capnocytophaga canimorsus PM-253. Prawidłową interpretację preparatu zawierającego zawiesinę szczepu Corynebacterium diphteriae PM-251 podało 393 z 449 laboratoriów, tj. 87,5%. Prawidłową interpretację preparatu zawierającego zawiesinę szczepu Bacillus subtilis PM-252 podało 441 z 449 laboratoriów, tj. 98,2%. Prawidłową interpretację preparatu zawierającego zawiesinę Capnocytophaga canimorsus PM-253 podało 419 z 449 laboratoriów, tj. 93,3%. Preparaty z krwi okazały się najbardziej dyskusyjne w ocenie. Problematyczna była zarówno interpretacja koloru komórek bakteryjnych barwionych metodą Grama, jak i ocena kształtu komórek bakteryjnych w preparatach bezpośrednich z krwi. Nie odnotowano różnicy w interpretacji między preparatami zabarwionymi w COBJwDM (preparat A), a preparatami zabarwionymi w laboratorium (preparat B). Stopień trudności oceny preparatów był podobny i nie odnotowano znaczących różnić w interpretacji między laboratoriami dla dwóch typów preparatów. Preparaty z jednorodnych hodowli bakteryjnych na podłożu stałym nie przysporzyły laboratoriom większych problemów interpretacyjnych Pozytywny wynik IV tury sprawdzianu POLMICRO 2015 uzyskało trzysta czterdzieści (77,7%) laboratoriów. Wewnętrzna kontrola testów lekowrażliwości Zgodnie z wytycznymi EUCAST do kontroli jakości (QC) testów lekowrażliwości pneumokoków oraz paciorkowców β-hemolizujących grup A, B, C i G należy stosować szczep Streptococcus pneumoniae ATCC Szczep ten był wykorzystany w QC TYLKO przez trzysta dziewięćdziesiąt trzy laboratoria (88,1%). Zgodnie z wytycznymi do kontroli jakości oznaczeń lekowrażliwości izolatów z rodzaju Haemophilus należy stosować szczepy: H. influenzae NCTC 8468 do kontroli jakości krążków oraz H. influenzae ATCC do kontroli oznaczania wartości MIC. Stosowanie szczepu NCTC 8468 zadeklarowały cztery laboratoria, natomiast szczepu ATCC sto siedemdziesiąt trzy. Zgodnie z rekomendacjami EUCAST, szczepem przeznaczonym do kontroli jakości lekowrażliwości Staphylococcus aureus jest szczep Staphylococcus aureus ATCC Aż trzydzieści cztery laboratoria (7,6%) do kontroli jakości zastosowały szczep Staphylococcus aureus ATCC 25923, co było niezgodne z obowiązującymi zaleceniami EUCAST i KORLD [3,8]. Szczep ten nie znajduje się w wykazie szczepów do rutynowej kontroli w Zaleceniach EUCAST, natomiast wskazywany jest jako szczep wzorcowy w zaleceniach amerykańskich (zalecenia Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI) do kontroli jakości metody dyfuzyjno-krażkowej. Laboratoria, które zastosowały ten szczep, proszone były o ZWE- RYFIKOWANIE swoich procedur kontroli jakości. Dyskusja i podsumowanie Założeniem organizatora Programu POLMICRO jest promowanie aktualnych standardów diagnostyki mikrobiologicznej i ujednolicanie metod badawczych w polskich laboratoriach medycznych. Jak co roku, główny nacisk położono na identyfikację drobnoustrojów oraz prawidłowe oznaczanie fenotypów wrażliwości na antybiotyki badanych izolatów bakteryjnych z uwzględnieniem wytwarzanych przez nie mechanizmów oporności. Kluczowym elementem diagnostyki mikrobiologicznej jest właściwa identyfikacja czynnika etiologicznego zakażenia, a biegłość laboratorium w oznaczaniu fenotypów wrażliwości patogenów umożliwia podejmowanie odpowiednich decyzji terapeutycznych i działań związanych z kontrolą zakażeń. Wśród bakterii Gram-dodatnich wytwarzających mechanizmy oporności szczególnie niebezpieczne są szczepy Staphylococcus 36

9 Diagn Lab 2016; 52(1): aureus oporne na meticylinę, wankomycynę czy linezolid, gatunki z rodzaju Enterococcus oporne na wankomycynę, teikoplaninę, aminoglikozydy i linezolid oraz izolaty Streptococcus pneumoniae oporne na penicylinę, makrolidy i cefalosporyny III generacji. Gatunki E. gallinarum oraz E. casseliflavus charakteryzują się naturalną opornością na wankomycynę przy zachowanej wrażliwości na teikoplaninę (fenotyp VanC). Należy jednak pamiętać, że gatunki te mogą także nabywać oporność na glikopeptydy. W rundzie VI edycji 2015 wykorzystano szczep PM-269 (E. gallinarum) oporny także na teikoplaninę, należało więc rozważyć w tym przypadku możliwość nabycia przez szczep oporności typu VanA. Taki fenotyp można wykryć bez konieczności stosowania specjalnych technik badawczych, np. biologii molekularnej; w tym przypadku, wystarczająca była metoda dyfuzyjno-krążkowa). Takie szczepy pojawiają się w środowisku szpitalnym i mogą być przyczyną ciężkich zakażeń. E. gallinarum oraz E. casseliflavus mogą także nabyć oporność typu VanB. Oporność na glikopeptydy wynikajacą z obecności jednocześnie dwóch mechanizmów: naturalnej oporności VanC i oporności nabytej typu VanB, można potwierdzić tylko i wyłącznie metodami genetycznymi. Istotne epidemiologicznie jest także wykrywanie szczepów pałeczek Gram-ujemnych, zarówno jelitowych z rodziny Enterobacteriaceae jak i pałeczek niefermentujących, wytwarzających enzymy nabyte takie jak: β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) i karbapenemazy [13]. Biegłość Laboratoriów w wykrywaniu i interpretacji wymienionych mechanizmów bakteryjnej oporności na antybiotyki była m.in. przedmiotem poszczególnych rund Sprawdzianów POLMICRO Jako przykład może posłużyć jeden z obiektów badań w rundzie III POLMICRO 2015 szczep kontrolny PM-245 H.influenzae o fenotypie BLNAR. Szczep taki powinien być traktowany jako klinicznie oporny także na amoksycylinę z kwasem klawulanowym oraz cefuroksym, pomimo, iż in vitro może wykazywać wrażliwość na wymienione leki [2]. Wiele laboratoriów mikrobiologicznych w procesie diagnostyki wykorzystywało systemy automatyczne do identyfikacji i lekowrażliwości drobnoustrojów. Z roku na rok wzrasta też liczba laboratoriów określających wartości MIC z użyciem pasków z gradientem stężeń antybiotyku. Z ankiety przeprowadzonej w 2007 r. przez COBJwDM wśród uczestników Programu POLMICRO wynikało, że 71% (n=329/457) laboratoriów stosowało metodę pasków z gradientem stężeń [10]. Edycja POLMICRO 2015 wykazała, że aż 94,1% (n=416/442) stosowało tę metodę oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów. W roku 2007 na rynku polskim dostępne były wyłącznie paski E-test, a obecnie, zdecydowana większość laboratoriów korzystała z pasków E-test (biomérieux) oraz M.I.C.E. (Argenta), nieliczne z pasków MIC Strip (Liofilchem). Błędy w określaniu fenotypów wrażliwości, mające przełożenie na ocenę negatywną, w większości przypadków związane były z nieprawidłową interpretacją kliniczną odczytywanych wielkości stref zahamowania wzrostu (mm) i wartości MIC (mg/l); mogły być także wynikiem nie przestrzegania zalecanych czasów inkubacji testów antybiogramowych (np. oznaczanie wartości MIC glikopeptydów, itp.) Wyniki porównań międzylaboratoryjnych POLMICRO 2015, podobnie jak w latach ubiegłych [6], wykazały pewne niedoskonałości procedur wewnętrznej kontroli jakości u niektórych uczestników Programu POLMICRO. Nieprawidłowości te muszą być przeanalizowane i zweryfikowane przez laboratoria, co zostało opisane przy poszczególnych turach sprawdzianu. Stosowanie w kontroli jakości antybiogramów szczepów innych gatunków niż rekomendowane przez EUCAST jest niewłaściwe, może zagrażać wiarygodności oznaczeń i wymaga pilnego przeanalizowania procedur laboratoryjnych. Na zakończenie każdej rundy Programu POLMICRO 2015 Laboratoria otrzymywały szczegółowe analizy i komentarze dotyczące wyników badań oraz szereg praktycznych wskazówek odnośnie stosowanych metod i technik diagnostycznych. Ważnym elementem diagnostyki mikrobiologicznej, wskazującym dalsze postępowanie laboratoryjne jest ocena bezpośrednich preparatów mikroskopowych z materiałów klinicznych, jak również preparaty mikroskopowe z hodowli [9, 11, 12]. W roku 1999 w pierwszej turze Sprawdzianu rozesłano do Laboratoriów utrwalone, niezabarwione bezpośrednie preparaty mikroskopowe z plwociny i ropy z ropnia głębokiego oraz preparaty z hodowli Clostridium perfringens lub grupy Bacteroides fragilis. każdy z preparatów opatrzony był informacjami klinicznymi [4]. W roku 2014 Organizator Programu POLMICRO przeprowadził sprawdzian elektroniczny (POLMICRO 2014/II) z wykorzystaniem zdjęć obrazów bezpośrednich preparatów mikroskopowych. Na podstawie opisów przypadków, wyników badań analitycznych i mikrobiologicznych i zdjęć preparatów mikroskopowych, laboratoria miały za zadanie dokonać oceny przedstawionych obrazów mikroskopowych i zaproponować interpretację kliniczną [5]. Po kilkunastu latach przerwy, ponownie w Programie POLMICRO wykorzystano preparaty mikroskopowe w edycji praktycznej (POLMICRO 2015/IV). Przeprowadzona tura sprawdzianu wykazała, że istnieje potrzeba doskonalenia tego obszaru badawczego oraz przeprowadzania kontroli tego etapu diagnostyki, podstawowej umiejętności jaką jest ocena bezpośredniego preparatu mikroskopowego. Popełniane przez Laboratoria błędy dotyczyły przede wszystkim sposobu wybarwiania preparatów mikroskopowych, nieprawidłowych czasów ekspozycji na poszczególne odczynniki (barwniki, alkohol), sposobu oceny preparatu mikroskopowego (nieodpowiednie powiększenie), ale także wyborze pola ocenianego preparatu (brzegi preparatów, pola zbyt grube, itp.). Analiza popełnionych błędów oraz wskazówki zawarte w podsumowaniu danej rundy Sprawdzianu powinny umożliwić Laboratoriom weryfikację procedur przygotowania i oceny preparatów mikroskopowych. Ze względu na rolę edukacyjną Ogólnopolskiego Zewnątrzlaboratoryjnego Sprawdzianu Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej, Organizator Programu POLMICRO przyjął założenie, że wyniki każdego nowego typu Sprawdzianu pozostają bez wpływu na końcowy wynik edycji rocznej Programu, i tak w roku 2015 w ocenie rocznej pominięto zatem wyniki końcowe rundy IV POLMICRO 2015 sprawdzian dotyczący oceny preparatów mikroskopowych. Procent prawidłowych wyników uzyskiwanych przez laboratoria w kolejnych turach Programu POLMICRO w roku 2015 był zróżnicowany i wynosił od 79,7% do 96,8%. Ogółem w roku 2015 świadectwa uczestnictwa i uzyskania pozytywnych wyników 37

10 w Ogólnopolskim Zewnątrzlaboratoryjnym Sprawdzianie Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej otrzymało 314 laboratoriów (70,6% wszystkich uczestników). Piśmiennictwo: 1. EUCAST guidelines for detection of resistance mechanisms and specific resistances of clinical and/or epidemiological importance (version 1.0, July 2013) 2. Eksperckie zasady interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów zalecenia EUCAST, wersja 2.0, Polskie tłumaczenie pod red. prof. dr hab. n. med. Walerii Hryniewicz 3. Europejski Komitet ds. Oznaczania Lekowrażliwości (EUCAST), Tabele interpretacji wartości granicznych minimalnych stężeń hamujących (MIC) oraz wielkości stref zahamowania wzrostu; wersja 5.0, 2015; Polskie tłumaczenie pod red. prof. dr hab. n. med. Walerii Hryniewicz 4. Hryniewicz W, Szczypa K, Krzysztoń-Russjan i wsp. VI Krajowy Zewnętrzny Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych POLMICRO 99. Diagn Lab 2000; 36, Młodzińska E, Bosacka K, Stefaniuk E i wsp. Bezpośredni preparat mikroskopowy kontrola jakości pierwszego etapu diagnostyki mikrobiologicznej. Diagn Lab 2014; 50(4): Młodzińska E, Stefaniuk E, Bosacka K i wsp. Wyniki Ogólnopolskiego Zewnątrzlaboratoryjnego Sprawdzianu Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych POLMICRO Diagn Lab 2014; 50(1): Norma PN-EN ISO/IEC 17043:2011. Ocena zgodności Ogólne wymagania dotyczące badania biegłości. 8. Rekomendacje European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing EUCAST, Version 5.0, Sogaard M, Norgaard M, Schonheyder HC. First notification of positive blood cultures and high accuracy of the Gram stain report. J Clin Microbiol 2007; Stefaniuk E, Ronkiewicz P, Chmylak B, Hryniewicz W. Struktura i kompetencje laboratoriów mikrobiologicznych w Polsce. Nowa Klinika Medycyna Zakażeń. 2011; 18 (4): Strand CL. Positive blood cultures. Can we always trust the Gram stain? Am J Clin Pathol 2006; 126: Uehara Y, Yagoshi M, Tanimichi Y, et al. Impact of reporting gram stain results from blood culture bottles on the selection of antimicrobial agenst. Am J Clin Pathol 2009; 132(1): Żabicka D, Baraniak A, Literacka E, Gniadkowski M, Hryniewicz W. Wykrywanie karbapenemaz zalecenia Adres do korespondencji: dr n. med. Elżbieta Stefaniuk Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej Warszawa, ul. Rydygiera 8 Tel estefaniuk@cls.edu.pl, sprawdzian@polmicro.edu.pl Otrzymano: Akceptacja do druku: Konflikt interesów: nie zgłoszono