Biosensory jako nowoczesne narzędzie w diagnostyce i detekcji - częśd bio biosensorów i na czym to leży

Transkrypt

1 Biosensory jako nowoczesne narzędzie w diagnostyce i detekcji - częśd bio biosensorów i na czym to leży dr Marcin Łoś Instytut Chemii Fizycznej/ Uniwersytet Gdaoski mlos@biotech.ug.gda.pl

2 Podział ze względu na wykrywany materiał Białka Kwasy nukleinowe Metabolity i aktywnośd metaboliczna Całe organizmy Cukry Lipidy Antybiotyki Toksyczne chemikalia Hormony

3 Białka Elementy strukturalne takie jak białka błonowe, cytoplazmatyczne, periplazmatyczne lub wchodzące w skład struktur takich jak wici czy pile Białka wydzielane np. toksyny, enzymy, Białka o wartości diagnostycznej np. CRP, hormony białkowe Analiza składu pokarmów

4 Przeciwciała Przeciwciała produkowane przez limfocyty B Wykrywanie przeciwciał we krwi lub na śluzówkach Różne typy przeciwciał w różnych fazach zakażenia na początku IgM, a później IgG Na powierzchni śluzówek IgA

5 Kwasy nukleinowe DNA jest podstawowym kwasem kodującym informację genetyczną, obecny w większości organizmów mrna pośredniczy w transferze informacji z DNA do białek, obecny we wszystkich aktywnych metabolicznie organizmach rrna najliczniejsza frakcja RNA w komórkach

6 Kwasy nukleinowe mają pewną właściwośd, która umożliwia przechowywanie i przekazywanie informacji, a mianowicie nukleotydy, z których te kwasy są zbudowane lepią się ze sobą. Najsilniejsze połączenia tworzą pary A-T i G-C. Sklejanie się dwóch nici kwasu nukleinowego to hybrydyzacja. Jeśli nici do siebie pasują to mówimy, że są komplementarne. Rozklejanie się dwóch nici kwasu nukleinowego to denaturacja. Aby zwiększyd czułośd metod detekcji możliwe jest użycie amplifikacji kwasów nukleinowych

7 Amplifikacja kwasów nukleinowych NASBA: Izotermiczna amplifikacja RNA wykorzystująca mieszaninę trzech enzymów: polimerazy DNA, rybonukleazy H i odwrotnej transkryptazy. Jest to bardzo wydajna metoda powielania RNA

8 Amplifikacja kwasów nukleinowych PCR: Amplifikacja DNA polegająca na wielokrotnym powtórzeniu cyklu denaturacji martycy, przyłaczenia starterów i syntezy koplementarnej nici na bazie martycy. Metoda łatwa do miniaturyzacji, znacznie szybsza w wersji zminiaturyzowanej. Umożliwia amplifikacje DNA na bazie RNA bitesizebio.com

9 Amplifikacja kwasów nukleinowych LCR: Reakcja łaocuchowa ligazy łączy dwa krótsze kawałki DNA w jeden dłuższy, jeśli obecna jest odpowiednia matryca

10 Metabolity i aktywnośd metaboliczna Niektóre metabolity mają dużą wartośd prognostyczną (np. ATP wskazuje na obecnośd czegoś żywego) Obecnośd innych może byd skrajnie niepożądana (toksyny np. aflatoksyna) Aktywnośd metaboliczna umożliwia detekcję obecności organizmu na podstawie obecności lub zmiany stężeo produktów metabolizmu Dzięki aktywności metabolicznej można również zmusid organizm do ujawnienia się

11 Całe organizmy Obecnośd bakterii, grzybów, pasożytów, ich jaj i cyst a także wirusów może byd skrajnie groźna dla zdrowia i życia ludzi i zwierząt Ze względu na to, że potrafią się one namnażad, ich użycie jako broni może mied znacznie groźniejsze skutki, niż zastosowanie np. toksyn Szybka i czuła detekcja jest niezbędna w takich dziedzinach jak diagnostyka pola walki ale też monitorowanie skażenia wody wodociągowej, monitorowanie skażenia żywności w trakcie produkcji, ewentualnie monitorowanie obiektów cywilnych na wypadek ataku terrorystycznego Zarodniki wąglika urzędy pocztowe USA, politycy Yersinia enterocolitica zdrowe, niepasteryzowane, jednodniowe soki w Polsce

12 Cukry Cukry są ważnym składnikiem strukturalnym i energetycznym Ciągłe monitorowanie poziomu glukozy jest niezwykle istotne w przebiegu cukrzycy Bardzo duże znaczenie zdrowotne tego testu i bardzo wysoki potencjał komercjalizacji Cukry są ważnymi składnikami LPS (lipopolisacharydu) endotoksyny bakterii gram ujemnych Reszty cukrowe w LPS są najbardziej wyeksponowaną częścią i determinują właściwości antygenowe

13 Lipidy Lipidy są podstawowym składnikiem wszystkich błon komórkowych Monitorowanie poziomu cholesterolu Wykrywanie komponentów ściany komórkowej bakterii lipid A

14 Antybiotyki Antybiotyki występują naturalnie w przyrodzie Ich nadużywanie w medycynie i hodowli zwierząt i roślin powoduje lawinowo rosnącą antybiotykoopornośd bakterii patogennych Niektóre antybiotyki bardzo niebezpieczne dla ludzi np. chloramfenikol (powoduje niedokrwistośd aplastyczną 1:19 000) Produkty spożywcze nie powinny zawierad antybiotyków spory problem w przypadku mleka

15 Toksyczne chemikalia Obecnośd pestycydów w żywności Obecnośd mutagennych i toksycznych produktów spalania dioksyny itp. - nie tylko zimą nad osiedlami domków jednorodzinnych ale tez w żywności Chioska żywnośd glikol etylenowy w dżemie

16 Hormony Hormony są bardzo istotnym składnikiem regulującym procesy biologiczne żywych organizmów Są to pochodne aminokwasów, peptydy, pochodne lipidów i fosfolipidów Monitorowanie ich poziomu może byd niezwykle istotne w przebiegu wielu chorób i terapii Hormony sterydowe u sportowców są świetnym sposobem na oszukanie rywali i zniszczenie sobie zdrowia Hormony obecne w ściekach komunalnych są rosnącym problemem

17 Podział ze względu na czynnik wykrywający Przeciwciała Sztuczne przeciwciała Fagi Receptory Aptamery Kwasy nukleinowe Całe organizmy ich tkanki lub komórki Cukry

18 Przeciwciała Są naturalnym składnikiem systemu immunologicznego Występują różne warianty w różnych gatunkach Charakteryzują się zróżnicowaną siłą wiązania, lecz możliwe są warianty o bardzo wysokich powinowactwach

19 Przeciwciała Przeciwciała i pokrewne im receptory charakteryzują się obecnością regionów hiperzmiennych Kilka klas przeciwciał Wcale nie wyglądają jak proca! Można uzyskad przeciwciała reagujące np. tylko z ufosforylowanym antygenem

20 Przeciwciała Niektóre organizmy posiadają przeciwciała szczególnie przydatne w konstrukcji leków i sensorów

21 Przeciwciała Uzyskanie przeciwciał dla substancji drobnocząsteczkowych jest stosunkowo trudne. W tym celu stosuje się koniugaty substancji z białkami Fragment rozpoznawany przez przeciwciało to epitop, który może byd bardzo mały Epitopy, szczególnie te obecne na białkach mogą byd liniowe lub konformacyjne Z tego powodu trudno jest mapowad epitopy konformacyjne

22 Produkcja przeciwciał poliklonalnych + = Zalety: Stosunkowo łatwe do uzyskania Wady: niejednorodna populacja przeciwciał, co może powodowad fałszywe wyniki, różna reakcja zwierząt na antygen, co powoduje zróżnicowanie jakości przeciwciał i problemy z produkcją powtarzalnych partii

23 Produkcja przeciwciał monoklonalnych + + = Zalety: ściśle zdefiniowane, możliwa produkcja na dowolną skalę bez zmiany właściwości, Wady: bardziej kosztowny i skomplikowany cykl produkcyjny

24 Sztuczne przeciwciała Uzyskiwane na drodze selekcji powinowactwa przypadkowych sekwencji aminokwasowych Techniki uzyskiwania sztucznych przeciwciał takie jak phage display, ribosom display Pozwalają na uzyskanie przeciwciał przeciw czynnikom nieimmunogennym lub o wysokiej toksyczności

25 Produkcja przeciwciał w bakteriach + =? Produkcja fragmentów zawierających regiony zmienne Produkcja fagów eksponujących peptyd

26 Fagi Bakteriofagi wykazują naturalne powinowactwo do bakterii, przy czym spektrum tego powinowactwa może się znacznie różnid miedzy poszczególnymi gatunkami Fagi wykazują zdolnośd do inicjowania łatwo mierzalnych zmian w infekowanej komórce np. wycieku jonów, ekspresji wprowadzanych genów, zmian strukturalnych powierzchni komórki Można wprowadzid do fagów geny reporterowe i np. uzyskad świecenie bakterii po jej zainfekowaniu fagiem

27 Fagi mogą zastąpid przeciwciała Shabani et al. Anal. Chem., 2008, 80,

28 Bakteriofag P1 wychwytuje i niszczy bakterie

29 Przykład możliwego wykorzystania fagów kodujących enzym AP released after cell lysis

30 Receptory Często znacznie łatwiej jest uzyskad receptory wiążące się silnie z niewielkimi cząsteczkami, niż stworzyd analogiczne przeciwciała Jako receptory mogą też służyd enzymy naturalnie wiążące się z wykrywaną cząsteczką np. białka wiążące penicylinę mogą służyd do wykrywania obecności antybiotyków - laktamowych

31 Receptory Można wykorzystad naturalne receptory używane przez wirusy do ich wykrywania Podobnie jest z toksynami np. najsilniejsze toksyny (botulina, toksyna tężcowa) są proteazami niszczącymi selektywnie pewne typy receptorów Wiązanie receptora HIV (Wikipedia)

32 Kwasy nukleinowe Kwasy nukleinowe wykazują naturalną zdolnośd do wiązania się z komplementarnymi fragmentami w procesie hybrydyzacji Związanie sondy z sekwencją docelową zachodzi przez utworzenie wiązao wodorowych Siła wiązania zależy od ilości sparowanych zasad, rodzaju zasad, pozycji i rodzaju niesparowanych zasad oraz rodzaju kwasu Pochodną siły wiązania jest temperatura topnienia dupleksu Są naturalną przynętą dla mutagenów

33 DNA DNA występuje jako nośnik informacji we wszystkich organizmach z wyjątkiem niektórych wirusów i wiroidów W jego sekwencji występują pary A-T i G-C Ma niższą siłę oddziaływania niż RNA lub PNA Jest stosunkowo stabilny Niska liczba kopii w pojedynczym organizmie Nadaje się bezpośrednio do powielania w PCR

34 Inne zasady w kwasach nukleinowych Istnieją zasady, które w kwasach nukleinowych potrafią wiązad się z kilkoma różnymi zasadami w nici komplementarnej

35 PNA Jest sztucznie zsyntetyzowaną cząstką Bardzo stabilna Tworzy heterodupleksy o wysokich temepraturach topnienia, co jest spowodowane brakiem ładunku obecnego w szkielecie fosforowym naturalnych kwasów nukleinowych

36 RNA Występuje we wszystkich organizmach poza wirionami wirusów DNA (w czasie infekcji tymi wirusami ich RNA jest obecne) W jego sekwencji występują zasady A, U, G, C (Uracyl zastępuje Tyminę) Tworzy hybrydy z DNA, RNA, PNA Hybrydy tworzone przez RNA mają wyższą temperaturę topnienia niż utworzone przez DNA Jest mniej stabilne niż DNA ze względu na powszechnośd występowania stabilnych RNaz Występuje w zróżnicowanej liczbie kopii na komórkę zależnie od tego, jaką sekwencję analizujemy

37 Aptamery Fragmenty kwasów nukleinowych mogą tworzyd struktury pasujące do innych struktur Mogą zastąpid przeciwciała Można to wykorzystad nie tylko do uzyskania powinowactwa, lecz również np. do odwracalnego blokowania centrów katalitycznych enzymów Możliwe jest skonstruowanie aptamerów wykazujących powinowactwo do różnych struktur, przy czym siła powinowactwa może się różnid

38 Blokowanie enzymu aptamerem Blokowanie enzymu + próbka = + Po hybrydyzacji aptameru z komplementarną sekwencją następuje odblokowanie aktywności eznymu.

39 Aptamery o powinowactwie do kilku Aptamery można tak dobrad, żeby miały słabe powinowactwo do nanorurek węglowych, a silne do komórek bakteryjnych. Obecnośd komórek spowoduje wymiareczkowanie aptamerów, co z kolei wygeneruje mierzalną zmianę potencjału. struktur

40 Całe (mikro)organizmy, tkanki lub komórki Organizmy, ich tkanki lub komórki reagują na zmiany w otoczeniu i na interakcje z innymi organizmami Mierzalne są takie parametry jak wyciek jonów, zwiększona respiracja, uwalnianie różnych substancji, zmiana składu wydzielanych gazów Możliwe jest wprowadzenie genów reporterowych i np. uzyskanie świecenia w reakcji na obecnośd antygenu

41 Całe (mikro)organizmy, tkanki lub komórki Ze względu na aktywnośd elektryczną bardzo chętnie używane są komórki nerwowe i komórki serca Niektóre komórki mają naturalne zdolności do generowania sygnału optycznego chromatofory (z ryb, płazów, głowonogów itp.). Służą tym organizmom do kamuflażu lub komunikacji Do wykrywania obecności antygenu świetnie nadają się limfocyty, szczególnie po modyfikacjach wprowadzających gen reporterowy

42 Całe (mikro)organizmy, tkanki lub komórki Chlorofil w komórkach organizmów fotosyntetyzujących jest naturalnym fluoroforem wrażliwym na toksyczne gazy takie jak np. tabun Mają niestety swoje wady stosunkowo trudne jest długotrwałe utrzymanie aktywności takich sensorów Interpretacja sygnału może byd trudna ze względu na to, że niektóre szlaki transdukcji sygnału mogą byd aktywowane przez wiele różnych czynników

43 Cukry Cukry mają zdolnośd wiązania wielu białek, wśród których znajdują się takie jak np. rycyna Cukry wchodzą w skład zewnętrznej warstwy błon i ścian komórkowych bardzo często warunkują rozpoznanie celu przez np. wirusy Rycyna (Wikipedia)

44 Imprinting w polimerach Syntetyczne receptory Po polimeryzacji w obecności substancji (małej czasteczki, białka, wirusa) i po odpłukaniu substancji uzyskujemy powierzchnię sformatowaną do ponownego oddziaływania z daną substancją. Wysoka trwałośd Niższa czułośd

45 Na czym zrobid biosensor?

46 Ze względu na stosowanie coraz większej ilości technik detekcji oraz koncepcji budowy biosensorów gama materiałów stosowanych do konstrukcji sensorów poszerza się

47 Metale szlachetne - Au Brak korozji Przewodzi prąd Tworzy wiązania z tiolami Pod wpływem światła wzbudzany jest plazmon Łatwe w obróbce

48 Metale szlachetne - Pt Brak korozji Przewodzi prąd Gorzej tworzy wiązania Pod wpływem światła wzbudzany jest plazmon Łatwe w obróbce

49 Metale szlachetne - Ag Znacznie łatwiej koroduje Przewodzi prąd Tworzy wiązania z tiolami Pod wpływem światła wzbudzany jest plazmon Łatwe w obróbce

50 Węgiel - grafit Przewodzi prąd Mechanicznie nieodporny Lepsze właściwości plastyczne w postaci pasty grafitowej

51 Węgiel - diament Nie przewodzi prądu Jest odporny chemicznie i mechanicznie Biokompatybilny nie wywołuje reakcji immunologicznych Układy oparte na diamentowych tranzystorach

52 Węgiel - nanorurki Przewodzą prąd Mogą budowad struktury trójwymiarowe, dzięki czemu powierzchnia sensora rośnie Odporne mechanicznie Można je budowad wokół nanodrutów (rurki z kremem?) obok nanodrut Bi w nanorurce Bi 2 O 3

53 Szkło Łatwe do funkcjonalizowania Przeźroczyste dobre do odczytów optycznych Stosunkowo bierne chemicznie Łatwo pokrywane warstwami metalu

54 Tworzywa sztuczne Wykazują bardzo szerokie spektrum właściwości w zależności od tworzywa i ewentualnych domieszek Niektóre przewodzą prąd, dzięki czemu nadają się na elektrody np. polipirol Częśd z nich jest przezroczysta, więc nadaje się do detekcji optycznej Nadają się do tworzenia kopolimerów z cząsteczkami ułatwiającymi przytwierdzenie czynników wychwytujących

55 Krzem Jest bazą do produkcji układów elektronicznych Porowaty krzem często używany do zwiększenia powierzchni sensora Doskonałe tworzywo do konstrukcji mikrodzwigni Au (+) Au (-) Au (+) Krzem SiO 2

56 Kwarc Odpowiednio cięte kryształy kwarcu są wykorzystywane w sensorach piezoelektrycznych

57 Nanodruty Można je syntetyzowad z bardzo różnych materiałów, co wpływa na ich właściwości fizyczne Nanodruty przewodzące prąd mogą budowad nanoelektrody Depozycja cząsteczek na powierzchni modyfikuje właściwości nanodrutu, co można zmierzyd Journal of the Korean Physical Society 2006, 49:1635 Sensor zbudowany z nanodrutu ZnO. Przyłączenie się białek do nanodrutu skutkuje zmianą oporu

58 Żele Umożliwiają uzyskanie dużej powierzchni Utrzymują stabilne środowisko Łatwe wbudowywanie w żel białek, nukleotydów Łatwe zamykanie całych komórek i fragmentów tkanek Mogą ograniczad dyfuzję i blokowad wnikanie większych cząstek Stosowane żele syntetyczne (np. poliakrylamid) i naturalne (np. kolagen) paleceklab.che.wisc.edu/protein_arrays.htm

59 Biosensory jako nowoczesne narzędzie w diagnostyce i detekcji - przytwierdzanie bio i detekcja dr Marcin Łoś Instytut Chemii Fizycznej/ Uniwersytet Gdaoski

60 Jak przytwierdzid bio do sensora?

61 Receptory i inne białka Wiązania tiolowe Biotynylacja Wiązanie do grup aminowych Wiązanie do grup karboksylowych Oligonukleotydy

62 Przeciwciała Te same co inne białka Ponadto białko A, białko G (superantygeny)

63 Synteza kwasu nukleinowego może odbywad się poza sensorem lub na sensorze. Po syntezie poza sensorem kwas nukleinowy trzeba przytwierdzid do sensora. Można w tym celu użyd szkła powleczonego polilizyną lub wiązad np. wstawione uprzednio do kwasu nukleinowego grupy tiolowe lub np. biotynę. Synteza na sensorze możliwa jest tylko w przypadku użycia materiałaów nieporowatych. Możliwe są tu różne opcje np.: synteza przy użyciu deprotekcji chemicznej, lub świetlnej.

64 W związku z tym, że proces przebiega z ok. 95% wydajnością, długośd oligonukleotydów nie powinna przekraczad 25nt. Synteza przy pomocy deprotekcji świetlnej wymaga skonstruowania 4n masek fotolitograficznych. Charakteryzuje się wysoką rozdzielczością, lecz podobnie jak w przypadku innych sposobów syntezy na chipie utworzone oligonukleotydy nie mogą zostad oczyszczone. Dzięki rozwojowi technik LCD maski fotolitograficzne aktualnie mogą zostad zastąpione programowalnym układem co znaczni obniża koszty tworzenia sensorów i mikromacierzy na żądanie

65 Synteza przy użyciu deprotekcji chemicznej jest oparta na tradycyjnych metodach używanych przy produkcji min. primerów. Substraty dostarczane są w odpowiednie sektory automatycznie. Sektory mogą byd oddzielone hydrofobową przestrzenią w celu uniknięcia mieszania się substratów z różnych sektorów. Ten typ syntezy na chipie jest najtaoszy przy produkcji pojedynczych chipów. Wymaga tylko przeprogramowania robota odpowiedzialnego za syntezę.

66 W celu zwiększenia wydajności hybrydyzacji stosuje się łączniki pomiędzy powierzchnią i sondą. Pozwalają one oddalid cząstkę od powierzchni, która stanowi zawadę przestrzenną. W chipach z krótkimi oligonukleotydami stosuje się niskie temperatury hybrydyzacji, ewentualnie syntezę oligonukleotydu rozpoczyna się od kilku inozyn. Na wydajnośd hybrydyzacji wpływa nie tylko skład, ale i kolejnośd zasad w łaocuchu. Z tego powodu na chipie oligonukleotydowym używanym do badania ekspresji genów powinny byd umieszczone różne sondy rozpoznające ten sam transkrypt. Sygnał z tych sond jest najczęściej uśredniany.

67 Całe (mikro)organizmy, tkanki i komórki Jeśli wykrywany sygnał ma byd sygnałem elektrycznym, do immobilizacji komórek można użyd przewodzących polimerów. Jeśli mierzymy inne właściwości można użyd takich polimerów jak żelatyna lub poliakrylamid. Istotne w tych warunkach jest z jednej strony utrzymanie odpowiednich warunków zapewniających przeżycie części bio, a z drugiej odpowiednio intensywne jej wyeksponowanie na warunki zewnętrzne.

68 Cukry Cukry posiadają dużą ilośd potencjalnie reaktywnych grup: hydroksylowe, ketonowe, karboksylowe, Bioconjug Chem : 1485

69 Sygnał i jego detekcja

70 Sygnał Detekcja może wiązad się ze zmianą mierzonego sygnału, jego zanikiem lub pojawieniem się.

71 Sygnał - Zmiana mierzonych parametrów (np. pojemności, długości pochłanianej fali)

72 Sygnał - Pojawienie się mierzalnego sygnału (np. przepływu prądu, fluorescencji, świecenia)

73 Próbka DNA Znakowanie fluorescencyjne Denaturacja Hybrydyzacja na chipie Testowane DNA

74 Sygnał - Zanik mierzalnego sygnału np. fluorescencji, przepływu prądu

75 Zanik sygnału test kompetycyjny W teście kompetycyjnym wykorzystuje się bardzo precyzyjnie określone stężenie znakowanej substancji wykrywanej w tym przypadku przeciwciało lub receptor są immobilizowane na sensorze Możliwe jest również użycie znakowanego przeciwciała lub receptora

76 Sonda wychwytująca jest wyznakowana (fluoroforem, enzymem lub innym znacznikiem)

77 W próbce znajduje się komplementarny DNA

78 Tworzy się dupleks, przez co odtwarza się miejsce restrykcyjne

79 Enzym restrykcyjny przecina dupleks

80 Znacznik jest usuwany

81 Wykrywany sygnał Światło Fluorescencja Zmiana właściwości elektrycznych 1. Zmiana stężenia jonów 2. Zmiana przewodnictwa 3. Zmiana pojemności 4. Zmiana pola magnetycznego 5. Zmiana red-ox Konwersja substratu w barwny produkt lub kondensacja nanocząstek Zmiana właściwości optycznych Zmiana masy Zmiana topologii powierzchni (AFM) Ugięcie mikrodzwigni

82 Światło Detekcja bardzo czuła dzięki zastosowaniu fotopowielaczy Stosunkowo wysoka selektywnośd niewielka ilośd organizmów jest w stanie emitowad światło Tani pomiar nie wymaga zaawansowanych elementów trudnych do miniaturyzacji

83 Światło United States Patent Nano and Microsensors for Chemical and Biological Terrorism Surveillance Autorzy Jeffrey B.-H. Tok RSC Publishing Generowane przy użyciu chemiluminescencji, a ta z kolei może byd wzbudzana enzymatycznie przez przekształcenie substratu Możliwe do uzyskania przez wbudowanie w szlaki transdukcji sygnału genów lux (np. limfocyty) lub wstawienie segmentu genów do operonu (wykrywanie bakterii przy użyciu fagów)

84 Fluorescencja Przeciwciało znakowane barwnikiem fluorescencyjnym Antygen Au ( Au (-) Au (+) SiO 2 Przeciwciało wychwytujące immobilizowane do powierzchni

85 Fluorescencja Detekcja jest trudniejsza niż w przypadku pomiaru światła dużo substancji naturalnych wykazuje zdolnośd do fluorescencji lub do jej tłumienia Pomiar bardziej skomplikowany, ze względu na potrzebę użycia filtrów lub monochromatorów, źródła światła oraz układu optycznego Czasem zachodzi potrzeba użycia barwników fluorescencyjnych

86 Fluorescencja Wykorzystywane znakowane sondy lub przeciwciała Barwniki interkalujące pomiędzy zasadami kwasów nukleinowych środowisko hydrofobowe Przekształcenie enzymatyczne substratu Zanik fluorescencji usunięcie barwnika np. dzięki odtworzeniu miejsca restrykcyjnego po hybrydyzacji z sondą Testy kompetycyjne brak fluorescencji przy obecności poszukiwanego czynnika w próbce

87 Fluorescencja W metodach wykorzystujących fluorescencję stosuje się różne podejścia w celu zminimalizowani tła i uzyskania jak najwyższych czułości Często próbuje się używad światłowodów w celu minimalizowania niepożądanego tła, dzięki znacznemu ograniczeniu strefy penetracji światła do roztworu

88 Zmiana stężenia jonów Jedna z metod wykrywania obecności wirusów, których wniknięcie do komórki powoduje chwilowe zaburzenie integralności błony komórkowej Wykorzystywana w metodach typu BERA BioElectro Recognition Assay), SEPTIC (Sensing of Phage-Trigerred Ion Cascade), do bardzo szybkiego wykrywania obecności wirusa, lecz bez dobrej dyskryminacji czynnika infekującego (lub infekowanego) Komórki, szczególnie organizmów wyższych, mogą reagowad uwalnianiem jonów na wiele różnych czynników możliwośd uzyskania wyników fałszywie dodatnich

89 Zmiany właściwości elektrycznych 0,2 mm Elektroda 800 nm Izolator 800 nm Często stosowana konstrukcja umożliwiająca maksymalizację powierzchni przy minimalizacji dystansu między elektrodami.

90 Zmiana przewodnictwa Ferrocen przyłączony do sond, przeciwciał, kompetytora itp. Precypitacja lub kumulacja przewodnika pod wpływem aktywności enzymatycznej lub katalitycznej Precypitacja izolatora Enzymatyczne przekształcenie cząsteczki nieaktywnej w aktywną w reakcji redoks

91 Zmiana przewodnictwa United States Patent

92 Generowanie sygnału przez enzymatyczną konwersję fosforanu para-amino fenolu do para-amino fenolu p-app p-app a.p a.p a.p a.p a.p p-ap p-ap a.p Alkaliczna fosfataza - straptawidyna Surowica przeciw fagowi (biotynylowana) Redox-Recykling Redox-Recykling Antygen Au (+) Au (-) Au (+) SiO 2 Krzem Przeciwciała przeciw bakteriofagowi

93 Pomiar amperometryczny konwersji papp do pap przez alkaliczną fosfatazę Control electrode Contacts Measurement elecrode

94 Biosensory oparte na nanodrutach i nanorurkach Nature Biotechnology 22, (2004) Figure 4. Nanowire- and nanotube-based electrical biosensors. (a) Scheme showing silicon nanowires functionalized with biotin. (b) On exposure to streptavidin, the nanowires show changes in conductivity. Plot of conductance versus time for a biotin-modified SiNW, where region 1 corresponds to buffer solution, region 2 corresponds to the addition of 250 nm streptavidin, and region 3 corresponds to pure buffer solution. (c) A nanowire that is not functionalized with biotin shows no response. Conductance versus time for an unmodified SiNW; regions 1 and 2 are the same as in b. (a c, Reprinted by permission of the American Association for the Advancement of Science from ref. 59.) (d) Scheme showing nanotubes functionalized with biotin shows similar changes. (e,f) Quartz-based microbalance signal (e) and electrical signal of nanotubes after addition of different concentrations of streptavidin (f). (d f, Reprinted by permission of the National Academy of Sciences, USA, from ref. 98.)

95 Nanorurki i nanodruty Bardzo intensywnie rozwijane techniki użycia tych struktur w biosensorach Bardzo duże zmiany w przepływie prądu po związaniu się cząsteczek do nanorurek lub nanodrutów powodowane są tym, że przepływ prądu odbywa się w bezpośredniej bliskości powierzchni, i jest to przepływ stosunkowo niewielki w pojedynczej strukturze przez co zmiana ładunku lub konformacji cząsteczki wiążącej się do tych struktur daje duży efekt

96 Zmiana pojemności Pojemnośd układu zależy od właściwości dielektrycznych przestrzeni między okładkami kondensatora Właściwości te zmieniają się, jeśli miedzy okładkami będzie akumulowana substancja o innych właściwościach niż rozpuszczalnik Możliwe pomiary bezznacznikowe, i ze znacznikiem (w tym enzymem) Electroanalysis 2000, vol. 13, 173

97 Zmiana pola magnetycznego Użycie sond znakowanych cząsteczkami ferromagnetycznymi Techniki detekcji pola magnetycznego są bardzo szczodrze finansowane przez przemysł elektroniczny (twarde dyski) Pozwalają na łatwą koncentracje znakowanego czynnika detekcyjnego w miejscu oddziaływania, co znacznie przyspiesza czas reakcji Pozwalają w niektórych przypadkach na zwiększoną wydajnośd usuwania znakowanego czynnika związanego niespecyficzniee W detekcji można wykorzystad zjawisko gigantycznego magnetooporu

98 Zmiana pola magnetycznego Opracowane zostały nanocząstki magnetyczne o unikalnych właściwościach zachowują się one jak pojedyncza domena magnetyczna. Okazuje się, że natura była pierwsza takie cząstki znajdują się w niektórych bakteriach i umożliwiają im wyczuwanie linii sił pola magnetycznego i w konsekwencji magnetotaksję

99 Zmiana red-ox Utlenianie guanidyny Enzymatyczne przekształcenia cukrów, akloholi, trójglicerydów itp. moga powodowad mierzalne zmiany potencjału red-ox

100 Konwersja substratu w barwny produkt lub konensacja nanocząstek Konwersja enzymatyczna Enzym może byd połączony z sondą lub przeciwciałem detekcyjnym Enzym może pochodzid z wykrywanego celu Zasada działania podobna jak w klasycznym teście ELISA Produkt może byd rozpuszczalny lub lokalnie wytrącad się z roztworu Przeciwciała lub sondy mogą byd skoniugowane z nanoczastkami. Po reakcji nastąpi kondensacja nanocząstek, co będzie skutkowało lokalną zmianą koloru.

101 Zmiana właściwości optycznych SPR (powierzchniowy rezonans plazmonowy) pozwala na bezznacznikowy pomiar oddziaływania substancji z powierzchniowa warstwą sensora, dzięki zmianie częstotliwości światła wzbudzającej rezonans plazmonowy.

102 Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) Długośd fali świetlnej wzbudzającej plazmon w warstewce metalu zależy od współczynnika refrakcji w warstewce dielektryka (roztworu wodnego lub gazu) leżącej bezpośrednio przy powierzchni metalu. Niewielkie zmiany współczynnika refrakcji wynikające z akumulacji cząstek, skutkują niewielką zmianą długości fali wzbudzającej plazmon i pochłanianej w tym procesie.

103 Zmiana właściwości optycznych Refraktometria Pozwala na mierzenie zmiany kąta załamania światła. Pomiar w objętości 0,1 fl z czułością jednostki współczynnika załamania światła

104 Zmiana właściwości optycznych Elipsometria Pozwala na mierzenie zmiany kąta polaryzacji światła przez cienkie warstwy na powierzchni sensora.

105 Elipsometria Zmiana na powierzchni sensora powoduje zmianę jego właściwości optycznych. Dzięki elipsometrii możliwy jest pomiar skręcenia kąta polaryzacji (Ψ), różnicy fazy (Δ) oraz ilorazu dużej do małej osi elipsy.

106 Zmiana właściwości optycznych Interferometria Pozwala na mierzenie zmian w interferencji. Interferencja jest zależna między innymi od średnicy otworów, przez które przechodzi światło. Przyłączenie dodatkowej warstwy do powierzchni zmienia obraz interferencji. unit.aist.go.jp

107 Zmiana właściwości optycznych Resonant mirrors - technika dająca bardzo wysokie czułości nawet 10x czulsza niż SPR Mierzy kąt padania światła, który powoduje jego rezonans w warstwie materiału o wysokim współczynniku załamania światła. Ten parametr jest zależny od oddziaływania substancji z zewnętrzną warstwą lustra

108 Resonant mirrors Wiązka lasera, która wpada w rezonans po wyjściu z warstwy ma skręconą o 90 polaryzację światła względem wiązki odbitej, dzięki czemu jest bardzo łatwa do wykrycia.

109 Zmiana właściwości optycznych Spektroskopia Ramana (SERS) pozwala na wykrycie i rozpoznanie różnych wirusów Możliwe jest również rozpoznawanie różnych szczepów tego samego gatunku wirusa Czułośd ok. 500 wirionów Można jej również używad do monitorowania stanu żywych komórek zmiana spektrum w obecności toksyn

110 Spektroskopia Ramana Pomiar rozproszonej energii po oświetleniu próbki wiązką lasera Z pomiaru długości fali fotonów wchodzących w skład rozproszonej energii uzyskujemy informacje o wibracjach i rotacjach cząstki, a te z kolei są ściśle zależne od budowy czastki i od jej otoczenia

111 Zmiana masy sensora W trakcie detekcji wykrywane cząstki lub np. komórki jeśli znajdują się w badanym materiale będą wychwytywane z roztworu Działanie takie zwiększa masę sensora w sposób nieznaczny, lecz mierzalny Pomiaru zmiany masy można dokonad za pomocą mikrowagi kwarcowej (QCM) lub rezonatorów akustycznych (SAW)

112 Zasada działania mikrowagi kwarcowej Kryształy kwarcu w polu elektrycznym zmieniają swoja objętość (jest to tzw. efekt piezoelektryczny). Przy odpowiedniej częstotliwości zmian pola elektrycznego kryształ taki wpada w rezonans. Częstotliwość ta jest zależna min. od masy kryształu. Jeśli zmieni się masa, zmieni się też częstotliwość rezonowania kryształu. Dzięki temu można wykryć przyrost masy równy nawet pojedynczemu wirionowi!

113 Sensory akustyczne i mikrowagi kwarcowe Zmiana masy zdeponowanej na powierzchni powoduje zmianę częstotliwości drgao kryształu Zrywanie wiązao przy uzyskaniu częstotliwości rezonansowej powoduje silny sygnał tu mierzona jest energia zrywania wiązao, a nie masa! Im mniejsza masa kryształu tym bardziej czuła detekcja

114 Zmiana topologii powierzchni (AFM) AFM Wychwytywanie wirusów lub białek przeciwciałami i obserwacja pod mikroskopem sił atomowych Technika dosyd powolna o małej przepustowości

115 Ugięcie mikrodźwigni Biosensory oparte na mikrodźwigniach są wrażliwe na zmianę ładunku na powierzchni W teorii możliwe jest zrobienie bardzo małych i cienkich dźwigni, co powinno pozwolid na analizę bardzo małych próbek z wysoką czułością Nature Biotech, 19, , 2001

116 Lab-on-a-chip Automatyzacja i integracja wielu czynności w jednym niewielkim układzie, zwykle jednorazowego użytku l Burns, M.A. et al. Science 282: , 1998.

117 Dziękuję za uwagę!