Katedra Chemii Nieorganicznej i Analitycznej Uniwersytet Łódzki ul.tamka 12, Łódź

Transkrypt

1 Katedra hemii Nieorganicznej i Analitycznej Uniwersytet Łódzki ul.tamka 12, Łódź Dr Paweł Krzyczmonik Łódź, kwiecień 2014

2 Plan wykładu Biosensory wstęp Metody immobilizacji enzymów i białek Kinetyka reakcji enzymatycznych Wdrukowywanie molekularne (molecular imprinting) 2

3 Biosensory wstęp Biosensor to sensor zawierający w warstwie receptorowej materiał biologiczny, który w wyniku reakcji z analitem przetwarza energię chemiczną na formę energii z której w części przetwornikowej uzyskujemy sygnał analityczny. Materiały stosowane w warstwach receptorowych biosensorów: Sygnał analityczny Enzymy Białka Przeciwciała DNA, RNA Organelle, mitochondria Bakterie, komórki Tkanki zęść przetwornikowa Zamiana informacji chemicznej na formę energii zęść receptorowa Bio Próbka analityczna 3

4 Biosensory wstęp Typ Zasada działania Specyficzność Limit detekcji Detekcja analitu na podstawie specyficznych Duża względem Immunosensor interakcji przeciwciało-antygen. Możliwość analizowanego detekcji komórek bakteryjnych a także białek składnika w w komórek/ml i cukrowców. próbce hemoreceptosensor Sensor enzymatyczny Sensor DNA Sensor tkankowy Sensor bakteryjny Detekcja sygnału na podstawie specyficznych oddziaływań między cząsteczką analitu a cząsteczką specjalnie zaprojektowanego chemoreceptora. Możliwość detekcji białek, receptorów i kanałów błonowych. W działaniu wykorzystuje katalizę enzymatyczną określonego substratu przez dany enzym. Działanie opiera się na oddziaływaniach pomiędzy sondami molekularnymi a DNA zawartym w analizowanej próbce. Detekcja komórkowego DNA. Zawiera w części sensorycznej fragment tkanki. Działanie oparte na specyficznych interakcjach między tkanką a analitem. Jako komponent sensoryczny służą komórki bakteryjne, których genom koduje enzymy katalizujące tworzenie się fluorescencyjnych związków. Głównie rozpoznawane są duże rodziny białek o podobnej strukturze. Ograniczona przez specyficzność wykorzystanego enzymu. 10 nmol/ml 100 nmol/ml Wysoka w względem poszukiwanej próbki. >pmol/ml Niska względem wykrywanych molekuł lub komórek. Wysoka względem wykrywanych molekuł. 100 nmol/ml n 4

5 Biosensory wstęp Porównanie parametrów biosensorów glutaminy wykorzystujących różne materiały biologiczne w warstwach receptorowych. Enzymatyczny mitochondrialny bakteryjny tkankowy zułość [mv/dekadę] Dolny limit detekcji[mol/l] x x x x10-5 Zakres liniowy [mmol/l] zas odpowiedzi [min] zas życia [dni]

6 Metody immobilizacji enzymów i białek Adsorpcja Sieciowana adsorpcja Wiązanie kowalencyjne Sieciowanie Pułapkowanie Enkapsulacja 6

7 Immobilizacja enzymów - przykłady kolagen-nh 2 + OH-(H 2 ) 3 -OH + H 2 N-enzym kolagen-n=h-(h 2 ) 3 -H=N-enzym kolagen-n=h-(h 2 ) 3 -H=N-enzym + LiBH 4 kolagen-n-h-(h 2 ) 3 -H-N-enzym O H 3 H 3 H 2 O N + N H 2 E H 2 NH E O O O H 3 H 3 H 2 H + O NH 2 H 2 O NH * H 2 H O NH 2 H 2 n * n O NH E E OH OH OH l O + l Si (H 2 ) H 2 X O Si (H 2 ) H 2 X + 3Hl l O X grupy NH 2, SH epoxy 7

8 Immobilizacja enzymów - przykłady Koenzym FAD - Dinukleotyd flawinoadeninowy 8

9 Kinetyka reakcji enzymatycznych Warunki badania szybkości reakcji: 1. Substraty i bufory odpowiedniej jakości i czystości 2. Aktywny preparat enzymatyczny 3. Enzym powinien być stabilny w warunkach prowadzenia pomiarów 4. Optymalna temperatura oraz ph prowadzenia reakcji 5. Odpowiednia metoda zatrzymywania reakcji enzymatycznej: - temperatura 100-1% roztwór SDS - w przypadku metaloenzymów dodatek EDTA - dodanie silnego kwasu np.: trichlorooctowego (2-3%) 6. Podczas oznaczenia zapewnione warunki stanu ustalonego reakcji enzymatycznej

10 Kinetyka reakcji enzymatycznych Określanie szybkości początkowej reakcji enzymatycznej

11 Kinetyka reakcji enzymatycznych E + S k 1 k-1 [E:S] k 2 E + P Zmiany w stężeniach uczestników reakcji enzymatycznej w warunkach stanu stacjonarnego i równowagi 11

12 Kinetyka reakcji enzymatycznych Kinetyka reakcji monosubstratowych założenie stanu równowagi k 1 k 2 E + S [ E][ S] wprowadzając K, v = k [ E : S] 2 [E:S], oraz zakładając k 2 <<k 1 v k-1 k2 [ Ec][ S] K [ S] [E:S] [ Ec ][ S] K [ S] Jeśli enzym działa z maksymalną szybkością V max, to wszystkie jego cząsteczki tworzą kompleks z substratem, czyli gdy [E:S] = [E c ], to: V max = k kat [E c ] v E + P Przyjmując całkowite stężenie enzymu jako [E c ] = [E] + [E:S], Otrzymamy: lub k kat gdzie k kat = k 2 - stała katalityczna Stała równowagi K we wzorze wyprowadzonym przy przyjęciu założenia stanu r-gi nosi nazwę stałej substratowej i jest określana symbolem Ks. 12

13 Założenie stanu ustalonego Kinetyka reakcji enzymatycznych Kinetyka reakcji monosubstratowych założenie stanu ustalonego k 1 k 2 E + S k-1 d[ E : S] dt k [E:S] E + P d[ E : S] 0 dt ES k E : S k E : S wprowadzając stałą K m K m -stała Michaelisa k 1 k k 1 2 v i przekształcając równanie otrzymuje się: V K [ max m S] [ S] K K Warto zauważyć, że 2 czyli K M = K s, jeżeli k 2 <<k m s 1 k1 k 13

14 Kinetyka reakcji enzymatycznych Model Michaelisa-Menten E + S k 1 k-1 [E:S] k 2 E + P v V K [ max m S] [ S] 14

15 Kinetyka reakcji enzymatycznych GRAFIZNE WYZNAZANIE STAŁYH KINETYZNYH v V K [ max m S] [ S] 1_ v 1 K 1 m 1 [ S] V V max max 1_ V K m /V Równanie Lineweavera-Burka _ 1_ K M 0 1_ [S] 15

16 Kinetyka reakcji enzymatycznych K m (stała Michaelisa) opisuje tworzenie i rozpad kompleksu ES K m jest miarą powinowactwa enzymu do substratu niska wartość K m silne powinowactwo enzymu do substratu wysoka wartość K m słabe powinowactwo enzymu do substratu Wartość stałej K m jest to stężenie substratu (mol/dm 3 ) przy, którym szybkość reakcji enzymatycznej jest równa połowie jej szybkości maksymalnej. Kiedy [S]=K m wtedy V=V max /2. Inaczej stężenie o wartości równej Km, to stężenie przy którym obsadzona jest połowa aktywnych miejsc. Jednostka aktywności enzymatycznej katal; 1katal (kat) wywołuje w określonych warunkach reakcji przemianę 1 mola substancji w ciągu jednej sekundy. Jednostka enzymu (jednostka enzymatyczna), U (ang. unit, w pol. także J)- Jeden U to ilość enzymu katalizująca przemianę 1 μmola substratu w czasie 1 minuty. Zwykle przyjmuje się określone warunki: temperaturę 30, dane ph i maksymalne wysycenie enzymu substratem. 1 U = 1μmol/min = 1/60 μkatala = 16,67 nanokatala 16

17 Kinetyka reakcji enzymatycznych rodzaje biosensorów Sensory biocatalytic to głównie enzymy unieruchomione na powierzchni elektrody działające jako selektywne katalizatory. Enzymy katalizują powolne reakcje. Szybkość reakcji, w odpowiednich warunkach, jest ilościową miarą stężenia substratu. Jeśli próbka jest jednym z reagentów, np. jeśli jest sama próbka Podłoże, po czym czujniki chemiczne mogą być tworzone na tej podstawie. Szybkość reakcji może być mierzona jako prąd elektrolizy w biosensorach amperometrycznych. Druga grupa to bioaffinity sensors. W tym przypadku analit tworzy trwałe kompleksy z cząsteczkami w warstwie receptorowej czujnika. Ilość cząsteczek powstającego kompleksu jest ilościową miarą stężenia analitu w próbce. Może być mierzona pośrednio, od wielu właściwości. W sensorach bioaffinity wykorzystuje się głównie reakcje przeciwciałoantygen. 17

18 Wdrukowywanie molekularne (molecular imprinting) Wdrukowywanie molekularne (molecular imprinting) chemiczna metoda tworzenia warstw o wysokiej selektywności względem oznaczanego składnika. 18

19 Wdrukowywanie molekularne IhF PAN Warszawa 19

20 Literatura 1. Z. Brzózka, W. Wróblewski, Sensory chemiczne, Oficyna Wydawnicza Politechniki Warszawskiej,W-wa Pr. zbiorowa pod red Z.Brzózki Miniaruryzacjia w analityce, Oficyna Wydawnicza Politechniki Warszawskiej, W-wa J. Janata, Principles of hemical Sensors, Springer, wyd. 2, P. Gründler, hemical Sensors, An Introduction for Scientists and Engineers, Springer, P. N. Bartlett (ed.), Bioelectrochemietry, fundamentals, experimental techniques and applications, Willey & Sons, W. Szczepaniak, Metody Instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, W-wa A.J.Bard, G.Inzelt, F.Scholz, Electrochemical Dictionary Springer,

21 Dziękuje za uwagę 21