BIOLOGIA SYSTEMÓW

Transkrypt

1 BIOLOGIA SYSTEMÓW W biologii zrozumienie na poziomie systemu wymaga analizy struktury i dynamiki na poziomie komórki i organizmu, a nie oddzielnie części składowych. Stara nauka wyjaśnia obserwowane zjawiska poprzez zredukowanie ich do współuczestniczących składowych i obserwację każdej oddzielnie. Współczesna nauka dostrzega wagę całościowego spojrzenia spychając na dalszy plan podejście redukcjonistyczne. Uprawianie biologii systemów oznacza obecnie zastosowanie i integrację matematyki, inżynierii, fizyki i informatyki w celu zrozumienia złożonych biologicznych zależności. 1

2 Bazy danych sieci zależności genów i ich produktów Signal Transduction Knowledge Environment Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes BioCyc - collection of Pathway/Genome Databases (A. thaliana AraCyc MapMan KaPPA-View (A Web-Based Analysis Tool for Integration of Transcript and Metabolite Data on Plant Metabolic Pathway Maps 2

3 3

4 transkryptomika proteomika 4

5 METABOLOMIKA Moda na -omy i -omiki ( biom, CHOm, komórkom, komórkomika, chronomika, klinomika, kompleksom, krystalomika, cytomika, cytoszkieletom, degradomika, diagnomika, enzymom, epigenome, ekspresom, przepływom, foldom, sekretom, funkcjonom, funkcjonomika, genomika, glikomika, immunom, transcriptomika, integromika, interaktom, kinetom, ligandomika, lipoproteomika, lokalizom, fenomika, metabolom, farmakometabolomika, metylenom, mikrobiom, morfom, neurogenomika, nuckleom, sekretom, onkogenomika, operom, transkryptomika, ORFom, parazytom, patogenom, peptydomika, farmakogenom, farmakometylomika, fenomika, fylom, fizjogenomika, postgenomika, predyktome, polimorfom, promotorom, proteom, pseudogenom, sekretom, regulom, rezystom, rybonom, rybonomika, ryboproteomika, cukromika, sekretom, somatonom, systeom, tokisykomika, transkryptom, translatom, niewiadomon, vaccinom, wariomika... 5

6 SPOSOBY REGULACJI EKSPRESJI GENÓW 6

7 Eukaryota: -Jądro komórkowe oddzielenie transkrypcji i translacji (np. regulacja transportu mrna do cytoplazmy) -Organizmy wielokomórkowe W tym samym czasie nie jest konieczne włączanie wszystkich genów w każdej komórce. Niektóre geny musza być czynne zawsze, niektóre tylko w określonym czasie podczas rozwoju, inne w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne Regulacja genów zachodzi na wielu poziomach DNA regulacja regulacja pre-mrna mrna RNA regulacja BIAŁKO Dostępność chromatyny dla maszynerii transkrypcyjnej (acetylacja i metylacja histonów, metylacja DNA). Regulacja transkrypcji (Poprzez zróżnicowane wiązanie czynników transkrypcyjnych do sekwencji w obrębie promotorów, wzmacniaczy i represorów. 7

8 Białkowe regulatory transkrypcji Białka zaangażowane w regulację transkrypcji można podzielić na cztery funkcjonalne grupy: 1) podstawowe czynniki transkrypcyjne (GTF, ang. general transcription factor), zaangażowane w ogólny mechanizm transkrypcji, 2) wielopodjednostkowe koaktywatory lub kofaktory, 3) specyficzne czynniki transkrypcyjne (STF, ang. specific transcription factor) 4) białka remodelujące chromatynę. Podstawowe czynniki transkrypcyjne są u Eukariontów wysoce konserwowane, w odróżnieniu od czynników specyficznych i koregulatorów. Czynniki transkrypcyjne Wiele procesów biologicznych jest regulowanych między innymi na poziomie transkrypcji przez aktywację lub represję tak zwanych regulatorów transkrypcji *Ogólne czynniki transkrypcyjne działanie, rodzaje i budowa *Główne rodziny czynników transkrypcyjnych (Arabidopsis) *Omówienie przykładowych regulatorów transkrypcji 8

9 Czynniki Transkrypcyjne (Transcriptional Factor, TF): są konieczne, aby polimeraza RNA przyłączyła się do DNA oraz do rozpoczęcia transkrypcji decydują o tym, że ekspresja zachodzi we właściwej komórce, w odpowiedzi na określone warunki, w odpowiednim czasie i na wymaganym poziomie wiążą się do specjalnych obszarów występujących w promotorach tzw. sekwencji regulatorowych Ogólne czynniki transkrypcyjne *TBP (TFIID) wiąże się tylko w obecności TFIIA. Następnie przyłączają się: TFIIB, polimeraza oraz TFIIE i F. *TFIIH za pomocą ATP fosforyluje pol RNA II zmieniając jej konformację w taki sposób, że enzym może się uwolnić z kompleksu i rozpocząć transkrypcję. S. Pan

10 Dzięki różnym kombinacjom regulatorów oraz małej długości elementów cis możliwe jest selektywne regulowanie tysięcy genów poprzez stosunkowo małą liczbę czynników transkrypcyjnych. TFy tworzą zawiły układ regulacyjny, na który składają się różne oddziaływania białko białko poprzez wytworzenie PĘTLI Specyficzne TFy Ogólne TFy Benfey, Weigel

11 Czynniki transkrypcyjne: Posiadają strukturę złożoną z co najmniej dwóch domen: * domeny wiążącej DNA (DNA-binding domain) * domeny aktywującej (activation domain) Schemat budowy czynników transkrypcyjnych Klasyfikacja czynników transkrypcyjnych na podstawie budowy domeny wiążącej: Regulatory z domeną zasadową suwak leucynowy (leucine zipper) AP-1 c-jun, c-fos, MAF, CREB, G-box binding factors (GBF, TAF) Helix-loop-helix factors - cmyc NF-1 RF-X bhsh (helix-span-helix) palec cynkowy (zinc finger, Zinccoordinating DNA-binding domains) Cys4, Cys2His2, Cys6 helisa-skręt-helisa (helix-turn-helix) Homeodomena - HOXA D, Antp, HNF, POU Paired box Fork head / winged helix Heat shock factors - HSF Tryptophan clusters MYB, MYB-like, Ets-type TEA domain rusztowanie beta (beta-scaffold Factors with Minor Groove Contacts) RHR (Rel homology region) - Rel/ankyrin, NF-AT, NF-kappaB2 STAT p53 MADS-box beta-barrel alpha-helix transcription factors E2, EBNA TATA-binding proteins - TBP HMG SRY, SOX, TCF, HMG, UBF, MATA Heteromeric CCAAT factors CP1 Grainyhead Cold-shock domain factors Runt Runt, PEBP, Lozenge INNE AP2/EREBP-related factors AP2, ANT, ABI, DREB, EREBP, AP2/B3 (RAV) Pocket domain Copper fist proteins 11

12 Suwak leucynowy Domena - 35 aa Wiązanie białka do DNA następuje tylko w formie dimeru. Leucyny wystepują w α-helisie w regularnych odstępach (co 7 pozycja), Reszty hydrofobowe leucyn tworzą szczeble C-końce cząsteczek splatają się ze sobą za pomocą oddziaływań reszt leucynowych, natomiast rozdzielone N- końce wsuwają się w dużą bruzdę DNA rola: stabilizacja cząsteczki za pomocą wiązań hydrofobowych i oddziaływań van der Waalsa Palec cynkowy Domena zbudowana z około 30 aa Zn 2+ wiąże się z resztami cysteiny i histydyny za pomocą wiązań koordynacyjnych rola Zn 2+ : stabilizacja cząsteczki 12

13 Palec cynkowy Budowa przestrzenna: α- helisa i spinka β α-helisa aminokwasy tworzą wiązania wodorowe z dużym rowkiem DNA HTH - Homeodomena HD składa się z 60 aa, z dużą przewagą aa zasadowych Helisa 3 biegnie prostopadle do helis 1 i 2. Ramię służy do oddziaływania z małym, a helisa 3 z dużą bruzdą DNA 13

14 beta-scaffold (MADS-box z elementem CArG-box) 14

15 Porównanie wielkości genomów i liczby genów kodujących TF-y u trzech organizmów modelowych organizm rozmiar genomu (Mbp) całk. liczba genów liczba genów kod. TF % genów kod. TF % TF genet. scharakt. A.thaliana ~1 700 ~6 7!!! C.elegans ~500 ~3 20 D.melanogaster ~700 ~5 25 J.L. Riechmann, O.J. Ratcliffe 2000 Główne rodziny czynników transkrypcyjnych u roślin Regulatory transkrypcji u Arabidopsis thaliana można podzielić na 29 podstawowych klas, z których 16 jest prawdopodobnie specyficznych tylko dla świata roślin Rodzina MYB (180) AP2/EREBP (150) NAC (105) bzip (100) HB (90) Funkcje genów wtórne przemiany metaboliczne; morfogeneza komórkowa, przekazywanie sygnałów, odpowiedzi na biotyczne i abiotyczne stresy, zegar biologiczny rozwój kwiatów, różnicowanie komórek, wtórne przemiany metab., odpowiedzi na biotyczne i abiotyczne stresy, odpowiedź na ABA i etylen rozwój, tworzenie wzorów tkankowych i separacja liścieni ekspresja genów zw. z magaz. sub. zapas. nasion, fotomorfogeneza, rozwój liści i kwiatów, odpowiedź obronna i na ABA, biosynteza giberelin rozwój (liści, korzeni, międzywęźli, zalążków), utrzymanie charakteru kom. macierzystych, różnicowanie komórek, akumulacja antocjanów, śmierć komórki J.L. Riechmann, O.J. Ratcliffe

16 Główne rodziny czynników transkrypcyjnych u roślin Rodzina Funkcje genów Z-C 2 H 2 (85) rozwój ( liści, korzeni, międzywęźli, zalążków), utrzymanie charakteru kom. macierzystych, różnicowanie komórek, akumulacja antocjanów, śmierć komórki MADS (80) rozwój kwiatów, owoców, korzeni, kwitnienie WRKY (75) ARF-AUX/IAA (42) DOF (41) odpowiedzi obronne odpowiedź na auksyny, rozwój, wzór merystemu kwiatowego kiełkowanie nasion, metabolizm węgla, rozwój endospermu YABBY rozwój słupka, oś apikalno-bazalna, rozwój zarodka J.L. Riechmann, O.J. Ratcliffe 2000 Mechanizmy zmian epigenetycznych Park & Pfeifer 2003, Nature Genetics 34:126 16

17 TGS Wyciszanie genów u eukariontów może być związane z tworzeniem heterochromatyny, która blokuje transkrypcję. H. powstaje poprzez metylację cytozyn w DNA, metylację lizyny 9 w sekwencji histonu H3 (H3 Lys 9) i specyficzne wiązanie białka heterochromatynowego HP1 do zmetylowanej lizyny 9. 17

18 epimutacje Linaria vulgaris Lnica pospolita 18

19 Regulacyjna rola RNA wyciszanie genów Wyciszanie genów polega na inaktywacji ekspresji genów, może dotyczyć transgenów, transpozonów, genów endogennych i wirusowych Wyciszanie genów może być efektem zmniejszenia poziomu lub całkowitego zahamowania transkrypcji lub w przypadku, kiedy zaszła synteza RNA, efektem degradacji specyficznych, homologicznych sekwencji RNA w cytoplazmie GEN transkrypcja transkrypcja RNA RNA degradacja białko translacja 19

20 Wyciszanie genów, podobnie jak i ich regulacja może odbywać się na poziomach: transkrypcji (transcriptional gene silencing, TGS) posttranskrypcyjnym (post-transcriptional gene silencing, PTGS) Regulacyjna rola RNA wyciszanie genów W 1969 Britten i Davidson jako pierwsi postulowali że regulacja ekspresji genów (włączanie i wyłączanie) opiera się na parowaniu zasad regulacyjnego RNA (Science 165, 349). Wraz z odkryciem białkowych reg. transkrypcji (których jest około 1850 u H.s.) koncepcję porzucono. Obecnie obserwujemy powrót do tej koncepcji mając wiele dowodów na to, że srna (small RNA) regulują ekspresję genów u roślin i zwierząt. Są to cząsteczki nt. Są transkrybowane przez RNA Pol. II, IV i V 20

21 Pośród srna wyróżniamy (jest to podział opierający się raczej na pochodzeniu niż funkcji):: micrornas (mirnas) powstają ze spinek na jednoniciowych prekursorach poprzez cięcie nukleolityczne przez RNazę III Dicer i mogą pośredniczyć w cięciu transkryptów docelowych przez enzym zbliżony do RNAzy H - Argonaute poprzez rozpoznawanie specyficznych sekwencji. mirna może również hamować translację docelowych mrna. Parowanie jest zwykle niedoskonałe. Występuje jedynie u roślin, zwierząt i w ich wirusach. small interfering RNAs (sirnas) powstają z dłuższych dwuniciowych cząsteczek dsrna przy pomocy enz. Dicer. Parowanie musi być idealne. sirna mogą pośredniczyć w cięciu innych transkryptów lub mogą inicjować syntezę drugiej nici RNA prez RdRP (RNAdependent RNA polymerase) pozwalając na dalszą produkcję dsrna. Dodatkowo sirna uczestniczyć może w modyfikacji heterochromatyny prowdząc do wyciszania transkrypcyjnego. Występują u wszystkich zbadanych eukariontów. Repeat associated small interfering RNAs (rasirnas) Tylko mirna podejrzewane jest o regulację co najmniej 1/3 genów ludzkich Wyciszanie z udziałem RNA (RNA silencing) PTGS : * interferencja RNA (RNA interference, RNAi) - zwierzęta, * kosupresja (co-suppression) - rośliny * tłumienie (quelling) - grzyb Neurospora crassa 21

22 Kosupresja - supresja sekwencją sensową - mechanizm inaktywujący zarówno transgen jak i homologiczny gen endogenny transformacja petunii genem syntazy chalkonowej (Napoli, Lemieux, Jorgensen 1990, Van der Krol i in. 1990) Genetyczne uwarunkowania posttranskrypcyjnego wyciszania genów Model progowy RNA (ang. treshold model). Model oparty na oddziaływaniach homologicznych sekwencji kwasów nukleinowych oparty na zdolności komórek do wykrywania cząsteczek RNA, których liczba przekraczała dopuszczalny poziom 22

23 Model progowy PTGS Waterhouse PM, Smith NA and Wang MB, 1999 Model oparty na oddziaływaniach homologicznych sekwencji kwasów nukleinowych (RNA-induced silencing complex) 23

24 mirna mirna (ang. micro-rna) krótkie, jednoniciowe cząsteczki RNA, o długości nukleotydów, Regulacja ma charakter negatywny DNA, z którego produkowane jest prekursorowe pre-mirna znajduje się najczęściej w rejonach międzygenowych, rzadziej w intronach czy sekwencjach kodujących. ten sposób regulacji dotyczy między innymi wielu czynników transkrypcyjnych należących do rodzin: MYB, AP2, NAC, GRAS, SBP oraz WRKY, U roślin cząsteczki mirna wykazują pełną lub prawie pełną komplementarność do sekwencji docelowych. Poznano dwa mechanizmy regulacji przez mirna. Transkrypty docelowe: Albo po rozpoznaniu przez mirna podlegają degradacji Albo nie dochodzi do translacji w wyniku związania się mirna z 3 UTR mrna 24

25 Zamore i Haley

26 Represja AP2 przez mirna172 26

27 Konstytutywna ekspresja MIR172 z promotora 35S powoduje powstanie fenotypu mutanta ap2. Wysoki poziom ekspresji MIR172 we wszystkich typach komórek zapobiega działaniu AP2. 27

28 MIR172 ogranicza aktywność AP2 do 1 i 2 okółka. Aktywność AG jest zahamowana w 1 i 2 okółku, ale może mieć miejsce w 3 i 4. Ekspresja zmutowanych form mrna dla AP2 o zmniejszonym podobieństwie do MIR172 prowadzi do zwiększenia ilości płatków korony i okółków. 28

29 mirna172a-2 działa hamująco na AP2 na poziomie translacji Model czasowej regulacji kwitnienia przy udziale mirna172 29

30 W wyniku MPSS rzodkiewnika [C. Lu et al., Science 309, 1567 (2005)] otrzymano: Ponad sekwencji srna reprezentujących różnych Pasują do 15% genów obecnie szacuje się, że 2% jest regulowane przez mirna Większość pasuje do sekwencji powtarzalnych i transpozonów Złożoność populacji srna w kwiatostanach rzodkiewnika 2x większa niż w 2-tyg. siewkach konieczność wyciszenia transpozonów w germplazmie lub po prostu więcej różnych typów komórek Możliwy udział w wyciszaniu pseudogenów Możliwy udział w NMD (nonsense mediated decay) Powszechny udział w tworzeniu heterochromatyny wątpliwy 30

31 Udział srna w różnych komponentach genomu A. thaliana. 31

32 Bez srna transpozony masowo skakałyby po genomie siejąc spustoszenie w funkcjonalnych częściach, nie pozostałyby żadne komórki macierzyste, nie mógłyby rozwijać się mięśnie i mózg, rośliny uległyby masowym infekcjom wirusowym, kwiaty przybrałyby kształt nieatrakcyjny dla pszczół, komórki nie mogłyby się dzielić z powodu niefunkcjonalnych centromerów, rozregulowane byłoby wydzielanie insuliny. Poprzez wyciszanie srna regulują transkrypcję, strukturę chromatyny, integralność i stabilność genomu i najczęściej trwałość mrna. 32

33 Mechanizmy regulujące stabilność mrna 1) 3-5 : deadenylacja > egzosom 2) 5-3 : decaping/processing bodies > egzorybonukleaza 3) interakcje z NMD i wyciszaniem U A. thaliana: Okres półtrwania mrna: 0,2 do >24godz. Średnio 5,8 godz 5 i 3 UTRy zawierają konserwowane elementy związane ze stabilnością mrna Geny zawierające przynajmniej jeden intron dają bardziej stabilne mrna 33

34 Deadenylation: PARN, CCR4/CAF1 (polya ribonuclease complex); PAN (polya nuclease) Belostosky i Sieburth(2009) Nonsense-Mediated Decay Nonsense-mediated mrna decay (NMD) to mechanizm nadzoru mrna zapewniający szybką degradację cząsteczek zawierających przedwczesne kodony terminacji translacji (PTCs) lub zbyt długi 3 UTR, zapobiegający syntezie skróconych i potencjalnie szkodliwych białek. Mechanizm ten reguluje ekspresję ok. 10% transkryptomu i ma kluczowe znaczenie w rozwoju myszy. 34

35 PTC definiowany jest w sposób zależny od translacji polegający na wymianie informacji pomiędzy przystopowanym na kodonie rybosomem i położonymi w stronę 3 sygnałami cis na mrna. Efektem jest uruchomienie odległych (trans) czynników NMD, prowadzące do powstania kompleksu nadzorującego, który indukuje degradację mrna. 35

36 Model for the role of human SMG7 in NMD. Phosphorylation of UPF1 as a result of a premature translation termination event leads to the recruitment of SMG7 via a specific interaction with its like domain. SMG7 then targets the bound mrna for decay via its C-terminal domain. Decay may occur in the cytoplasm or in P- bodies. SMG7 also recruits PP2A, resulting in UPF1 dephosphorylation and dissociation from the like binding site. This enables the recycling of these proteins for a new round of NMD [27,28,30,59]. rybozymy 36

37 FIGURE 12-9 Model of spliceosome-mediated splicing of pre-mrna. Step : After U1 and U2 snrnps associate with the pre-mrna, via base-pairing interactions shown in Figure 12-8, a trimeric snrnp complex of U4, U5, and U6 joins the initial complex to form the spliceosome. Step : Rearrangements of basepairing interactions between snrnas converts the spliceosome into a catalytically active conformation and destabilizes the U1 and U4 snrnps, which are released. Step : The catalytic core, thought to be formed by U6 and U2, then catalyzes the first transesterification reaction, forming the intermediate containing a 2,5-phosphodiester bond shown in Figure Step : Following further rearrangements between the snrnps, the second transesterification reaction joins the two exons by a standard 3,5-phosphodiester bond and releases the intron as a lariat structure and the remaining snrnps. Step : The excised lariat intron is converted into a linear RNA by a debranching enzyme. [Adapted from T. Villa et al., 2002, Cell 109:149.] 37

38 Fig. 1. (A) The lariat mechanism for self-splicing group II introns. Step 1, 2 -hydroxyl attacks intron terminus. Step 2, Exons are ligated together. (B) Branching creates a circular cap for mrna in D. iridus. ORF, open reading frame. FIGURE Schematic diagrams comparing the secondary structures of group II self-splicing introns (a) and U snrnas present in the spliceosome (b). The first transesterification reaction is indicated by green arrows; the second reaction, by blue arrows. The branch-point A is boldfaced. The similarity in these structures suggests that the spliceosomal snrnas evolved from group II introns, with the trans-acting snrnas being functionally analogous to the corresponding domains in group II introns. The colored bars flanking the introns in (a) and (b) represent exons [Adapted from P. A. Sharp, 1991, Science 254:663.] 38

39 Czy wszystko jest zakodowane? Wydaje się, że roślina może w różny sposób zapamiętać (w postaci zmian genetycznych i epigenetycznych) różne zdarzenia, którym podlegało poprzednie pokolenie. 39

40 Czułość profilowania metabolitów Mutant dgd1 ma o 90% zredukowany poziom galaktolipidu digalaktosyldiacyloglicerolu (zaburzenia w fotosyntezie, nadwrażliwy na światło - poważne zmiany) Mutant sdd1-1 ma zaburzenia w rozwoju aparatów szparkowych (u mutanta zwiększona gęstość fenotyp łagodny) Dwa ekotypy są bardziej oddalone niż mutant od swojej kontroli Fiehn et al. (2000) Nature Biotech. 18: Naturalna zmienność biologiczna, a dokładność pomiaru (A. thaliana C24 wt) Substancja Średnia zawartość Zmienność biologiczna Zmienność analityczna (nmol/mg FW) (% s.d.) (% s.d.) n = 18 n = 18 n = 7 Ethylene glycol 1.2 ± Alanine 144 ± Valine 38 ± Ethanolamine 63 ± Glycerol 24 ± Leucine 25 ± Benzoic acid 0.8 ± Aspartic acid 79 ± Glutamic acid 199 ± Glucose 119 ± Sucrose 598 ± Fiehn 2000, Nature Biotechnology Vol 18 40

41 Poziom zmienności biologicznej Ruebelt i in Ruebelt i in

42 Jaką zmienność indukują kultury tkankowe? Która metoda regeneracji jest najlepsza? LC leaf callus culture CDS cytokinin dependent cell suspension LMC liquid culture of meristematic clumps Identyfikacja 78 metabolitów przez GC/MS Każdy typ kultury in vitro generuje własny, specyficzny i dziedziczny wzór zmian odzwierciedlonych przez profile metaboliczne. Filipecki i in Efekt stresu dziedziczna, zwiększona częstość rekombinacji somatycznej (Molinier i in. 2006). 42