NOWINY LEKARSKIE DWUMIESIĘCZNIK NAUKOWY UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO IM. KAROLA MARCINKOWSKIEGO W POZNANIU MEDICAL NEWS

Transkrypt

1 NOWINY LEKARSKIE DWUMIESIĘCZNIK NAUKOWY UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO IM. KAROLA MARCINKOWSKIEGO W POZNANIU MEDICAL NEWS A BIMONTHLY SCIENTIFIC JOURNAL PUBLISHED BY POZNAN UNIVERSITY OF MEDICAL SCIENCES POLAND Rok założenia Founded in (77) ISSN Indeksowane w/indexed in: Polska Bibliografia Lekarska, MNiSW Pełne teksty prac/full texts on line:

2 REDAKTOR NACZELNY EDITOR IN CHIEF prof. dr hab. Marian Grzymisławski SEKRETARZ REDAKCJI EDITORIAL SECRETARY mgr Danuta Węglewska SEKRETARIAT SECRETARY mgr Grażyna Dromirecka dr med. Włodzimierz Szczepaniak mgr Danuta Węglewska RADA NAUKOWA EDITORIAL BOARD prof. dr hab. Maria Borysewicz-Lewicka (Poznań) prof. dr hab. Grzegorz H. Bręborowicz (Poznań) prof. dr hab. Magdalena Czarnecka-Operacz (Poznań) prof. dr hab. Mieczysława Czerwionka-Szaflarska (Bydgoszcz) prof. Wolfgang Dick (Mainz Niemcy) prof. dr hab. Leon Drobnik (Poznań) prof. dr hab. Janusz Gadzinowski (Poznań) prof. dr hab. Wojciech Golusiński (Poznań) prof. dr hab. Witold Jurczyk (Poznań) prof. dr hab. Jacek Juszczyk (Poznań) prof. dr hab. Ryszard Koczorowski (Poznań) prof. UM dr hab. Tomasz Kościński (Poznań) prof. Odded Langer (Nowy Jork USA) prof. dr hab. Krzysztof Linke (Poznań) prof. Tadeusz Maliński (Athens USA) prof. UM dr hab. Roman K. Meissner (Poznań) prof. dr hab. Michał Musielak (Poznań) prof. dr hab. Leszek Paradowski (Wrocław) mgr Aniela Piotrowicz (Poznań) mgr Bogdan Poniedziałek (Poznań) prof. dr hab. dr h.c. Antoni Pruszewicz (Poznań) prof. dr hab. Kazimierz Rzymski (Poznań) prof. dr hab. Krzysztof Słowiński (Poznań) prof. dr hab. Bruno Szczygieł (Warszawa) prof. dr hab. Andrzej Szkaradkiewicz (Poznań) prof. UM dr hab. med. Jacek Szmeja (Poznań) prof. dr hab. Roman Szulc (Poznań) prof. Kai Taeger (Regensburg Niemcy) prof. dr hab. Krzysztof Wiktorowicz (Poznań) prof. dr hab. Witold Woźniak (Poznań) WYDAWCA PUBLISHER Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Copyright by Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu ADRES ADDRESS Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Metabolicznych i Dietetyki ul. Przybyszewskiego Poznań tel./fax: nowinylekarskie@ump.edu.pl ISSN Korekta: Grażyna Dromirecka Korekta tekstów w j. ang.: Jan Jaroszewski Skład i łamanie: Bartłomiej Wąsiel Czasopismo do nabycia w Punkcie Sprzedaży Wydawnictw Naukowych UMP ul. Przybyszewskiego 37a Poznań tel./fax: sprzedazwydawnictw@ump.edu.pl Redakcja deklaruje, że wersja papierowa Nowin Lekarskich jest wersją pierwotną (referencyjną). WYDAWNICTWO NAUKOWE UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO IM. KAROLA MARCINKOWSKIEGO W POZNANIU Poznań, ul. Bukowska 70 tel./fax: Ark. wyd. 14,2. Ark. druk. 13,0. Papier kreda 115 g/m 2, 64 x 90.

3 Nowiny Lekarskie 2008, 77, 4, TAMARA DANILUK 1, MAŁGORZATA ŚCIEPUK 1, KRZYSZTOF FIEDORUK 1, MARIA LUCYNA ZAREMBA 1, DOROTA ROŻKIEWICZ 2, ELŻBIETA OŁDAK 2 CZĘSTOŚĆ WYSTĘPOWANIA I WRAŻLIWOŚĆ NA ANTYBIOTYKI SZCZEPÓW ESCHERICHIA COLI I KLEBSIELLA PNEUMONIAE IZOLOWANYCH OD DZIECI HOSPITALIZOWANYCH W UNIWERSYTECKIM SZPITALU DZIECIĘCYM W LATACH PREVALENCE RATE AND ANTIBIOTIC SUSCEPTIBILITIES OF ESCHERICHIA COLI AND KLEBSIELLA PNEUMONIAE STRAINS ISOLATED FROM HOSPITALIZED CHILDREN IN THE UNIVERSITY CHILDREN S HOSPITAL DURING Zakład Mikrobiologii Uniwersytet Medyczny w Białymstoku Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. med. Maria Lucyna Zaremba 2 Klinika Obserwacyjno-Zakaźna Dzieci Uniwersytet Medyczny w Białymstoku Kierownik Kliniki: dr hab. n. med. Elżbieta Ołdak Streszczenie Cel pracy. Analiza częstości wykrywania i wrażliwości na antybiotyki szczepów Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae izolowanych od dzieci hospitalizowanych w Uniwersyteckim Szpitalu Dziecięcym w Białymstoku w latach Materiał i metody. Z próbek materiałów klinicznych od hospitalizowanych dzieci wyosobniono i zidentyfikowano łącznie 4558 szczepów E. coli i 475 K. pneumoniae. Wrażliwość na antybiotyki oceniano metodą krążkowo-dyfuzyjną, a do wykazania β-laktamazy typu ESBL stosowano specyficzne testy fenotypowe (DDST, kombinacje metody krążkowej i/lub Etest ESBL). Wyniki. Około 40% szczepów E. coli było wrażliwych na wszystkie antybiotyki, 20% było opornych tylko na ampicylinę i 40% na ampicylinę i/lub inne klasy antybiotyków. Szczepy ESBL(+) występowały z częstością 2,6% (120/4558) wśród E. coli i 24,4% (116/475) wśród K. pneumoniae. Szczepy ESBL(+) E. coli i K. pneumoniae często były wielooporne; odpowiednio 69,2% i 79,3%. Oporność na ciprofloksacynę istotnie częściej stwierdzano wśród szczepów E. coli ESBL(+) niż ESBL( ). Tylko jeden szczep E. coli izolowany w 2006 roku był oporny na imipenem (MBL+) i wytwarzał β-laktamazę typu ESBL. Szczepy ESBL(+) najczęściej izolowano z próbek materiałów od dzieci leczonych na oddziałach onkologii, intensywnej terapii i dziecięcym zakaźnym. Wnioski. 1. Generalnie wykazano niską częstość szczepów E. coli i K. pneumoniae opornych na różne klasy antybiotyków i jeszcze niższą częstość szczepów wieloopornych wśród tych gatunków. 2. W ostatnich latach odnotowano jednak wzrost częstości szczepów Klebsiella pneumoniae ESBL(+) i Escherichia coli ESBL(+) wieloopornych, w tym z opornością na ciprofloksacynę. SŁOWA KLUCZOWE: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, lekooporność, ESBL. Summary Aim of the study. Analysis of frequencies and antibiotic susceptibilities of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae strains isolated from hospitalized children in the University Children s Hospital during Material and methods. A total of 4558 Escherichia coli and 475 Klebsiella pneumoniae strains from various clinical specimens obtained from hospitalized children were isolated and identified. Antibiotic susceptibility with disk diffusion methods and specific phenotypes tests (DDST and combination disk method and/or ESBL Etest) were used to detect ESBL types of β-lactamases. Results. About 40% strains of E. coli were sensitive to all tested antibiotics, 20% were resistant to ampicillin only, and 40% were resistant to ampicillin and/or other group of antibiotics. ESBL(+) types were found in 120 (2.6%) E. coli and in 116 (24.4%) K. pneumoniae isolates. ESBL producing strains of E. coli and K. pneumoniae were frequently multidrug resistant (MDR); 69.2% and 79.3% respectively. Resistance to ciprofloxacin was significantly (p < 0.05) higher in ESBL(+) than ESBL( ) of E. coli isolated from hospitalized children (mainly from ICU, oncology and children infectious diseases wards). Except of one E. coli strain (2006), no carbapenem resistant isolates in examined strains were observed. Conclusions. 1. Generally, low frequencies of E. coli and K. pneumoniae strains with resistance to various classes of antibiotics were observed, and even lower frequency of multidrug resistance among strains of these species. 2. However, lately increased frequency of multidrug resistant strains of K. pneumoniae ESBL(+) and E. coli ESBL(+), including those resistant to ciprofloxacin were found. KEY WORDS: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, drug resistance, ESBL. Wstęp Liczne gatunki rodzajów z rodziny Enterobacteriaceae są rozpowszechnione w środowisku naturalnym i wy- stępują w przewodzie pokarmowym zwierząt i człowieka, a kilka z nich, w tym Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae, są dominującymi i uznanymi patogenami w zakażeniach pozaszpitalnych i szpitalnych [1 5].

4 266 Tamara Daniluk i inni Gatunek Escherichia coli należy do stałych mikrobiontów jelita zdrowych ludzi, jednak liczne szczepy mogą wywoływać pozajelitowe i jelitowe zakażenia zarówno u zdrowych osobników (kompetentnych), jak i z obniżoną odpornością (ang. immunocompromised) [1, 2, 4, 5]. Zakażenia dróg moczowych, bakteriemia, zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i choroba biegunkowa są najczęstszymi zespołami chorobowymi, które są wywołane przez ograniczoną liczbę patogennych klonów E. coli [2, 4 10]. Pałeczki Escherichia coli oprócz zakażeń dróg moczowych (cystitis, pyelonephritis) wywołują zakażenia wewnątrzbrzuszne (cholangitis/cholecystitis, appendicitis, peritonitis i inne), często też uczestniczą w zapaleniach płuc i bakteriemiach, zwłaszcza szpitalnego pochodzenia oraz w zapaleniach opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków i niemowląt i rzadziej w ropnych zakażeniach z inną lokalizacją [2, 5]. Escherichia coli była dominującym czynnikiem wśród wszystkich nabytych w szpitalach w USA zakażeniach dróg moczowych (25 26%) [1, 7, 8]. Prawie 6,5% 10% zakażeń śródchirurgicznych lub ran było również wywołanych przez E. coli, co jest zbliżoną częstością do Pseudomonas aeruginosa (8,1% 9,5%). Pałeczki E. coli są również najczęściej izolowane z krwi (około 3 5%) wśród innych gatunków Enterobacteriaceae oraz zajmują czwarte miejsce wśród Gram-ujemnych bakterii; w tych zakażeniach dominują Coag NS (29 43%), S. aureus (14 16%) i Enterococcus spp. (9 14,5%) [1, 7]. Pałeczki Klebsiella pneumoniae wywołują u ludzi zakażenia w szerokim zakresie od bezobjawowej kolonizacji jelitowej, dróg moczowych i oddechowych do zapalenia płuc, posocznicy i zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych o przebiegu śmiertelnym [1, 3, 5, 7 10]. Z badań NNISS (National Nosocomial Infections Surveillance System) w USA wiadomo, że Klebsiella pneumoniae znajduje się pomiędzy miejscem piątym a siódmym wśród licznych czynników szpitalnych zakażeń układu moczowego, łożyska krwi i układu sercowo-naczyniowego oraz zakażeń dróg oddechowych [7, 8]. Na miejscu drugim (7,2%) bakterie te znajdują się wśród czynników zapalenia płuc nabytego w szpitalu, a E. coli w tej lokalizacji szacowana jest na miejscu trzecim (5,0%); zakażenia Enterobacter spp. w szpitalnych zapaleniach płuc są dominujące (10,0%). Pomimo że Klebsiella pneumoniae wywołuje bakteriemię/posocznicę cztery do 10 [7, 8] razy rzadziej niż bakterie Gram-dodatnie, to takie zakażenia dwukrotnie częściej kończą się zgonem pacjentów [3, 9]. Pałeczki Klebsiella mogą wywoływać zakażenia śródoperacyjne i pooperacyjne, szacowane na 68%; częstość ta dla Escherichia coli lub Staphylococcus aureus określona była przez Twum-Danso i wsp. [10] odpowiednio na 31% i 55%. Pałeczki Klebsiella w 1997 roku były odpowiedzialne za 7% zakażeń dróg moczowych w Europie [11] i 12% w Ameryce Północnej [12], a w roku 2003 około 10% zakażeń szpitalnych w USA z taką lokalizacją wywołanych było przez K. pneumoniae [7]. Ze względu na ciężki przebieg zakażeń, niekiedy zagrażających życiu, wywoływanych przez E. coli i K. pneumoniae, zwłaszcza posocznicy (sepsis), zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i zapalenia płuc, które często są nabywane podczas hospitalizacji [1, 5, 7 10], istotne znaczenie mają badania bakteriologiczne połączone z izolacją, identyfikacją i oceną wrażliwości tych bakterii na chemioterapeutyki [13, 14, 15]. Zakażenia z udziałem tych dwóch gatunków często są epidemiczne i wywoływane przez szczepy oporne na większość antybiotyków β-laktamowych, z mechanizmem wytwarzania beta-laktamazy o szerokim spektrum substratowym znanym jako typ ESBL i niekiedy z opornością także na inne grupy chemiczne antybiotyków (szczepy wielooporne) [5, 11 16]. Epidemiczne zakażenia wieloopornymi szczepami E. coli i K. pneumoniae występują często na oddziałach intensywnej opieki (ICU), w tym na oddziałach wcześniaków, noworodkowych i niemowlęcych oraz dziecięcych oddziałach onkologicznych [5, 7 9, 17]. Celem obecnej pracy była retrospektywna analiza częstości wykrywania i wrażliwości na antybiotyki szczepów Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae izolowanych od dzieci leczonych w Uniwersyteckim Szpitalu Dziecięcym w Białymstoku w latach Materiał i metody W latach wykonano badań próbek materiałów klinicznych pochodzących od dzieci leczonych w różnych oddziałach szpitalnych Uniwersyteckiego Szpitala Dziecięcego Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku. Z (56,5%) próbek wyosobniono łącznie szczepów bakteryjnych, wśród których 7790 (44,8%) należało do rodziny Enterobacteriaceae. Łącznie 4558 szczepów zidentyfikowano jako należące do gatunku Escherichia coli (4558/7790; 58,5%) i 475 (6,1%) do gatunku Klebsiella pneumoniae. Do hodowli bakterii stosowano standardowe procedury. Identyfikację pałeczek Gram-ujemnych do poziomu gatunku prowadzono w oparciu o konwencjonalne biochemiczne testy i komercyjne identyfikacyjne zestawy API 20E dla automatycznego systemu ATB Expression (bio-mérieux). Wrażliwość na antybiotyki oceniano metodą dyfuzyjnokrążkową przy użyciu krążków firmy BBL, Becton- Dickinson. Szczepy klasyfikowano jako wrażliwe lub oporne (włączono kategorię średniowrażliwych) według kryteriów CLSI [13, 18], wcześniej znane jako NCCLS [13]. Do kontroli jakości wykorzystano referencyjne szczepy ATCC (American Type Culture Collection): Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli ATCC oraz Klebsiella pneumoniae ATCC (dla potwierdzenia szczepów wytwarzających ESBL). Zdolność wytwarzania enzymów ESBL przez szczepy badano przy użyciu testu DDST (double-disk synergy test), stosując krążki z cefotaksymem (30 µg), ceftazydymem (30 µg), aztreonamem (30 µg) oraz amoksycyliną z kwasem klawulanowym (20/10 µg) [13, 14, 18]. Dla każdego szczepu ESBL(+) w teście DDST wykonano test potwierdzający według CLSI (CDM; combination disk method), z krążkami z cefotaksymem (CTX) (30 µg) i ceftazydymem (CAZ) (30 µg) oraz w połączeniu z kwasem klawulanowym (CTX/CLA i CAZ/CLA) [14].

5 Częstość występowania i wrażliwość na antybiotyki szczepów Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae 267 Stosowano też Etesty ESBL oraz Etest MBL (AB Biodisk, Solna, Szwecja) [13, 14]. Analizę statystyczną wykonano przy użyciu programu Statistica 8.0. Do wykazania różnic istotnych statystycznie stosowano test χ 2 i poziom istotności p = 0,05. Wyniki Z łącznej liczby 4558 szczepów Escherichia coli wyizolowanych w latach (82,4%) wyosobniono z próbek kału (53,7%) od dzieci hospitalizowanych z powodu ostrej biegunki pozaszpitalnej i z moczu (28,7%) od dzieci leczonych z powodu infekcji dróg moczowych (tab. 1.). Tylko 82 (1,8%) szczepy E. coli izolowano z ropy (77/4558; 1,7%) i krwi (5/4558; 0,1%). Jeden tylko szczep E. coli wyosobniono spośród 359 (0,02%) próbek badanych płynu mózgowo-rdzeniowego (1/114; 0,9% 2005 rok). Szczepy E. coli izolowano również z wymazów z rurek tracheostomijnych (57/4558; 1,3%) od dzieci hospitalizowanych w oddziale intensywnej opieki medycznej (OIT). W kolejnych latach nie odnotowano zwiększonej ogólnej liczby izolowanych szczepów E. coli (tab. 1). W roku 2007 w porównaniu do roku 2004 znamiennie częściej E. coli izolowano z treści ropnej (p = 0,0054; p < 0,05), natomiast istotny statystycznie spadek w kolejnych latach dotyczył częstości izolacji tych bakterii z jamy nosowo-gardłowej (139 szczepów; 12,3% w roku 2004 i 58; 5,2% w roku 2007) (p = 0,00000; p < 0,05). Pałeczki z gatunku Klebsiella pneumoniae, podobnie jak i Escherichia coli, najczęściej izolowane były z próbek kału (40%), moczu (20%), wymazów z gardła (18,1%) oraz rurki tracheostomijnej (11,2%) (tab. 1.). Łącznie wyizolowano 475 szczepów tego gatunku, wśród których 424 szczepy (89,3%) pochodziły z tych czterech materiałów. Pozostałe szczepy wyosobniono z płynu mózgowordzeniowego (8/359 próbek 2,2%; 7/114 6,1% w 2005 Tab. 1. Częstość występowania Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae w próbkach materiałów klinicznych od dzieci hospitalizowanych w latach Table 1. The prevalence of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates in clinical samples of children hospitalized during Razem Materiały kliniczne E. coli K. pneumoniae E. coli K. pneumoniae Płyny ustrojowe: (30,5%) krew (0,1%) płyn mózgowo rdzeniowy (0,02%) mocz * * * 1306 (28,7%) ropa 11* * 0 77 (1,7%) Wymazy: (14,5%) gardło * * 316 (6,9%) nos (0,6%) rurka 16 24* * 57 tracheostomijna (1,3%) pochwa (3,3%) inne ,4%) Kał * * * 2449 (53,7%) Inne (1,3%) Razem (100%) E. coli K. pneumoniae E. coli K. pneumoniae E. coli K. pneumoniae 106 (22,3%) 1 (0,2%) 8 (1,7%) 95 20,0%) 2 (0,4%) 171 (36,0%) 86 (18,1%) 10 (2,1%) 53 (11,2%) 14 (2,9%) 8 1,7%) 190 (40,0%) 8 (1,7%) 475 (100%) * p < 0,05

6 268 Tamara Daniluk i inni roku), wymazów z pochwy (14/1195 1,2%), z nosa (10/1012 1,0%) i innych. Sporadycznie K. pneumoniae były izolowane z krwi (1/2076 prowadzonych hodowli krwi; 0,05%) i z treści ropnej (2/716 próbek; 0,3%). Zwraca uwagę istotnie statystyczny spadek częstości izolacji K. pneumoniae z próbek moczu w 2006 roku (11/98 11,2%) w porównaniu z pierwszym analizowanym 2004 rokiem (38/154 24,7%) (p < 0,05). Istotnie statystycznie częściej szczepy K. pneumoniae były izolowane w 2004 roku (41/154; 26,6%) również z wymazów z gardła w porównaniu do 2007 roku (12/120 10%) (p = 0,0005; p < 0,05) (tab. 1.). Wśród 4558 szczepów E. coli 1786 (39,2%) było wrażliwych na wszystkie antybiotyki stosowane w badaniach, a 904 (19,8%) wykazywało oporność tylko na ampicylinę (tab. 2). Odnotowano istotnie statystyczny spadek częstości występowania szczepów E. coli opornych tylko na ampicylinę w roku 2007 (107/1116 9,6%) w porównaniu do lat wcześniejszych (p = 0,0000; p < 0,05) i wzrost oporności na ampicylinę i/lub inne antybiotyki (57,9%) w porównaniu do lat wcześniejszych (33,9% 37,7%) (tab. 2.). U 1868 (41%) szczepów E. coli wykazano oporność na ampicylinę i/lub inne antybiotyki. W latach wyosobniono łącznie 120 (2,6%) szczepów E. coli wytwarzających β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL), wśród których 29 (24,2%) nie było wrażliwych na skojarzony preparat amoksycyliny z kwasem klawulanowym. Wśród wszystkich ESBL(+) E. coli 88 (70,4%) było z opornością również na inne niż β-laktamy klasy antybiotyków (szczepy wielooporne MDR; multidrug resistance). Statystycznie częściej szczepy ESBL-dodatnie (ESBL(+)) wykrywano w 2005 roku (50/1222 4,1%) w porównaniu do roku 2006 (18/1091 1,6%) i 2007 (21/1116 1,9%) (tab. 1. i 3.). Szczepy E. coli wytwarzające betalaktamazy ESBL izolowano najczęściej z moczu (30%), kału (28,3%), wymazów z gardła (18,3%) i rurki tracheostomijnej (8,3%). Wśród 5 szczepów E. coli izolowa- Tab. 2. Lekooporność szczepów Escherichia coli wyizolowanych z próbek materiałów klinicznych w latach Table 2. The drug resistance of Escherichia coli strains isolated from clinical samples during Rok Liczba szczepów Wrażliwe na wszystkie antybiotyki Oporne tylko na ampicylinę Oporne na ampicylinę i/lub inne antybiotyki (40,3%) *248 (21,9%) *426 (37,7%) (40,6%) *312 (25,5%) *414 (33,9%) (43,3%) *237 (21,7%) *382 (35,0%) (32,5%) *107 (9,6%) *646 (57,9%) Razem (39,2%) 904 (19,8%) 1868 (41,0%) * p < 0,05 Tab. 3. Szczepy Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae wytwarzające β-laktamazy typu ESBL Table 3. ESBL-producing strains of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Materiały kliniczne E. coli Razem K. pneumoniae E. coli K. pneumoniae Płyny ustrojowe: krew płyn mózgowo rdzeniowy mocz ropa Wymazy: gardło nos rurka tracheostomijna pochwa inne Kał Inne Razem E. coli K. pneumoniae E. coli K. pneumoniae E. coli K. pneumoniae

7 Częstość występowania i wrażliwość na antybiotyki szczepów Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae 269 nych z krwi 3 z nich były ESBL (+). Piętnaście szczepów E. coli ESBL (+) pochodziło z próbek innych materiałów, takich jak: treść ropna, wymazy z nosa, pochwy i płyn mózgowo-rdzeniowy. Wśród ogólnej liczby 475 szczepów Klebsiella pneumoniae wyizolowanych w latach (24,4%) wytwarzało enzymy ESBL (tab. 3). Szczepy K. pneumoniae ESBL(+) izolowano najczęściej z wymazów z rurek tracheostomijnych (31,9%), z moczu (17,2%), wymazów z gardła (16,4%) oraz kału (17,2%). Pozostałe szczepy (20/116; 17,2%) izolowano z płynu mózgowordzeniowego (3x), ropy (2x), wymazów z nosa (6x) i innych materiałów (9x). Wszystkie szczepy K. pneumoniae ESBL(+) charakteryzowały się opornością na ampicylinę, cefazolinę, cefuroksym, cefotaksym i aztreonam (tab. 4.). Oporność na ceftazydym stwierdzono wśród 90 (77,6%) szczepów, a oporność na Augmentin u 35 (30,2%); szczepy te wytwarzały β-laktamazy oporne na inhibitor. Odsetki szczepów opornych na antybiotyki inne niż betalaktamowe były istotnie statystycznie wyższe dla szczepów K. pneumoniae ESBL(+) w porównaniu do szczepów K. pneumoniae ESBL( ). Dotyczyło to oporności na gentamycynę, amikacynę, doksycyklinę i trimetoprim/sulfametoksazol (SXT). Trzy szczepy Klebsiella pneumoniae ESBL(+) oporne na ciprofloksacynę (2,6%) wyosobniono z rurek tracheostomijnych (2x) i wymazu z gardła (1x) tylko w 2007 roku. Nie stwierdzono występowania szczepów opornych na karbapenemy. Wśród 116 szczepów K. pneumoniae ESBL(+) 92 (79,3%) były wielooporne (MDR); oporność dotyczyła nie tylko antybiotyków β-laktamowych, ale również gentamycyny, amikacyny i SXT (56/92; 60,9%) lub dodatkowo jeszcze oporności na doksycyklinę (30/92; 32,6%). Dwa szczepy MDR K. pneumoniae ESBL(+) były oporne na wszystkie antybiotyki β-laktamowe łącznie z ceftazydymem, SXT i doksycykliną, a jeden szczep był oporny na β-laktamy (bez ceftazydymu), gentamycynę i doksycyklinę. Trzy szczepy K. pneumoniae ESBL(+) oporne na ciprofloksacynę były oporne na wszystkie uwzględnione w badaniach klasy antybiotyków, tj. β-laktamowe, aminoglikozydowe, tetracykliny i trimetoprim/sulfametoksazol (SXT); szczepy te były wrażliwe na cefoksytynę, amoksycylinę w skojarzeniu z kwasem klawulanowym (Augmentin) oraz na imipenem. Szczepy K. pneumoniae ESBL( ), które były w 100% oporne na ampicylinę w 93,6% odzyskiwały wrażliwość na skojarzony preparat amoksycylinę i kwas klawulanowy (Augmentin). Wykazano oporność na cefazolinę (3,3%), gentamycynę i amikacynę (po 5%) oraz na doksycyklinę (12%) i na SXT (27,3%) (tab. 4.). Wszystkie szczepy K. pneumoniae ESBL( ) były wrażliwe na ciprofloksacynę i imipenem oraz na cefalosporyny II i III generacji i na aztreonam. Wszystkie szczepy E. coli ESBL(+) były oporne na ampicylinę, cefazolinę, cefuroksym, cefotaksym i aztreonam (tab. 4). Wśród 120 szczepów ESBL(+) E. coli 10 (8,3%) było wrażliwych na ceftazydym. Ponadto, 83 (69,2%) szczepy E. coli ESBL(+) były MDR z różnymi wzorami oporności na co najmniej trzy różne klasy chemioterapeutyków, wśród których 12 (14,5%) było opornych na ciprofloksacynę. Siedem szczepów opornych na ciprofloksacynę było także opornych na doksycyklinę i SXT, u 3 występowała oporność na aminoglikozydy i SXT i u pojedynczych oporność na gentamycynę i amikacynę (aminoglikozydy) lub na doksycyklinę. Jeden szczep oporny na imipenem był jednocześnie oporny na doksycyklinę i SXT; był wyosobniony z moczu dziewczynki leczonej w klinice z powodu zakażenia dróg moczowych. Wszystkie ESBL(+) E. coli były hamowane przez cefoksytynę i w 75,8% przez kwas klawulanowy (amoksycylina + kwas klawulanowy) (tab. 4.). Tab. 4. Porównanie wzorów lekooporności szczepów Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae Table 4. Comparison of drug resistance patterns of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae strains Liczba (%) szczepów opornych Chemioterapeutyk ESBL (+) ESBL ( ) E. coli K. pneumoniae E. coli K. pneumoniae (n = 120) (n = 116) (n = 1748) (n = 359) Ampicylina 120 (100,0) 116 (100,0) 1184 (67,7) 359 (100,0) Amoksycylina/ 29 (24,2) 35 (30,2) 8 (0,5) 23 (6,4) kwas klawulanowy Cefazolina 120 (100,0) 116 (100,0) 8 (0,5) 12 (3,3) Cefuroksym 120 (100,0) 116 (100,0) 0 0 Cefotaksym 120 (100,0) 116 (100,0) 0 0 Ceftazydym 110 (91,7) 90 (77,6) 0 0 Aztreonam 120 (100,0) 116 (100,0) 0 0 Cefoksytyna Imipenem 1 (0,8) Ciprofloksacyna 12 (10,0) 3 (2,6) 13 (0,7) 0 Gentamycyna 73 (60,8) 99 (85,3) 38 (2,2) 18 (5,0) Amikacyna 72 (60,0) 95 (81,9) 3 (0,2) 18 (5,0) Doksycyklina 57 (47,5) 37 (31,9) 1075 (61,5) 43 (12,0) Trimetoprim/ Sulfametoksazol 81 (67,5) 93 (80,2) 1154 (66,0) 98 (27,3)

8 270 Tamara Daniluk i inni Wśród szczepów E. coli ESBL( ) 67,7% było opornych na ampicylinę, które w większości (99,5%) odzyskiwały wrażliwość na skojarzony preparat Augmentin (tab. 4.). Oporność na gentamycynę (2,2%) i amikacynę (0,2%) była wykazywana wśród ESBL( ) istotnie statystycznie rzadziej w porównaniu do szczepów ESBL(+) z wysokimi odsetkami oporności odpowiednio 60,8% i 60% (p = 0,0000). Oporność na SXT występowała ze zbliżoną, wysoką częstością zarówno wśród szczepów E. coli ESBL( ) (66%), jak i ESBL(+) (67,5%) (p > 0,05). Oporność na doksycyklinę występowała statystycznie częściej wśród ESBL( ) (61,5%) niż ESBL(+) (47,5%) E. coli (p = 0,0000). Zwraca uwagę występowanie oporności na ciprofloksacynę wśród E. coli ESBL(+) istotnie statystycznie częściej (12/120; 10%) w porównaniu do szczepów K. pneumoniae ESBL(+) (3/116; 2,6%) (p = 0,0196) oraz w porównaniu do szczepów E. coli ESBL( ) (13/1748; 0,7%) (p = 0,0000) (tab. 4.). Wykazano też, że chociaż częstość oporności na ciprofloksacynę wśród ogólnej liczby badanych szczepów E. coli wynosiła 0,5% (25/4558), to w 2007 roku była statystycznie wyższa (16/1116; 1,4%) w porównaniu do 2004 (1/1129; 0,09%) i 2005 roku (1/1222; 0,08%) (p < 0,05). Dyskusja Jeszcze nie tak dawno, pod koniec lat 80. XX w., wybór przez lekarzy praktykujących w szpitalach antybiotyku do terapii poważnych zakażeń wywoływanych przez Enterobacteriaceae był prosty. Bakterie te bowiem, wraz z głównymi gatunkami Klebsiella pneumoniae i Escherichia coli, odznaczały się wrażliwością na antybiotyki stosowane zazwyczaj w terapii empirycznej lub też wykazywały przewidywalne wzory lekooporności [2 5, 11, 12, 15 17, 19, 20]. Pałeczki z gatunku E. coli należały do najczęściej izolowanych z różnych próbek materiałów od chorych leczonych w latach w szpitalach i poradniach miasta Białegostoku i województwa [19, 20], podobnie jak na to wskazują badania prezentowane w obecnej pracy pochodzące z ostatnich czterech lat Wiadomo też, że pałeczki E. coli i K. pneumoniae pod koniec lat 80. charakteryzowały się niższym stopniem lekooporności wobec licznych antybiotyków w porównaniu do końca lat 90. ubiegłego wieku [19]. W 1998 roku odnotowano prawie dwukrotny wzrost oporności na ampicylinę (66,4%) wśród szczepów E. coli w porównaniu do ocenianych 10 lat wcześniej (36,7%) [21]. W kolejnych latach nie obserwowano wzrostu częstości oporności szczepów E. coli na ampicylinę ( ,8%) [20]. Z aktualnych danych wynika, że odsetki szczepów E. coli opornych na ampicylinę utrzymują się na niezmiennym, porównywalnym poziomie około 50% ( ,5% i ,4%). W latach [19, 20] nie odnotowano też istotnego wzrostu oporności wśród szczepów E. coli na cefalosporyny I, II (cezuroksym) i III generacji (cefotaksym, ceftazydym) oraz na aztreonam, których wartości wynosiły w granicach 5 10%. Wśród szczepów E. coli izolowanych w latach oporność na cefalosporyny I, II i III generacji (cefotaksym) oraz na aztreonam wykryto u łącznej liczby 120 (2,6%) spośród ogólnej liczby 4558 ocenianych izolatów; szczepy te wytwarzały beta-laktamazę typu ESBL. Częstość ESBL(+) izolatów E. coli jest istotnie statystycznie wyższa, gdy będzie odniesiona tylko do szczepów opornych na ampicylinę i/lub inne antybiotyki beta-laktamowe i z innych grup chemicznych (120/1868 6,4% lub 120/2772 4,3%). Wśród szczepów E. coli generalnie odnotowano spadek częstości oporności na gentamycynę (2,5% 2004 i 1,5% 2007) i na amikacynę (1% 2004 i 1,1% 2007) w porównaniu do lat [19, 20], chociaż istotne różnice dotyczą szczepów ESBL(+) i ESBL( ) E. coli; wrażliwe na aminoglikozydy są tylko szczepy ESBL( ). Wysokie, jakkolwiek niższe w porównaniu do (37,6%) odsetki szczepów E. coli dotyczyły oporności na tetracykliny (19,9% 2004 i 24,1% 2007). Odnotowano istotnie statystyczny wzrost oporności na trimetoprim/sulfametoksazol (SXT) wśród szczepów E. coli izolowanych w 2007 roku (51,8%) w porównaniu do 2004 (21,7%), 2005 (18,9%) i 2006 (16,9%) roku. Wśród szczepów E. coli ESBL(+) i ESBL( ) wykrywano jednak wysokie porównywalne odsetki oporności na SXT (odpowiednio 67,5% i 66%). Zwraca uwagę wzrost oporności wśród szczepów E. coli na ciprofloksacynę w 2006 (7/1091; 0,6%) i 2007 roku (16/1116; 1,4%) w porównaniu do 2004 (1/1129; 0,08%) i 2005 roku (1/1222; 0,08%). Szczepy E. coli oporne na ciprofloksacynę istotnie częściej wykrywano wśród ESBL(+) niż ESBL( ) izolatów. Na 12 szczepów ESBL(+) opornych na ciprofloksacynę 8 (66,7%) z nich izolowano z kału od dzieci leczonych w oddziale intensywnej terapii (4x) (OIT), klinice onkologii (2x) i w klinice chorób zakaźnych dzieci (2x). Dwa szczepy izolowano z krwi od dzieci z kliniki onkologicznej i kolejne dwa z rurki tracheostomijnej od dzieci z OIT. Szczepy E. coli oporne na ciprofloksacynę ESBL( ) izolowano z moczu (4x), wymazów ze skóry (3x), rurki tracheostomijnej (2x) i innych (2x), głównie od dzieci z OIT i kliniki onkologicznej. Szczepy K. pneumoniae dziesięciokrotnie rzadziej niż E. coli były izolowane z różnych próbek materiałów od dzieci leczonych w latach Takie częstości były podobne do lat wcześniejszych ( ) [19, 20]. Wśród wszystkich szczepów K. pneumoniae 24,4% było opornych na wszystkie antybiotyki beta-laktamowe, które wytwarzały β-laktamazę typu ESBL. Szczepy ESBL(+) K. pneumoniae izolowano z częstością 15,6% (24/154) w 2004 roku i 25,8% (31/120) w 2007 roku; nie odnotowano istotnego wzrostu częstości ESBL(+) w porównaniu do lat wcześniejszych [20]. Szczepy K. pneumoniae generalnie były bardziej oporne na aminoglikozydy niż E. coli; oporność na gentamycynę i amikacynę wykazywano z podobną częstością (odpowiednio 24,7% i 26,6%) w 2004 roku i 2007 roku (22,5% i 21,7%). Podobna sytuacja rejestrowana była w latach [19, 20].

9 Częstość występowania i wrażliwość na antybiotyki szczepów Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae 271 Odnotowano spadek oporności na doksycyklinę w 2007 roku (15%) w porównaniu do 2004 roku (20,1%) oraz wzrost oporności na SXT z 40,9% (2004) do 61,7% (2007), wśród szczepów K. pneumoniae (głównie izolowane z moczu i kału). Szczepy K. pneumoniae oporne na ciprofloksacynę izolowano w roku 2007 (3/120; 2,5%); dwa szczepy pochodziły z rurki tracheostomijnej i jeden z wymazu z gardła od dzieci leczonych na oddziale intensywnej terapii. Istotne jest, że od 1998 roku, kiedy to po raz pierwszy wykazano oporność na imipenem (karbapenem) wśród szczepów E. coli (1%) izolowanych od dzieci leczonych w oddziale onkologii [19], jak dotąd szczepy takie nie rozprzestrzeniły się wśród dzieci leczonych w różnych oddziałach szpitalnych. W 2006 roku tylko jeden szczep E. coli był oporny na imipenem (MBL+), który jednocześnie wytwarzał β-lakatamazę o rozszerzonym spektrum działania (ESBL+). Szczepów opornych na imipenem jak dotąd nie wykryto wśród badanych izolatów Klebsiella pneumoniae. Taka sytuacja jest bardzo korzystna, gdyż karbapenemy mogą być lekami stosowanymi z powodzeniem w leczeniu zakażeń wywoływanych przez patogeny bakteryjne wielooporne (MDR), w tym wytwarzające β-laktamazy typu ESBL. Niepokojący jest jednak odnotowany wzrost oporności na ciprofloksacynę, zwłaszcza wśród szczepów E. coli. Zakażenia wywołane przez szczepy E. coli i K. pneumoniae oporne na fluorochinolony i wytwarzające ESBL występują aktualnie na terenie całego świata. Wykazano, że około 20 60% szczepów E. coli i K. pneumoniae ESBL(+) jest opornych na fluorochonolony i że oporność na fluorochinolony jest ściśle związana z wytwarzaniem ESBL [5, 15, 22 25]. Zwrócono uwagę, że nabycie oporności na ciprofloksacynę przez szczepy E. coli i K. pneumoniae wytwarzające typ ESBL β-laktamazy, pozostawał w silnym związku z wcześniejszym stosowaniem fluorochonolonów [23 25]. Szczepy wytwarzające β-laktamazy typu ESBL izolowane od dzieci często były oporne nie tylko na wszystkie antybiotyki β-laktamowe (wyjątek karbapenemy i Augmentin), lecz także na inne niepokrewne związki takie jak aminoglikozydy, tetracykliny i trimetoprim-sulfametoksazol, podobnie jak na to wskazują badania z innych ośrodków [5, 15, 17, 23]. Taka oporność może być problemem ze względu na ograniczenie opcji terapeutycznych [5, 22]. Obecność oporności na ciprofloksacynę i wytwarzanie ESBL może być konsekwencją wcześniej stosowanych antybiotyków β-laktamowych (głównie cefalosporyn II i III generacji) lub ciprofloksacyny, które mogły spowodować selekcję i umożliwić rozprzestrzenienie bakterii wieloopornych (MDR) pomiędzy pacjentami, podobnie jak wskazywali inni [5, 23]. Chociaż generalnie fluorochinolony nie są stosowane w leczeniu dzieci do lat 16, to potrzeba ich włączenia do terapii na niektórych oddziałach dziecięcych była niekwestionowana. W związku z tym w roku 2005 ponad dwukrotnie wzrosło zużycie chinolonów, głównie ciprofloksacyny (z 0,5 do 1,14 DDD/100 osobodni) w porównaniu do 2004 roku w Uniwersyteckim Dziecięcym Szpitalu w Białymstoku [26]. Odnotowano wyraźne zróżnicowanie ilości stosowanych antybiotyków w zależności od specyfiki oddziałów; w 2004 r. najwięcej antybiotyków stosowano na oddziale intensywnej terapii (3,6 DDD/100 osobodni), chirurgii (3,1) i onkologii dziecięcej (3,0). Ograniczenia zużycia drogich antybiotyków w większości z 12 klinik szpitala poza onkologią (3,26 DDD/100 osobodni), laryngologią (wzrost z 2,3 do 2,86) i alergologią dziecięcą (wzrost z 0,53 do 2,33) nie miały zasadniczego wpływu na ich zużycie. Związek pomiędzy stosowaniem antybiotyków i występowaniem oporności na te leki jest złożony i trudny do oceny. Ocena zużycia antybiotyków w szpitalu może być dokonywana w oparciu o nadzór na poziomie pacjenta lub w oparciu o nadzór populacyjny zebrany na poziomie oddziału szpitalnego lub szpitala [27]. W celu ograniczenia presji selekcyjnej prowadzącej do rozwoju oporności powinny być stosowane różne działania (edukacyjne, organizacyjne, restrykcyjne) zmierzające do standaryzowanego systemu nadzoru zużycia antybiotyków, który to został wprowadzony ostatnio w Uniwersyteckim Szpitalu Dziecięcym w Białymstoku [26]. Należy się spodziewać, że monitorowanie zużycia antybiotyków i ograniczenie ich stosowania nie tylko spowoduje zmniejszenie kosztów leczenia, ale także będzie stanowić ważny element działań zapobiegających selekcji i narastaniu antybiotykooporności wśród bakterii kolonizujących i/lub uczestniczących w zakażeniach u dzieci. Wnioski 1. Wyniki obecnych badań retrospektywnych wskazują generalnie na niską częstość szczepów Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae opornych na różne klasy antybiotyków i jeszcze niższą częstość szczepów wieloopornych wśród tych gatunków. 2. W ostatnich latach odnotowano jednak wzrost częstości szczepów Klebsiella pneumoniae ESBL(+) i Escherichia coli ESBL(+) wieloopornych, w tym z opornością na ciprofloksacynę. Piśmiennictwo 1. Farmer III J.J.: 41. Enterobacteriaceae: Introduction and identification. W: Manual of clinical microbiology, 8th edition, Murray P.R., i in. (eds), ASM Press, Washington, D.C. 2003, 1, Bopp C.A., Brenner F.W., Fields P.J. et al.: 42. Escherichia, Shigella, and Salmonella. W: Manual of clinical microbiology, 8th edition, Murray P.R. i in. (eds), ASM Press, Washington, D.C. 2003, 1, Abbott S.L.: 44. Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Plesiomonas, and other Enterobacteriaceae. W: Manual of clinical microbiology, 8th edition, Murray P.R. i in. (eds), ASM Press, Washington, D.C. 2003, 1, Scheutz F., Strockbine N.A.: Genus I. Escherichia Castellani and Chalmers 1919, 941 TAL. W: Bergey s manual of systematic bacteriology, Second Edition, 2005, 2, (The Proteobacteria. Part B,,The Gammaproteobacteria, Brenner DJ, Krieg NR, Stanley J.T. eds. volume two). 5. Denton M.: Enterobacteriaceae. Int. J. Antimicrob. Agents, 2007, Suppl.3, 9-22.

10 272 Tamara Daniluk i inni 6. Nataro J.P., Kaper J.B.: Diarrheagenic Escherichia coli. Clin. Microbiol. Rev., 1998, 11, Gaynes R., Edwards J.R., and the National Nosocomial Infections Surveillance System: Overview of nosocomial infections caused by Gram-negative bacilli. Clin. Infect. Dis., 2005, 41, Richards M.J., Edwards J.R., Culver D.H. et al..: Nosocomial infections in medical intensive care units in the United States. Crit. Care Med., 1999, 27, Vallis J., Leōn C., Alvarez-Lerma F.: Nosocomial bacteremia in critically ill patients: a multicenter study evaluating epidemiology and prognosis. Clin. Infect. Dis., 1997, 24, Twum-Danso K., Grant C., Al-Suleiman S.A. et al.: Microbiology of postoperative wound infections: a pro-spective study of 1770 wounds. J. Hosp. Infect., 1992, 21, Fluit A.C., Jones M.E., Schmitz F.J. et al..: Antimicrobial resistance among urinary tract infections (UTI) isolates in Europe: results from the SENTRY antimicrobial surveillance program Antonie Leeuwenhoek 2000, 77, Jones R.N., Kugler K.C., Pfaller M.A., Winokur P.L., and the SENTRY Surveillance Group, North America: Characteristics of pathogens causing urinary tract infections in hospital in North America: results from the SENTRY antimicrobial surveillance program, Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 1999, 35, Jorgensen J., Turnidge J.D.: 70. Susceptibility test methods. W: Manual of clinical microbiology, 8th edition, Murray P.R. et al.: (eds.), ASM Press, Washington, D.C. 2003, 1, Drieux L., Brossier F., Sougakoff W. et al.: Phenotypic detection of extended-spectrum β-lactamase production in Enterobacteriaceae: review and bench guide. Clin. Microbiol. Infect., 2008, 14 (Suppl. 1), Bradford P.A.: Extended-spectrum β-lactamases in the 21st Century: characterization, epidemiology, and detection of this important resisitance threat. Clin. Microbiol. Rev., 2001, 14 (4), Rossolini G.M., D Andrea M.M., Mugnaioli C.: The spread of CTX-M-type extended spectrum β-lactamases. Clin. Microbiol. Infect., 2008, 14 (Suppl. 1), Grisaru-Soen G., Sweed Y., Lerner-Geva L. et al.: Nosocomial bloodstream infection in a pediatric intensive care unit: 3-year survey. Med. Sci. Monit., 2007, 13 (6), CR PMID: Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 16th Informational Supplement. Document M100-S16. Wayne, PA: CLSI, Zaremba M.L.: Antybiotykooporność bakterii w regionie wschodnim Polski. Prz. Epidemiol., 2000, 54, Zaremba M.L., Ściepuk M., Daniluk T. et al.: Częstość występowania i lekooporność szczepów Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae w materiałach klinicznych ( ). Post. Mikrobiol., 2004, 43 (Sup1), Rożkiewicz M., Zaremba M.L., Rożkiewicz D. et al.: Sensitivity rates to Augmentin and Unasyn among Gramnegative bacilli and staphylococci. J. Chemother., 1993, 5 (Suppl n. 1), Hyle E.P., Lipworth A.D., Zaoutis T.E. et al.: Risk factors for increasing multidrug resistance among extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella species. Clin. Infect. Dis., 2005, 40, Paterson D.L., Mulazimoglu L., Casellas J.M. et al.: Epidemiology of ciprofloxacin resistance and its relationship to extended-spectrum beta-lactamase production in Klebsiella pneumoniae isolates causing bacteremia. Clin. Infect. Dis., 2000, 30, Lautenbach E., Strom B.L., Bilker W.B. et al.: Epidemiological investigation of fluoroquinolone resistance in infections due to extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. Clin. Infect. Dis., 2001, 33, Tolun V., Kucukbasmaci O., Torumkuney-Akbulut D. et al.: Relationship between ciprofloxacin resistance and extendedspectrum beta-lactamase production in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae strains. Clin. Microbiol. Infect., 2004, 10, Ołdak E., Rożkiewicz D., Domański M. et al.: Stosowanie antybiotyków w Dziecięcym Szpitalu Klinicznym z północno-wschodniej Polski w latach Prz. Pediatr., 2007, 37, Kritsotakis E.J., Gikas A.: Surveillance of antibiotic use in hospitals: methods, trends and targets. Clin. Microbiol. Infect., 2006, 12, Adres do korespondencji: dr n. med. Tamara Daniluk Uniwersytet Medyczny w Białymstoku Zakład Mikrobiologii ul. A. Mickiewicza 2C Białystok mikrob@umwb.edu.pl

11 Nowiny Lekarskie 2008, 77, 4, JOANNA KOPEĆ-SZLĘZAK, JOLANTA WOŹNIAK STANDARDOWE OZNACZANIE IMMUNOFENOTYPU KOMÓREK BIAŁACZKOWYCH W ROZPOZNAWANIU I MONITOROWANIU OSTREJ BIAŁACZKI SZPIKOWEJ (OBS) STANDARD FOR ACUTE MYELOID LEUKEMIA (AML) IMMUNOPHENOTYPING AT DIAGNOSIS AND MONITORING Pracownia Immunofenotypowania Kierownik: prof. dr hab. Joanna Kopeć-Szlęzak Zakład Diagnostyki Hematologicznej i Transfuzjologicznej Kierownik: doc. dr hab. Magdalena Łętowska Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie Streszczenie Wstęp. Ustalenie immunofenotypu komórek w ostrych białaczkach szpikowych (OBS) ma na celu identyfikację linii komórek i stopnia ich dojrzałości oraz określenie ekspresji nietypowych dla wykrywania choroby resztkowej. Celem pracy było ustalenie standardu oznaczania immunofenotypu komórek białaczkowych w OBS. Materiał i metody. Analizę immunofenotypu komórek białaczkowych szpiku kostnego i/lub krwi obwodowej 116 pacjentów przeprowadzano metodą czterokolorowej cytofluorometrii w cytometrze przepływowym FACS Canto BD. Zastosowano antygen panleukocytarny CD45 dla wyodrębnienia komórek rozrostowych oraz konieczne do ustalenia immunofenotypu OBS antygeny: liniowe i związane z dojrzewaniem komórek linii mieloidalnej oraz antygeny limfoidalne. Wyniki i wnioski. Opracowano zestawy przeciwciał monoklonalnych do przesiewowego oznaczania OBS oraz panele dla ustalenia podtypów OBS: CD14/CD64/CD45, CD19/CD13/CD45/CD3, CD7/CD33/CD45/CD117, CD66/CD16/CD45, CD79a/MPO/CD3/TdT. Dla podtypu OBS M1/M2 charakterystyczna jest ekspresja CD13+CD33+CD1117+ oraz CD34+HLA-DR+, dla M3- brak ekspresji CD34, HLA-DR i CD11b/CD18. W M4- mieloblasty są CD117+CD64-, a komórki monocytoidalne CD117-CD64+. W podtypie M5 komórki CD14- charakteryzuje ekspresja CD117 i słaba ekspresja CD34, natomiast komórki CD14+ nie mają ekspresji CD117 i CD34. W monitorowaniu choroby resztkowej przydatne jest oznaczanie głównie ekspresji asynchronicznych bądź z linii limfoidalnej (np. CD2, CD56). SŁOWA KLUCZOWE: ostra białaczka szpikowa, cytometria, choroba resztkowa. Summary Introduction. Immunophenotype determination of leukemia cell in acute myeloid leukemia (AML) connects with cell line and cell maturity identification as well as aberrant antigen expression, for minimal residue disease (MRD) monitoring. The aim of this study was standardization of AML leukemia cell immunophenotyping. Material and methods. 116 AML patient bone marrow/peripheral blood were tested. Immunophenotype determination was carried out by four-color analysis with FACS Canto BD flow cytometer. To separate leukemia cells pan-leukocyte CD45 antigen and for immunophenotype determination of line-specific antigens, myeloid cells maturation antigens and lymphoid antigens were used. Results and conclusions. We established useful screening kits for four-color flow cytometry: CD14/CD64/CD45, CD19/CD13/CD45/CD3, CD7/CD33/CD45/CD117, CD66/CD16/CD45 and CD79a/MPO/CD3/TdT. In AML M1/M2 myeloblasts are CD13+CD33+CD117+ and CD34+HLA-DR+, in M3 promyelocytes they are CD34, HLA-DR and CD11b/CD18 they a negative. In M4- myeloblasts are CD117+ CD64- and monocytoidal cells are CD64+CD117-. In M5 CD14 negative cells are CD117+CD34+ and CD14+ cells are CD117-CD34-. Determination of asynchronous and non-lineage expressions (CD2, CD56) are mainly useful for MRD monitoring. KEY WORDS: acute myeloid leukemia, cytometry, minimal residual disease. Wstęp Ostra białaczka szpikowa (OBS) to nieograniczony rozrost prekursorowych komórek mieloidalnych z dojrzewaniem zablokowanym na różnych etapach rozwoju. Efektem rozrostu jest akumulacja komórek rozrostowych i zahamowanie normalnej hematopoezy w szpiku, czyli wyparcie prawidłowych elementów szpiku, jak erytroblasty, megakariocyty i granulocyty oraz zajęcie krwi obwodowej i innych organów przez komórki białaczkowe [1]. Cytometria przepływowa jest jedną z istotnych metod diagnostycznych, stosowaną w rozpoznawaniu OBS. Jest to metoda nowoczesna, prosta, specyficzna i czuła, w ostatnich 10 latach szybko rozwijająca się, a dodatkową zaletą tej metody jest stosunkowo krótki czas uzyskania wyników. Ustalenie immunofenotypu komórek w ostrych białaczkach szpikowych ma na celu: identyfikację linii komórek układu krwiotwórczego, która uległa rozrostowi

12 274 Joanna Kopeć-Szlęzak, Jolanta Woźniak określenie stopnia dojrzałości komórek rozrostowych, istotne w określeniu podtypu OBS. Podtypy ostrej białaczki szpikowej określane są na podstawie klasyfikacji WHO i FAB z uwzględnieniem immunofenotypowania [2, 3] oznaczenie charakterystycznych cech immunofenotypu fenotypu, przydatnych w monitorowaniu choroby, w wykrywaniu choroby resztkowej oraz rokowaniu. Aby analiza cytometryczna fenotypu komórek białaczkowych w OBS była jak najbardziej efektywna i użyteczna w ocenie wielkości choroby resztkowej, zaleca się w momencie diagnozy rozpoznawanie związanych z białaczką aberrantnych immunofenotypów (LAIP Leukemia- Associated Immunophenotypes). Aberrantne immunofenotypy są obecne na wszystkich lub na części komórek białaczkowych, natomiast na prawidłowych komórkach szpiku są obecne z bardzo małą częstotliwością lub w ogóle nie występują. W tym celu podczas diagnozy ustala się charakterystyczny dla danego chorego aberrantny immunofenotyp białaczkowy (LAIP), za pomocą którego w trakcie monitorowania leczenia będzie rozpoznawana minimalna choroba resztkowa (MRD minimal residual disease) oraz oceniany stopień zajęcia szpiku przez komórki białaczkowe [4, 5]. Białaczkowe immunofenotypy aberrantne można podzielić na cztery kategorie ze względu na charakter aberracji: 1. cross-lineage ekspresja limfoidalnych antygenów na mieloidalnych komórkach białaczkowych, takich jak CD2, CD7, CD19 2. underexpression brak ekspresji lub słaba ekspresja antygenów, które występują w trakcie normalnego różnicowania komórek linii granulo- lub monocytarnej, takich jak CD13 i CD33 3. overexpression większa intensywność ekspresji antygenów niż na prawidłowych komórkach szpiku, takich jak CD13, CD33 czy CD34 4. asynchroniczna ekspresja antygenu koekspresja antygenu, który w trakcie normalnej granulo- lub monopezy występuje w ustalonej kolejności, a nie równocześnie, np. koekspresja markerów wczesnego dojrzewania, takich jak CD34 lub CD117 z antygenami związanymi z późniejszym dojrzewaniem komórek linii mieloidalnej takimi jak, CD15, CD11b, CD11c lub wcześniejszym np.: brak CD38 lub obecność TdT [4]. Materiał i metody W latach przebadano w Instytucie Hematologii i Transfuzjologii, w celu ustalenia rozpoznania, 176 pacjentów z ostrą białaczką szpikową M0-M5. Monitorowanie choroby resztkowej (co najmniej jedno badanie) przeprowadzono u 40 chorych. Metodą stosowaną w immunofenotypowaniu ostrych białaczek jest cytometria przepływowa. Cytometria przepływowa to metoda pomiaru pojedynczych komórek przepływających przed wiązką lasera w strumieniu cieczy. W immunofenotypowaniu przy użyciu cytometru przepływowego ocenia się : rozmiar komórek FSC ziarnistości komórek SSC ekspresję antygenów powierzchniowych i cytoplazmatycznych przy użyciu przeciwciał monoklonalnych związanych z barwnikami fluorescencyjnymi. W oparciu o własne doświadczenia oraz na podstawie danych uzyskanych z 10 laboratoriów prowadzących immunofenotypowanie ostrych białaczek szpikowych opracowano ogólne zasady dotyczące przygotowania materiału, sprzętu, odczynników i analizy stosowanych w immunofenotypowaniu ostrych białaczek szpikowych, zawarto je w tabeli 1. Tab. 1. Podstawowe zasady immunofenotypowania OBS Table 1. Basic principles of AML immunphenotyping Materiał: rodzaj materiału: minimalna ilość sposób przygotowania sposób przechowywania lub/i dostarczenia do laboratorium szpik kostny i krew obwodowa pobrane na EDTA 1 ml komórki liczone w analizatorze hematologicznym (lub w kamerze) przed barwieniem szpik płukany 2x w PBS-ie, do barwienia używana jest zawiesina komórek w ilości tys./ml Próbki krwi obwodowej powinny być dostarczone do laboratorium maksimum w ciągu 12 h, a aspirat szpiku w ciągu 6 h od pobrania, przechowywane w temp. pokojowej (optymalnie: C) stosowane urządzenie rodzaj znakowania Metoda: Cytometr przepływowy, laser 488 nm, (+ ewentualnie drugi umożliwiający jednoczesny pomiar większej ilości parametrów) Minimalne wymagania: możliwość pomiaru 5 parametrów, FSC, SSC, 3 fluorescencje (F1, F2, F3) Znakowanie przeciwciałami bezpośrednie w pełnej krwi i/lub aspiracie szpiku

13 Standardowe oznaczanie immunofenotypu komórek białaczkowych w rozpoznawaniu i monitorowaniu ostrej białaczki 275 cd. tab. 1. firmy stosowanych przeciwciał firma produkująca lizat barwniki fluorescencyjne inkubacja z przeciwciałami liczba analizowanych komórek w rozpoznaniu liczba analizowanych komórek w MRD rodzaj zakładanych bramek Wybór dowolny zastrzeżenia: przy porównawczych oznaczeniach ilościowych oceniających ilość badanego antygenu na komórce lub jego intensywność fluorescencji konieczne jest stosowanie przeciwciał tej samej firmy Wybór dowolny (zalecany lizat najmniej zmieniający morfologię badanych komórek nasze sugestie PharmLyse BD) Nie zaleca się stosowania jednocześnie przeciwciał związanych z PE-Cy5 i APC (niemożliwa kompensacja) Zaleca się odpowiedni dobór fluorochromów do badanych antygenów: jeżeli słaba ekspresja antygenu, to PE l jeżeli pośrednia ekspresja antygenu, to PE-Cy5, PerCPCy5.5, APC, PE-Cy7 jeżeli mocna ekspresja antygenu, to FITC lub PerCP Jeżeli nie ma specjalnych wskazań producenta, obecnie poleca się dwa sposoby: min w ciemności w temperaturze pokojowej 30 min w 4 0 C Analiza: i więcej (20 30 komórek resztkowych ) Bramkowanie komórek blastycznych w OBS na diagramie (dot. plot) SSC/CD45 i/lub FSC/SSC i/lub SSC/charakterystyczny marker (CD117, CD34, CD64) Wyniki Analiza cytometryczna zasady stosowania i wyniki. Panel przeciwciał do immunofenotypowania OBS powinien zawierać: przeciwciała do oznaczenia linii komórkowej rozrostu przeciwciała do oznaczenia stopnia dojrzałości populacji komórek białaczkowych Przeciwciała nieliniowe, charakterystyczne dla komórek mielo- i monocytoidalnych przeciwciała do oznaczania immunofenotypów aberrantnych ekspresja antygenów innych linii komórkowych lub niezgodnych ze stopniem dojrzałości co jest przydatne w ocenie choroby resztkowej kontrole izotypowe odpowiednie dla stosowanych przeciwciał. Obowiązkowe antygeny oceniane przy diagnostyce ostrej białaczki szpikowej to: antygen pan-leukocytarny CD45 do wyodrębnienia populacji komórek rozrostowych antygeny charakterystyczne dla komórek linii mielo- i monoidalnej:cd13, CD14, CD15, CD33, CD64, CD117, GlyA, CD41, CD61, MPO (mieloperoksydaza) antygeny komórek limfoidalnych: CD19, CD7, CD2, ccd79a, ccd3. antygeny związane z dojrzewaniem komórek hematopoetycznych: CD34, CD38, HLA-DR, TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) antygeny do oceny dojrzałości komórek linii mieloidalnej: CD66, CD16. Kolejność wykonywanych czynności: 1. W procesie immunofenotypowania OBS podstawowe znaczenie ma wyodrębnienie populacji komórek rozrostowych. Narzędziem wyznaczającym grupę komórek białaczkowych jest CD45, który na komórkach OBS wykazuje zróżnicowaną i odmienną od prawidłowych komórek linii mielo-monocytoidalnej ekspresję. Jest to uznany w piśmiennictwie gate marker. Po raz pierwszy powinien być użyty w przesiewie ( screening ), następnie w identyfikacji linii i stadium dojrzałości (w postępowaniu różnicującym podtypy OBS). Równolegle oznaczane limfocyty CD45+ służą jako punkt odniesienia dla ułatwienia lokalizacji badanej populacji komórek białaczkowych na cytogramach (ryc. 1 A i B). 2. Ustalenie głównej linii komórek, czyli stwierdzenie rozrostu mielo- lub monocytoidalnego z wykluczeniem rozrostu z komórek linii limfoidalnej. Służą do tego celu tzw. panele przesiewowe z użyciem wielokolorowej fluorescencji (3 8 fluorochromów). Oprócz parametrów dotyczących ekspresji antygenów wyznaczonych przy użyciu przeciwciał monoklonalnych sprzężonych z fluorochromami w cytometrii przepływowej dysponujemy dwoma dodatkowymi parametrami o charakterze morfologicznym: SSC (odzwierciedlającą tzw. ziarnistość komórek) oraz ich wielkość FSC. Proponowany zestaw przesiewowy z zastosowaniem czterech fluorochromów zawiera 15 przeciwciał i znakuje: a. antygeny powierzchniowe: 1) CD14/CD64/CD45/GlyA 2) CD19/CD13/CD45/CD34 3) CD7/CD33/CD45/CD117 4) CD66/CD16/CD45/CD41a, 5) odpowiednie kontrole izotypowe

14 276 Joanna Kopeć-Szlęzak, Jolanta Woźniak b. antygeny cytoplazmatyczne: CD3/MPO/CD79a/TdT plus odpowiednie kontrole izotypowe Dodatnia ekspresja: CD13, CD33, CD34, CD117, MPO oraz ujemna ekspresja: CD19, CD7, ccd3, CD79a, CD14, CD64 wskazuje na OBS z wczesnych komórek linii mieloidalnej (M1/M2), z jednoczesnym wykluczeniem rozrostu z komórek linii monocytoidalnej i limfoidalnej (ryc. 1 C-I). Ryc. 1. Cytogramy A i B przedstawiają wyodrębnianie populacji komórek blastycznych z wykorzystaniem różnic, pomiędzy subpopulacjami leukocytów, w sile ekspresji CD45 i ziarnistości (SSC). Cytogramy C-I przedstawiają pierwszy krok w immunofenotypowaniu ostrej białaczki czterokolorowy panel składający się z czterech probówek po cztery przeciwciała. Fig. 1. Four-colour screening panel. Cytograms A and B show the separate blast cell populations. We use differences in SSC and CD45 expression intensity between leukocyte subpopulations. Cytograms C-I show the first step pf AML immunophenotyping: Four-colour screening panel consist 4 tubes with 4 monoclonal antibodies every one of them. Jednocześnie zastosowanie takich zestawów przeciwciał umożliwia określenie fenotypów aberrantnych zarówno w przypadkach rozrostów z linii mieloidalnej, jak i limfoidalnej B i T i są to koekspresje: CD13+CD19+, CD33+CD7+CD117+. Określenie podtypu OBS oraz fenotypów aberrantnych (LAIP): Poniższa propozycja stanowi przykład panelu przeciwciał używanego po zastosowaniu czterokolorowego zestawu przesiewowego CD18/HLA-DR/CD45/CD11b/CD117 mieloblasty? CD18 -/dim, DR+, CD11b -/dim monoblasty? CD18 ++, DR+, CD11b dim/+ negatywna expresja: HLA-DR, CD18, CD11b prawdopodobnie AML M3 CD38/CD34/CD45 określenie CD34+CD38 komórek CD15/CD117/CD45/CD34 fenotyp aberrantny CD11c/CD117 komórki monocytoidalne, aberrantny fenotyp dla mieloblastów CD36 komórki monocytoidalne? CD36+; komórki erytroidalne? CD36++ CD2/CD56/CD117 fenotyp aberrantny Poszczególne podtypy charakteryzuje ekspresja: Podtyp OBS M1/M2 CD13+CD33+CD117+, CD34+HLA-DR+ Podtyp OBS M3 CD13+CD33++CD34-/HLA-DR- CD18-CD11b- (konieczne sprawdzenie translokacji t(15;17). Podtyp OBS M4 występują dwie subpopulacje komórek białaczkowych najczęściej wyróżniane w trakcie analizy ekspresji CD45: linia monocytoidalna z mocniejszą siłą ekspresji, mieloblasty ze słabszą siłą ekspresji CD45. Proces odróżniania komórek linii monocytoidalnej od mieloblastów można przeprowadzić również przez oznaczenie odsetka komórek z ekspresją CD117 i CD64; mieloblasty są CD117+CD64- a komórki monocytoidalne CD117 CD64+; różnicowanie linii komórek rozrostowych w OBS M4 w okresie rozpoznania jest przydatne w monitorowaniu efektów leczenia (ryc. 2.). Podtyp OBS M5 CD14 minus: CD13+CD33++CD64+CD36+CD11c+CD15++CD117+ /-CD34-/+ CD14 plus: CD13+CD33++CD64+ CD36+CD11c+CD15+CD117-CD34-. Szczegółową charakterystykę ekspresji molekuł w podtypach OBS przedstawia tabela 2. Aberrantne ekspresje antygenów na komórkach białaczkowych w OBS. Najczęściej spotykanymi aberracjami na komórkach białaczkowych w OBS jest ekspresja obca crosslineage markerów komórek linii limfoidalnej np.: CD7, CD56, CD19 oraz ekspresja asynchroniczna, czyli jednoczesna ekspresja markera charakterystycznego dla komórek z wczesnych etapów dojrzewania linii mieloidalnej oraz markera charakterystycznego dla komórek z późnych etapów dojrzewania linii mieloidalnej, np. występowanie mieloblastów o fenotypie CD15+CD117+CD34+ (ryc. 3.) lub CD11b+CD117+CD34+.

15 Standardowe oznaczanie immunofenotypu komórek białaczkowych w rozpoznawaniu i monitorowaniu ostrej białaczki 277 Ryc. 3. Fenotyp aberrantny CD34+CD117+CD15+ na mieloblastach w OBS M2 w prawidłowym szpiku komórek o takim fenotypie stwierdza się poniżej 0,8% wśród wszystkich komórek jądrzastych. Fig. 3. Leukemia-associated aberrant immunophenotype (LAIP): CD34+CD117+CD15+ on myeloblasts in AML M2 patient. The cells with such phenotype exist in normal bone marrow at 0,8% WBC level. Ryc. 2. Przedstawia wykorzystanie różnic w sile ekspresji CD45, pomiędzy populacjami komórek monocytoidalnych a mieloblastami do rozróżnienia dwóch populacji komórek białaczkowych. Na rycinie przedstawiono różnice w ekspresji dwóch antygenów CD64 i CD117 na dwóch populacjach komórek rozrostowych a OBS M4. Fig. 2. The differentiation AML M4 leukemic cells: cytograms show CD45 diverse expression intensity on monocytoid cells and myeloblasts. The histograms show different CD64 and CD117 expression on monocytoid cells and myeloblasts. Wynik badania cytometrycznego określającego immunofenotyp komórek białaczkowych w OBS powinien zawierać: odsetek komórek blastycznych wyznaczony na cytogramie SSC/CD45 i wyrażony względem wszystkich jądrzastych komórek szpiku odsetki komórek z ekspresją badanych antygenów w odniesieniu do komórek rozrostowych, wyodrębnionych przy zastosowaniu bramki SSC/CD45. Populację uważa się za pozytywną dla danego antygenu, gdy ponad 20% komórek w wyodrębnionej bramce wykazuje ekspresję danego antygenu. W przypadku poszukiwania choroby resztkowej wynik podawany jest jako odsetek komórek z ekspresją aberrantnego fenotypu wśród wszystkich jądrzastych komórek szpiku w odniesieniu do odsetka aberrantnej subpopulacji komórek w prawidłowym szpiku. Fenotyp komórek białaczkowych może być podawany w formie opisowej, gdy niemożliwe jest wyodrębnienie bramki dla komórek rozrostowych. Dodatkową charakterystyką komórek białaczkowych jest określenie siły ekspresji badanych antygenów, przedstawionej jako intensywność fluorescencji (średni kanał fluorescencji mean fluorescence intensity MFI) lub jako ilość miejsc wiążących przeciwciało np. MESF Molecules of Equivalent Soluble Fluorophores, ABC Antibody Bound per Cell).

16 278 Joanna Kopeć-Szlęzak, Jolanta Woźniak Tab. 2. Odsetek chorych na OBS, u których ponad 20% blastów wykazywało ekspresję badanego antygenu Table 2. The percentage of AML cases with antigens expression above 20% liniowe antygeny mieloidalne M0/M1 CD13 CD33 CD15 CD117 CD34 HLA-DR CD14 CD64 CD36 M2 t(8;21) CD13 CD33 CD15 CD117 CD34 HLA-DR CD14 CD64 CD36 M2 CD13 CD33 CD15 CD117 CD34 HLA-DR CD14 CD64 CD36 M2/MDS CD13 CD33 CD15 CD117 CD34 HLA-DR CD14 CD64 CD36 M3 t(15;17) CD13 CD33 CD15 CD117 CD34 HLA-DR CD14 CD64 CD36 M4 mieloblasty CD13 CD33 CD15 CD117 CD34 HLA-DR CD14 CD64 CD36 M4 monocyty CD13 CD33 CD15 CD117 CD34 HLA-DR CD14 CD64 CD36 M5 CD14- CD13 CD33 CD15 CD117 CD34 HLA-DR CD14 CD64 CD36 M5 CD14+ CD13 CD33 CD15 CD117 CD34 HLA-DR CD14 CD64 CD36 antygeny cytoplazmatyczne fenotypy aberrantne (cross-lineage) cząsteczki adhezyjne antygeny limfoidalne fenotypy aberrantne asynchroniczne M0/M1 MPO TdT CD11b CD11c CD31 CD56 CD2 CD7 CD19 CD CD M2 t(8;21) MPO TdT CD11b CD11c CD31 CD56 CD2 CD7 CD19 CD CD M2 MPO TdT CD11b CD11c CD31 CD56 CD2 CD7 CD19 CD CD M2/MDS MPO TdT CD11b CD11c CD31 CD56 CD2 CD7 CD19 CD CD M3 t(15;17) MPO TdT CD11b CD11c CD31 CD56 CD2 CD7 CD19 CD CD M4 mieloblasty MPO TdT CD11b CD11c CD31 CD56 CD2 CD7 CD19 CD CD M4 monocyty MPO TdT CD11b CD11c CD31 CD56 CD2 CD7 CD19 CD CD M5 CD14- MPO TdT CD11b CD11c CD31 CD56 CD2 CD7 CD19 CD CD M5 CD14+ MPO TdT CD11b CD11c CD31 CD56 CD2 CD7 CD19 CD CD % 50% chorych 49% 21% chorych 20% 1% chorych 0% chorych OBS OBS

17 Standardowe oznaczanie immunofenotypu komórek białaczkowych w rozpoznawaniu i monitorowaniu ostrej białaczki 279 Podsumowanie Oznaczanie immunofenotypów komórek białaczkowych przy użyciu wieloparametrycznej cytometrii przepływowej jest obecnie powszechnie akceptowaną metodą w diagnostyce rozrostów hematologicznych i uważane za ważny i czuły test, szczególnie w rozpoznawaniu ostrych białaczek. Procedura oznaczania ostrej białaczki szpikowej proponowana przez nas oparta jest na opublikowanych wcześniej, przez zespoły międzynarodowe, zaleceniach oraz na doświadczeniach własnych [6, 7, 8, 9, 10]. Dokładne i szczegółowe ustalenie immunofenotypu komórek białaczkowych w momencie rozpoznania jest bardzo pomocne w monitorowaniu leczenia i poszukiwaniu choroby resztkowej u chorych na ostre białaczki. Jest bardzo ważne, aby badanie immunofenotypu komórek przeprowadzane było według uznanych, standardowych procedur, co umożliwia porównywalność uzyskanych wyników pomiędzy laboratoriami. Piśmiennictwo 1. Tavor S., Petit I., Porozov S. et al.: Motility, proliferation, and egress to the circulation of human AML cells are elastase dependent in NOD/SCID chimeric mice. Blood, 2005, 106, Vardiman J.W., Harris N.L., Brunning R.D.: The World Health Organization (WHO) classification of the myeloid neoplasms. Blood, 2002, 100, Bennett J.M., Catovsky D., Daniel M.T. et al.: Proposals for the classification of the acute leukemias French-American- British (FAB) co-operative group. Brit. J. Haematol., 1976, 33, Kern W., Schnittger S.: Monitoring of AML by flow cyometry. Curr. Oncol. Rep., 2003, 5, San Miguel J.F., Vidriales M.B., Lopez-Berges C. et al.: Early immunophenotypical evaluation of minimal residual disease in acute myeloid leukemia identifies different patient risk groups and may contribute to postinduction treatment stratification. Blood, 2001;98: Orfao A., Lopez A., Flores J. et al.: Diagnosis of hematological malignancies: new applications for flow cytometry. Hematology, 2006, 2, Bain B.J., Barnett D., Linch D. et al.: Revised guideline on immunophenotyping in acute leukemias and chronic lymphoproliferative disorders. Clin. Lab. Hematol., 2002, 24, Heilmeier B., Buske C., Spiekermann K. et al.: Diagnostics, classification and prognostic criteria of acute myeloid leukemia. Med. Klin., 2007, 102, Ratei R., Karawajew L., Lacombe F. et al.: Discriminant function analysis as decision support system for the diagnosis of acute leukemia with a minimal four color screening panel and multiparameter flow cytometry immunophenotyping. Leukemia, 2007, 21, Craig F.E., Foon K.A.: Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood, 2008, 111, Praca została wykonana w ramach grantu zamawianego PBZ- KBN-119/PO5/02. Adres do korespondencji: prof. dr hab. Joanna Kopeć-Szlęzak Pracownia Immunofenotypowania Instytut Hematologii I Transfuzjologii ul. Indiry Gandhi Warszawa tel.: fax: facsiht@ihi.waw.pl

18 Nowiny Lekarskie 2008, 77, 4, WOJCIECH CHALCARZ 1, NATALIA POPIERZ 1, SYLWIA MERKIEL 1, ALICJA CHYBICKA 2 ZMIANY AKTYWNOŚCI FIZYCZNEJ MŁODZIEŻY PO PRZEBYTEJ CHOROBIE NOWOTWOROWEJ CHANGES IN PHYSICAL ACTIVITY IN YOUNG CANCER SURVIVORS 1 Zakład Żywności i Żywienia Akademia Wychowania Fizycznego w Poznaniu Kierownik: dr hab. Wojciech Chalcarz, prof. nadzw. AWF 2 Katedra i Klinika Transplantacji Szpiku, Onkologii i Hematologii Dziecięcej Akademia Medyczna we Wrocławiu Kierownik: prof. dr hab. med. Alicja Chybicka Streszczenie Wstęp. Jedną z ciągle niedocenianych możliwości prewencji pierwotnej i wtórnej chorób nowotworowych jest aktywność fizyczna. Cel pracy. Celem pracy była ocena zmian aktywności fizycznej młodzieży po przebytej chorobie nowotworowej. Metodyka. Badaniami ankietowymi dotyczącymi aktywności fizycznej przed przebytą chorobą nowotworową i po niej objęto 33 pacjentów Katedry i Kliniki Transplantacji Szpiku, Onkologii i Hematologii Dziecięcej Akademii Medycznej we Wrocławiu, w wieku lat, w tym 17 dziewcząt i 16 chłopców, uczniów szkół średnich. Ankieta zawierała pytania dotyczące ogólnych informacji o pacjentach oraz pytania dotyczące ich aktywności fizycznej przed chorobą i po niej. Statystyczną analizę wyników przeprowadzono za pomocą programu komputerowego SPSS 11,5 for Windows, stosując test niezależności w tabelach kontyngencji. Do analizy przyjęto podział badanej grupy ze względu na czynnik: aktywność fizyczna przed chorobą i obecnie płeć. Wyniki. Stwierdzono statystycznie istotny wpływ czynnika: aktywność fizyczna przed chorobą i obecnie płeć na odpowiedzi na pytania dotyczące: liczby sportów uprawianych w szkole, łatwości dostępu do infrastruktury rekreacyjnej, korzystania z infrastruktury rekreacyjnej oraz częstotliwości korzystania z obiektów infrastruktury rekreacyjnej. Wnioski. Spadek aktywności fizycznej młodzieży po przebytej chorobie nowotworowej wskazuje na konieczność opracowania dla niej programu aktywności fizycznej oraz podjęcie działań edukacyjnych w tym zakresie ukierunkowanych zarówno na pracowników służby zdrowia, jak i oświaty, a przede wszystkim na nauczycieli i trenerów. SŁOWA KLUCZOWE: aktywność fizyczna, młodzież, choroba nowotworowa. Summary Introduction. Physical activity is one of still underestimated possibilities of cancer prevention. Aim. The aim of this study was to assess physical activity in young cancer survivors. Material and methods. Questionnaires on physical activity before cancer diagnosis and after recovery where filled in by 33 patients of the Department and Clinic of Paediatric Oncology, Haematology and Bone Marrow Transplantation of the Wroclaw Medical University, aged 17 to 20 years, including 17 girls and 16 boys, who attended secondary schools. The questions concerned general information about the patients and their physical activity before cancer diagnosis and after recovery. Statistical analysis was carried out by means of the SPSS 11.5 for Windows computer programme using the independence test in the contingency tables. The studied population was divided according to the variable: physical activity before cancer diagnosis and after recovery-gender. Results. The variable physical activity before cancer diagnosis and after recovery-gender had statistically significant impact on the answers to the questions concerning the number of sports practised at school, the accessibility of recreational facilities, using recreational facilities and frequency of using recreational facilities. Conclusions. The observed decrease in physical activity of the studied population shows the need to work out a physical activity programme for them and to educate the health service staff, as well as teachers and coaches, on the importance of being physically active in cancer prevention and recovery. KEY WORDS: physical activity, youths, cancer. Wstęp Od lat w Polsce obserwuje się wzrost liczby zachorowań na nowotwory złośliwe. W ciągu ostatnich 40 lat liczba zachorowań u mężczyzn wzrosła 3,8 razy, a u kobiet 3 razy [1]. Choroby nowotworowe stanowią drugą po chorobach układu krążenia przyczynę niepełnosprawności na świecie [2]. Wśród nowotworów występujących w Polsce, nowotwory dziecięce stanowią 1 1,5%, co oznacza zachorowań w roku [3, 4]. Jedną z ciągle niedocenianych możliwości prewencji pierwotnej i wtórnej chorób nowotworowych jest aktywność fizyczna. Istnieją dowody, że odpowiednio dobrana aktywność fizyczna może zapobiegać takim chorobom nowotworowym, jak nowotwory piersi [2, 5, 6], nowotwory układu pokarmowego [5], nowotwory gruczołu krokowego [5], no-

19 Zmiany aktywności fizycznej młodzieży po przebytej chorobie nowotworowej 281 wotwory płuc [5], krtani [7, 8] oraz chłoniaki [9] lub pomóc w ich leczeniu. Natomiast niedostateczna lub niewłaściwa aktywność fizyczna jest uważana za jeden z czynników ryzyka zapadalności na niektóre nowotwory [7, 13]. Stwierdzono również, że zastosowanie ćwiczeń fizycznych wpływa korzystnie zarówno na chorych w trakcie leczenia, jak i po przebytej chorobie nowotworowej [10, 11, 12]. W tym celu opracowano specjalne zestawy ćwiczeń fizycznych dla rekonwalescentów [2, 6, 7, 8]. Niestety nie znaleziono prac, w których analizowano zmiany aktywności fizycznej pacjentów po przebytej chorobie nowotworowej. Cel Celem pracy była ocena zmian aktywności fizycznej młodzieży po przebytej chorobie nowotworowej. Metodyka Badaniami ankietowymi dotyczącymi aktywności fizycznej przed i po przebytej chorobie nowotworowej objęto 33 pacjentów Katedry i Kliniki Transplantacji Szpiku, Onkologii i Hematologii Dziecięcej Akademii Medycznej we Wrocławiu, w wieku lat, w tym 17 dziewcząt i 16 chłopców, uczniów szkół średnich. Ankieta zawierała pytania dotyczące ogólnych informacji o pacjentach oraz ich aktywności fizycznej przed chorobą i po niej. Statystyczną analizę wyników przeprowadzono za pomocą programu komputerowego SPSS 11,5 for Windows, stosując test niezależności w tabelach kontyngencji. Do analizy przyjęto podział badanej grupy ze względu na czynnik: aktywność fizyczna przed chorobą i obecnie płeć. Wyniki Informacje ogólne o pacjentach zamieszczono w tabeli 1. Natomiast ich zwykłą aktywność fizyczną, preferencje w zakresie aktywności fizycznej, aktywność fizyczną w szkole, uprawianie sportów, korzystanie z obiektów infrastruktury rekreacyjnej i korzyści płynące z aktywności fizycznej zestawiono, odpowiednio, w tabelach 2., 3., 4., 5., 6. i 7. Stwierdzono statystycznie istoty wpływ czynnika: aktywność fizyczna przed chorobą i obecnie płeć na odpowiedzi na pytania dotyczące: liczby sportów uprawianych w szkole, łatwości dostępu do infrastruktury rekreacyjnej, korzystania z infrastruktury rekreacyjnej oraz częstotliwości korzystania z obiektów infrastruktury rekreacyjnej. Tab. 1. Informacje ogólne o badanej grupie młodzieży [%] Table 1. General information about the studied population [%] Lp. Wskaźnik Płeć Ogółem Żeńska Męska (n = 33) (n = 17) (n =16) 1. Miejsce zamieszkania Województwo dolnośląskie 52,9 68,8 60,6 Województwo opolskie 47,1 31,3 39,4 Pierwsze 29,4 31,3 30,3 2. Kolejność dziecka w rodzinie Drugie 52,9 56,3 54,5 Trzecie 5,9 12,5 9,1 Piąte 11,8 0,0 6,1 Mięsaki 11,8 31,3 21,2 3. Rodzaj przebytej choroby Nieziarniczne chłoniaki 29,5 25,1 27,3 Nowotwór jajnika 5,9 0,0 3,0 Ziarnica złośliwa 52,9 43,8 48,5 1 2 lata 47,1 43,8 45,5 4. Czas od zakończenia terapii 3 4 lata 23,5 25,0 24,2 Ponad 5 lat 29,4 31,3 30,3 Chemioterapia 88,2 87,5 87,9 Hormonoterapia 5,9 6,3 6,1 Immunoterapia 5,9 0,0 3,0 5. Stosowany rodzaj terapii* Ingerencja chirurgiczna 58,8 62,5 60,6 Radioterapia 70,6 68,8 69,7 Transplantacja szpiku 5,9 12,5 9,1 Transplantacja krwinek 11,8 18,8 15,2 Inny rodzaj terapii 5,9 6,3 6,1 Bardzo dobra 17,6 12,5 15,2 6. Sytuacja ekonomiczna w rodzinie Dobra 58,8 68,8 63,6 Przeciętna 17,6 18,8 18,2 Zła 5,9 0,0 3,0 17 lat 35,3 18,8 27,3 7. Wiek 18 lat 29,4 56,3 42,4 19 lat 35,3 12,5 24,2 20 lat 0,0 12,5 6,1 * Niektórzy pacjenci byli poddani więcej niż jednej terapii.

20 282 Wojciech Chalcarz i inni Po przebytej chorobie zmniejszył się odsetek pacjentów płci obojga uprawiających sport w szkole. I tak, przed chorobą 23,5% dziewcząt oraz 56,3% chłopców uprawiało jeden rodzaj sportu, a po chorobie tylko 17,6% dziewcząt i 25,0% chłopców. Mimo że łatwość dostępu do infrastruktury rekreacyjnej po chorobie zwiększyła się w grupie dziewcząt z 35,3% do 52,9%, a w grupie chłopców nie zmieniła się i wyniosła 81,3%, to korzystanie z infrastruktury rekreacyjnej po przebytej chorobie zmniejszyło się w grupie dziewcząt z 35,3% do 29,4%, a w grupie chłopców z 87,5% do 37,5%. Zmniejszyła się również częstotliwość korzystania z obiektów infrastruktury rekreacyjnej. Tab. 2. Zwykła aktywność fizyczna [%] Table 2. Ordinary physical activity [%] Lp. Wskaźnik Płeć żeńska (n = 17) Przed chorobą Płeć męska (n = 16) Płeć żeńska (n = 17) Po chorobie Płeć męska (n = 16) Ogółem (n = 33) 1. Podejmowanie aktywności fizycznej 82,4 100,0 64,7 87,5 83,3 Codziennie 5,9 12,5 0,0 6,3 6, Czas poświęcony na aktywność fizyczną Liczba rodzajów aktywności fizycznych podejmowanych w czasie wolnym Chodzenie na spacery Ćwiczenia fizyczne w domu 2-3 godziny w tygodniu 17,6 18,8 29,4 37,5 25,8 4-5 godzin w tygodniu 23,5 31,3 17,6 18,8 22,7 6-7 godzin w tygodniu 17,6 18,8 5,9 12,5 13,6 Ponad 8 godzin w tygodniu 5,9 18,8 17,6 12,5 13,6 Nie przeznaczam czasu na aktywność fizyczną 29,4 0,0 29,4 12,5 18,2 Jeden 17,6 6,3 29,4 31,3 21,2 Dwa 47,1 37,5 41,2 37,5 40,9 Trzy 5,9 25,0 0,0 12,5 10,6 Cztery 17,6 31,3 11,8 12,5 18,2 Nie podejmuję aktywności fizycznej 11,8 0,0 17,6 6,3 9,1 Częściej niż raz w tygodniu 70,6 87,5 58,8 46,7 66,2 Raz w tygodniu 11,8 6,3 23,5 46,7 21,5 Raz w miesiącu 5,9 0,0 11,8 0,0 4,6 Rzadko lub wcale 11,8 6,3 5,9 6,7 7,7 3 razy w tygodniu lub częściej 5,9 31,3 5,9 33,3 18,5 Przynajmniej raz w tygodniu 41,2 25,0 41,2 26,7 33,8 Ćwiczę nieregularnie 23,5 25,0 35,3 33,3 29,2 Nie stosuję ćwiczeń 29,4 18,8 17,6 6,7 18,5 Tab. 3. Preferencje w zakresie aktywności fizycznej [%] Table 3. Preferences with regard to physical activity [%] Lp Wskaźnik Przed chorobą Płeć żeńska (n = 17) Płeć męska (n = 16) Płeć żeńska (n = 17) Po chorobie Płeć męska (n = 16) Ogółem (n = 33) Ulubiony Aktywny 47,1 81,3 35,3 50,0 53,0 i najczęściej Telewizja, Internet, książki, 11,8 0,0 29,4 31,3 18,2 wybierany spotkania ze znajomymi sposób spędzania codziennego książki, spotkania ze znajomymi Aktywny i telewizja, Internet, 11,8 18,8 11,8 18,8 15,2 czasu wolnego Brak odpowiedzi 29,4 0,0 23,5 0,0 13,6 Ulubiony Aktywny 58,8 56,3 41,2 43,8 50,0 11,8 0,0 29,4 37,5 19,7 11,8 31,3 5,9 12,5 15,2 Brak odpowiedzi 17,6 12,5 23,5 6,3 15,2 Jedna 47,1 81,3 41,2 50,0 54,5 Liczba rodzajów Dwie 17,6 6,3 17,6 18,8 15,2 ulubionych Trzy 5,9 6,3 5,9 0,0 4,5 aktywności fizycznych Cztery i więcej 0,0 6,3 5,9 6,3 4,5 Brak odpowiedzi 29,4 0,0 29,4 25,0 21,2 i najczęściej sposób spędzania Telewizja, Internet, książki, Aktywny i telewizja, Internet, wybierany weekendowego spotkania ze znajomymi książki, spotkania ze znajomymi czasu wolnego