GMO i inżynieria metaboliczna

Transkrypt

1 GMO i inżynieria metaboliczna

2 PCR

3

4

5 Elektroforeza DNA

6 Oczyszczanie DNA Lizat Frakcja rozpuszczalna Wiązanie do złoża Płukanie Elucja do nowej probówki

7 Enzymy restrykcyjne EcoRI z Escherichia coli DNA bakterii DNA człowieka...g AATTC......G AATTC......CTTAA G......CTTAA G... Bakteria Człowiek

8 Enzymy restrykcyjne EcoRI z Escherichia coli DNA bakterii DNA człowieka...g AATTC......G AATTC......CTTAA G......CTTAA G... Bakteria Człowiek

9 Enzymy restrykcyjne EcoRI z Escherichia coli DNA bakterii AATTC... G... DNA człowieka...g...cttaa...g AATTC... Bakteria...CTTAA G... Człowiek Ligaza DNA

10 Narzędzia w tworzeniu GMO Enzymy restrykcyjne Ligaza DNA

11 Klonowanie

12 Startery z over-hangami

13 Miejsce ułatwiające klonowanie Gen umożliwiający selekcję Element odpowiadający za amplifikację Promotor i terminator Wektory Pvu I(4426) Sgf I(4426) Sma I(4300) Cla I(4117) Nru I(4083) Eco57 I(3772) Kan ( ) Dra III(5127) f1 origin ( ) pet-28a(+) (5369bp) Bpu1102 I(80) Xho I(158) Not I(166) Eag I(166) Hind III(173) Sal I(179) Sac I(190) EcoR I(192) BamH I(198) Nhe I(231) Nde I(238) Nco I(296) Xba I(335) Bgl II(401) SgrA I(442) Sph I(598) laci ( ) Mlu I(1123) Bcl I(1137) BstE II(1304) Apa I(1334) BssH II(1534) EcoR V(1573) Hpa I(1629) Element umożliwiający regulację transkrypcji transgenu AlwN I(3640) BssS I(3397) ori (3286) BspLU11 I(3224) Sap I(3108) Bst1107 I(2995) Tth111 I(2969) Bgl I(2187) Fsp I(2205) Psp5 II(2230) PshA I(1968)

14 AlwN I(3640) BssS I(3397) Wektory Tth111 I(2969) BspLU11 I(3224) Sap I(3108) Bst1107 I(2995) Bgl I(2187) Fsp I(2205) Psp5 II(2230) PshA I(1 T7 promoter primer # pet upstream primer # Bgl II T7 promoter lac operator Xba I rbs Nco I His Tag Nde I Nhe I T7 Tag Eag I BamH I EcoR I Sac I Sal I Hind III Not I Xho I thrombin His Tag Bpu1102 I T7 terminator T7 terminator primer # pet-28a-c(+) cloning/expression region

15 AlwN I(3640) BssS I(3397) Wektory Tth111 I(2969) BspLU11 I(3224) Sap I(3108) Bst1107 I(2995) Bgl I(2187) Fsp I(2205) Psp5 II(2230) PshA I(1 T7 promoter primer # pet upstream primer # Bgl II T7 promoter lac operator Xba I rbs Nco I His Tag Nde I Nhe I T7 Tag Eag I BamH I EcoR I Sac I Sal I Hind III Not I Xho I thrombin His Tag Bpu1102 I T7 terminator T7 terminator primer # pet-28a-c(+) cloning/expression region

16 Chromatografia powinowactwa

17 Chromatografia powinowactwa Bardzo często stosuje się pary: unieruchomione jony Ni 2+ i 6xHis (tzw. His-tag)

18 Oczyszczanie i identyfikacja białka

19 Oczyszczanie i identyfikacja białka

20 Organizmy Modyfikowane Genetycznie

21 Etapy rozwoju GMO Krzyżowanie podobnych osobników Wytworzenie ras i odmian Rozwój genetyki klasycznej Sztuczne zwiększenie zmienności Rozwój genetyki molekularnej Ukierunkowanie zmienności

22

23

24

25 Zwiększenie zmienności genetycznej

26 Niektóre zmiany są korzystne, niektóre są niekorzystne, a pozostałe mogą nie mieć znaczenia...

27 Klasyczne GMO Wykorzystuje ogromną naturalną zmienność organizmów Umożliwia selekcję cech bez znajomości genów Proces powstawania jest stosunkowo wolny

28 Przezroczystą złotą rybkę otrzymano metodami genetyki klasycznej!

29 (Bardzo) ukierunkowane zmiany genetyczne

30 Białka fuzyjne DNA gen kodujący białko X GFP Transkrypcja Translacja białko X GFP

31 Śledzenie białka Tubulina

32 Śledzenie białka Tubulina

33 Śledzenie białka Tubulina

34

35 Ukierunkowane zmiany genetyczne Modyfikacja genetyczna organizmów jest możliwa, kiedy: genom biorcy został dobrze zbadany wprowadzany gen jest dobrze scharakteryzowany znane są metody umożliwiające wprowadzenie obcego DNA

36 Uprawy GMO

37 Uprawy GMO 1. soja (81% upraw, 11 krajów), 2. bawełna (81% upraw, 15 krajów), 3. kukurydza (35% upraw, 17 krajów), 4. rzepak (30% upraw, 4 kraje). Najczęściej są to rośliny Bt

38 Flavr Savr 1994 r. Wyciszenie syntezy poligalakturonazy za pomocą sirna GMO to nie tylko nowe cechy Zmiana może polegać na usunięciu lub wyciszeniu wybranego genu

39 sirna DNA RNA Białko

40 sirna DNA sirna RNA Białko

41 sirna DNA sirna RNA Białko Degradacja

42 Golden Rice 2000 r. Ryż zawierający duże ilości prowitaminy A (β-karotenu)

43 Synteza β-karotenu pirofosforan geranylogeranylu 2 pirofosforan fitoen ζ-karoten α-karoten likopen β-karoten

44 Synteza β-karotenu pirofosforan geranylogeranylu 2 pirofosforan fitoen ζ-karoten α-karoten likopen β-karoten

45 Kukurydza modyfikowana Zawiera lizynę, która rzadko występuje w naturalnych białkach kukurydzy

46 Odporność na herbicydy Roundup Uniemożliwienie syntezy niektórych aminokwasów Działa na większość gatunków roślin Rośliny Roundup-Ready nie są wrażliwe na herbicyd Roundup

47

48 Wielki głód w Irlandii ( )

49 Efekt wąskiego gardła

50

51

52 Klonowanie organizmów Powstanie identycznych, pod względem informacji genetycznej, organizmów Nadużywanie może doprowadzić do zmniejszenia zmienności genetycznej w populacji Rozmnażanie bezpłciowe zmniejsza zmienność genetyczną

53 Ukierunkowane zmiany genetyczne Mleko bez laktozy Modele choroby cukrzyca, otyłość, nowotwory itd.

54 Terapie genowe

55 Co jest przekazywane? Terapie genowe - komórki somatyczne Zmiany dotyczą jednego pokolenia Zmiany na poziomie zarodkowym Komórki rozrodcze także posiadają te zmiany i mogą one być przekazywane następnym pokoleniom

56 Introgresja Przepływ genów do puli innego gatunku lub populacji Jak zapobiegać? Izolacja osobników - szczególnie przeciwnej płci Męska sterylność - szczególnie w przypadku roślin

57 Znakowanie żywności GMO Żywność genetycznie zmodyfikowana to żywność zawierająca, składająca się lub wyprodukowana z GMO. Przepisy te nie mają zastosowania do produktów, w których ilość GMO jest mniejsza niż 0,9 %, pod warunkiem, że zawartość ta jest niezamierzona lub technicznie nieunikniona.

58 Zawartość GMO? Masa nasion zawierających transgen w genomie w stosunku do całej próby? Liczba nasion zawierających transgen w genomie w stosunku do całej próby? Liczba transgenów w stosunku do całkowitej liczby genomów w próbie?

59 zarodek (9%) bielmo (73%) owocnia (18%) (0,09 x 0,5 + 0,73 x 0,33) x 0,01 = 0, = 0,29%

60 Mały genom Duży genom W reakcji PCR używa się określonej ilości DNA

61 Roślina Ilość DNA w komórce Próg badań jakościowych Próg badań ilościowych Rzepak 1,15 pg 0,01% 0,12% Kukurydza 2,73 pg 0,03% 0,27% Soja 1,14 pg 0,01% 0,11% Pszenica 17,33 pg 0,17% 1,73%

62 Podsumowanie

63 Wykład 1 Funkcja białek zależy od ich kształtu Hydroliza H H H Cztery poziomy organizacji struktury białek H2N C C CH2 O C O N C COOH CH2 C O OH H N Wynik hydrolizy białek H

64 Wykład 1 Znaczenie wykresu Ramachandrana Najważniejsze struktury drugorzędowe Wykres Ramachandrana +130 o -40 o -90 o -60 o Najczęstsze kombinacje wartości kątów ψ i ϕ to... Mechanizmy fałdowania białek 1. PrP C PrP Sc Rola mostków dwusiarczkowych 2. Szczególne cechy prionów 3.

65 Denaturacja, koagulacja A teraz o białkach Zrozumienie obu procesów biochemicznych Doświadczenie Anfinsena jako przykład odwracalnej denaturacji białek Co właściwie znaczy ścięcie się białka? Roztwór białek, to po prostu roztwór - - nie ulega koagulacji, bo nie jest roztworem koloidalnym. Funkcjonalne białko o właściwej konformacji denaturacja renaturacja zmiana struktury pierwszorzędowej (proteoliza) Niefunkcjonalne, zdenaturowane białko o innej konformacji zmiana stanu skupienia koagulacja Agregat Denaturacja a denaturacja Mocznik rozpuszczalne (bez koagulacji) Temperatura nierozpuszczalne (po koagulacji)

66 Wykład 2 Prawidłowa budowa DNA i jej konsekwencje biologiczne Budowa materiału genetycznego: od nukleotydów przez nukleosomy do chromatyny Fragmenty Okazaki 3 5 Jak komórka rozwiązuje brak aktywności syntezy DNA w kierunku 3 -> 5? 5 3

67 Wykład 2 Czynnik transkrypcyjny Kod genetyczny: definicja, jego uniwersalność i błędne stosowanie w mediach i ustawie Gen SRY Rola czynników transkrypcyjnych Single Nucleotide Polymorphism Wady i zalety masowego sekwencjonowania

68 Wykład 3 Klasyfikacja enzymów Kinetyka Michaelisa-Menten Rola enzymów w komórce Wpływ temperatury i ph na aktywność enzymów Szybkość początkowa reakcji Stężenie substratu Cechy centrum aktywnego enzymu Dlaczego początkowa? Sposoby regulacji aktywności enzymów: proenzym i inhibitory Glukometr

69 Wykład 4 Hemaglutynina Neuraminidaza Budowa cukrowców (uwaga na dihydroksyaceton!) Wiązanie glikozydowe Rola glikokaliksu w zakażeniach wirusowych Etapy glikolizy Dlaczego metabolizm kroczy małymi krokami?

70 Wykład 4 Ogólne spojrzenie na glikolizę Czyli? Wynik glikolizy! Regulacja glikolizy Synteza i degradacja glikogenu Degradacja glikogenu Glikogen (n) + Pi Glikogen (n-1) + Glukozo-1-fosforan Glukozo-6-fosforan 1 x Glukoza 2 x Pirogronian Zysk... 2 x NADH 2 x ATP Regulacja glikolizy Krok 1: Heksokinaza Grupa izoenzymów (-) G6P W wątrobie glukokinaza o wysokim K M i niewrażliwa na G6P Krok 3: Fosfofruktokinaza (+) F2,6BP i AMP Krok 10: Kinaza pirogronianowa (+) F1,6BP i PEP Glukoza Glikoliza (-) ATP

71 Wykład 5 Budowa lipidów Funkcje fosfolipidów Dwuwarstwa lipidowa Liposom Woda ω-3 i ω-6 są egzogenne Micele Woda Woda Woda Rola fosfo-, sfingo- i Woda Sfingomielina glikolipidów Hormony steroidowe Glikolipidy Cerebrozydy" Ceramid (sfingozyna + KT) + monosacharyd" Gangliozyd" Ceramid (sfingozyna + KT) + oligosacharyd" Kwas N-acetyloneuraminowy (kwas sialowy)" Glikokaliks" Receptory

72 Wykład 5 Bilans β-oksydacji Przy aktywacji i jednym cyklu" β-oksydacja: procesy i bilans Dlaczego w komórce występuje NADH i NADPH?! Strata 1 ATP na aktywację KT (tylko w pierwszym cyklu!)" Zysk 1 FADH2, 1 NADH i 1 acetylo-coa" Acylo-CoA krótszy o 2 atomy węgla" Kolejny cykl β-oksydacji Synteza cholesterolu Synteza TAG i steroidów: najważniejsze metabolity

73 Wykład 6 Co dalej z Ac-CoA? Co dalej z Ac-CoA? Bilans cyklu Krebsa Fizjologiczna rola ciał ketonowych Sposób działania łańcucha transportu elektronów szczawiooctan cytrynian Odróżnienie go od fosforylacji oksydacyjnej! Rozprzęganie mitochondriów A jak nie ma tlenu? Porównanie bilansu oddychania tlenowego i fermentacji Sens fermentacji

74 Wykład 7 Tetrahydrofolian Oznaczenie ubikwityną i degradacja w proteasomie Rola transaminacji w degradacji AA THF a metabolizm AA Metionina jako szczególny AA w obiegu grup metylowych Metionina Metaboliczne znaczenie szlaku glioksylanowego Glukoneogeneza: substraty i nakład energii

75 Wykład 8 Rola kwasu glutaminowego w wiązaniu azotu i usuwaniu grup aminowych z AA Cykl ornitynowy Synteza kofaktora CPS Amoniak może pochodzić z: działania dehydrogenazy kwasu glutaminowego metabolizmu bakterii z przewodu pokarmowego kwas glutaminowy α-c kwas glutaminowy Cykl mocznikowy Cykl ornitynowy Rozmaite aminokwasy Transaminacja Dehydrogenaza kwasu glutaminowego Syntaza glutaminowa 2-oksoglutaran glutamina Glutamina Deaminacja α-c Szlak przekazywania sygnału z udziałem białka G Fumaric acid

76 Wykład 8 Cykl alaninowo-glukozowy Cykl alaninowo-glukozowy Tlenek azotu jako przekaźnik sygnałów w komórce Zasada działania NO Zastosowanie inhibitora fosfodiesterazy cgmp

77 Wykład 9 Synteza zasad azotowych: dlaczego są dwie CPS? Co to jest dna moczanowa i jak sobie z nią radzić? Jak dochodzi do uwolnienia insuliny z komórek B?

78 Wykład 9 Co właściwie robi insulina? Oporność na insulinę Molekularne podłoże insulinooporności komórek! PKC Działanie glukagonu: camp Fosforoliza glikogenu Przeciwdziałanie glikolizie Fosfofruktokinaza 2 Glukagon PKA/cAMP F2,6BP Fosforylacja Dlaczego myszy ob/ob są otyłe? Fosfofruktokinaza 2 Glukoneogeneza F6P Fosfofruktokinaza 1 F1,6BP

79 Wykład 10 Rola AMPK Jakie znaczenie ma stosunek ATP:AMP pod względem funkcji AMPK? Czy ATP przechowuje energię? ATP:ADP:AMP = 100:10:1 1 kj = 0, kcal 337 kj = 80,49 kcal ATP => ADP + Pi daje ok. 31 kj/mol 1 mol = 6,02 x cząsteczek 337 kj jest magazynowane w 10,9 mol ATP Czyli 6,6 x cząsteczek ATP ATP waży 507,1 g/mol Czyli energia z jednego batonika jest magazynowana w 5,56 kg ATP!

80 PKC Wykład 10 Cukrzyca typu II Profile metaboliczne różnych stanów Oporność na insulinę Pierwotnym źródłem oporności tkanek na insulinę jest otyłość i duża ilość tkanki tłuszczowej Co to jest mikrobiom? Mikrobiom Do 3% masy ciała Wielokrotnie więcej genów niż w genomie człowieka

81 Wykład 11 PCR, do czego mogą przydać się tzw. over-hangi? Cechy wektorów do klonowania molekularnego Ewolucja na naszych oczach Tworzenie białek fuzyjnych Śledzenie białka Tubulina

82 Wykład 11 Przykłady modyfikacji genetycznych Dlaczego rośliny częściej są GMO? Co to znaczy zawartość GMO? (0,09 x 0,5 + 0,73 x 0,33) x 0,01 = 0, = 0,29% Metody wykrywania GMO

83 Przykładowe pytania

84 1.5. # Mostki dwusiarczkowe nie występują w białkach wewnątrzkomórkowych, ponieważ: a. w ich tworzeniu biorą udział aminokwasy niewystępujące w białkach wewnątrzkomórkowych. b. w ich tworzeniu bierze udział enzym obecny jedynie poza komórką. c. w komórce panuje środowisko utleniające i ulegają one utlenieniu. d. w komórce panuje środowisko redukujące i ulegają one redukcji.

85 2.6. Białko kodowane przez gen SRY znajdujący się jedynie w chromosomie Y jest: a. czynnikiem transkrypcyjnym umożliwiającym transkrypcję genów związanych z cechami męskimi. b. enzymem powielającym geny związane z cechami męskimi. c. białkiem strukturalnym niezbędnym w utrzymaniu mięśni. d. hormonem regulującym pojawianie się cech męskich.

86 3.3. Na schemacie 1. przedstawiono cząsteczkę aktywnego enzymu z zaznaczonym centrum aktywnym. Czym może być grupa atomów zaznaczona kolorem czarnym na schemacie 2.? a. inhibitorem współzawodniczącym. b. substratem enzymu. c. fragmentem proenzymu, który jest usuwany podczas aktywacji enzymu. d. wszystkie wyżej wymienione odpowiedzi [(a), (b) i (c)] są prawidłowe.

87 4.4. Fosfofruktokinaza 2 fosforyluje fruktozo-6-fosforan do fruktozo-2,6-bisfosforanu. Związek ten jest aktywatorem: a. fosfofruktokinazy 1, dzięki której fruktozo-6- fosforan podlega przemianom glikolizy. b. fosfofruktokinazy 1, dzięki której fruktozo-6-fosforan podlega przemianom glukoneogenezy. c. kinazy pirogronianowej, dzięki której fruktozo-6- fosforan podlega przemianom glikolizy. d. kinazy pirogronianowej, dzięki której fruktozo-6- fosforan podlega przemianom glukoneogenezy.

88 4.7. # Produktem fosforolizy glikogenu jest glukozo-1- fosforan. Fosfoglukomutaza umożliwia przemianę tego związku do glukozo-6-fosforanu (G6P), zaś fosfataza glukozo-6-fosforanowa umożliwia otrzymanie glukozy z G6P. Biorąc pod uwagę rolę wątroby i mięśni szkieletowych, określ występowanie obu enzymów w tych tkankach. Wątroba Mięśnie szkieletowe Fosfoglukomutaza Fosfataza G6P Fosfoglukomutaza Fosfataza G6P a. Nie występuje Występuje Występuje Nie występuje b. Występuje Nie występuje Nie występuje Występuje c. Występuje Występuje Występuje Występuje d. Występuje Występuje Występuje Nie występuje

89 5.2. Ile cząsteczek acetylo-coa powstaje w wyniku β- oksydacji jednej cząsteczki kwasu tłuszczowego 20:0? Z ilu cząsteczek glukozy w warunkach tlenowych można uzyskać taką samą liczbę cząsteczek acetylo-coa? a. 5 cząsteczek acetylo-coa z kwasu tłuszczowego 20:0; z 5 cząsteczek glukozy. b. 5 cząsteczek acetylo-coa z kwasu tłuszczowego 20:0; z 10 cząsteczek glukozy. c. 10 cząsteczek acetylo-coa z kwasu tłuszczowego 20:0; z 5 cząsteczek glukozy. d. 10 cząsteczek acetylo-coa z kwasu tłuszczowego 20:0; z 10 cząsteczek glukozy.

90 6.4. DNP (2,4-dinitrofenol) to sztuczny związek organiczny umożliwiający przepływ protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Związek ten powoduje, że: a. zmniejsza się produkcja ATP i energia rozpraszana jest w postaci ciepła. b. zwiększa się produkcja ATP i energia rozpraszana jest w postaci ciepła. c. NADH nie może być utleniony do NAD + w kompleksie I łańcucha transportu elektronów. d. FADH 2 nie może być utleniony do FAD w kompleksie II łańcucha transportu elektronów.

91 7.4. Aminokwasy glukogenne u ludzi: a. nie są poddawane przemianom w cyklu Krebsa. b. nie są poddawane przemianom w cyklu glioksylanowym. c. są substratem glukoneogenezy. d. wszystkie odpowiedzi [(a), (b) i (c)] są prawidłowe.

92 8.5. # Acetylocholina to związek pojawiający się m.in. na skutek pobudzenia seksualnego. Sygnał ten wywołuje produkcję tlenku azotu, który aktywuje enzym przeprowadzający syntezę cgmp. Związek ten ostatecznie wpływa na poszerzenie naczyń krwionośnych powodując m.in. wzwód u mężczyzn. Sildenafil to skuteczny inhibitor enzymu rozkładającego cgmp, który jest substancją czynną w tabletkach Viagra. Stosowanie tabletki Viagra u mężczyzn powoduje: a. pojawienie się wzwodu bez pobudzenia seksualnego. b. utrzymanie wzwodu, pod warunkiem, że trwa pobudzenie seksualne. c. utrzymanie wzwodu, nawet po wygaśnięciu pobudzenia seksualnego. d. wzmożone pobudzenie seksualne.

93 8.5. # Acetylocholina to związek pojawiający się m.in. na skutek pobudzenia seksualnego. Sygnał ten wywołuje produkcję tlenku azotu, który aktywuje enzym przeprowadzający syntezę cgmp. Związek ten ostatecznie wpływa na poszerzenie naczyń krwionośnych powodując m.in. wzwód u mężczyzn. Sildenafil to skuteczny inhibitor enzymu rozkładającego cgmp, który jest substancją czynną w tabletkach Viagra. Stosowanie tabletki Viagra u mężczyzn powoduje: a. pojawienie się wzwodu bez pobudzenia seksualnego. b. utrzymanie wzwodu, pod warunkiem, że trwa pobudzenie seksualne. c. utrzymanie wzwodu, nawet po wygaśnięciu pobudzenia seksualnego. d. wzmożone pobudzenie seksualne.

94 # Zjedzenie batonika dostarcza 337 kj energii. Biorąc pod uwagę następujące wiadomości, oblicz w jakiej masie ATP byłaby zmagazynowana energia wynikająca z całkowitego utlenienia składników odżywczych zawartych w batoniku. - Reakcja ATP -> ADP + P i daje ok. 31 kj/mol - 1 mol = 6,02 x cząsteczek - Masa cząsteczkowa ATP wynosi 507,1 g/mol a. ok. 5,6 mg. b. ok. 56 mg. c. ok. 5,6 kg. d. ok. 56 kg.