MAŁGORZATA DAWIDOWSKA, JACEK WACHOWIAK. Streszczenie. Summary

Transkrypt

1 Nowiny Lekarskie 2007, 76, 3, MAŁGORZATA DAWIDOWSKA, JACEK WACHOWIAK ROZWÓJ BADAŃ MOLEKULARNYCH W HEMATOONKOLOGII MONITOROWANIE MINIMALNEJ CHOROBY RESZTKOWEJ W OSTREJ BIAŁACZCE LIMFOBLASTYCZNEJ I POTRANSPLANTACYJNEGO CHIMERYZMU HEMATOPOETYCZNEGO DEVELOPMENT IN MOLECULAR BIOLOGY APPLICATION IN HAEMATOONCOLOGY MONITORING OF MINIMAL RESIDUAL DISEASE IN ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKAEMIA AND POST-TRANSPLANT HAEMATOPOIETIC CHIMERISM Klinika Onkologii, Hematologii i Transplantologii Pediatrycznej Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Kierownik: prof. dr hab. med. Jacek Wachowiak Streszczenie Minimalna choroba resztkowa to populacja przetrwałych komórek nowotworowych, zazwyczaj poniżej progu czułości standardowych technik diagnostycznych, która może zainicjować wznowę. Poziom choroby resztkowej uznawany jest za nadrzędny czynnik prognostyczny w ostrej białaczce limfoblastycznej. Chimeryzm potransplantacyjny to zjawisko współwystępowania w organizmie biorcy własnych komórek hematopoetycznych z komórkami dawcy. Monitorowanie chimeryzmu umożliwia ocenę przyjęcia przeszczepu, a przy odpowiedniej częstotliwości badań, także wczesne wykrywanie wznowy. W pracy przedstawiono postęp w monitorowania chimeryzmu potransplantacyjnego i minimalnej choroby resztkowej, poczynając od metod niemolekularnych na nowoczesnych technikach biologii molekularnej kończąc. Przedstawione tendencje rozwojowe można jednak, w bardziej uniwersalny sposób, odnieść do postępu w badaniach molekularnych w hematoonkologii. SŁOWA KLUCZOWE: minimalna choroba resztkowa, chimeryzm komórek hematopoetycznych, ostra białaczka limfoblastyczna, monitorowanie leczenia. Summary Minimal residual disease is a population of residual malignant cells, usually below the sensitivity threshold of standard diagnostic techniques, which may initiate disease relapse. The level of residual disease is regarded as the most powerful prognostic factor in acute lymphoblastic leukaemia. Post-transplant chimerism is a phenomenon of coexistence of donor s and recipient s haematopoietic cells in the patient. Monitoring of post-transplant chimerism enables assessment of engraftment and early detection of disease relapse, provided that appropriate strategy and timing are applied. This review focuses on development in post-transplant chimerism and minimal residual disease monitoring, from early pre-molecular methods till novel molecular strategies. However, the trends presented in the review address the development in molecular biology applications in haematooncology in a more universal manner. KEY WORDS: minimal residual disease, hematopoietic chimerism, acute lymphoblastic leukaemia, outcome monitoring. Minione półwiecze, a w szczególności lata 90., bez wątpienia uznać można za okres gwałtownego rozwoju diagnostyki molekularnej. Współczesna medycyna w coraz większym stopniu polega na osiągnięciach w dziedzinie biologii molekularnej i biotechnologii. Dotyczy to zarówno poziomu podstawowego, tj. badań naukowych nad etiologią chorób, stanowiących podstawę dla opracowywania nowych testów diagnostycznych i metod terapeutycznych, jak również poziomu praktycznego zastosowania tych odkryć oraz technik biologii molekularnej w rutynowych badaniach medycznych. W dziedzinie hematoonkologii badania molekularne przyczyniają się do: poznawania molekularnych mechanizmów nowotworzenia precyzyjnej diagnostyki nowotworów hematologicznych nowoczesnej klasyfikacji pacjentów do grup ryzyka, w oparciu o parametry molekularne precyzyjnej oceny odpowiedzi na zastosowaną terapię oceny tzw. chimeryzmu poprzeszczepowego u dzieci poddanych transplantacji monitorowania tzw. choroby resztkowej w trakcie leczenia i po jego zakończeniu wczesnego wykrywania (na poziomie molekularnym) wznowy choroby i odrzucenia przeszczepionego szpiku modyfikacji terapii i podjęcia działań interwencyjnych w wyżej wymienionych sytuacjach. Najlepszym przykładem wykorzystania metod biologii molekularnej w realizacji wymienionych zadań w hematoonkologii są badania chimeryzmu potransplantacyjnego i minimalnej choroby resztkowej. Stanowią one jednocześnie dogodny model do zaprezentowania głównych tendencji w rozwoju badań molekularnych na polu hematoonkologii.

2 Rozwój badań molekularnych w hematoonkologii monitorowanie minimalnej choroby resztkowej Definicja i znaczenie badań MRD Terminem minimalnej choroby resztkowej (ang. minimal residual disease, MRD) określa się populację przetrwałych komórek białaczkowych, których nie zdołano wytrzebić w trakcie leczenia, a które mogą zapoczątkować wznowę choroby [1]. Zazwyczaj, poziom choroby resztkowej znajduje się poniżej progu czułości standardowych technik diagnostycznych, jak mikroskopia świetlna czy klasyczna cytogenetyka. Stąd ogromne znaczenie w wykrywaniu i ilościowej ocenie poziomu MRD zyskały techniki molekularne, szczególnie oparte o łańcuchową reakcję polimerazy (ang. polymerase chain reaction, PCR), pozwalające na wykrywanie przetrwałych komórek białaczkowych z dużą czułością. Znaczenie monitorowania poziomu choroby resztkowej z użyciem techniki PCR zostało już ustalone w przypadku ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL), ale także ostrej i przewlekłej białaczki szpikowej (AML i CML) oraz chłoniaka ziarniczego (FCL) [2]. Badania choroby resztkowej mają jednak różne znaczenie w zależności od rozpoznania. Na przykład u dzieci z CML i APL (ostra białaczka promielocytowa) monitorowanie poziomu choroby resztkowej ma charakter systematyczny i pozwala na podejmowanie skutecznych działań interwencyjnych i modyfikację terapii [1]. Natomiast w przypadku ALL, podstawową wartość prognostyczną mają oznaczenia poziomu MRD dla oceny odpowiedzi na leczenie w fazie indukcji remisji, co stanowi podstawę dla stratyfikacji dalszego leczenia, poprzez odpowiedni dla grupy ryzyka, dobór protokołów terapeutycznych [3, 4]. Stratyfikacja oparta o kryterium poziomu MRD umożliwia zastosowanie bardziej intensywnego leczenia u pacjentów z grupy wysokiego ryzyka oraz na ograniczenie intensywności leczenia, a tym samym występowania efektów ubocznych związanych z toksycznością chemioterapii, w przypadku pacjentów w mniejszym stopniu zagrożonych wznową choroby. Znamienna, niezależna i nadrzędna, w stosunku do innych czynników prognostycznych, wartość oznaczeń poziomu MRD w ALL została wykazana w badaniach wiodących ośrodków hematoonkologicznych w Europie Zachodniej [5]. Ponadto, badanie choroby resztkowej znajduje zastosowanie w wyznaczaniu grup ryzyka przed planowaną transplantacją komórek krwiotwórczych (ang. hematopoietic stem cell transplantation, HSCT), na podstawie ustalonego związku między przedtransplantacyjnym poziomem MRD a wynikami leczenia z zastosowaniem HSCT [6]. Wybór techniki badania choroby resztkowej uzależniony jest od rodzaju markera molekularnego charakteryzującego wykrywane komórki białaczkowe. Do markerów takich, w przypadku ALL, należą antygeny powierzchniowe komórek białaczkowych, geny fuzyjne, będące efektem translokacji chromosomowych, ale przede wszystkim, ze względu na wysoką specyficzność i możliwość zastosowania u większości pacjentów, rearanżacje genów kodujących immunoglobuliny i receptory limfocytów T (Ig/TCR). Istotny jest również wybór techniki o jak najwyższej czułości. Stąd obecnie stosowane metody wykrywania MRD w ALL to wieloparametryczna cytofluorymetria przepływowa, wykonywana w oparciu o ekspresję białaczkowospecyficznych antygenów na powierzchni blastów (czułość ) oraz metody molekularne, wykorzystujące reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (ang. real-time PCR, RQ-PCR) do ilościowej oceny poziomu komórek posiadających rearanżacje genów Ig/TCR lub, charakterystyczne dla ALL, geny fuzyjne (czułość ) [1, 9]. Rearanżacje genów Ig/TCR stanowią specyficzne dla każdego pacjenta markery do wykrywania przetrwałych komórek białaczkowych. Rearanżacje te są integralnym elementem procesu dojrzewania limfocytów, a ze względu na klonalny charakter rozrostów białaczkowych, określane są mianem markerów klonalności. Miejsca złącz zrearanżowanych genów, w których dochodzi do insercji i delecji przypadkowych nukleotydów, określa się jako genetyczne odciski palca danej białaczki (danego pacjenta). Monitorowanie choroby resztkowej przy pomocy tych markerów jest możliwe u ponad 95% pacjentów z ALL [1]. Geny fuzyjne, ze względu na ich ograniczone występowanie w ALL, znajdują zastosowanie jako markery do badania poziomu choroby resztkowej w przypadku około 45% pacjentów z B-prekursorową ALL (np. BCR- ABL, TEL-AML,, MLL-AF4) i około 35% pacjentów z T-ALL (np. SIL-TAL1). W przypadku AML, geny fuzyjne (np. AML1-ETO, PML-RARA) znajdują zastosowanie jako markery do badań MRD u około 30% pacjentów. Znaczenie tych markerów w monitorowaniu MRD jest natomiast dużo większe np. w przypadku CML, ze względu na występowanie markerowej translokacji t(9;22) i genu fuzyjnego BCR-ABL u około 90% pacjentów. Definicja i znaczenie badań chimeryzmu Chimeryzm to zjawisko, do którego dochodzi po allogenicznej transplantacji komórek krwiotwórczych, na skutek której pacjent staje się molekularną chimerą, ze względu na współistnienie w jego organizmie komórek o dwóch różnych genotypach. Pojecie chimeryzmu zainspirowane zostało postacią chimery z mitologii starożytnych Greków, która stanowiła połączenie lwa, kozy i węża. W hematologii termin chimeryzmu komórek hematopoetycznych zrodził się na gruncie transplantologii eksperymentalnej w połowie lat 50. XX wieku. Wtedy to Ford i współpracownicy, używając markerów chromosomowych wykazali, że przeszczepione komórki zwierzęcia-dawcy wykazują z upływem czasu stopniowy wzrost liczebności w organizmie biorcy [7]. Zwierzęta, u których wykryto chimeryzm hematopoetyczny nazwali radiacyjnymi

3 284 Małgorzata Dawidowska i inni chimerami, ze względu na sposób przygotowania do transplantacji. Sukcesy pierwszych allogenicznych transplantacji szpiku kostnego u ludzi zainspirowały dalsze zainteresowanie zjawiskiem chimeryzmu i jego znaczeniem dla prognozowania powodzenia leczenia [8]. Zjawisko chimeryzmu po allo-hsct może przyjmować różną postać (tabela 1.). Jeśli w układzie hematopoetycznym biorcy wykrywa się wyłącznie komórki pochodzące od dawcy, mówimy o chimeryzmie pełnym (ang. complete chimerism, CC). Sytuację współwystępowania komórek dawcy i biorcy, określa się jako chimeryzm mieszany (ang. mixed chimerism, MC), natomiast wykrycie w układzie hematopoetycznym wyłącznie własnych komórek pacjenta świadczy o braku chimeryzmu. Przed wprowadzeniem technik umożliwiających analizę ilościową, sam fakt wystąpienia MC uznawano za zły czynnik prognostyczny i zapowiedź wznowy. Obecnie definiuje się trzy rodzaje mieszanego chimeryzmu: przejściowy MC, trwały MC i progresywny MC [9]. Znaczenie poszczególnych typów chimeryzmu potransplantacyjnego przedstawione jest w tabeli 1. Badania chimeryzmu rozwijały się niemal równolegle z postępem w transplantologii. Zjawisko chimeryzmu analizowane było w różnorodnych aspektach, np. w zależności od wskazania do transplantacji (choroby rozrostowe a nierozrostowe), typu dawcy komórek krwiotwórczych (rodzeństwo lub dawca niespokrewniony, w pełni lub częściowo zgodni w zakresie układu HLA), typu transplantacji (transplantacja szpiku kostnego a transplantacja komórek hematopoetycznych krwi obwodowej), sposobu przygotowania do przeszczepu (mieloablacyjne kondycjonowanie a przygotowanie o zmniejszonej intensywności), czy w zależności od badanego materiału (pełna krew/szpik a izolowane subpopulacje komórek). Obecnie uznaje się, że znaczenie badań chimeryzmu uzależnione jest od uwarunkowań kliniczno-terapeutycznych. Podstawową przesłankę do monitorowania stanu pacjentów po allo-hsct, poprzez badania chimeryzmu, stanowi możliwość oceny i dokumentacji przyjęcia przeszczepionych komórek bądź ewentualnego ich odrzucenia, co ma szczególne znaczenie po transplantacji od tzw. dawców niespokrewnionych. W przy-padku białaczek, badania chimeryzmu mogą mieć również znaczenie dla wczesnego wykrywania wznowy, co jednak wciąż pozostaje nieco kontrowersyjne, szczególnie w odniesieniu do białaczek ostrych [10]. Uważa się, że przydatność badań chimeryzmu w wykrywaniu wznowy jest ściśle uzależniona od rozpoznania zastosowanej metody oraz częstotliwości badań chimeryzmu. Obecnie powszechną metodą badania chimeryzmu potransplantacyjnego jest technika reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z użyciem starterów znakowanych fluorescencyjnie, w połączeniu z automatyczną analizą długości sekwencji w czasie rozdziału elektroforetycznego w sekwenatorze [11]. Do genotypowania, tj. odróżniania komórek dawcy od komórek biorcy, wykorzystuje się polimorfizm markerów mikrosatelitarnych, czyli krótkich powtórzeń tandemowych (ang. short tandem repeats, STR), stąd metodę tę określa się nieraz terminem fluorescencyjnej STR- PCR. Długość sekwencji STR w danym locus zależy od ilości powtórzeń motywu nukleotydowego (1 6 nt; powtórzonych razy), co stanowi podstawę do identyfikacji genotypów [12]. W sytuacji wykrycia chimeryzmu mieszanego, każdorazowo wykonuje się analizę ilościową, aby ustalić procentową zawartość komórek dawcy i biorcy w badanym materiale. Systematyczne badanie chimeryzmu, w odpowiednio krótkich (np. cotygodniowych) odstępach czasu pozwala śledzić dynamikę zmian chimeryzmu i skutecznie monitorować zagrożenie odrzucenia przeszczepu i/lub wystąpienia wznowy choroby rozrostowej układu krwiotwórczego (białaczki, zespół mielodysplastyczny, chłoniaki). Ważne etapy w rozwoju badań molekularnych w hematoonkologii na przykładzie badań nad chorobą resztkową i chimeryzmem potransplantacyjnym Rozwój technik monitorowania chimeryzmu potransplantacyjnego i minimalnej choroby resztkowej doskonale obrazują postęp, jaki dokonał się w badaniach molekularnych na przestrzeni ostatnich 20 lat. Ujęcie historii tych badań poczynając od okresu przedmolekularnego, a na najnowocześniejszych molekularnych metodach kończąc, pozwala zauważyć pewne podstawowe tendencje rozwojowe. Są one wspólne nie tylko dla badań chimeryzmu i MRD, ale także dla innych zastosowań technik molekularnych w hematoonkologii i w ogólnie pojmowanych badaniach medycznych. Tendencje te określić można następująco: zmiana poziomu dostępnego analizie przejście od analizy jakościowej do ilościowej zwiększanie czułości analizy standaryzacja metod analizy i interpretacji wyników. Najbardziej oczywistą i podstawową konsekwencją wprowadzenia metod biologii molekularnej do badań medycznych, w tym także na gruncie hematoonkologii, było umożliwienie przejścia z poziomu komórkowego prowadzonych badań na poziom molekularny. Oznacza to możliwość analizowania zjawisk w sposób całkowicie dotąd niedostępny, bądź wykrywania zjawisk na dużo wcześniejszym, bo molekularnym, etapie, co np. w przypadku wznowy choroby ma kluczowe znaczenie dla powodzenia leczenia. Ten ważny krok, bez wątpienia, określić można mianem swoistej rewolucji molekularnej. Dzięki tej rewolucji możliwe stało się wykrywanie na poziomie molekularnym obecności przetrwałych komórek białaczkowych lub współistnienia w układzie hematopoetycznym pacjenta komórek dawcy i biorcy. Jednak samo stwierdzenie obecności choroby resztkowej czy chimeryzmu ma ograniczone znaczenie prognostyczne.

4 285 Rozwój badań molekularnych w hematoonkologii monitorowanie minimalnej choroby resztkowej Stąd niezwykle ważnym krokiem było zastąpienie metod analizy jakościowej technikami ilościowymi, które, umożliwiając określenie poziomu MRD i procentowego udziału komórek dawcy i biorcy, pozwalają monitorować dynamikę tych zjawisk w trakcie leczenia. Równie istotne było stopniowe zwiększanie czułości technik badania jakości remisji, rozumianej jako poziom choroby resztkowej i chimerymu od około , w przypadku mikroskopii świetlnej, klasycznej cytogenetyki i tradycyjnych technik hybrydyzacji DNA, poprzez blisko 10-3, dla fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) aż do czułości , charakteryzującej technikę PCR, w szczególności PCR w czasie rzeczywistym (tabela 2.). Intensywny postęp badań nad znaczeniem prognostycznym oznaczeń chimeryzmu i MRD w praktyce klinicznej, rozwój nowych technik i strategii badawczych oraz poszukiwanie nowych markerów molekularnych doprowadziły do konieczności standaryzacji metod i interpretacji uzyskiwanych wyników. Tendencja ta widoczna jest zarówno w obszarze badań chimeryzmu, jak i choroby resztkowej, w postaci: debat prowadzonych na łamach czołowych czasopism w dziedzinie hematologii, sympozjów, spotkań warsztatowych i konferencji oraz programów badawczych i edukacyjnych [11, 13, 14, 15, 16]. Rozwój badań choroby resztkowej Przez wiele lat jedyną dostępną metodą oceny remisji białaczki była cytomorfologiczna ocena szpiku przy użyciu mikroskopii świetlnej. Ze względu na niewystarczającą czułość tej techniki, nie przekraczającą 1 5%, nie pozwalała ona na wykrywanie choroby resztkowej. Stąd poszukiwano technik o odpowiedniej czułości (przynajmniej 10-3 ), specyficzności, zapewniających powtarzalność wyników i możliwość zastosowania w rutynowym monitorowaniu pacjentów. Jednak spełnienie wszystkich tych kryteriów stanowi niełatwe wyzwanie. Pierwsze metody wykrywania choroby resztkowej, jak te oparte o techniki hodowli in vitro komórek pobranych od pacjentów w remisji białaczki (ang. colony assay), charakteryzowały się dużą niedoskonałością, przede wszystkim ze względu na trudności w uzyskaniu powtarzalnych wyników [17, 18]. Bardziej odpowiednia do badań MRD okazała się technika cytometrii przepływowej, wykrywająca komórki białaczkowe w oparciu o nieprawidłową zawartość DNA (DNA index) lub na podstawie obecności na ich powierzchni antygenów specyficznych dla ostrych białaczek [19, 20]. Ze względu na niedoskonałość antygenów powierzchniowych jako markerów do wykrywania MRD (nierzadko te same antygeny występują zarówno na powierzchni komórek prawidłowych, jak i białaczkowych) technika ta była stopniowo udoskonalana, między innymi przez rozszerzanie panelu i kombinacje wykrywanych antygenów [21, 22]. Obecnie cytometria przepływowa znajduje za- stosowanie w wykrywaniu MRD, z czułością , w przypadku niemal wszystkich pacjentów z T-ALL i w większości przypadków prekursorowej B-ALL; najczęściej jednak stanowi uzupełnienie technik opartych o PCR [23]. Kolejną z metod, którą próbowano wykorzystać do wykrywania przetrwałych komórek białaczkowych, była klasyczna cytogenetyka, charakteryzująca się czułością Podstawowe wady tej techniki, prócz niewystarczającej czułości, to przydatność ograniczona wyłącznie do przypadków, w których występują wykrywalne aberracje chromosomowe oraz konieczność uzyskania preparatów płytek metafazalnych [24]. Z czasem cytogenetyczne techniki oznaczeń MRD zostały udoskonalone o osiągnięcia biologii molekularnej. Obecność przetrwałych komórek białaczkowych zaczęto wykrywać dzięki zastosowaniu fluorescencyjnie wyznakowanych sond DNA, komplementarnych wobec określonych aberracji, głównie genów fuzyjnych [25, 26]. Wprawdzie czułość interfazowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) nie wykracza poza czułość klasycznej cytogenetyki, jednak FISH ma nad tą techniką podstawową przewagę niezależność analizy od dzielących się komórek. Wadą jest natomiast relatywnie wysokie prawdopodobieństwo uzyskania wyników fałszywie pozytywnych, na skutek przestrzennego nałożenie się identyfikowanych sekwencji, a nie faktycznej fuzji genów. Problem ten można jednak zminimalizować przez zastosowanie FISH-u na komórkach w stadium metafazy [27]. Wariant ten charakteryzuje się zwiększoną czułością, należy mieć jednak świadomość, że podobnie jak w klasycznej cytogenetyce wymagane jest uzyskanie preparatów metafazalnych, co w przypadku hodowli komórek białaczkowych nierzadko okazuje się niemożliwe. Jedną z nowszych modyfikacji techniki FISH stanowi również zastosowanie jej do wykrywania MRD w populacjach sortowanych komórek, co pozwala na połączenie czułości i specyficzności cytometrii przepływowej i fluorescencyjnej hybrydyzacji DNA [28]. Geny fuzyjne, jako markery przetrwałych komórek białaczkowych, mogą być także wykrywane w reakcji łańcuchowej polimerazy, jednak w większości przypadków, ze względu na udział w translokacjach sekwencji intronowych, konieczne jest wykrywanie genów fuzyjnych na poziomie transkryptów (mrna). Stąd konieczność skorelowania techniki PCR z reakcją odwrotnej transkrypcji (ang. reverse transcriptase, RT), która umożliwia przepisanie nietrwałego mrna na DNA (tzw. cdna, ang. complementary DNA) i wykrywanie przetrwałych komórek białaczkowych [29, 30, 31]. Jak jednak wspomniano, obecnie najszersze zastosowanie w wykrywaniu choroby resztkowej w ALL mają rearanżacje genów kodujących immunoglobuliny i receptory limfocytów T (Ig/TCR), jako wysoce specyficzne i powszechne markery komórek białaczkowych. Rozwój

5 286 Małgorzata Dawidowska i inni technik biologii molekularnej i ich zastosowanie w badaniach nad chorobami limfoproliferacyjnymi umożliwiły całkowicie nowe spojrzenie na patogenezę, diagnostykę i klasyfikację tych nowotworów. Badania molekularne nad procesem rearanżacji genów Ig/TCR zaowocowały poznaniem hierarchicznego porządku tych rearanżacji, a w latach 80. XX wieku, scharakteryzowaniem ich jako markerów klonalności w białaczkach. W roku 1983 Arnold i wsp. wykazali, że rearanżacje genów kodujących immunoglobuliny są specyficzne i unikalne dla danej białaczki (dla danego pacjenta), a ich wykrywanie, techniką hybrydyzacji Southerna, stanowi podstawę dla potwierdzenia klonalności i pochodzenia komórek z linii prekursorów limfocytów B [32]. Podobne wnioski, dotyczące rearanżacji genów kodujących receptory limfocytów T i ich przydatności do badań klonalności, pochodzenia blastów, a tym samym do diagnozowania i klasyfikacji białaczek, przedstawili w 1985 roku Waldmann i współpracownicy [33]. Wkrótce po tym, rearanżacje Ig/TCR zaczęły być wykorzystywane do monitorowania minimalnej choroby resztkowej w ostrej białaczce limfoblastycznej z wykorzystaniem sond DNA i hybrydyzacji Southerna, charakteryzującej się czułością 10-2 [34, 35]. Ze względu na znaczną czasochłonność i pracochłonność, lecz przede wszystkim niewystarczającą czułość tej metody poszukiwano nowych, lepszych rozwiązań. Istotnym krokiem w rozwoju badań MRD okazało się wykorzystanie techniki reakcji łańcuchowej polimerazy (ang. polymerase chain reaction, PCR), wynalezionej w 1983 roku przez Mullisa [36], do amplifikacji sekwencji zrearanżowanych genów kodujących immonoglobuliny i receptory limfocytów T (Ig/TCR). W ten sposób powstała metoda oparta o wykrywanie genetycznych odcisków palca każdego pacjenta (regionów złącz zrearanżowanych genów) z wysoką czułością i specyficznością. Jedne z pierwszych prac z zastosowaniem tej metody ukazały się już w roku 1989 i 1990, opisując jej wykorzystanie do wykrywania komórek białaczkowych w oparciu o amplifikację rearanżacji genów kodujących łańcuchy TCR gamma, TCR delta oraz łańcuch ciężki immunoglobulin [37, 38, 39]. Najbardziej powszechna strategia analizy MRD polegała na: zastosowaniu reakcji PCR do wykrywania regionów złącz u danego pacjenta, sekwencjonowaniu produktów PCR i projektowaniu na podstawie tej sekwencji sond DNA, specyficznych wobec danych sekwencji złącz (ang. antijunctional oligonucleotides, AJOs). Ich zastosowanie w hybrydyzacji Southerna umożliwiało wykrywanie przetrwałych komórek białaczkowych z nieosiągalną dotąd czułością [40,41]. Podstawową wadą metod analizy MRD, opartych o klasyczną PCR i techniki hybrydyzacyjne jest trudność w uzyskaniu wiarygodnych wyników ilościowych. Częściowe rozwiązanie tego problemu stanowi zastosowanie eksperymentów rozcienczeniowych do półilościowych oznaczeń poziomu MRD, poprzez porównywanie intensywności sygnałów hybrydyzacyjnych lub sygnałów uzyskanych dzięki wybarwieniu produktów PCR, np. bromkiem etydyny. Uzyskanie bardziej wiarygodnych oznaczeń ilościowych poziomu MRD było możliwe dzięki zastosowaniu techniki kompetycyjnej reakcji PCR, w której analizowaną sekwencję amplifikuje się równolegle z tzw. kompetytorem (ang. internal calibration standard, ICS), tj. sekwencją na tyle podobną do sekwencji analizowanej, aby zachodziło zjawisko współzawodniczenia o składniki reakcji, a jednocześnie na tyle odmienną, by było możliwe ich odróżnienie [42]. Analiza ilościowa poziomu MRD polega na porównaniu intensywności sygnałów pochodzących od analizowanej sekwencji i tych pochodzących od sekwencji kompetytora, amplifikowanego w znanych stężeniach. Istotną wadą tej metody jest znaczna pracochłonność, co stanowiło pewną przeszkodę w jej rutynowym zastosowaniu. Prawdziwy przełom w rozwoju badań choroby resztkowej nastąpił wraz z wprowadzeniem, wynalezionej w początku lat 90. ubiegłego wieku, rewolucyjnej techniki reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (ang. real-time quantitative polymerase chain reaction, RQ-PCR) [43]. Metoda ta spełnia wszystkie wspomniane wcześniej kryteria umożliwia szybkie, relatywnie proste i wiarygodne analizowanie poziomu MRD z czułością Ponadto, znajduje zastosowanie zarówno w stosunku do markerów specyficznych wobec ALL (określone geny fuzyjne), jak i wobec pacjenta (rearanżacje Ig/TCR) [44, 45, 46]. Badanie MRD techniką RQ-PCR w oparciu o rearanżacje Ig/TCR wymaga jednak czasochłonnych i pracochłonnych analiz na etapie diagnozy (wykrywanie i identyfikacja rearanżacji oraz projektowanie starterów oligonukleotydowych specyficznych wobec każdego pacjenta; ang. allel specific oligonucleotides, ASO). Należy mieć również świadomość, że wadą tej techniki jest, wynikająca ze specyfiki reakcji RQ-PCR, niecałkowita powtarzalność wyników (przesunięcie o jeden cykl reakcji powoduje dwukrotną różnicę wyniku ilościowego) [10]. Z tego względu, zaleca się oznaczanie poziomu choroby resztkowej u pacjentów z ALL zarówno przy pomocy niezwykle czułej techniki RQ-PCR, jak i mniej czułej, ale dokładniejszej i mniej kosztownej techniki wielokolorowej cytometrii przepływowej [47]. Rozwój badań chimeryzmu potransplantacyjnego Podobnie jak w odniesieniu do choroby resztkowej rewolucja molekularna zaznaczyła się, w latach 80. XX wieku, na gruncie badań chimeryzmu. Przed jej nastaniem, w początkowym okresie badań chimeryzmu, do odróżniania komórek dawcy i biorcy stosowano techniki immunologiczne, biochemiczne i cytogenetyczne. Jako jedne z pierwszych markerów do oznaczania chimeryzmu

6 Rozwój badań molekularnych w hematoonkologii monitorowanie minimalnej choroby resztkowej stosowano antygeny czerwonych krwinek, analizowane w zakresie układów AB0, MN, Rh, Kell, Kidd, Duffy, Lutheran i P [48]. Mimo wysokiej czułości techniki (10-3 ) antygeny erytrocytów nie stanowiły idealnych markerów, ze względu na długi okres trwania czerwonych krwinek w krwioobiegu, co ma szczególnie znaczenie w przypadku, gdy biorca szpiku był przed transplantacją poddany transfuzji krwi od innego dawcy niż dawca szpiku, lecz zgodnego pod względem tych Tab. 1. Rodzaje chimeryzmu po allogenicznej transplantacji komórek krwiotwórczych (allo HSCT) Table 1. Types of chimerism after allogenic haemopoietic stem cell transplantation (albo HSCT) Rodzaj chimeryzmu Pełny chimeryzm Trwały chimeryzm mieszany Przejściowy chimeryzm mieszany Progresywny chimeryzm mieszany Nazwa anglojęzyczna (skrót) Complete chimerism (CC) Stable mixed chimerism (SMC) Transient mixed chimerism (TMC) Progressive mixed chimerism (PMC) Komentarz Wykrywane komórki identyfikowane są wyłącznie jako komórki dawcy. Dobry czynnik prognostyczny. Współwystępowanie, przez długi okres czasu po transplantacji, komórek dawcy i biorcy we względnie stałym stosunku ilościowym (zazwyczaj komórki biorcy stanowią 1 20%). Dobry czynnik prognostyczny. Współwystępowanie, przez okres około 6 9 miesięcy po transplantacji, komórek dawcy z komórkami biorcy (stanowiącymi zazwyczaj 1 5%). Najczęściej następuje przejście TMC w stan CC. Współwystępowanie komórek dawcy z komórkami biorcy, których udział procentowy zwiększa się z upływem czasu. Zły czynnik prognostyczny. Może stanowić zapowiedź wznowy białaczki. Tab. 2. Porównanie metod analizy choroby resztkowej Table 2. Comparison of methods applied for analysis of minimal residual disease Metoda Czułość Komentarz M i k r o s k o p i a świetlna Podstawa klasycznej definicji remisji, opartej o morfologię komórek. Niewystarczająca czułość. Hodowle komórek in vitro zmienna Problemy z uzyskaniem powtarzalnych wyników utrudniają rutynowe zastosowanie. Cytogenetyka Przydatność ograniczona do sytuacji występowania aberracji chromosomowych. Trudności w uzyskaniu preparatów komórek w metafazie mogą uniemożliwić analizę H y b r y d y z a c j a Southerna Przydatność we wszystkich nowotworach limfoproliferacyjnych ze względu na wykrywanie rearanżacji genów Ig/TCR. Konieczność stosowania radioaktywności i czasochłonnej hybrydyzacji. FISH Przydatność ograniczona do sytuacji występowania aberracji chromosomowych. Możliwość zwiększenia czułości techniki (metafazowa FISH, FISH na izolowanych frakcjach komórkowych) Cytofluorymetria przepływowa Immunofenotypowanie w oparciu o występowanie nieprawidłowych antygenów na powierzchni komórek. Technika relatywnie szybka i prosta, rekomendowana do oznaczeń MRD. PCR Przydatność w wykrywaniu rearanżacji genów Ig/TCR oraz genów fuzyjnych, będących efektem translokacji. RQ-PCR technika rekomendowana do oznaczeń MRD. Tab. 3. Porównanie metod analizy chimeryzmu Table 3. Comparison of methods applied for analysis of chimerism Metoda Czułość Komentarz A n t y g e n y erytrocytów Izoenzymy Allotypowanie immunoglobulin Cytogenetyka FISH P o l i m o r f i z m RFLP/VNTR/STR VNTR-PCR STR-PCR RQ-PCR 0,1 0,5% ( x 10-3 ) 10 30% ( x 10-1 ) 2 5% (2x x 10-2 ) 10 20% ( x 10-1 ) 1 0,1% ( ) 1 20% ( x 10-1 ) 1 5% ( x 10-2 ) 0,1 0,0001% ( ) Niski stopień trudności wykonania analizy. Długi okres trwania erytrocytów w krwioobiegu utrudnia analizę chimeryzmu. Umiarkowany stopień trudności analizy. W przypadku enzymów erytrocytów problem trwałości erytrocytów w krwioobiegu. Wysoki stopień trudności analizy. Wysoki stopień trudność analizy. Ograniczona przydatność, głównie w przypadku różnicy płci dawcy i biorcy. Umiarkowany stopień trudności analizy. Ograniczona przydatność, głównie w przypadku różnicy płci dawcy i biorcy. Możliwość analizy ilościowej. Wysoki stopień trudność analizy. Konieczność stosowania radioaktywności i czasochłonnej hybrydyzacji. Szybkość i prostota analizy. Znakowanie fluorescencyjne (bezpieczeństwo pracy). Możliwość genotypowania w oparciu o różnicę płci dawca/biorca lub polimorfizm genetyczny. Możliwość precyzyjnej analizy ilościowej. Ewentualne problemy uzyskania wysokiej powtarzalności wyników.

7 288 Małgorzata Dawidowska i inni antygenów. Jako markery w badaniach chimeryzmu wykorzystywano także antygeny zgodności tkankowej HLA, pozwalające odróżnić komórki dawcy od komórek biorcy pod warunkiem, jednak występowania niepełnej zgodności pomiędzy dawcą a biorcą w zakresie układu HLA [49]. Serologiczne metody typowania antygenów HLA znajdowały jednak zastosowanie w jakościowej, a nie ilościowej ocenie chimeryzmu. W badaniach chimeryzmu próbowano także wykorzystywać allotypowanie immunoglobulin [50, 51, 52]. Jednak i te markery okazały się niedoskonałe, między innymi ze względu na długi okres trwania immunoglobulin w organizmie, jak również z powodu trudności w wykonaniu analizy ilościowej chimeryzmu. Ponadto, w historii badań chimeryzmu stosowano metody wykorzystujące analizę polimorfizmu enzymów izolowanych z erytrocytów i leukocytów, w oparciu o różnice w mobilności elektroforetycznej różnych izoform enzymów [53, 54]. Szczególnie przydatne były oznaczenia enzymów leukocytów, gdyż w przypadku enzymów erytrocytów również pojawiał się problem długości trwania erytrocytów w krwioobiegu. Istotną niedogodnością dotyczącą badania izoform enzymów była konieczność ostrożnego postępowania z tkankami, ze względu na ograniczoną stabilność enzymów. Czułość tej techniki także nie była zadowalająca (10-1 ). Zastosowanie technik cytogenetyki klasycznej w badaniach chimeryzmu opierało się przede wszystkim o identyfikację chromosomów płci, w przypadku gdy dawca i biorca różnią się płcią, a także, choć rzadziej, w oparciu o identyfikację aberracji strukturalnych, specyficznych dla pacjenta lub analizę heteromorfizmu chromosomów [55, 56]. Podstawowe wady tych metod to stosunkowo niewysoka czułość analizy (10-1 ), pracochłonność, czasochłonność oraz ograniczone możliwości ich zastosowania, głównie w przypadku różnicy płci między dawcą a biorcą, ale także ze względu na dość częste trudności w uzyskaniu preparatów płytek metafazalnych. Większość tych trudności można było ominąć, dzięki wprowadzeniu do technik cytogenetycznych osiągnięć biologii molekularnej. Stosując metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w relatywnie szybki, prosty sposób, z minimalną czułością 10-2, można przeprowadzić analizę zarówno na jądrach interfazowych, jak i na płytkach metafazalnych, choć możliwości tej techniki nadal ograniczają się generalnie do sytuacji niezgodności płci dawcy i biorcy. Jedno z pierwszych doniesień o zastosowaniu techniki FISH w badaniach chimeryzmu ukazało się pod koniec lat 80. ubiegłego wieku, kiedy to Durnam (w 1989 r.) opisał użycie molekularnych sond specyficznych wobec chromosomu Y do odróżniania komórek dawcy od komórek biorcy [57]. Nie był to jednak faktyczny początek rewolucji molekularnej na gruncie badań chimeryzmu. Już w 1985 roku ukazały się prace, w których genotypowanie w celu wykrycia chimeryzmu, oparto o analizę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych, wynikającego z nabycia lub utraty miejsca cięcia enzymu restrykcyjnego w danym locus (ang. restriction fragments length polymorphism, RFLP) [58, 59]. Ponadto, do badań chimeryzmu wykorzystywano także polimorfizm długości sekwencji minisatelitarnych (ang. variable number of tandem repeats, VNTR) i mikrosatelitarnych (ang. short tandem repeats, STR), polegający na różnicy w ilości powtórzeń, w danym locus, podstawowego motywu nukleotydowego (1 6 nt i nt, odpowiednio dla sekwencji STR i VNTR) [12]. Niezależnie od badanego polimorfizmu (RFLP/ VNTR/STR), konieczność zastosowania dużych ilości DNA, radioaktywnego znakowania sond i czasochłonnej hybrydyzacji Southerna, stosunkowo niska czułość badania (około 10-1 ) oraz trudność prowadzenia analizy ilościowej chimeryzmu były podstawowymi niedogodnościami tych metod. Prawdziwy przełom w rozwoju badań chimeryzmu stanowiło wprowadzenie techniki opartej o łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). Podstawową zaletą tej techniki jest duża czułość, prostota i krótki czas wykonania oraz możliwość badania chimeryzmu zarówno w sytuacji zgodności, jak i niezgodności płci dawcy i biorcy, w zależności od wyboru markerów amplifikowanych w reakcji PCR. W 1989 r. Lawler i wsp. opisali zastosowanie w badaniach chimeryzmu techniki PCR z użyciem starterów specyficznych wobec chromosomu Y [60]. Powszechniejsze zastosowanie w badaniach chimeryzmu, bo niezależne od płci dawcy i biorcy, miała amplifikacja w reakcji PCR sekwencji polimorficznych, takich jak VNTR i STR [61, 62, 63, 64]. Należy jednak mieć świadomość, że konwencjonalna technika PCR, ze swej natury nie pozwala na prowadzenie ilościowej analizy chimeryzmu. Przy jej użyciu możliwe jest jedynie odróżnienie CC od MC i braku chimeryzmu, nie ma natomiast możliwości rozróżnienia typów chimeryzmu mieszanego, a przez to oceny dynamiki zmian chimeryzmu. Wprowadzenie techniki ilościowej analizy chimeryzmu, w oparciu o analizę sekwencji polimorficznych, amplifikowanych w reakcji PCR z użyciem starterów znakowanych fluorescencyjnie nastąpiło w połowie lat 90. XX wieku [65]. Ze względu na szybkość, prostotę wykonania i możliwość analizy ilościowej technika ta szybko się upowszechniła i była stopniowo udoskonalana o nowe warianty, jak np. opcja multipleks, umożliwiająca jednoczesną analizę kilku loci polimorficznych [66]. Z czasem, w badaniach chimeryzmu zaczęto stosować najpowszechniejszą obecnie technikę analizy ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (RQ- PCR), pozwalającą na analizę chimeryzmu z czułością co najmniej 10-3, tj. dziesięciokrotnie przewyższającą czułość badań opartych o analizę sekwencji STR lub VNTR [10]. Technika ta może zostać zastosowana do identyfikacji zarówno sekwencji specyficznych dla chro-

8 Rozwój badań molekularnych w hematoonkologii monitorowanie minimalnej choroby resztkowej mosomów płci, np. genu SRY na chromosomie Y, jak i do analizy sekwencji polimorficznych, obecnie najczęściej w postaci polimorfizmu pojedynczych nukleotydów (ang. single nucleotide polymorphism, SNP) [67, 68]. Konkluzje Mimo ogromnego postępu, jaki dokonał się w badaniach molekularnych w hematoonkologii, umożliwiającego wiarygodne monitorowanie jakości remisji choroby oraz chimeryzmu potransplantacyjnego, nadal pozostają nierozwiązane problemy i pytania oczekujące jednoznacznych odpowiedzi. Odnośnie badań choroby resztkowej, wciąż istnieją wątpliwości czy techniki RQ-PCR i cytometria przepływowa mogą być stosowane zamiennie do monitorowania poziomu choroby resztkowej, czy może powinny się uzupełniać? Jaka jest faktycznie istotna granica czułości monitorowania choroby resztkowej, skoro niskie poziomy transkryptów niektórych genów fuzyjnych wykrywa się także u zdrowych osób? Na ile wiarygodnie poziom choroby resztkowej odzwierciedlają obecnie dostępne metody molekularne, skoro przy pomocy każdej z nich analizuje się tylko niewielką frakcję całkowitej puli komórek hematopoetycznych pacjenta? Co do badań chimeryzmu, nie ustalono ostatecznie jaka powinna być optymalna częstotliwość badań w przypadku pacjentów z ALL, aby możliwe było wczesne wykrywanie wznowy? Czy w niektórych sytuacjach, np. przy zastosowaniu mieloablacyjnego przygotowania do transplantacji, wiążącego się z wystąpieniem, u większości pacjentów, pełnego chimeryzmu, uzasadnione jest odstąpienie od rutynowego monitorowania chimeryzmu potransplantacyjnego? Czy możliwości najpowszechniejszej obecnie metody analizy chimeryzmu (fluorescencyjnej STR-PCR) są wystarczające czy może technikę tę należałoby zastąpić bardziej czułą, ale i bardziej kosztowną techniką PCR w czasie rzeczywistym (RQ-PCR)? To tylko niektóre z pytań wciąż oczekujących na odpowiedź. Dla polskiego środowiska hematoonkologicznego podstawową trudnością jest jednak nadal niedostateczna dostępność technik molekularnych. Badania, które w wielu krajach Europy są elementem rutynowej opieki nad pacjentem z białaczką, w naszym kraju najczęściej wciąż prowadzone są w ramach projektów badawczych. Szpitale rzadko dysponują własnym zapleczem laboratoryjnym, wyposażonym na potrzeby nowoczesnej diagnostyki molekularnej oraz odpowiednio wykwalifikowanym personelem, przez co uzależnione są niejako od współpracy z ośrodkami badawczymi. Taka sytuacja niewątpliwie wymaga zmian. Całkowita autonomia ośrodków hematoonkologicznych w zakresie diagnostyki molekularnej jest bowiem niezwykle istotna dla jej upowszechnienia w ramach rutynowego monitorowania procesu leczenia. Jednocześnie, ośrodki badawcze, zamiast prowadzić rutynową diagnostykę molekularną, mogłyby całkowicie skoncentrować się na projektach badawczych, służących odpowiedzi na aktualne pytania i problemy hematoonkologii. Jednak należy mieć również świadomość, że bezpośrednie przetransponowanie doświadczeń ośrodków zachodnioeuropejskich na polski grunt nie jest sprawą prostą, między innymi ze względów finansowych. Istnieje więc wyraźna potrzeba opracowania, w oparciu o doświadczenia europejskie, naszych polskich standardów, dotyczących zastosowania nowoczesnej diagnostyki molekularnej w leczeniu białaczek. Choć przy ich tworzeniu konieczne będzie wypracowanie swoistego kompromisu między możliwym zakresem badań a jakością opieki, którą pacjentowi należy zapewnić, nie można rezygnować z podjęcia takiego wyzwania. Piśmiennictwo 1. Szczepañski T., Orfão A., van der Velden V. et al.: Minimal residual disease in leukemia patients. Lancet Oncol, 2001, 2, Liang R., Chan D., Kwong Y.L. et al.: Molecular detection of minimal residual disease for patients with leukaemia and lymphoma. HKMJ, 1997, 3, Brisco M.J., Condon J., Hughes E. et al.: Outcome prediction in childhood acute lymphoblastic leukemia by molecular quantification of residual disease at the end of induction. Lancet, 1994, 343, Eckert C., Biondi A., Seeger K. et al.: Prognostic value of minimal residual disease in relapsed childhood acute lymphoblastic leukemia. Lancet, 2001, 358, Van Dongen J.J.M., Seriu T., Panzer-Grumayer E.R. et al.: Prognostic value of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukaemia in childhood. Lancet, 1998, 352, Bader P., Hancock J., Kreyenberg H. et al.: Minimal residual disease (MRD) status prior to allogeneic stem cell transplantation is a powerful predictor for post-transplant outcome in children with ALL. Leukemia, 2002, 16, Ford C.E., Hamerton J.L., Barnes D.W. et al.: Cytological identification of radiation-chimaeras. Nature, 1956, 177(4506), Mathe G., Amiel J.L., Schwartzenberg L. et al.: Successful allogeneic bone marrow transplantation in man: chimerism, induced specific tolerance and possible anti-leukemic effects. Blood, 1965, 25, Monitoring outcome: MRD, chimaerism and relapse. McCann SR, Lawler M. Haemopoietic stem cell transplantation. Apperley J, Carreras E. i wsp. (eds); Forum Service Editore, Genua 2004; Thiede C., Bornhäuser M., Ehninger G.: Strategies and clinical implications of chimerism diagnostics after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Acta Haematol., 2004, 112, Antin J.H., Childs R., Filipovich A.H. et al.: Establishment of complete and mixed donor chimerism after allogeneic lymphohematopoietic transplantation: Recommendations from a workshop at the 2001 Tandem Meetings. Biol. Blood Marrow Transpl., 2001, 7, Genom człowieka. Bal J., Bocian E. Biologia molekularna w

9 290 Małgorzata Dawidowska i inni medycynie. Elementy genetyki klinicznej. Bal J (ed); PWN, Warszawa 2001, Lion T.: Debate round table. Chimerism testing after allogeneic stem cell transplantation: importance of timing and optimal technique for testing in different clinical-biological situations. Leukemia, 2003, 17, Pongers-Willemse M.J., Seriu T., Stolz F. et al.: Primers and protocols for standarized detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia using immunoglobulin and T cell receptor gene rearrangements and TAL1 deletions as PCR targets. Report of the BIOMED-1 Concerted Action: Investigation of minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia, 1999, 13, van Dongen J.J.M., Langerak A.W., Brüggemann M. et al.: Design and standarization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations. Report of BIOMED-2 Concerted Action BMH4 CT Leukemia, 2003, 17, Gabert J., Beillard E., van der Velden V.H.J. et al.: Standarization and quality control studies of real-time quantitative reverse transciptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia A Europe Against Cancer Program. Leukemia, 2003, 17, Estrov T., Grunberger Z., Dube I.D. et al.: Detection of residual acute lymphoblastic leukemia cells in cultures of bone marrow obtained during remission. N. Engl. J. Med., 1986, 315, Breard J., Mathe G., Consolini R.: Abnormal in vitro differentiation of clonogenic B-cells in common acute lymphoblastic leukemia in complete remission. A marker for minimal residual disease? Bull Soc. Sci. Med. Grand Duche Luxemb., 1989, 126(1), Walle A.J., Niedermayer W.: Aneuploidy as a marker of minimal residual disease in leukemia. Cancer Detect Prev., 1985, 8 (1-2), Tsurusawa M., Kaneko Y., Katano N. et al.: Flow cytometric evidence for minimal residual disease and cytological heterogeneities in acute lymphoblastic leukemia with severe hypodiploidy. Am. J. Hematol., 1989, 32(1), Babusikova O., Mesarosova A., Konikova M. et al.: Leukemiaassociated marker combinations in acute leukemia suitable for detection of minimal residual disease. Neoplasma, 1993, 40(5), Orfao A., Ciudad J., Lopez-Berges M.C. et al.: Acute lymphoblastic leukemia (ALL): detection of minimal residual disease (MRD) at flow cytometry. Leuk Lymphoma, 1994; 13 Suppl 1, Neale G.A.M., Coustian Smith E., Pan Q. et al.: Tandem application of flow cytometry and polymerase chain reaction for comprehensive detection of minimal residual diseasse in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia, 1999; 13, Hittelman W.N., Tiguad J.D., Estey E. et al.: Premature chromosome condensation in the study of minimal residual disease. Bone Marrow Transplant., 1990, 6, Anastasi J., Thangavelu M., Vardiman J.W. et al.: Interphase cytogenetic analysis detects minimal residual disease in a case of acute lymphoblastic leukemia and resolves the question of origin of relapse after allogeneic bone marrow transplantation. Blood, 1991, 77 (5), Nylund S.J., Ruutu T., Saarinen U. et al.: Detection of minimal residual disease using fluorescence DNA in situ hybridization: a follow-up study in leukemia and lymphoma patients. Leukemia, 1994, 8(4), El-Rifai W., Ruutu T., Vettenranta K. et al.: Follow-up of residual disease using metaphase-fish in patients with acute lymphoblastic leukemia in remission. Leukemia, 1997, 13, Cotteret S., Belloc F., Boiron J.M. et al.: Fluorescent in situ hybridization on flow-sorted cells as a tool for evaluating minimal residual disease or chimerism after allogenic bone marrow transplantation. Cytometry, 1998, 15, 34(5), Kagan J., Finger L.R., Besa E. et al.: Detection of minimal residual disease in leukemic patients with the t(10;14) (q24;q11) chromosomal translocation. Cancer Res., 1990, 1, 50(17), van Dongen J.J., Breit T.M., Adriaansen H.J. et al.: Detection of minimal residual disease in acute leukemia by immunological marker analysis and polymerase chain reaction. Leukemia, 1992, 6 Suppl 1, Cayuela J.M., Baruchel A., Orange C. et al.: TEL-AML1 fusion RNA as a new target to detect minimal residual disease in pediatric B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood, 1996, 88(1), Arnold A., Cossman J., Bakhshi A. et al.: Immunoglobulingene rearrangements as unique clonal markers in human lymphoid neoplasms. N. Engl. J. Med., 1983, 29, 309(26), Waldmann T.A., Davis M.M., Bongiovanni K.F. et al.: Rearrangements of genes for the antigen receptor on T cells as markers of lineage and clonality in human lymphoid neoplasms. N. Engl. J. Med., 1985, 26, 313(13), Wright J.J., Poplack D.G., Bakhshi A. et al.: Gene rearrangements as markers of clonal variation and minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia. J. Clin. Oncol., 1987, 5(5), Katz F., Ball L., Gibbons B. et al.: The use of DNA probes to monitor minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukaemia. Br. J. Haematol., 1989, 73(2), Mullis K.B.: The unusual origin of polymerase chain reaction. Sci. Amer., 262, 4, d Auriol L., Macintyre E., Galibert F. et al.: In vitro amplification of T cell gamma gene rearrangements: a new tool for the assessment of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemias. Leukemia, 1989, 3(2), Jonsson OG, Kitchens RL, Scott FC i wsp. Detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia using immunoglobulin hypervariable region specific oligonucleotide probes. Blood, ; 76(10): Hansen-Hagge T.E., Yokota S., Bartram C.R.: Detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia by in vitro amplification of rearranged T-cell receptor delta chain sequences. Blood, 1989, 74(5), Beishuizen A., de Bruijn M.A., Pongers-Willemse M.J.: i wsp. Heterogeneity in junctional regions of immunoglobulin kappa deleting element rearrangements in B cell leukemias: a new molecular target for detection of minimal residual disease. Leukemia, 1997, 11(12), Macintyre E.A., d Auriol L., Duparc N. et al.: Use of oligonucleotide probes directed against T cell antigen receptor gamma delta variable-(diversity)-joining junctional sequences as a general method for detecting minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemias. J. Clin. Invest., 1990, 86(6), Hosler G.A., Bash R.O., Bai X. et al.: Development and validation of a quantitative polymerase chain reaction assay to evalu-

10 Rozwój badań molekularnych w hematoonkologii monitorowanie minimalnej choroby resztkowej ate minimal residual disease for T-cell acute lymphoblastic leukemia and follicular lymphoma. Am. J. Pathol., 1999, 154(4), Holland P.M., Abramson R.D., Watson R. et al.: Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the exonuclease activity of Thermus aquatius DNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, Pongers-Willemse M.J., Verhagen O.J., Tibbe G.J. et al.: Realtime quantitative PCR for the detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia using junctional region specific TaqMan probes. Leukemia, 1998, 12(12), Pallisgaard N., Clausen N, Schroder H. et al.: Rapid and sensitive minimal residual disease detection in acute leukemia by quantitative real-time RT-PCR exemplified by t(12;21) TEL- AML1 fusion transcript. Genes Chromosomes Cancer, 1999, 26(4), Bolufer P., Barragan E., Verdeguer A. et al.: Rapid quantitative detection of TEL-AML1 fusion transcripts in pediatric acute lymphoblastic leukemia by real-time reverse transcription polymerase chain reaction using fluorescently labeled probes. Haematologica, 2002, 87(1), Malec M., van der Velden V.H., Bjorklund E. et al.: Analysis of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia: comparison between RQ-PCR analysis of Ig/TcR gene rearrangements and multicolor flow cytometric immunophenotyping. Leukemia, 2004, 18(10), Sparkers M.C., Crist M.L., Sparkers R.S. et al.: Transplantation Group Gene markers in human bone marrow transplantation. Vox Sang, 1977, 33, Hansen G.S., Dupont B., Faber V. et al.: Lymphocyte chimerism after bone marrow transplantation. Surface markers and in vitro function of donor and recipient lymphocyte subpopulations. Scand. J. Immunol., 1977, 6(4), Starling K.A., Falletta J.M., Fernbach D.J.: Immunologic chimerism as evidence of bone marrow graft acceptance in an identical twin with acute lymphocytic leukemia. Exp. Hematol., 1975 Aug; 3(4), Witherspoon R.P., Schanfield M.S., Storb R. et al.: Immunoglobulin production of donor origin after marrow transplantation for acute leukemia or aplastic anemia. Transplantation, 1978, 26, Sparkes R.F., Sparkes M.C., Gale R.P. et al.: Immunoglobulin synthesis following allogeneic bone marrow transplantation in man. Conversion to donor allotype. Transplantation, 1979, 27, Schmidt GM, Blume KG, Bross KJ i wsp. The use of lymphocyte phosphoglucomutase as a genetic marker in bone marrow transplant recipients. Blood, 1979; 38: Vives C.J., Merino A., Pujades A. et al.: Combined study of lymphocyte phosphoglucomutase (PGM) and adenylate kinase (AK) isoenzymes in the early characterization of bone marrow engraftment. Scand. J. Haematol., 1985, 35, Borgaonkar D.S., Bias W.B., Sroka B. et al.: Identification of graft and host cells in bone marrow transplants by quinacrine banding technique of chromosome identification. Acta Cytol., 1974, 18, Olson S.B., Magenis R.E., Lovrien E.W.: Human chromosome variation: The discriminatory power of Q-band heteromorphism (variant) analysis in distinguishing between individuals with specific application to cases of questionable paternity. Am. J. Hum. Genet., 1986, 38, Durnam D.M., Anders K.R., Fisher L. et al.: Analysis of the origin of marrow cells in bone marrow transplant recipients using a Y-chromosome-specific in situ hybridization assay. Blood, 1989, 74, Blazar B.R., Orr H.T., Arthur D.C. et al.: Restriction fragments length polymorphism as markers of engraftment in allogeneic bone marrow transplantation. Blood, 1985, 66, Ginsburg D., Antin J.H., Smith B.R. et al.: Origin of cell populations after bone marrow transplantation. Analysis using DNA sequence polymorphism. J. Clin. Invest., 1985, 75, Lawler M., McCann S.R., Conneally E. et al.: Chimaerism following allogeneic bone marrow transplantation: detection of residual host cells using the polymerase chain reaction. Br. J. Haematol., 1989, 73, Lawler M., Humprhries P., McCann S.R.: Evaluation of mixed chimerism by in vitro amplification of dinucleotide repeat sequences using the polymerase chain reaction. Blood, 1991, 77, Ugozzoli L., Yam P., Petz L.D. et al.: Amplification by the polymerase chain reaction of hypervariable regions of the human genome for evaluation of chimerism after bone marrow transplantation. Blood, 1991, 77(7), Roth M.S., Antin J.H., Bingham E.L. et al.: Use of polymerase chain reaction detected sequence polymorphism to document engraftment following allogeneic bone marrow transplantation. Transplantation, 1990, 49, van Leeuwen J.E., van Tol M.J., Bodzinga B.G. et al.: Detection of mixed chimerism in flow-sorted cell subpopulations by PCR-amplified VNTR markers after allogeneic bone marrow transplantation. Br. J. Haematol., 1991, 79, Scharf S.J., Smith A.G., Hansen J.A. et al.: Quantitative determination of bone marrow transplant engraftment using fluorescent polymerase chain reaction primers for human identity markers. Blood, 1995, 85, Thiede C., Florek M., Bornhäuser M.: Rapid quantification of mixed chimerism using multiplex amplification of short tandem repeat markers and fluorescence detection. Bone Marrow Transplantation, 1999, 23, Fehse B., Chukhlovin A., Kuhleke K. et al.: Real-time quantitative Y chromosome-specific PCR (QYCS-PCR) for monitoring hematopoietic chimerism after sex-mismatched allogeneic stem cell transplantation. J. Hematother. Stem Cell Res., 2001, 10, Alizadeh M., Bernard M., Danie B. et al.: Quantitative assessment of hematopoietic chimerism after bone marrow transplantation by real-time quantitative polymerase chain reaction. Blood, 2002, 99, Adres korespondencyjny: dr Małgorzata Dawidowska Instytut Genetyki Człowieka PAN ul. Strzeszyńska Poznań