X LICEUM OGÓLNOKSZTAŁCĄCE W GDYNII

Transkrypt

1 X LICEUM OGÓLNOKSZTAŁCĄCE W GDYNII IM. GDYŃSKICH NAUCZYCIELI BOHATERÓW II WOJNY ŚWIATOWEJ ZASTOSOWANIE ELICYTORÓW BIOTYCZNYCH POCHODZENIA BAKTERYJNEGO W ROŚLINNYCH KULTURACH IN VITRO DIONAEA MUSCIPULA I DROSERA CUNEIFOLIA W CELU POZYSKANIA SUBSTANCJI BIOLOGICZNIE CZYNNYCH Aleksandra Siluta Klasa IIe Opiekun: mgr Ewa Faka PODZIĘKOWANIA Realizacja pracy była łatwiejsza, dzięki wsparciu, inspiracji i cennym uwagom prof. dr hab. inż. Aleksandry Królickiej. Jestem jej bardzo wdzięczna za umożliwienie prowadzenie badań w Katedrze Biotechnologii Uniwersytetu Gdańskiego i Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego. Gdynia, 2015

2 STRESZCZENIE Rośliny owadożerne są źródłem związków biologicznie czynnych (metabolitów wtórnych) z grupy naftochinonów i flawonoidów. Poziom tych związków może być zwiększony dzięki zastosowaniu elicytorów (wyzwalaczy) w roślinnych kulturach in vitro. Badania prowadzono z wykorzystaniem kultur in vitro 2 gatunków roślin owadożernych: Drosera cuneifolia i Dionaea muscipula. Hodowle prowadzono na pożywce płynnej Murashige i Skoog (½ MS) i pożywce dodatku soli azotowych. W pożywce zastosowano również elicytor w postaci autoklawowanego lizatu bakterii Enterobacter sakazaki. Badania dowiodły, iż zastosowany elicytor nie wykazał istotnego wpływu na poziom naftochinonów w tkankach roślin owadożernych, które oznaczono przy pomocy wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Wykazano również, iż ekstrakty z roślin owadożernych miały silne właściwości przeciwdrobnoustrojowe w stosunku do bakterii G (+) Staphylococcus aureus i grzyba Candida albicans. Najwyższą oporność na ekstrakty wykazywał Pseudomonas aeruginosa G (-) bakteryjny patogen człowieka. Różna wrażliwość patogenów na metabolity wtórne z roślin owadożernych jest zależna od budowy ściany komórkowej oraz zawartości związków biologicznie czynnych naftochinonów i najprawdopodobniej flawonoidów. WSTĘP Rośliny wytwarzają metabolity wtórne, czyli związki chemiczne aktywne biologicznie, które nie są niezbędne dla funkcjonowania i przeprowadzania podstawowych procesów życiowych rośliny, ale pełnią znaczącą rolę w przystosowaniu do warunków otaczającego środowiska. Metabolity wtórne są wykorzystywane przez człowieka do produkcji leków, kosmetyków, barwników, dodatków do żywności (przyprawy, aromaty, używki) oraz biopestycydów. W roślinach pełnią one funkcje obronne, allelopatyczne oraz jako atraktanty dla owadów i innych zwierząt. Elicytory odgrywają znaczącą rolę w produkcji wtórnych metabolitów. Działają one na zasadzie czynników stresowych, zmieniają metabolizm i wywołują reakcje obronne w roślinach, co prowadzi do gromadzenia się metabolitów wtórnych. W roślinnych kulturach in vitro stosuje się elicytory w celu podwyższenia poziomu metabolitów wtórnych w tkankach roślinnych. Pierwszym celem badań było sprawdzenie jaki wpływ ma elicytor - lizat bakteryjny Enterobacter sakazaki na produkcję naftochinonów (plumbaginy i ramentaceonu) w tkankach roślin owadożernych z gatunku Dionaea muscipula i Drosera cuneifolia w roślinnych kulturach in vitro. Drugim celem projektu było zbadanie czy zastosowana elicytacja zwiększy skuteczność bakterioi grzybobójczą ekstraktów uzyskanych z roślin w stosunku do groźnych patogenów bakteryjnych człowieka z gatunku S. aureus i P. aeruginosa oraz grzybowych C. albicans.

3 MATERIAŁY I METODY 1. Hodowla roślin owadożernych in vitro i elicytacja metabolitów wtórnych. Materiał roślinny w postaci kultur in vitro 2 gatunków roślin owadożernych Dionaea muscipula i Drosera cuneifolia pochodził z hodowli Katedry Biotechnologii Uniwersytetu Gdańskiego i Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego. Ekperymenty prowadzono w 25 ml kolbach Erlenmajera. Testowano 4 warianty pożywek do hodowli roślin: A) pożywka ½MS (pożywka Murashige i Skoog z obniżoną o połowę ilością makroelementów, [12]); B) pożywka ½MS + 1% lizat z bakterii Enterobacter sakazaki; C) pożywka soli azotowych; D) pożywka ½MS bez soli azotowych + 1% lizat z bakterii. Wszystkie pożywki zawierały 2% sacharozy, ph = 5,5. Lizat bakteryjny z uzyskano z nocnej hodowli bakterii hodowanych na pożywce płynnej Luria Bretani. Do jałowych pożywek (A, B, C, D) wykładano jałowo w komorze z laminarnym przepływem powietrza po kilka roślin z każdego gatunku. Hodowle prowadzono przez 30 dni na wytrząsarkach w fitotronach w temp. 20 o C przy natężeniu światła 900 luxów (fotoperiod 16/8). Wszystkie warianty były prowadzone w 3 niezależnych powtórzeniach. 2. Ekstrakcja metabolitów z tkanek roślinnych i analiza chromatograficzna. Po 30 dniach hodowli ważono po 2 g mokrej masy (mm) roślinnej zebranej z pożywek A, B, C i D, dodawano po 10 ml tetrahydrofuranu, 10 ml wody i 2 g NaCl. Po wymieszaniu próbówki wirowano z prędkością 8000 rcf (relative centrifugal force) w celu uzyskania fazy organicznej i nieorganicznej. Fazę organiczną filtrowano przez filtr strzykawkowy (teflonowa membrana, 0,2 µm). Po 4 ml ekstraktów odparowywano i zawieszano w 2 ml metanolu. Tak przygotowane ekstrakty były analizowane z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Zawartość rametaceonu w tkankach D. cuneifolia i plumbaginy w tkankach D. muscipula oznaczano wykorzystując MeOH : H 2 O (program gradientowy od 30 do 90% MeOH). 3. Badanie aktywności przeciwdrobnoustrojowej ekstraktów. Do 96-dołkowych jałowych płytek nakładano ekstrakty metanolowe z roślin owadożernych w objętościach od 50 do 2 µl, a po ich odparowaniu do sucha dodawano 100 µl pożywki BHI. Do tak przygotowanych studzienek dodawano 10 µl zawiesiny bakterii z gatunku P. aeruginosa, S. aureus (5 x 10 7 ) i grzyba z gatunku C. albicans (5 x 10 7 ). Następnie płytki inkubowano przez 24h w 37 o C. Brak zmętnienia pożywki w dołku wskazywał na minimalne stężenie hamujące wzrost mikroorganizmów. Zawartość dołków w których nie obserwowano zmętnienia wysiewano następnie na murawę na pożywkę Luria Agar i inkubowano przez 24 h w 37 o C. Brak wzrostu mikroorganizmów wskazywał na minimalne stężenie bakteriobójcze (MBC) lub grzybobójcze (MFC).

4 WYNIKI Rośliny owadożerne z gatunku D. cuneifolia i D. muscipula hodowano w kulturach in vitro na dwóch kombinacjach pożywek roślinnych: ½MS (kombinacja A) oraz ½MS bez soli azotowych (kombinacja C). Wzrost roślin na obu pożywkach był zbliżony i wynosił (D. cuneifolia - 25g mokrej masy (mm)/erlenmajerka i D. muscipula 10g mm/erlenmajerka) i nie różnił się od siebie statystycznie. Zaobserwowano jedynie niewielką różnicę w poziomie plumbaginy w tkankach D. muscipula. O ile na pożywce ½MS wykazano obecność 1325 µg plumbaginy w 1 g mm tkanki, o tyle na pożywce ½MS bez soli azotowych wartość ta wynosiła 1180 µg plumbaginy/1g mm (Fig. 1). W przypadku tkanek D. cuneifolia na pożywce ½MS oznaczono 800 µg ramentaceonu/1g mm, a na pożywce bez soli azotowych o 100 µg mniej ramentaceonu/1g mm (Fig. 1). Dodanie elicytora w postaci lizatu z do pożywek spowodowało zmniejszenie poziomu ramentaceonu w tkankach D. cuneifolia o około 100 µg/1g mm w porównaniu do kontroli w przypadku pożywki ½ MS (Fig. 1). W pozostałych przypadkach nie odnotowano statystycznie istotnych różnic (Fig. 1). Figura 1. Porównanie poziomu naftochinonów (plumbaginy w tkankach D. muscipula i ramentaceonu w tkankach D. cuneifolia). Kolejnym etapem badań było sprawdzenie aktywności bakterioi grzybobójczych ekstraktów uzyskanych z roślin owadożernych. Do badań wykorzystano 2 bakteryjne patogeny ludzkie oporne na szereg antybiotyków: Pseudomonas aeruginosa - gram-ujemną bakterię oportunistyczną powodującą zakażenia wewnątrzszpitalne i Staphylococcus aureus - bakterię gram-dodatnią, często powodującą zakażenia w szpitalach, wytwarzającą enterotoksynę odporną na wysokie temperatury oraz pasożytniczy grzyb: Candida albicans z rodziny drożdżaków, powodujący szereg schorzeń miejscowych i systemowych, szczególnie groźnych dla pacjentów z rozległymi ranami oparzeniowymi. Badania wykazały, że najwrażliwszy na ekstrakty z roślin owadożernych był C. albicans. W tym przypadku zastosowanie od 10 do 20 mg mm/ml ekstraktów

5 wykazywało efekt grzybobójczy (Tab. 1). Z kolei w przypadku bakterii najsilniej działał ekstrakt z tkanek D. muscipula na S. aureus, gdzie MBC wynosiło 20 mg mm/ml. Wyższe wyniki uzyskany dla tkanek D. muscipula rosnących na pożywce ½ MS z elicytorem są spowodowane najprawdopodobniej błędnym odważeniem mokrej masy i nie były brane pod uwagę w analizie (Tab. 1). Najbardziej oporny na działanie ekstraktów był P. aeruginosa. Aby skutecznie wyeliminować tego G (-) patogena trzeba zastosować od 200 do 500 mg mm/1ml (Tab. 1). Tabela 1. Porównanie aktywności bakterio- i grzybobójczej ekstraktów z tkanek Drosera cuneifolia i Dionaea muscipula (MBC minimalne stężenie bakteriobójcze; MFC minimalne stężenie grzybobójcze). Gatunek rośliny i rodzaj pożywki hodowlanej Pseudomonas aeruginosa G (-) MBC mg mm/ml Ekwiwalent naftochinonów µg/ml Staphylococcus aureus G (+) MBC mg mm/ml Drosera cuneifolia Ekwiwalent naftochinonów µg/ml MFC mg mm/ml Candida albicans Ekwiwalent naftochinonów µg/ml ½ MS ½ MS , ,5 10 7,2 azotu , ,5 azotu , ,7 Dionaea muscipula ½ MS , ,9 ½ MS ,8 azotu , ,7 azotu , ,2 Na uwagę zasługuje fakt, iż aktywność bakterio- i grzybobójcza ekstraktów nie była bezpośrednio skorelowana z obecnością naftochinonów w tkankach roślin owadożernych (Fig. 1, Tab. 1). Świadczy to o tym, iż na aktywność biologicznie czynną ekstraktów składa się działanie zarówno naftochinonów, jak również innych metabolitów zawartych w tkankach roślin owadożernych (flawonoidów), które nie były przedmiotem badań w niniejszym projekcie.

6 DYSKUSJA Głównymi metabolitami wtórnymi wytwarzanymi przez rośliny owadożerne są związki z grupy naftochinonów i flawonoidów [9, 11]. W ramach niniejszego projektu badano wpływ 2 naftochinonów: plumbaginy w tkankach D. muscipula i ramentaceonu w tkankach D. cuneifolia w kulturach roślinnych in vitro na groźne patogeny człowieka. W celu podwyższenia poziomu metabolitów wtórnych w kulturach in vitro roślin owadożernych zastosowano elicytor w postaci lizatu bakteryjnego. Dodanie elicytora do pożywki na której rosły rośliny owadożerne skutkowało niewielkim spadkiem poziomu ramentaceonu i nie wpłynęło znacząco na poziom plumbaginy w tkankach roślinnych. Odmienne wyniki elicytacji odnotował zespół Putalun [6], wykazując 3-krotny wzrost poziomu plumbaginy w tkankach Drosera burmanii pod wpływem działania elicytora - jasmonianu metylu. Podobne wyniki uzyskał Ziaratnia i in. [7] zwiększając poziom naftochinonów w Drosera capensis poprzez poddanie do pożywki kwasu jasmonowego i kwasu salicylowego. Literatura naukowa wskazuje, że zastosowanie różnych elicytorów w różnych gatunkach roślin owadożernych może wywoływać różny wpływ na poziom naftochinonów. Jakkolwiek w trakcie wykonywania niniejszego projektu nie zaobserwowano podwyższenia poziomu naftochinonów w tkankach roślin owadożernych w wyniku elicytacji, to ekstrakty uzyskane z tych roślin wykazały wyższą aktywność przeciwdrobnoustrojową w porównaniu do roślin nie poddanych elicytacji. Wydaje się wielce prawdopodobne, że elicytacja spowodowała podwyższenie poziomu innych wtórnych metabolitów zawartych w roślinach owadożernych, a mianowicie flawonoidów, które nie były badane w ramach tego projektu. Podwyższenie poziomu flawonoidów pod wpływem działania elicytorów w tkankach roślin owadożernych odnotowała między innymi Królicka i in. [2]. Działanie przeciwdrobnoustrojowe naftochinonów zostało wykazane przez szereg zespołów naukowych [1,2,4,10]. Te cenne metabolity wtórne są z powodzeniem wykorzystywane przez człowieka w przemyśle farmaceutycznym. Ekstrakty z roślin owadożernych zawierających plumbaginę wykazują aktywność grzybobójczą w stosunku do C. albicans [10]. Zastosowanie mg mm/ml ekstraktu skutecznie eliminuje tego groźnego dla człowieka grzyba. Ekstrakty roślinne pozyskane z tkanek D. muscipula wykazały dużą skutecznością przeciwdrobnoustrojową w stosunku do S. aureus, gdzie MBC wynosiło 20 mg mm/ml. Podobne wyniki odnotował Didry [1], opisując działanie metabolitów wtórnych na bakterie G (+) jamy ustnej. Machado wraz z zespołem [8] badali wpływ naftochinonów w ekstraktach roślinnych pozyskanych z Punica granatum i Tabebuia avellanedae na S. aureus, a Khan i Timi [5] ekstraktów uzyskanych z Diospyros lolin, D. maritima i D. novoguinensis. W obu przypadkach stwierdzono aktywność przeciwbakteryjną naftochinonów względem S. aureus. W ramach przedstawionego projektu wykazano, że ekstrakty z roślin owadożernych wykazały wysoką aktywność przeciw bakterii G (+) S. aureus i silne działanie hamujące wzrost C. albicans, jednakże wobec P. aeruginosa G (-)

7 bakterii, okazały się mało skuteczne. Zespół De Paiva prowadził badania na innych G (-) bakteriach jak Salmonella typhimurium i Escherichia coli i ich badania wykazały małą aktywność plumbaginy w stosunku do tych bakterii. Królicka i in. [3] również wykazali wysoką oporność P. aeruginosa na działanie ekstraktów chloroformowych zawierających naftochinony z roślin owadożernych. Taka różnica w aktywności naftochinonów przeciwko patogenom prawdopodobnie jest spowodowana różnicą w budowie ściany komórkowej. Bakterie G (+) posiadają grubą ścianę mureinową, natomiast bakterie G (-) mają cienką ścianę komórkową z dwiema błonami komórkowymi. Wśród bakterii G (- ) skuteczność wykazują tylko ekstrakty metanolowe z roślin owadożernych zawierające flawonoidy [2]. W ramach niniejszego projektu do ekstrakcji metabolitów wtórnych zawartych w D. cuneifolia i D. muscipula zastosowano THF. Zastosowanie tego rozpuszczalnika spowodowało, że ekstrakty zawierały mieszaninę naftochinonów i flawonoidów. Dzięki zawartości 2 różnych grup związków możliwe było zaobserwowanie efektu synergii. Zjawisko to może być efektem współpracy wtórnych metabolitów roślinnych i odpowiednich związków działających przeciwdrobnoustrojowo powodując wzrost aktywności preparatu przeciwko drobnoustrojom mimo braku wzrostu poziomu naftochinonów w tkankach roślin owadożernych, co stwierdziła Krychowiak i in. [4]. PIŚMIENNICTWO 1) Didry N, Dubreuil L, Trotin F, Pinkas M (1998). Antimicrobial activity of aerial parts of Drosera petalta Smith on oral bacteria. J. Ethnopharmacol. 60: ) Królicka A, Szpitter A, Gilgenast E i in. (2008). Stimulation of antibacterial naphthoquinones and flavonoids accumulation in carnivorous plants grown in vitro by addition of elicitors. Enzyme Microbial Technol. 42: ) Królicka A, Szpitter A, Maciag M i in. (2009). Antibacterial and antioxidant activity of the secondary metabolites from in vitro cultures of the Alice sundew (Drosera aliciae). Biotechnol. Appl. Biochem. 53: ) Krychowiak M, Girnholc M, Banasiuk R i in. (2014). Combination of silver nanoparticles and Drosera binata extract as a possible alternative for antibiotic treatment of burn wound infections caused by resistant Staphylococcus aureus. PLOS ONE 9(12):e ) Khan MR, Timi D (1999). Constituents of Diospyros lolin, D. maritima and D. novoguinensis. Fitoterapia 70: ) Putalun W, Udomsin O, Yusakul G i in. (2010). Enhanced plumbagin production from in vitro cultures of Drosera burmanii using elicitation. Biotechnol. Lett. 32: ) Ziaratnia SM, Kunert KJ, Lall N (2008). Elicitation of 7-methyljuglone in Drosera capensis. South African J. Botan. 75: ) Machado TB, Pinto AV, Pinto MC i in. (2003). In vitro activity of Brazilian medicinal plants, naturally occurring naphthoquinones and their analogues, against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Int. J. Antimicrob. Agents 21: ) Banasiuk R, Kawiak A, Królicka A (2012). In vitro cultures of carnivorous plants from the Drosera and Dionaea genus for the production of biologically active secondary metabolites. BioTechnologia 93: ) de Paiva SR, Figueiredo MR, Aragão TV, Kaplan MA (2003). Antimicrobial activity in vitro of plumbagin isolated from plumbago species. Mem Inst. Oswaldo Cruz 98: ) Cowan MM (1999). Plant Products as Antimicrobial Agents. Clin. Microbiol. Rev. 12: ) Murashige T, Skoog F (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol Plant 15: