OCENA ODCZYNEM WESTERN- IMMUNOBLOTTING ANTYGENOWYCH WŁAŚCIWOŚCI BIAŁEK CAMPYLOBACTER JEJUNI I CAMPYLOBACTER COLI

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2008, 60: Natalia Rokosz, WaldemarRastawicki,Marek Jagielski OCENA ODCZYNEM WESTERN- IMMUNOBLOTTING ANTYGENOWYCH WŁAŚCIWOŚCI BIAŁEK CAMPYLOBACTER JEJUNI I CAMPYLOBACTER COLI Zakład Bakteriologii NIZP PZH w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. M. Jagielski Oceniono właściwości antygenowe wybranych białek pałeczek z rodzaju Campylobacter. Badane szczepy C. jejuni jak i C. coli charakteryzowały się wysokim podobieństwem profilu białkowego i podobną reaktywnością antygenową. Najbardziej swoistymi w odczynie western-immunoblotting były białka o masie cząsteczkowej 92, 62, 56, 52, 45-43, 29 kda, które mogłyby być wykorzystane jako wysoce swoiste antygeny w serodiagnostyce kampylobakteriozy. Pałeczki Campylobacter jejuni i Campylobacter coli są obecnie jednymi z najczęściej izolowanych ludzkich enteropatogenów wywołującymi stany zapalne jelit (1,3,6). Liczba przypadków zakażeń wywołanych przez pałeczki Campylobacter często przewyższa liczbę zarejestrowanych przypadków zakażeń pałeczkami Salmonella lub Shigella (6). Pomimo, że laboratoryjna diagnostyka kampylobakteriozy oparta jest przede wszystkim na izolacji drobnoustroju z próbek materiału klinicznego w rutynowych badaniach można wykorzystać również różne metody serologiczne. Przydatność odczynu ELISA z ciepłostałym antygenem C. jejuni i C. coli oraz oczyszczonym białkiem o masie 45 kda pałeczek C. jejuni w serologicznej diagnostyce kampylobakteriozy opisano uprzednio (6). W obecnej pracy podjęto próbę oceny odczynem western-immunoblotting antygenowych właściwości wybranych białek pałeczek Camylobacter jejuni i Campylobacter coli jako potencjalnych, wysoce swoistych antygenów przydatnych w badaniach serologicznych. MATERIAŁ I METODY Przygotowanie zawiesiny białek pałeczek Campylobacter. Przedmiotem badań było 6 szczepów C. jejuni wyizolowanych od osób z objawami ostrej biegunki, oznaczonych odpowiednio: 33/06, 72/06, 76/06, 79/06, 82/06 i 129/07, szczep referencyjny C.jejuni ATCC oraz trzy szczepy C. coli (12/07, 41/07, 88/07). Hodowlę szczepów Campylobacter prowadzono na podłożu Columbia agar w temperaturze 42 o C przez 2 dni w warunkach mikroaerofilnych. Zebraną masę bakteryjną każdego szczepu zawieszano w fizjologicznym roztworze NaCl. Tak przygotowane zawiesiny przechowywano w temp. 70 o C.

2 122 N. Rokosz, W. Rastawicki, M. Jagielski Nr 2 Surowice ludzkie. W badaniach posłużono się 20 próbkami surowicy ludzkiej z wysokim poziomem przeciwciał dla antygenów pałeczek C. jejuni oznaczonym odczynem ELISA (6). Wśród tych próbek surowicy 6 uzyskano od osób z kampylobakteriozą potwierdzoną izolacją C. jejuni z próbek kału. Dodatkowo, do badań przeznaczono 6 próbek surowicy od osób z jersiniozą bądź salmonelozą oraz 3 próbki uzyskane od osób klinicznie zdrowych. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym. Bezpośrednio przed elektroforezą zawiesinę bakteryjną rozmrażano a następnie dodawano równą objętość dwukrotnie stężonego roztworu Laemmli zawierającego 0,5 M Tris HCL o ph 6,8, 10% SDS, 3% 2-merkaptoetanolu, 20% glicerolu oraz 0,05 % błękitu bromofenolowego i ogrzewano we wrzącej łaźni wodnej przez 15 minut. Elektroforezę w 12,5% żelu poliakrylamidowym (płytki o wymiarach 160 x 190 x 1,5 mm ) prowadzono w aparacie firmy Kucharczyk przy natężeniu prądu 60 ma na żel przez 3,5 godziny zgodnie z metodyką podaną przez Laemmli (8). Po zakończeniu elektroforezy żele barwiono barwnikiem Coomasie Brilliant Blue R-250. W celu określenia masy cząsteczkowej elektroforetycznie rozdzielonych białek w każdej serii doświadczenia rozdziałowi poddawano standardy masowe firmy Bio Rad: SDS-PAGE Molecular Weight Standards Broad Range (Nr kat ), Prestained Standard Low Range (Nr kat ) lub Prestained Standard Broad Range (Nr kat ). Odczyn western immunoblotting. Przeniesienie elektroforetycznie rozdzielonych białek pałeczek C. jejuni oraz białek C. coli na membranę nitrocelulozową Immobilon- P (Millipore) wykonywano w aparacie firmy Bio-Rad przy natężeniu prądu 300 ma przez 3 godziny w temperaturze 4 o C według metody Towbina i wsp. (14). Po zablokowaniu receptorowej powierzchni nitrocelulozy 5% roztworem odtłuszczonego krowiego mleka, arkusze pocięto na paski o szerokości 3-4 mm i następnie inkubowano jedną godzinę w temperaturze pokojowej z ludzkimi surowicami rozcieńczonymi w PBS w stosunku 1:100. Po trzykrotnym przemyciu PBS + 0,5% Tween 20 (PBST) paski nitrocelulozy inkubowano w roztworze odpowiedniego koniugatu. W badaniach posłużono się kozimi przeciwciałami sprzężonymi z peroksydazą chrzanową dla ludzkich immunoglobulin klasy IgA, IgG oraz IgM. Użytkowe rozcieńczenie koniugatów dla IgA i IgM wynosiło 1/750 natomiast dla IgG 1/1500. Po jednej godzinie inkubacji w temperaturze pokojowej paski nitrocelulozy płukano roztworem PBST a następnie inkubowano w roztworze benzydyny (Sigma) w buforze cytrynianowym o ph 5,0 z dodatkiem perhydrolu. Po upływie 10 minut reakcję barwną przerywano poprzez przeniesienie pasków nitrocelulozy do wody destylowanej. WYNIKI Przeprowadzony elektroforetyczny rozdział białek komórkowych siedmiu szczepów C. jejuni oraz trzech szczepów C. coli wykazał znaczne podobieństwo profili białkowy szczepów należących do danego gatunku. We wszystkich elektroforegramach szczepów C. jejuni stwierdzono po 21 prążków białkowe o masie cząsteczkowej: , 178, 149, , 116, , 92, 84, 80-79, 74, 70, 66, 68, 62, 58, 53, 52, 45-43, 38, 31, 29 kda natomiast w elektroforegramie białek komórkowych szczepów C. coli było widocznych tylko 17 prążków białkowych o masie cząsteczkowej odpowiednio: , 178, 149, , , 92, 80, 74, 70, 62, 58, 53, 52, 45-43, 38, 31, 29 kda (Ryc. 1). Obserwowane

3 Nr 2 Antygenowe właściwości białek pałeczek Campylobacter kda 200 kda 116 kda 116,6 kda 97,4 kda 86 kda KDa 66,2 kda 50,9 kda 50,0 kda Ryc ,2 kda 31,0 kda Elektroforetyczny obraz białek różnych szczepów pałeczek C. jejuni i C. coli rozdzielonych w 12,5% żelu poliakrylamidowym barwionym Commasie Brilliant Blue 1 marker masowy (Broad Range Prestained Bio-Rad), 2 szczep C. jejuni ATCC 33560, 3 C. jejuni 33/06, 4 - C. jejuni 82/06, 5 - C. jejuni 129/07, 6 - C. jejuni 79/06, 7 - C. jejuni 77/06, 8 - C. jejuni 72/06, 9 - C. coli 88/07, 10 C. coli 12/07, 11 C. coli 41/06, 12 marker masowy (SDS PAGE Molecular Weight Standards Broad Range, Bio-Rad). nieznaczne różnice w obrazach elektroforetycznych dotyczyły głównie masy cząsteczkowej jednego z najmocniejszych prążków białkowych, która w zależności od szczepu pałeczek tych dwóch gatunków wahała się od 43 kda do 45 kda. Ponadto w rozdziale elektroforetycznym białek dwóch szczepów C. coli zaobserwowano brak prążków o masie 70 kda. W celu określenia właściwości antygenowych opisanych białek badano je w odczynie western immunoblotting wobec próbek surowicy uzyskanych od osób chorych z bakteriologicznie bądź serologicznie potwierdzoną kampylobakteriozą a także, w celu wykazania swoistości tych reakcji, również z surowicami osób z jersiniozą bądź salmonelozą i osób klinicznie zdrowych. W pierwszym etapie badań porównano antygenową aktywność białek wszystkich 7 szczepów pałeczek C. jejuni i 3 szczepów C. coli wobec jednej, wybranej próbki surowicy uzyskanej od osoby z bakteriologicznie potwierdzoną kampylobakteriozą. Wyniki przeprowadzonych odczynem western-immunoblotting badań wykazały, że z przeciwciałami klasy IgG, swoistymi dla antygenów C. jejuni, reagowało kilkanaście białek komórkowych pałeczek należących do obydwu gatunków. Najsilniejsze reakcje uzyskiwano z białkami komórkowymi o masie cząsteczkowej: 74, 70, 52, kda pałeczek C. jejuni oraz białkami o masie cząsteczkowej: 74, 58, 52, 45-43, 31 kda pałeczek C. coli (Ryc. 2). Ze względu na to, że przeprowadzone wstępne badania nie wykazały różnic w białkowych profilach jak również w reaktywności antygenowej różnych szczepów C. jejuni do dalszych badań przeznaczono jeden szczep C. jejuni (33/06) wyizolowany od osoby chorej na terenie kraju oraz szczep referencyjny C. jejuni ATCC W przypadku badania białek pałeczek C. coli do dalszej analizy przeznaczono szczep C. coli 41/06.

4 124 N. Rokosz, W. Rastawicki, M. Jagielski Nr 2 92 kda 74 kda 68 kda 62 kda kda 52 kda Ryc kda 31 kda kda Wynik reakcji w odczynie western-immunoblotting białek różnych szczepów pałeczek C. jejuni i C. coli z surowicą osoby chorej na kampylobakteriozę.1 szczep C. jejuni ATCC 33560, 2 C. jejuni 33/06, 3 - C. jejuni 82/06, 4 - C. jejuni 129/07, 5 - C. jejuni 79/06, 6 - C. jejuni 77/06, 7 - C. jejuni 72/06, 8 - C. coli 88/07, 9 C. coli 12/07, 10 C. coli 41/06. Przeprowadzona w odczynie western-immunoblotting analiza białek komórkowych szczepu C. jejuni 33/06 i szczepu C. jejuni ATCC wykazała, że ludzkie immunoglobuliny najsilniej reagują z białkami o masie cząsteczkowej 74, 62, 52, i 38 kda. Na rycinie 3 przedstawiono typowy wynik reakcji w odczynie western immunoblotting białek szczepu C. jejuni 33/06 z surowicą pacjenta z kampylobakteriozą. Dla porównania na rycinie przedstawiono również wynik rekcji białek tego samego szczepu z surowicą osoby klinicznie zdrowej (Ryc. 3). W tabeli I zebrano wyniki badania białek o masie 74, 62, 52, i 38 kda z surowicami osób z kampylobakteriozą, jersiniozą bądź salmonelozą oraz krwiodawców. Najczęściej ze swoistymi immunoglobulinami reagowały białka o masie 74 i 62 kda, najrzadziej zaś białko 38 kda. W każdym przypadku najczęstsze i najsilniejsze reakcje obserwowano pomiędzy tymi białkami a immunoglobulinami klasy G. W przeprowadzonych badaniach stwierdzono również występowanie reakcji pomiędzy białkami o masach 74, 62, 52, i 38 kda a surowicami osób z jersiniozą, salmonelozą czy też osób klinicznie zdrowych. W przypadku białka 74 kda reakcje te stwierdzano we wszystkich klasach immunoglobulin, natomiast w przypadku pozostałych białek zazwyczaj wyłącznie w klasie IgG (Tabela I). Przeprowadzona analiza porównawcza pomiędzy białkami szczepu C. jejuni (33/06) a białkami referencyjnego szczepu C. jejuni ATCC nie wykazała żadnych istotnych różnic w ich aktywności antygenowej. Podobnie, białka o masie cząsteczkowej 74, 62, 52, 45-43, 38, 31 kda pałeczek C. jejuni jak i C. coli reagowały z podobną intensywnością z surowicami osób z biegunką, od których izolowano szczepy C. jejuni.

5 Nr 2 Antygenowe właściwości białek pałeczek Campylobacter 125 Tabela I Wyniki wykrywania odczynem western-immunoblotting przeciwciał dla białek pałeczek C. jejuni w próbkach surowicy wybranych grup osób. Grupa badanych osób Osoby z potwierdzoną kampylobakteriozą Osoby z jersiniozą i salmonelozą Liczba badanych próbek surowicy Liczba próbek surowicy zawierających przeciwciała dla: Białko 74 kda Białko 62 kda Białko 52 kda Białko kda Białko 38 kda IgA IgG IgM IgA IgG IgM IgA IgG IgM IgA IgG IgM IgA IgG IgM Krwiodawcy

6 126 N. Rokosz, W. Rastawicki, M. Jagielski Nr 2 92 kda 74 kda 62 kda 52 kda kda 38 kda 31 kda Ryc. 3. Wynik reakcji w odczynie western - immunoblotting białek szczepu C. jejuni 33/06 z surowicą pacjenta z kampylobakteriozą ( ścieżka 1 IgA, 2 IgG, 3 IgM ) oraz z surowicą osoby klinicznie zdrowej ( ścieżka 4 IgA, 5 IgG, 6 IgM ). Analizując intensywność reakcji w odczynie western immunoblotting pomiędzy białkami o masie 74 i 70 kda a przeciwciałami klasy IgA, IgG i IgM obecnymi w próbkach surowicy uzyskanych w różnych okresach choroby od osób z objawami ostrej biegunki zaobserwowano, że spada ona wraz z upływem czasu. Białko o masie 74 kda jako jedyne reagowało ze wszystkimi trzema klasami immunoglobulin w surowicach uzyskanych w ostrej fazie choroby. Białko to reagowało również z próbkami surowicy uzyskanymi w późnym okresie choroby, tj. po miesiącu od początku objawów klinicznych. W tym przypadku intensywność reakcji z immunoglobulin klasy IgA i IgM była jednak znacznie niższa. Pozostałe białka, o masach cząsteczkowych w zakresie kda oraz kda, pałeczek C. jejuni i C. coli reagowały z surowicami późnej fazy choroby znacznie słabiej. DYSKUSJA Przeprowadzone badania wykazały, że badane szczepy C. jejuni jak i C. coli charakteryzowały się wysokim podobieństwem profilu białkowego. Najbardziej charakterystycznymi spośród antygenów C. jejuni są białka komórkowe o masie cząsteczkowej: 92, 68, 66, 62, 58, 52, 45-43, 29 kda. Uważa się, że białka te reagujące z ludzkimi immmunoglobulinami klasy A, G, M są wysoce swoiste dla tego patogenu i mogłyby być wykorzystywane jako antygeny w odczynie western immunoblotting do wykrywania zakażeń wywołanych przez C. jejuni (11,15). Według Milss i Barandbury (10) obecność przeciwciał dla białka o masie cząsteczkowej 92, 56 i 19 kda świadczy o ostrej fazie infekcji pałeczkami C.

7 Nr 2 Antygenowe właściwości białek pałeczek Campylobacter 127 jejuni. W przeprowadzonych przez nas badaniach białko o masie 92 kda reagowało, i to wyłącznie z immunoglobulinami klasy G, tylko z połową próbek surowicy pobranych od osób z kampylobakteriozą potwierdzoną izolacją zarazka. Drugie białko, o masie cząsteczkowej 56 kda, reagowało natomiast ze wszystkimi próbkami surowicy wykazującymi wysokie miano przeciwciał w odczynie ELISA i uzyskanymi od osób chorych we wczesnym stadium choroby. Nie oceniono jednak swoistości antygenowej białka o masie 19 kda, gdyż w wyniku rozdziału elektroforetycznego nie uzyskano białek o masie cząsteczkowej poniżej 29 kda. Zaobserwowano również, że białka o masie 62 kda i masie 45 kda jako swoiste dla C. jejuni, opisywane przez innych autorów (1, 2, 5, 6, 11), silnie reagowały w naszych badaniach z surowicami osób z kampylobakteriozą. Intensywność reakcji badanych białek komórkowych z surowicami zależna była głównie od klasy immunoglobulin oraz od okresu choroby, w którym uzyskano próbkę do badań. Najczęściej i najbardziej intensywne reakcje obserwowano pomiędzy badanymi białkami a immunoglobulinami klasy G, znacznie słabsze z immunoglobulinami klasy A i M i to bez względu na poziom poszczególnych przeciwciał określony odczynem ELISA. Zależność ta jeszcze bardziej była widoczna w przypadku użycia do badań surowic uzyskanych w późnej fazie choroby, w których przeciwciała klasy IgA i IgM występowały już na niskim poziomie. Reakcje w odczynie western-immunoblotting były wtedy bardzo słabe i ograniczały się głównie do białka o masie 74 kda, będącego jednym z białek inwazyjnych (7). Podobne spostrzeżenia zostały opisane przez Cawthraw i wsp.(5). Wyniki przeprowadzonych badań potwierdziły obserwacje poczynione przez innych autorów, że białko o masie cząsteczkowej 31 kda pałeczek C. jejuni jak i C. coli reagowało z jednakową intensywnością z surowicami osób z zakażeniem wywołanym przez C. jejuni (4,15). Przeprowadzone przez nas badania wykazały możliwość wystąpienia reakcji krzyżowych pomiędzy białkiem o masie cząsteczkowej 74 kda, oraz w mniejszym stopniu 62, 52 i 31 kda, a przeciwciałami dla pałeczek Salmonella i Yersinia co może świadczyć o braku swoistości antygenowej tych białek. Według Rautelin i Kosunen (12) zastosowanie w odczynie western immunoblotting białek ekstrahowanych glicyną w środowisku kwaśnym pozwala na zwiększenie swoistości reakcji. Uzyskane wyniki wskazują na duże podobieństwo właściwości antygenowych białek pałeczek C. jejuni i C. coli. Wydaje się, że najbardziej przydatne w serodiagnostyce kampylobakteriozy są białka o masie 92, 62, 56, 52, 45-43, 29 kda. Białka te reagowały w odczynie western immunoblotting z większością surowic uzyskanych od osób z kampylobakteriozą, nie reagowały natomiast z surowicami osób z jersioniozą i salmonelozą. Możliwość wykorzystania tych białek jako antygenów w rutynowej serodiagnostyce kampylobakteriozy należałoby jednak potwierdzić dalszymi badaniami z użyciem większej liczby próbek surowicy uzyskanych od osób z podwyższonym poziomem przeciwciał dla antygenów innych pałeczek jelitowych.

8 128 N. Rokosz, W. Rastawicki, M. Jagielski Nr 2 N. Rokosz, W. Rastawicki, M. Jagielski EVALUATION OF ANTIGENIC PROPERTIES OF CAMPYLOBACTER JEJUNI AND CAMPYLOBACTER COLI PROTEINS IN A WESTERN IMMUNOBLOT SUMMARY Campylobacter jejuni and Campylobacter coli are the most common bacterial cause for acute diarrheal illnesses in developed countries. The aim of this study was to evaluate the antigenic properties of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli proteins in western-blot assay. Whole cell components of Campulobacter jejuni and Campylobacter coli were separated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electroforesis. Using this method we detected in all seven C. jejuni strains 21 peptides migrating between kda. All three C.coli strains had a 17 bands migrating with the same molecular weight range. Proteins were transferred electrophoretically to nitrocellulose paper for immunoblotting experiments. The 74 kda protein reacted strongly in all classes of immmunoglobulin with all tested human serum samples. We observed that this protein reacted also with human immunoglobulins for Salmonella and Yersinia sp. This cross - reaction observed for this protein could give false positive results in routine diagnosis of C.jejuni infections. The proteins with molecular weight of: 92, 62, 56, 52, 45-43, 29 kda were most recognized in the 20 human serum samples. The other proteins of C.jejuni and C. coli, particularly in the kda and kda regions, were recognized occasionally and the response to these in reconvalescent sera was usually weak. The result of this study showed that the proteins with molecular weight: 92, 62, 56, 52, and 29 kda can be use in routine serological diagnostic of campylobacteriosis. PIŚMIENNICTWO 1. Autenrieth IB, Schwarzkopf A, Ewald JH i inni. Bactericidal properties of Campylobacter jejuni specific immunoglobulin M antibodies in commercial imunoglobulin preparation. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: Blaser MJ, Hopkins JA, Vasil ML. Campylobacter jejuni outer membrane proteins are antigenic for humans. Infect Immun 1984; 43: Blaser MJ, Hopkins JA, Berka RM i inni. Idenification and characterization of Campylobacter jejuni outer membrane proteins. Infect Immun1983; 42: BlaserMJ, Duncan DJ. Human serum antibody response to Campylobacter jejuni infection as mesured in an enzyme immunosorbent assay. Infect Immun 1984; 44: Cawthraw SA, Feldman RA, Newell DG. Long-term antibody responses following human infection with Campylobacter jejuni. Clin Exp Immunol 2002; 130: Jakubczak A, Rastawicki W, Jagielski M. Wykorzystanie odczynu ELISA w serologicznej diagnostyce kampylobakteriozy. Med Dośw Mikrobiol 2007; 59: Konkel ME, Klena JD, Rivera Amill V i inni. Secretion of virulence proteins from Campylobacter jejuni is dependent on a functional flagellar apparatus. J Bacteriol 2004; 186: Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriaphage T4. Nature 1970; 227: Martin PM, Ipero J, Georges AJ, Georges-Courbot MC. Antibody response to Campylobacter coli in children instestinal infection and carriage. J Clin Microbiol 1988; 26: Mills SD, Bradbury WC. Human antibody response to outer membrane proteins of Campylobacter jejuni during infection. Infect Immun 1984; 43: Nachamkin I, Hart AM. Western blot analysis of the human antibody response to Campylobacter jejuni cellular antigens during gastrointestinal infection. J Clin Microbiol 1985; 21: 33-8.

9 Nr 2 Antygenowe właściwości białek pałeczek Campylobacter Rautelin HI, Kosunen TU. Campylobacter etiology in human gastroenteritis demonstrated by antibodies to acid extract antigen. J Clin Microbiol 1987; 25: Strid A, Engberg J, Larsen LB, Begtrup K i inni. Antibody response to Campylobacter infections determined by an enzyme linked immunosorbent assay: 2- year follow up study of 210 patients. Clin Diag Lab Immunol 2001; 8: Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheet: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci 1979; 76: Wu SL, Pacheco ND, Oprandy JJ, Rollwagen FM. Identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli antigens with mucosal and systemic antibodies. Infect Immun 1991; 59: Wu YL, Lee LH, Rollins DM Ching WM. Heat shock- and alkaline ph-induced proteins of Campylobacter jejuni: Characterization and immunological properties. Infect Immun 1994; 62: Otrzymano: 17 VI 2008 Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH w Warszawie

10