OCENA PRZYDATNOŚCI TESTU PREMI TEST SALMONELLA DO IDENTYFIKACJI PAŁECZEK SALMONELLA NIETYPUJĄCYCH SIĘ METODAMI KLASYCZNYMI

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: Grzegorz Madajczak, Jolanta Szych OCENA PRZYDATNOŚCI TESTU PREMI TEST SALMONELLA DO IDENTYFIKACJI PAŁECZEK SALMONELLA NIETYPUJĄCYCH SIĘ METODAMI KLASYCZNYMI Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego - -Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. M. Jagielski Oceniono przydatność komercyjnego testu Premi Test Salmonella do identyfikacji nietypujących się szczepów pałeczek Salmonella. Spośród 37 przebadanych szczepów, ocenianym testem w pełni zidentyfikowano 21 (56%) szczepów, identyfikacja 5 (14%) szczepów wymagała dodatkowego potwierdzenia, niepełną identyfikację uzyskano w przypadku 5 (14%) szczepów, natomiast 6 (16%) szczepów nie udało się zidentyfikować. Uzyskane wyniki świadczą o przydatności testu Premi Test Salmonella do określania serotypu pałeczek Salmonella, w przypadku gdy jest to niemożliwe tradycyjnymi metodami. Zakażenia pałeczkami Salmonella nadal stanowią w Polsce istotny etiologiczny czynnik bakteryjnych zakażeń przewodu pokarmowego u ludzi, pomimo obserwowanej w ostatnich latach, tak w Polsce jak i innych krajach europejskich, tendencji spadkowej. W Polsce, w 2007 roku zarejestrowano ponad 14 tysięcy przypadków zakażenia, a w 2008 tylko ponad 10 tysięcy (4). Identyfikacja pałeczek Salmonella enterica subsp. enterica opiera się na oznaczeniu antygenów somatycznych i rzęskowych metodą aglutynacji szkiełkowej. Ich zróżnicowanie pozwoliło podzielić pałeczki Salmonella na grupy i typy serologiczne, co zostało ujęte w schemacie White a-kauffmanna-le Minora (8). Zgodnie z tym schematem pałeczki Salmonella mogą posiadać antygeny rzęskowe występujące w I lub II fazie. U znakomitej większości występują antygeny obu faz, jednak niektóre z nich naturalnie posiadają jedynie antygeny w I-fazie, np. S. Enteritidis (8). Niekiedy izoluje się nietypowe szczepy pałeczek Salmonella, u których z różnych przyczyn, nie można uzyskać aglutynacji z żadną surowicą dla antygenów rzęskowych I lub II fazy. Może to być spowodowane brakiem genów kodujących białka antygenów rzęskowych (flic, fljb) lub brakiem ekspresji tych genów, pomimo iż szczepy takie należą do typu serologicznego normalnie wykazującego rzęski w obu fazach (6). Sytuacja taka uniemożliwia pełną serologiczną identyfikację szczepu. Wśród izolowanych od ludzi w Polsce pałeczek Salmonella, od wielu lat ponad 80 % szczepów należy do dwóch typów serologicznych Salmonella Enteritidis i Salmonella

2 30 G. Madajczak, J. Szych Nr 1 Typhimurium. Jednak w związku z wprowadzeniem krajowych programów zwalczania pałeczek Salmonella w stadach kur, wynikających z przepisów Rozporządzenia Parlamentu Europejskiego 2160/2003, należy spodziewać się zmiany tej sytuacji zarówno spadku ogólnej liczby salmoneloz, jak i zmian wśród najczęściej występujących typów serologicznych pałeczek Salmonella. Niebezpieczną tendencją w tym zakresie jest coraz częstsze pojawianie się szczepów pałeczek Salmonella o nietypowych właściwościach antygenowych (szczepy szorstkie, jednofazowe, nieruchliwe). W 2007 roku w Polsce wykryto 138 przypadków zakażeń takimi pałeczkami Salmonella (dane na podstawie informacji o wynikach badań laboratoryjnych, nadsyłanych do Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH przez Wojewódzkie Stacje Sanitarno-Epidemiologiczne). Zjawisko to obserwuje się nie tylko w Polsce ale również w innych krajach. Już od pewnego czasu notuje się co raz częstsze występowanie w całej Europie szczepów pałeczek Salmonella o defektywnej budowie antygenowej, uniemożliwiającej pełną ich identyfikację (5, 9, 11). Stwierdzono ponadto, że szczepy te często posiadają geny zlokalizowane na plazmidach lub transpozonach, warunkujące ich większą chorobotwórczość lub oporność na leki przeciwbakteryjne, które mogą być przeniesione na inne pałeczki Salmonella (6, 11). W ostatnich latach, w wielu przypadkach takie nietypujące się szczepy pałeczek Salmonella mogą zostać zidentyfikowane do poziomu typu serologicznego przy użyciu metod biologii molekularnej. Najczęściej stosuje się w tym celu technikę multiplex PCR oraz hybrydyzację DNA-DNA na mikromacierzach (1, 2, 7). Najnowszą techniką jest hybrydyzacja na mikromacierzach typu ArrayTube (13, 14). Metoda ta w porównaniu do tradycyjnej hybrydyzacji na mikromacierzach wykonywanej na szklanej lub plastikowej płytce przeprowadzana jest w całości w probówce typu Eppendorf, na dnie której umieszczono miniaturową macierz (Ryc. 1). Obecnie dostępnych jest, w postaci komercyjnych zestawów, kilka typów tych testów, między innymi do oznaczania serologicznego typu pałeczek Salmonella. W grudniu 2009 roku, zgodnie z informacją producenta R y c. 1. Obraz wyniku hybrydyzacji DNA trzech szczepów Salmonella na mikromacierzy w teście Premi Test Salmonella.

3 Nr 1 Test Premi Test w identyfikacji pałeczek Salmonella 31 holenderskiej firmy DSM, przy zastosowaniu tego testu można było zidentyfikować sto jeden serologicznych typów pałeczek Salmonella enterica subs. enterica (10). Celem badań była ocena przydatności komercyjnego testu Premi Test Salmonella (DSM, Holandia) wykorzystującego technikę hybrydyzacji na mikromacierzach w odmianie ArrayTube do określania typu serologicznego nietypujących się tradycyjnymi metodami szczepów pałeczek Salmonella. MATERIAŁ I METODY Przedmiotem badań było 37 szczepów pałeczek Salmonella nadesłanych do reidentyfikacji do Laboratorium Zakładu Bakteriologii w latach ze stacji sanitarno-epidemiologicznych. Szczepy te sprawiały problemy diagnostyczne, takie jak: występowanie w fazie szorstkiej (7 szczepów), brak ruchu (6 szczepów) lub brak jednej z faz antygenów rzęskowych (17 szczepów). Ponadto w przypadku 7 szczepów stwierdzono nietypowe właściwości biochemiczne lub przynależność do bardzo rzadko występującej grupy serologicznej, dla której autorzy nie posiadali surowic dla somatycznych antygenów cząstkowych. Szczepy te przekazano do Krajowego Ośrodka Salmonella w Gdańsku (KOS) celem rozpoznania. Wszystkie szczepy użyte do badań były identyfikowane biochemicznie i serologicznie zgodnie ze standardowymi procedurami badawczymi obowiązującymi w laboratorium (12). Przynależność do grupy antygenowej ustalano na podstawie wyniku testu lateksowego Lateks Salmonella (Biomex), następnie określano typ serologiczny odczynem aglutynacji szkiełkowej z surowicami dla cząstkowych antygenów somatycznych i surowicami dla antygenów rzęskowych (Biomed, Immunolab). Oznaczanie typu serologicznego przy użyciu testu Premi Test Salmonella firmy DSM (Holandia) przeprowadzono zgodnie z zaleceniami producenta. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE W obecnych badaniach test Premi Test Salmonella wykorzystano do oznaczenia typu serologicznego pałeczek Salmonella, w odniesieniu do których nie była możliwa identyfikacja metodą aglutynacji szkiełkowej z surowicami dla antygenów somatycznych i rzęskowych. Wśród 37 badanych szczepów pełną i jednoznaczną identyfikację uzyskano w 21 przypadkach, co stanowi 56% wszystkich badanych szczepów (Tabela I, Ryc. 2). R y c. 2. Wyniki identyfikacji badanych szczepów Salmonella, uzyskane metodą Premi Test Salmonella.

4 32 G. Madajczak, J. Szych Nr 1 Tabela I. Zestawienie wyników identyfikacji metodą klasyczną i testem PremiTest Salmonella 37 badanych szczepów pałeczek Salmonella oraz 8 szczepów kontrolnych ze sprawdzianu jakości EQAS (szczepy od S-1 do S-8) Nr szczepu Wynik identyfikacji metodą klasyczną Wynik identyfikacji testem Premi Test Salmonella** 300/07 S. enterica 6,8 : - : - (S. Blockley*) S. Blockley (14689.) 387/07 S. enterica 6,8 : r : - S. Bovismorbificans (15559.) 38/08 S. enterica 6,7,14 : - : e,h S. Braenderup (9610.) 263/08 S. enterica 4,(5),12 : l,v : - S. Brandenburg (14959.) 226/08 S. enterica 4,(5),12 : l,v : - S. Brandenburg (14959.) 166/07 S. enterica 1,4,12,27 : - : 1,7 S. Bredeney (12863) 105/07 S. enterica 6,7 : - : 1,5 S. Choleraesuis lub Paratyphi C (13545) 165/07 S. enterica 6,7 : - : 1,5 S. Choleraesuis lub Paratyphi C (13545) 383/08 S. enterica 6,7 : - : 1,5 S. Choleraesuis lub Paratyphi C (13545) 160/09 S. enterica 6,7 : - : 1,5 S. Choleraesuis lub Paratyphi C (13545) 285/07 S. enterica 6,7 : c : - S. Choleraesuis lub Paratyphi C (5353) 58/08 S. enterica O:9 (ruch -) S. Enteritidis (2994.G) 436/08 S. enterica w fazie R S. Enteritidis (2994.G) 301/07 S. enterica O:9 (ruch -) S. Enteritidis (2994.G) 533/07 S. enterica O:9 (ruch -) S. Enteritidis (2994.G) 56/08 S. enterica O:9 (ruch -) S. Enteritidis (2994.G) 383/07 S. enterica w fazie R S. Enteritidis (2994.G) 100/08 S. enterica O:6,8 (ruch -) S. Hadar (99,96 % prawdopodob.) (16293) 339/09 S. enterica w fazie R S. Infantis (9381.) 381/08 S. enterica w fazie R S. Infantis (9381) 382/08 S. enterica w fazie R S. Infantis (9381) 157/07 S. enterica w fazie R S. Muenster lub S. Reading (14958.F) 534/07 S. enterica O:61 (S. diarizonae*) możliwa S. diarizonae IIIb (1030) 392/07 S. enterica O:48 (S. diarizonae*) możliwa S. diarizonae IIIb (1030) 223/08 S. enterica O:61 (S. diarizonae*) możliwa S. diarizonae IIIb (9350.) 264/07 S. enterica w fazie R S. Senftenberg (109.) 302/07 S. enterica 1,3,19 : - : - (S. Senftenberg*) S. Senftenberg (109.) 560/07 S. enterica 1,3,19 : - : - S. Senftenberg (2092.) 189/08 S. enterica 6,7 : r : - S. Virchow (16037.DF) 227/08 S. enterica 6,7 : r : - S. Virchow (16037.DF) 525/07 S. enterica w fazie R S. Virchow (16037.DF) 144/09 S. enterica 6,8 : r : - Salmonella, genovar /08 S. enterica O:47,48,50,51,52 Salmonella, genovar /07 S. enterica O:9 (ruch -) Salmonella, genovar /07 S. enterica O:40 Salmonella, genovar /08 S. enterica 4 : - : e,n,x Salmonella, genovar /07 S. enterica O:48 Salmonella ssp. (serotyp nieustalony) * Wynik uzyskany z Krajowego Ośrodka Salmonella w Gdańsku ** W nawiasie podano kod identyfikacyjny uzyskany dla danego szczepu

5 Nr 1 Test Premi Test w identyfikacji pałeczek Salmonella 33 W przypadku 5 (14%) szczepów w teście Premi Test Salmonella uzyskano wynik Salmonella Choleraesuis lub Paratyphi C. Takie rozpoznanie jest związane z identyczną budową antygenową obu serotypów (6,7 : c : 1,5) (8). Pałeczki S. Paratyphi C mogą dodatkowo posiadać antygen Vi, czego jednak nie wykryto u żadnego z badanych szczepów w testach aglutynacji szkiełkowej. Aby zróżnicować te dwa typy serologiczne wykonano, zgodnie z zaleceniami ze schematu White a-kauffmanna-le Minora, dodatkowe testy biochemiczne: test na wykorzystywanie mucynianu, L-winianu oraz fermentacji dulcytolu. We wszystkich pięciu przypadkach uzyskano wyniki wskazujące na Salmonella Cholraesuis var. Kunzendorf. Postawienie takiego rozpoznania nie byłoby możliwe bez wcześniejszego oznaczenia typu serologicznego testem Premi Test Salmonella. Tak więc wyniki oznaczenia tych 5 szczepów można również zaliczyć do grupy wyników z pełną identyfikacją typu serologicznego. Należy podkreślić, iż nowsza wersja oprogramowania testu Premi Test Salmonella (z grudnia 2009) zastosowana do analizy wyników hybrydyzacji, rozróżnia typy serologiczne Choleraesuis lub Paratyphi C. Oprogramowanie testu użytego w obecnych badaniach nie dawało takiej możliwości. Następną grupę wyników stanowiły identyfikacje niepełne lub wątpliwe. Tego typu rozpoznania uzyskano w kolejnych pięciu przypadkach (14%), przy czym w trzech z nich (szczepy o numerach 534/07, 392/07 oraz 223/08) wynik uzyskany testem Premi Test Salmonella (prawdopodobnie S. diarizonae) pokrywał się z identyfikacją szczepów jako S. diarizonae dokonaną przez Krajowy Ośrodek Salmonella (Tabela I). W przypadku szczepu numer 100/08 rozpoznanego ocenianym testem jako S. Hadar z 99,96% prawdopodobieństwem, ze względu na brak zdolności do ruchu, nie było możliwe zweryfikowanie uzyskanego wyniku. Ostatni szczep z grupy niepełnych lub wątpliwych identyfikacji (szczep nr 157/07), został rozpoznany testem Premi Test Salmonella jako S. Muenster lub S. Reading. Rozpoznanie takie, według danych schematu White a-kauffmanna-le Minora wydaje się być niezrozumiałe, gdyż wymienione typy serologiczne są sklasyfikowane w różnych grupach odpowiednio w grupie O:3,10 i O:4, mając przy tym identyczną budowę I i II fazy antygenów rzęskowych. Ze względu na szorstkość tego szczepu niemożliwe było określenie jego grupy serologicznej ani przy zastosowaniu odczynu aglutynacji szkiełkowej ani w teście lateksowym. Tak więc spośród 37 badanych testem Premi Test Salmonella szczepów jedynie w 6 przypadkach (16%) nie udało się uzyskać identyfikacji szczepów do poziomu typu serologicznego, jedynym rozpoznaniem było potwierdzenie ich przynależności do rodzaju Salmonella. Szczepy należące do tej grupy zostały rozpoznane jako Salmonella genovar wraz z kodem identyfikacyjnym określającym charakterystyczny dla nich profil genetyczny, powstałym jako rezultat matematycznego przetworzenia informacji o obecności lub braku poszukiwanej w teście sekwencji DNA (13). Oznacza, to iż na razie nie udało się powiązać danego profilu genetycznego (określonego tym kodem) z konkretnym typem serologicznym. Niewykluczone jest jednak, iż w przyszłości, dzięki modyfikacjom testu, możliwa będzie pełna identyfikacja tych pałeczek Salmonella. Uzyskane wyniki badań wskazują na przydatność komercyjnego testu Premi Test Salmonella do identyfikacji szczepów Salmonella sprawiających kłopoty diagnostyczne ze względu na brak antygenów rzęskowych lub szorstkość szczepu. Sumując liczbę szczepów, dla których uzyskano pełną identyfikację, z liczbą szczepów rozpoznanych jako S. Choleraesuis (identyfikacja potwierdzona przy zastosowaniu dodatkowych testów biochemicznych) a także z liczbą szczepów rozpoznanych jako S. diarizonae (rozpoznanie potwierdzone

6 34 G. Madajczak, J. Szych Nr 1 w KOS) i szczepem rozpoznanym jako S. Hadar (99,96% prawdopodobieństwa) uzyskuje się 30 prawidłowych rozpoznań, co stanowi 81% wszystkich badanych szczepów. Wynik ten jest porównywalny z wynikami uzyskanymi przez Wattiau i wsp. (14), którzy badając przydatność zestawu Premi Test Salmonella do typowania 754 szczepów Salmonella izolowanych od zwierząt w 87,3% przypadków uzyskali pozytywne wyniki. Autorzy tej publikacji stwierdzili, iż w przypadku 9,2% badanych szczepów (69 izolatów) nie można było ustalić typu serologicznego metodą aglutynacji szkiełkowej ze względu na ich jednofazowość lub szorstkość. Brak jest jednak danych co do odsetka prawidłowych wyników uzyskanych testem Premi Test Salmonella w tej grupie. Oceniana metoda identyfikacji pałeczek Salmonella charakteryzuje się znacznie mniejszą pracochłonnością w porównaniu do tradycyjnej procedury, zwłaszcza w odniesieniu do szczepów jednofazowych, które wymagają czasochłonnego i kosztownego etapu hamowania antygenów rzęskowych poprzez posiew na półpłynne podłoże zawierające odpowiednią dla nich surowicę. Należy też zaznaczyć, że zgodnie z instrukcją czas potrzebny do identyfikacji takiego szczepu testem Premi Test Salmonella nie odbiega od czasu potrzebnego do identyfikacji typowego szczepu i może zamknąć się w ośmiu godzinach. Jednak doświadczenie własne wskazuje, iż lepsze wyniki można uzyskać po przedłużeniu czasu oznaczenia do półtorej doby (procedura jest przerywana na jednym z etapów), co i tak jest czasem znacznie krótszym w porównaniu z tradycyjną metodyką badania. Wadą ocenianego testu są wysokie koszty oznaczenia przewyższające koszt identyfikacji szczepu pałeczek Salmonella tradycyjną metodą. Oprócz wysokiej jednostkowej ceny zestawu, badanie testem Premi Test Salmonella wymaga specjalistycznego, laboratoryjnego wyposażenia: czytnika do mikromacierzy ArrayTube, termocyklera a także wirówki z rotorem przystosowanym do probówek używanych w teście (tzw. strips) oraz inkubatora z funkcją wytrząsania. Takie wyposażenie jest zwykle niedostępne w przypadku przeciętnego laboratorium bakteriologicznego. Zważywszy na obserwowane zarówno w Polsce, jak i innych krajach Europy zjawisko narastającego udziału nietypujących się szczepów Salmonella, zwłaszcza jednofazowych, w zakażeniach ludzi i zwierząt, problem prawidłowej identyfikacji takich szczepów staje się szczególnie istotny. Jak stwierdzono część jednofazowych szczepów Salmonella okazuje się być szczepami genetycznie dwufazowymi, o upośledzonej ekspresji genów kodujących antygeny rzęskowe (6, 9). Podsumowując, test Premi Test Salmonella może znaleźć zastosowanie do identyfikacji pałeczek Salmonella, zwłaszcza w wybranych laboratoriach wykonujących badania w kierunku obecności tych droboustrojów w próbkach materiału pochodzących od ludzi, od zwierząt lub w próbkach żywności a także w laboratoriach referencyjnych potwierdzających prawidłowość identyfikacji pałeczek Salmonella w innych laboratoriach mikrobiologicznych.

7 Nr 1 Test Premi Test w identyfikacji pałeczek Salmonella 35 G. Madajczak, J. Szych EVALUATION OF PREMI TEST SALMONELLA KIT FOR IDENTIFICATION OF NOT- TYPABLE BY CONVENTIONAL METHODS SALMONELLA SUMMARY Despite the downward trend, Salmonella is still one of the most important bacterial intestinal infections agents. For example, in 2007 y. in Poland over 14 thousands human salmonelosis cases were notified, in 2008 y. - over 10 thousands. Among all Salmonella isolated from human source, most common (more then 80%) are two serotypes S. Enteritidis and S. Typhimurium, but every year the number of non-typable (because of the lack I or II phase flagellar antigens, autoagglutinative or non-motility properties) Salmonella is growing. This work describes the results of the evaluation of commercially available kit Premi Test Salmonella (DSM, Netherlands), which uses the microarray hybridization in ArrayTube, for serological identification of non-typable Salmonella strains. All 37 researched strains were submitted to the Department of Bacteriology in y, were reidentified according to standard operating procedures and serotyped by slide agglutination for somatic and flagellar antigens if it was possible. All strains were tested using the Premi Test Salmonella Kit, according to manufacturer instructions. In 21 cases (56%) full identification were achieved, in 5 cases (14%) additional tests were required for precise identification (Salmonella Choleraesuis or Paratyphi C, what was detailed using examination of additional biochemical features), 5 strains (14%) achieved an incomplete identification (three of them S. diarizonae were confirmed in National Reference Laboratory for Salmonella) and 6 cases (16% ) were not identified at all. The total number of recognized strains is 30 (81%). The results of present studies show, that Premi Test Salmonella Kit is useful for non-typable Salmonella identification. PIŚMIENNICTWO 1. Alvarez J, Sota M, Vivanco AB i inni. Development of a multiplex PCR technique for detection and epidemiological typing of salmonella in human clinical samples. J Clin Microbiol 2004, 42, Chiu C H, Su L H, Chu C H i inni. Detection of multidrug-resistant Salmonella enterica serovar typhimurium phage types DT102, DT104, and U302 by multiplex PCR. J Clin Microbiol 2006, 44, Choroby zakaźne i zatrucia w Polsce w 2007 roku. Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny Zakład Epidemiologii, Główny Inspektorat Sanitarny Departament Przeciwepidemiczny. Warszawa, Choroby zakaźne i zatrucia w Polsce w 2008 roku. Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny Zakład Epidemiologii, Główny Inspektorat Sanitarny Departament Przeciwepidemiczny. Warszawa, Dionisi A M, Graziani C, Lucarelli C i inni. Molecular Characterization of Multidrug-Resistant Strains of Salmonella enterica Serotype Typhimurium and Monophasic Variant (S. 4,(5),12:i: ) Isolated from Human Infections in Italy. Food Path Dis, 6, Echieta M A, Herrera S, Usera M A. Atypical, fljb-negative Salmonella enterica subsp. enterica Strain of Serovar 4,5,12:i:- Appears To Be a Monophasic Variant of Serovar Typhimurium. J Clin Microb. 2001, 39, Garaizar J, Porwollik S, Echeita A, Rementeria A i inni. DNA microarray-based typing of an atypical monophasic Salmonella enterica serovar. J Clin Microbiol 40,

8 36 G. Madajczak, J. Szych Nr 1 8. Grimont P A D, Weill F X. Antigenic formulae of the Salmonella serovars. 2007, 9 th edition. WHO Collaborating Center for Reference and Research on Salmonella. Instytut Pasteura, Paryż Huehn S, Bunge C, Junker E i inni: Poultry-Associated Salmonella enterica subsp. enterica Serovar 4,12:d: Reveals High Clonality and a Distinct Pathogenicity Gene Repertoire. App Env Microbiol 2009, 75, Petrov P, Hendriksen R S, Kantardjiev, i inni. Occurrence and characterization of Salmonella enterica subspecies enterica serovar 9,12:l,v:- strains from Bulgaria, Denmark, and the United States. Europ J Clin Microb Infect Dis 2008, 28, Szych J. Identyfikacja pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae wyhodowanych w toku bakteriologicznego badania kału W: Etiologia, obraz kliniczny i diagnostyka ostrych zakażeń i zarażeń przewodu pokarmowego oraz zatruć pokarmowych. Red. M. Jagielski, Pro Pharmacia Futura, Warszawa 2010, Wattiau P, Weijersb T, Andreolib P i inni. Evaluation of the Premi Test Salmonella, a commercial low-density DNA microarray system intended for routine identification and typing of Salmonella enterica. Int J Food Microbiol 2008, 123, Wattiau P, Van Hessche M, Schlicker C i inni. Comparison of classical serotyping and PremiTest assay for routine identification of common Salmonella enterica serovars. J Clin Microbiol 2008, 46, Otrzymano: 10 II 2010 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH gmadajczak@pzh.gov.pl