dr hab. Beata Krawczyk Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Transkrypt

1 Nowoczesne metodydiagnostyczne diagnostyczne Immunodiagnostyka dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

2 Miareczkowanie przeciwciał W diagnostyce chorób zakaźnych izolacja patogenów nie zawsze jest możliwa, alternatywą jest mierzenie poziomu przeciwciał dla określonego patogena (poziom przeciwciał antibody titer ) poprzez precypitację Test serologiczny do ilościowego mierzenia stężenia przeciwciał Precypitacja pojawia się tylko wtedy, gdy są optymalne proporcje dwóch reagujących substancji Rys. Microbiology Robert W. Bauman Wyd. Pearson Benjamin Cummings

3 Immunodyfuzja Rys. Microbiology Robert W. Bauman Wyd. Pearson Benjamin Cummings

4 Linia identyczności i częściowej identyczności tzw. ostroga A,B,C C ekstrakty komórek Proteus mirabilis; S przeciwciała przeciwko Proteus mirabilis Rys. Brock Biology of Microorganisms Madigan, Martinko, Parker 9Ed.

5 Odmianą precypitacji jest immunodyfuzja (ang. radial immunodiffusion) Rys. Microbiology Robert W. Bauman Wyd. Pearson Benjamin Cummings

6 Immunoelektroforeza połączenie ł elektroforezy lkt i immunodyfuzji Antygen rozdzielany elektroforetycznie A. Jest tto metoda rozdziału dił i identyfikacji rozpuszczalnych antygenów w żelu, (+) ( ) (białek występujących we krwi, w surowicy lub w moczu) agar precypitat surowica (+) ( ) B. Po elektroforezie białek dodaje się do żelu przeciwciała, które dyfundują bocznie w kierunku antygenu (białka); w miejscu połączenia białka ze swoistym dla niego przeciwciałem następuje precypitacja (wytrącenie) kompleksu antygen przeciwciało w postaci łuku precypitacyjnego, co pozwala na ocenę charakteru antygenu.

7 Immunofiksacja Wybrane białka można zidentyfikować przez związanie ich w żelu swoistymi przeciwciałami, a następnie wybarwić je po wypłukaniu wszystkich innych nie związanych białek. Metoda ta nazywana jest immunofiksacją. Kiedy wykonujemy badanie? Elektroforezę stosuje się w celu wykrycia i identyfikacji nietypowych białek (jeżeli w surowicy lub moczu stwierdza się podwyższony lub obniżony poziom poszczególnych grup białek).

8 Aglutynacja Zachodzi dla antygenów nierozpuszczalnych, obecnych na powierzchni komórki czy innych cząstek Reakcja antygen przeciwciało i ł prowadzi dido wykłaczania (ang. clump) Aglutynacja

9 Zastosowanie kuleczek lateksowych (związanych z przeciwciałami lub antygenami) zwiększona czułość (100 x) w stosunku do precypitacji, pozwala na 100% identyfikację; bardzo szybka 30s; prosta w obsłudze, niedroga; kuleczki lateksowe mają zastosowanie do identyfikacji Staphylococcus aureus (wykrywanie czynnika clumping factor), Streptococcus pyogenes, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influensae, Campylobacter, Cryptococcus neoformans i Candida albicans niektóretesty testy aglutynacji używają jako nośnika węgiel aktywny np. testy na wykrywanie wirusa opryszczki Herpes simplex

10 1. Staphylococcus aureus produkuje zarówno clumping factor i białko A 2. Staphylococcus aureus produkuje tylko clumping factor 3. Staphylococcus aureus produkuje tylko białko A 4. Staphylococcus aureus produkuje clumping factor z wolnym białkiem A

11 Test komplementacji (ang. complement fixation test) Służy do wykrywania obecności specyficznych przeciwciał w surowicy pacjenta, które występują w bardzo małych ilościach, niewykrywalnych testem aglutynacji. Składa się z trzech etapów: 1. Próbka surowicy ogrzewana do 56 C w celu zniszczenia naturalnego komplementu 2. Dodanie znanej ilościantygenu (charakterystycznego dla danego czynnika chorobowego) i standardowej ilości komplementu do surowicy 3. Owcze krwinki czerwone (RBCs) i przeciwciała przeciwko tym krwinkom (przeciwciała anty RBC) 4. Wynik negatywny liza krwinek czerwonych Rys. Microbiology Robert W. Bauman Wyd. Pearson Benjamin Cummings

12 Pojedynczy pomiar przeciwciał nie wskazuje na aktywną infekcje, trzeba wykonać ć bd badania w odstępach czasu Poziom przeciwciał może wzrastać podczas rekonwalescencji (np. dur brzuszny, brucelloza) Sama obecność przeciwciał i ł jest wystarczająca do stwierdzenia infekcji np. w przypadku AIDS Odpowiedź immunologiczna słabo indukowana np. w przypadku Neisseria

13 Rys. Podstawy biologii komórki, Bruce Alberts i in. PWN 1999

14 Technika HYBRYDOMA Przeciwciała pochodzące z jednego klonu komórek B (o jednej specyficzności) zwane są monoklonalnymi Rys. Brock Biology of Microorganisms Madigan, Martinko, Parker 9Ed.

15 Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych 1. Do identyfikacji i rozdziału ł mieszaniny i limfocytów T 2. Do immunologicznego typowania bakterii i identyfikacji komórek zawierających obce antygeny powierzchniowe np. wirusa infekującego komórki k 3. W inżynierii genetycznej do identyfikacji i mierzenia poziomu produktów genów nie wykrywalnych innymi metodami 4. Zastosowania kliniczne i medyczne: wykrywanie i leczenie nowotworów w transplantologii typowanie krwi określenie czynnika reumatoidalnego testy ciążowe wykrywanie in vivo ukrytej miozyny w mięśniu sercowym

16 Mikroskopia immunoelektronowa Zastosowanie do określenia położenia ł specyficznego antygenu (przeważnie białka) w odpowiednim regionie komórki. Komórki traktuje się ę przeciwciałami kowalencyjnie związanymi ą z metalem ciężkim (złoto, platyna), metal rozprasza elektrony, obecność związanych przeciwciał widać w postaci gęstej plamy na fotografii.

17 Zastosowanie przeciwciał fluorescencyjnych Przeciwciała i ł są chemicznie i zmodyfikowane dfik barwnikiem fluorescencyjnym (rodamina, d i izotiocjanian) służą do wykrywania antygenów powierzchniowych. Zastosowanie w mikroskopii świetlnej Dwie metody znakowania fluorescencyjnego: a. odczyn immunofluorescencji bezpośredniej przeciwciała są wyznakowane barwnikiem fluorescencyjnym b. odczyn immunofluorescencji pośredniej ang. IFA przeciwciała (nie znakowane) przeciwko antygenom komórkowym wykrywa się stosując przeciwciała znakowane fluorescencyjnie np. FITC Rys. Brock Biology of Microorganisms Madigan, Martinko, Parker 9Ed.

18 Zastosowanie wielu warstw przeciwciał (sandwicza) w wielu przypadkach pozwala znacznie zwiększyć ć czułość ł testu. t Metoda sandwicza umożliwia wykrycie mniejszej liczby cząstek antygenu Znakowane drugie przeciwciało (czerwone) wiąże się z pierwszym przeciwciałem (fioletowe) antygen

19 Wykorzystanie przeciwciał fluorescencyjnych 1. W mikrobiologii środowiskowej 2. W mikrobiologii klinicznej w diagnostyce chorób infekcyjnych 3. do wykrywania markerów komórkowych 4. w chorobach nie infekcyjnych

20 Spektroskopiafluorescencyjna (FACS) Służy do wizualizacji, zliczania i rozdziału komórek FACS wykorzystuje promień lasera do aktywacji przeciwciał fluorescencyjnych związanych z komórkami Użycie przeciwciał wyznakowanych różnymi barwnikami fluorescencyjnymi pozwala na identyfikacjemarkerów komórkowych np. w identyfikacjibiałekpowierzchniowych CD3 i CD4 na komórkach T osobników chorych na AIDS i zdrowych TcR TcR CD3 CD3 T H T supressor/t CD4 c CD8

21 Rys. Brock Biology of Microorganisms Madigan, Martinko, Parker 9Ed.

22 Enzymatyczny odczyn immunoadsorpcyjny test ELISA (ang. Linked Immunosorbent Assay) Bezpośredni test ELISA direct ELISA detekcja antygenu (np.cz. wirusowe w krwi) 1. Wysoce specyficzny i czuły 2. Stosuje się przeciwciała związane kowalencyjnie z enzymami, których katalityczne, enzymatyczne właściwości i specyficzność pozostają niezmienione. Takimi linkami enzymatycznymi są: peroksydaza, alkaliczna fosfataza, beta galaktozydaza. Powstające produkty są kolorowe i mogą być wykrywane w bardzo małych ilościach Rys. Brock Biology of Microorganisms Madigan, Martinko, Parker 9Ed.

23 Pośredni test ELISA indirect ELISA wykrywanie przeciwciał Każda studzienka musi zawierać ok. 200ng zniszczonego wirusa HIV. Na początku infekcji produkowane są przeciwciała skierowane przeciwko antygenom płaszcza wirusa HIV i te przeciwciała są wykrywane w teście ELISA HIV. Rys. Brock Biology of Microorganisms Madigan, Martinko, Parker 9Ed.

24 Zastosowanie testu ELISA direct ELISA wykrywanie bk bakteryjnych toksyn np. toksyny cholery, toksyny enteropatogennych szczepów E. coli, enterotoksyny Staphylococcus aureus, wirusów: rotawirusy, Hepatitis wirus, Parainfluensae wirus indirect ELISA do wykrywania bakterii: Salmonella, Yersinia, Brucella, riketsji, Vibrio cholerae, Mycobacterium tuberculosis, M. leprae, Legionella pneumophila, Borrelia burgdorferi, Treponema pallidum Wykrywanie y przeciwciał na drożdżaki, amebozy, malarię, ę toksoplazmozę ę Zalety: szybki tani brak radioaktywności bardzo wrażliwy

25 Radioimmunoassay (RIA) Zamiast enzymów można wykorzystać radioizotopy jako koniuganty do przeciwciał. Izotop J 125 nie niszczy specyficzności białek. Służy do wykrywania poziomu takich białek jak: ludzki hormon wzrostu, glukagon, wazopresyna, testosteron, insulina, do badania nadużycia leków i środków dopingujących. Wzrastające stężenie antygenu Znane stężenie antygenu Surowica pacjenta Wykrywanie poziomu insuliny surowicy pacjenta z zastosowaniem przeciwciał antyinsulinowych wyznakowanych radioaktywnie Rys. Brock Biology of Microorganisms Madigan, Martinko, Parker 9Ed.

26 Western blot marker radioaktywny wiąże się do kompleksu antygen przeciwciało np. białko A Staphylococcus jodynownane J 125, białko to wykazuje silne powinowactwo do przeciwciał Dodanie anty ludzkich przeciwciał króliczychzwiązanych związanych z enzymem Rys. Brock Biology of Microorganisms Madigan, Martinko, Parker 9Ed.

27 Czułość metod immunodiagnostycznych Test Reakcja precypitacji W roztworze W żelu (podwójna immunodyfuzja) Reakcja aglutynacji Bezpośrednia 0,4 Czułość (μg przeciwciał/ml) a Pasywna 0,08 RIA 0,0008 0,008 ELISA 0,0008 0,008 Immunofluorescencja 8,0 a Najmniejsza ilość przeciwciał, która daje pozytywną reakcję w obecności antygenu

28 Wady metod opartych o analizę białek 1. Wd Wadą typowania serologicznego jest potrzeba posiadania id i odpowiedniego d i zestawu surowic, których otrzymanie wiąże się ze skomplikowaną procedurą. 2. Przeciwciała ł monoklonalne l mogą wchodzić ć w reakcje krzyżowe z antygenami występującymi u innych bakterii, nie będących przedmiotem badań. 3. W metodach elektroforetycznych skomplikowana analiza wzoru prążków, wynikająca z ich dużej ilości przy nieodpowiednim ustaleniu czułości przeprowadzanego procesu. Trudności te można ominąć stosując immunoblotting, w którym specyficzność reakcji jest określana przez strukturę chemiczną wysoko reaktywnych przeciwciał.