Comparison of usefulness of commercial ELISA Virion/Serion, homemade ELISA and tube agglutination test in serodiagnosis of tularemia

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2013, 65: Porównanie przydatności komercyjnego zestawu ELISA firmy Virion/Serion, zestawu ELISA opracowanego we własnym zakresie oraz odczynu aglutynacji probówkowej w serodiagnostyce tularemii Comparison of usefulness of commercial ELISA Virion/Serion, homemade ELISA and tube agglutination test in serodiagnosis of tularemia Waldemar Rastawicki, Natalia Wolaniuk Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie Wykazano wysoką zgodność wyników uzyskanych odczynem aglutynacji probówkowej, odczynem ELISA opracowanym we własnym zakresie (NIZP PZH) oraz komercyjnym zestawem ELISA firmy Virion/Serion podczas poszukiwania przeciwciał dla pałeczek F. tularensis w 90 próbkach surowicy ludzkiej. Badanie 57 próbek surowicy uzyskanych od osób chorych, podejrzanych w badaniu klinicznym o tularemię, odczynem aglutynacji probówkowej i odczynem ELISA firmy Virion/Serion w klasie IgG i IgM wykazało (68,4%) wyników dodatnich. Odczynem ELISA opracowanym we własnym zakresie uzyskano w tej grupie osób 42 (73,7%) wyników dodatnich w przypadku poszukiwania przeciwciał klasy IgA i IgG oraz (68,4%) podczas oznaczania przeciwciał klasy IgM. Badanie próbek surowicy uzyskanych od 13 osób z jersiniozą oraz 20 krwiodawców wykazało, że wszystkie trzy badane odczyny charakteryzują się wysoką swoistością i mogą być z powodzeniem wykorzystane w rutynowej serodiagnostyce tularemii. Słowa kluczowe: Francisella tularensis, tularemia, ELISA, przeciwciała, aglutynacja probówkowa ABSTRACT Introduction: Tularemia is a highly infectious zoonotic disease caused by Gramnegative bacterium Francisella tularensis. The microbiological diagnosis of tularemia is based on bacteriological, molecular and serological investigations. In the present study we compared of usefulness of commercial ELISA Virion/Serion, homemade ELISA and tube agglutination test in serodiagnosis of tularemia.

2 256 W. Rastawicki, N. Wolaniuk Nr 4 Methods: Serum samples from 57 patients with clinical symptoms of tularemia, 13 patients with yersiniosis and 20 blood donors were tested. The cutoff limit of IgA, IgG and IgM serum antibodies in homemade ELISA was set at mean antibody titer determined in sera of healthy blood donors exceeded by the three standard deviations. The cutoff for positivity in tube agglutination test was titers 25. The IgG and IgM antibodies to lipopolysaccharides of F. tularensis in Virion/Serion ELISA were measured and results interpreted according to the instructions by the manufacturer. Results: The results of the study showed that (68,4%) serum samples obtained from the patients suspected for tularemia were positive by tube agglutination test and Virion/Serion ELISA assay for IgG and IgM antibodies. Homemade ELISA was slightly more sensitive and detected the IgA/IgG antibodies in 42 (73,7%) and IgM antibodies in (68,4%) of serum samples. The positive reactions were not detected by the tube agglutination test and homemade ELISA in serum samples from patients with yersiniosis and blood donors. The Virion/Serion ELISA detected IgG antibodies in diagnostically significant level only in one blood donor. Conclusions: In conclusion, all three serological tests can be successfully used in routine serodiagnosis of tularemia. Key words: Francisella tularensis, tularemia, ELISA, antibodies, tube agglutination test WSTĘP Tularemia jest to wysoce zakaźna choroba odzwierzęca, nazywana również dżumą gryzoni, chorobą zajęczą lub gorączką króliczą (11). Wywoływana jest przez Francisella tularensis, Gramujemną, nietworzącą przetrwalników, względnie tlenową pałeczkę z rodziny Francisellaceae (5, 9, 14). Drobnoustroje te zaliczane są do grupy czynników biologicznych najwyższego ryzyka (20). W obrębie gatunku F. tularensis wyróżnia się dwa podgatunki: wysoce zjadliwy F. tularensis subsp. tularensis (typ A) oraz F. tularensis subsp. holarctica (typ B), wywołujący u ludzi zakażenie o łagodnym przebiegu. W zależności od zjadliwości szczepu oraz drogi wniknięcia patogenu do organizmu ludzkiego, rozpoznaje się następujące postacie kliniczne tularemii: wrzodziejącowęzłową, węzłową, ocznowęzłową, anginową, trzewną, duropodobną oraz płucną (2, 17, 21). Zakażenie może przebiegać w postaci ostrej, z wysoką gorączką, dreszczami, bólami mięśni oraz ogólnym osłabieniem lub w postaci łagodnej. Naturalny rezerwuar F. tularensis stanowią małe gryzonie, zającowate, dzikie ptactwo oraz stawonogi, między innymi: kleszcze, muchy oraz komary z gatunku Aedes, Culex, Anopheles (3, 5, 8, 12). Kleszcze, głównie Dermacentor retikulatus oraz Ixodes ricinus, odgrywają istotną rolę w przenoszeniu choroby. Do zakażenia dochodzi poprzez wtarcie w uszkodzoną skórę człowieka odchodów lub rozgniecionych tkanek kleszcza (1, 15). Do zakażenia człowieka pałeczkami F. tularenisis może dojść również poprzez bezpośredni kontakt z chorymi zwierzętami, spożycie skażonej wody lub mięsa oraz wdychanie kurzu zanieczyszczonego odchodami zakażonych zwierząt (6, 12). Wysokie ryzyko zakażenia występuje wśród myśliwych, rolników, rzeźników, weterynarzy oraz pracowników laboratoryjnych. Nie notowano przypadków przenoszenia choroby z człowieka na człowieka (4, 12,

3 Nr 4 Serodiagnostyka tularemii ). Naturalne zakażenia pałeczkami F. tularensis rejestrowane są w wielu krajach półkuli północnej. W Polsce najwięcej zachorowań na tularemię występuje głównie w okolicach Szczecina, Olsztyna, Bydgoszczy, Gdańska, Białegostoku i Olsztyna (10, 11, 12, 13, 15, 17). Ze względu na brak charakterystycznych objawów klinicznych, diagnostyka tularemii powinna być prowadzona w oparciu o badania mikrobiologiczne. Bakteriologiczna diagnostyka tularemii jest trudna, długotrwała i powinna być prowadzona w laboratorium BSL2. Dlatego też, główny ciężar laboratoryjnej diagnostyki tularemii spoczywa na metodach serologicznych bądź molekularnych (17, 19). W rutynowej serodiagnostyce tularemii w Polsce przez wiele lat wykorzystywano przede wszystkim odczyn aglutynacji probówkowej, wykrywający głównie przeciwciała klasy IgM. W 2005 roku opracowano we własnym zakresie i wprowadzono do rutynowej serodiagnostyki tularemii w Zakładzie Bakteriologii NIZPPZH w Warszawie odczyn immunoenzymatyczny ELISA, pozwalający na określenie poziomu przeciwciał w poszczególnych klasach immunoglobulin (16). Odczyn ten okazał się przydatny w epidemiologicznych badaniach dotyczących występowania przeciwciał dla pałeczek F. tularensis u pracowników leśnych w Polsce (18). Ostatnio, na terenie kraju dostępny jest również komercyjny zestaw ELISA firmy Virion/Serion, służący do oznaczania w próbkach surowicy lub osoczu poziomu swoistych przeciwciał dla antygenów pałeczek F. tularensis. Z danych piśmiennictwa wynika, że zestaw ten był między innymi wykorzystany do badań nad występowaniem tularemii w Iranie (7). Celem prezentowanej pracy było porównanie przydatności komercyjnego zestawu ELI SA firmy Virion/Serion, zestawu ELISA opracowanego we własnym zakresie oraz odczynu aglutynacji probówkowej w serodiagnostyce tularemii. MATERIAŁ I METODY Próbki surowicy. W badaniach wykorzystano 57 próbek surowicy uzyskanych od osób podejrzanych w badaniu klinicznym o tularemię. Próbki te zostały przysłane do Zakładu Bakteriologii NIZPPZH w Warszawie w latach w celu przeprowadzenia rutynowych badań diagnostycznych w kierunku obecności przeciwciał dla antygenu F. tularensis odczynem aglutynacji probówkowej bądź zestawem ELISA opracowanym we własnym zakresie. Dodatkowo, zbadano 20 próbek surowicy uzyskanych od krwiodawców oraz 13 próbek surowicy uzyskanych od osób z wysokim poziomem przeciwciał dla antygenów Yersinia enterocolitica bądź Y. pseudotuberculosis. Próbki surowicy do czasu badania przechowywano w temp. 70 o C. Odczyn aglutynacji probówkowej. Odczyn aglutynacji przeprowadzono w szklanych, jałowych probówkach serologicznych, wykonując szereg dwukrotnych rozcieńczeń badanych próbek surowicy w fizjologicznym NaCl z dodatkiem 0,5% fenolu. Następnie do każdej probówki dodawano po 50 µl zawiesiny pałeczek F. tularensis inaktywowanych formaldehydem (Bioveta). Kontrolę odczynu stanowiła zawiesina pałeczek F. tularensis w 1 ml fizjologicznego roztworu NaCl z 0,5% fenolem. Po 20 godzinnej inkubacji w temp. 37 o C, odczytywano wynik aglutynacji wg pięciostopniowej skali (+++, ++, +, +/, ). Za dodatni wynik odczynu aglutynacji przyjmowano wystąpienie reakcji zlepnej, ocenianej co najmniej na +. Miano przeciwciał w badanych próbkach surowicy równe lub wyższe 25 interpretowano jako wynik dodatni, natomiast niższe od 25 jako wynik ujemny.

4 258 W. Rastawicki, N. Wolaniuk Nr 4 Zestaw ELISA firmy Virion/Serion. Badanie poziomu przeciwciał klasy IgG i IgM wykonywano zgodnie z procedurą podaną przez producenta zestawu Francisella tularensis IgG/IgM Serion ELISA classic (nr kat. ESR142G/M). W zestawie tym jako antygen producent zastosował lipopolisacharyd uzyskany z pałeczek F. tularensis. W przypadku oznaczania immunoglobulin klasy M próbki surowicy wstępnie inkubowano z absorbentem czynnika reumatoidalnego (Serion RFAbsorbent, nr kat. Z200). Odczytu absorbancji dokonywano przy długości fali 405 nm oraz wartości fali odniesienia równej 620 nm. Do zestawu Virion/Serion ELISA producent dołączył certyfikat jakości, właściwy dla danej serii zestawu oraz krzywą standardową, umożliwiającą ilościową ocenę uzyskanych wyników w jednostkach U/ml. Diagnostycznie znamienne wartości poziomu przeciwciał (wartości cutoff) wyznaczono zgodnie z certyfikatem kontroli jakości, przy użyciu dołączonych do każdego zestawu dwóch standardowych próbek kontrolnych. Wartości uzyskane przy badaniu próbki diagnostycznej, mieszczące się poniżej przyjętego zakresu granicznego, przyjmowano za wynik ujemny, natomiast wartości powyżej tego zakresu, interpretowano jako dodatnie. Wyniki mieszczące się w wyznaczonym zakresie progowym, zgodnie z interpretacją producenta, uznawano za wątpliwe. Zestaw ELISA opracowany we własnym zakresie (ELISA NIZPPZH). Odczyn wykonywano na polistyrenowych płytkach Maxi Sorp firmy Nunc, wg metody opisanej uprzednio, z uwzględnieniem niezbędnych modyfikacji, poszukując przeciwciał w klasie IgA, IgG i IgM (16). Jako antygenu użyto inaktywowanej zawiesiny pałeczek F. tularensis rozbitych ultradźwiękami. Wykrycie przeciwciał w badanych próbkach surowicy, w stężeniu przekraczającym wartość cutoff, wyznaczoną na poziomie średniej arytmetycznej wartości OD uzyskanej podczas badania 20 próbek surowicy krwiodawców powiększonej o 3 odchylenia standardowe (x + 3SD) przyjmowano za wynik dodatni. Za wynik ujemny uznawano wartości niższe od średniej arytmetycznej wartości OD uzyskanej podczas badania próbek surowicy krwiodawców, powiększonej o 2 odchylenia standardowe (x + 2SD). Wyniki mieszczące się pomiędzy ustalonymi wartościami progowymi interpretowano jako wątpliwe. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE W tabeli I przedstawiono wyniki uzyskane podczas badania odczynem aglutynacji probówkowej, odczynem ELISA NIZPPZH oraz komercyjnym zestawem ELISA firmy Virion/ Serion 90 próbek surowicy uzyskanych od osób z podejrzeniem tularemii, osób z jersiniozą oraz krwiodawców. W (68,4%) próbkach surowicy, z badanych 57 próbek surowicy uzyskanych od osób podejrzanych w badaniu klinicznym o tularemię, wykryto odczynem aglutynacji probówkowej przeciwciała dla antygenów F. tularensis. Przeciwciała klasy IgA i IgG wykryto odczynem ELISA NIZPPZH we wszystkich próbkach z dodatnim wynikiem odczynu aglutynacji, natomiast przeciwciała klasy IgM w 38 (97,4%) próbkach surowicy. Zestawem ELISA firmy Virion/Serion przeciwciała klasy IgG i IgM dla antygenów F. tularensis wykryto we wszystkich badanych próbkach surowicy. W grupie 18 próbek surowicy z ujemnym wynikiem odczynu aglutynacji probówkowej, uzyskanych od osób podejrzanych o tularemię, odczynem ELISA NIZPPZH wykryto przeciwciała klasy IgA i IgG w trzech, a przeciwciała klasy IgM na poziomie diagnostycznie znamiennym w jednej próbce i na poziomie wątpliwym w dwóch próbkach surowicy. W przypadku użycia zestawu

5 Nr 4 Serodiagnostyka tularemii 259 ELISA firmy Virion/Serion uzyskano jedynie jeden wynik wątpliwy, podczas poszukiwania przeciwciał klasy IgG. W 13 próbkach surowicy uzyskanych od osób z jersiniozą, nie wykryto przeciwciał dla antygenów F. tularensis na poziomie diagnostycznie znamiennym żadnym z ocenianych zestawów serologicznych. W odczynie ELISA NIZPPZH uzyskano jedynie pojedyncze wyniki wątpliwe, podczas oznaczania przeciwciał klasy IgA i IgM. Podobnie, odczynem tym uzyskano jedynie sporadyczne wyniki wątpliwe podczas badania próbek surowicy krwiodawców. Odczynem ELISA firmy Virion/Serion podczas badania próbek surowicy krwiodawców uzyskano jeden wynik dodatni w klasie IgG i jeden wynik wątpliwy w klasie IgM (Tabela I). Tabela I. Wyniki uzyskane podczas badania odczynem aglutynacji probówkowej, odczynem ELISA NIZPPZH oraz komercyjnym zestawem ELISA firmy Virion/Serion próbek surowicy uzyskanych od osób z podejrzeniem tularemii, osób z jersiniozą oraz krwiodawców. Grupa osób, od których uzyskano próbki surowicy (N = liczba próbek) Liczba (odsetek) próbek z wynikiem dodatnim w aglutynacji probówkowej Liczba (odsetek) wyników Liczba (odsetek) wyników dodatnich/ dodatnich/wątpliwych * w odczynie ELISA NIZPPZH wątpliwych * w zestawie ELISA Virion/Serion IgA IgG IgM IgG IgM Osoby podejrzane w badaniu klinicznym o tularemię, z dodatnim wynikiem odczynu aglutynacji probówkowej (N= ) 38 (97,4%) Osoby podejrzane w badaniu klinicznym o tularemię, z ujemnym wynikiem odczynu aglutynacji probówkowej (N=18) Osoby z jersiniozą (N=13) Krwiodawcy (N=20) 3 (16,6%) 1 * (7,7 %) 2 * (10 %) 3 (16,6%) 1 (5,5%) 2 * (11,1%) 1 * (7,7 %) 1 * (5%) 1 * (5,5 %) 1 (5%) 1 * (5%) W tabeli II porównano częstość wykrywania przeciwciał dla antygenów F. tularensis w 90 badanych próbkach surowicy odczynem ELISA NIZPPZH i komercyjnym zestawem ELISA firmy Virion/Serion. W przeprowadzonej analizie wyniki wątpliwe uzyskane w obydwu testach przyjęto za wyniki ujemne. W przypadku poszukiwania przeciwciał klasy IgG nieznacznie częściej uzyskiwano wyniki dodatnie odczynem ELISA NIZPPZH, natomiast w przypadku oznaczania przeciwciał klasy IgM częstość uzyskiwania wyników dodatnich

6 260 W. Rastawicki, N. Wolaniuk Nr 4 była identyczna. Odsetek wyników zgodnych w obydwu testach ELISA, zarówno podczas oznaczania przeciwciał klasy IgG jak i IgM, był bardzo wysoki, przekraczający 95%. Tabela II. Porównanie częstości wykrywania przeciwciał dla antygenów F. tularensis w 90 badanych próbkach surowicy odczynem ELISA NIZPPZH i komercyjnym zestawem ELISA firmy Virion/Serion. Klasa badanych przeciwciał Liczba (odsetek) próbek z wynikiem w odczynie ELISA: NIZPPZH + Virion/Ser. + NIZPPZH + Virion/Ser. NIZPPZH Virion/Ser.+ NIZPPZH Virion/Ser. Liczba (odsetek) próbek z wynikiem zgodnym IgG (43,3%) 3 (3,3%) 1 (1,1%) 47 (52,2%) 86 (95,5%) IgM 38 (42,2%) 1 (1,1%) 1 (1,1%) 50 (55,5%) 88 (97,7%) Przeprowadzone badania wykazały wysoką zgodność wyników uzyskanych zestawem ELISA firmy Virion/Serion, zestawem ELISA opracowanym we własnym zakresie oraz odczynem aglutynacji probówkowej. Uzyskanie trzech wyników dodatnich odczynem ELISA NIZPPZH w klasie IgA i IgG podczas badania 18 próbek surowicy osób podejrzanych w badaniu klinicznym o tularemię, z ujemnym wynikiem aglutynacji, można tłumaczyć faktem, iż w serologicznych odczynach aglutynacyjnych wykrywane są głównie przeciwciała klasy IgM. Ograniczenie to może być jednak istotne podczas przeprowadzenia badań epidemiologicznych dotyczących częstości występowania zakażeń F. tularensis na terenie kraju. Możliwość oznaczania przeciwciał klasy IgG, które utrzymują się zazwyczaj po przebytym zakażeniu znacznie dłużej we krwi niż przeciwciała klasy IgM, daje znaczącą przewagę w tym względzie odczynowi ELISA. Włączenie do badań próbek surowicy osób z jersiniozą spowodowany był uwagą producenta zestawu ELISA firmy Virion/Serion o możliwych reakcjach krzyżowych pomiędzy przeciwciałami dla pałeczek Yersinia a lipopolisacharydowym antygenem F. tularensis. W przeprowadzonych badaniach nie wykazano jednak żadnych istotnych, nieswoistych reakcji. Podobnie nie stwierdzano, poza jednym przypadkiem, reakcji dodatnich podczas badania próbek surowicy krwiodawców. Jest to spowodowane niewątpliwie faktem, że tularemia nie jest chorobą powszechnie występującą w Polsce. Co więcej, podczas zakażenia pałeczkami F. tularensis dochodzi do silnej reakcji immunologicznej, skutkującej intensywną produkcją swoistych przeciwciał, znacznie ułatwiającą diagnostykę serologiczną. Oceniając przydatność w serodiagnostyce tularemii komercyjnego zestawu ELISA firmy Virion/Serion należy podkreślić fakt poprawnie wyznaczonego przez producenta poziomu cut off. Wartość ta była bardzo zbliżona do wartości cutoff wyznaczonego na podstawie badania osób klinicznie zdrowych krwiodawców zamieszkałych na terenie Polski. I tak, dla przeciwciał klasy IgG górna wartość cut off wyznaczona przez producenta zestawu wynosiła 0,310, natomiast wyliczona na podstawie badania próbek surowicy krwiodawców (x+3sd) 0,348; dla przeciwciał klasy IgM wartości te wynosiły odpowiednio 0,290 i 0,5. Miało to niewątpliwie wpływ na wysoki odsetek zgodnych wyników uzyskanych w obydwu użytych zestawach ELISA. Podsumowując przeprowadzone badania należy stwierdzić, że wszystkie trzy testy serologiczne mogą być z powodzeniem wykorzystane w rutynowej serodiagnostyce tularemii u osób z klinicznym podejrzeniem choroby.

7 Nr 4 Serodiagnostyka tularemii 261 PIŚMIENNICTWO 1. Cisak E, ChmielewskaBadora J, Zwoliński J, Dutkiewicz J. Choroby przenoszone przez kleszcze. Med Ogól 2008; 14: Dennis DT. Tularemia as a biological weapon. JAMA 2001; 285: Dutkiewicz J, Cisak E. Biologiczne czynniki zagrożenia zawodowego w leśnictwie. Zdr Publ 2008; 118: Dutkiewicz J, Jabłoński L. Biologiczne szkodliwości zawodowe. Warszawa PZWL 1989: Ellis J, Oyston PCF, Green M, Titball RW. Tularemia. Clin Microbiol Rev 2002; 15(4): Erricsson M. Persistence of CellMediated Immunity and Decline of Humoral Immunity to the Intracellular Bacterium Francisella tularensis 25 years after natural infection. J Infect Dis 1994; 170: Esmaeili S, Gooya MM, Shirzadi MR i inni. Seroepidemiological survey of tularemia among different groups in western Iran. Int J Infect Dis 2013; 13: Evans ME, Gregory DW, Schaffner W, McGee ZA. Tularemia: a 30 year experience with 88 cases. Medicine (Baltimore) 1985; 64: Foley JE, Nieto NC. Tularemia. Vet Microbiol 2010; 140: HermanowskaSzpakowicz T, Pancewicz SA. Obecność przeciwciał przeciw Francisella tularensis osób zamieszkujących północnowschodnią Polskę. Przegl Epidemiol 1996; 50: Kłapeć T, Cholewa A. Tularemia wciąż groźna zoonoza. Med Ogól 2011; 17: Knap J. Tularemia. W: Choroby zakaźne i pasożytnicze epidemiologia i profilaktyka. red. Magdzik W, NaruszewiczLesiuk D, Zieliński A, αmedica press, BielskoBiała 2004; Malottke R, Dominowska C. Zachorowania na tularemię w Polsce w latach Przegl Epidemiol 1973; 22: Osiak B, Bartoszcze M, Gaweł J. Francisella tularensis cechy zarazka, patogeneza, diagnostyka. Przegl Epidemiol 2006; 60: Pacewicz S, Zajkowska M, Świerzbińska R i inni. Czy kleszcze są wektorami tularemii u mieszkańców PółnocnoWschodniej Polski? Med. Pr 2004; 55: Rastawicki W, Jagielski M, Gierczyński R. Wykorzystanie odczynu ELISA w serologicznej diagnostyce tularemii. Med Dośw Mikrobiol 2005; 57: Rastawicki W, Jagielski M. Tularemia. Post Microbiol 2005; 44: Rastawicki W, Kurowska J, HermanowskaSzpakowicz T i inni. Występowanie przeciwciał dla antygenów Francisella tularensis u pracowników leśnych w wybranych regionach Polski 2006; 58: Sharma N, Hotta A, Yomamoto Y i inni. Detection of Francisella tularensis specific antibodies in patients with tularemia by a novel competitive enzyme linked immunosorbent assay. Clin Vaccine Immunol 2013; 20: Sjostedt A. Virulence determinants and protective antigens of Francisella tularensis. Cur Opin Microbiol 2003; 6: Tarnvik A, Berglund L. Tularemia. Eur Respir J 2003; 21: Otrzymano: 25 XI 2013 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie

8