Występowanie przeciwciał dla pałeczek Francisella tularensis w poszczególnych podklasach IgG u osób z tularemią

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2014, 66: Występowanie przeciwciał dla pałeczek Francisella tularensis w poszczególnych podklasach IgG u osób z tularemią Serum immunoglobulin IgG subclass distribution of antibody responses to Francisella tularensis in patients with tularemia Waldemar Rastawicki, Natalia Rokosz-Chudziak, Natalia Wolaniuk Zakład Bakteriologii NIZP-PZH w Warszawie Określono częstość występowania i poziom przeciwciał podklas IgG1-IgG4 dla inaktywowanych, rozbitych ultradźwiękami pałeczek F. tularensis u osób z tularemią. Przeprowadzone badania wykazały, że w przebiegu tularemii wytwarzane są przeciwciała należące do podklasy IgG1, IgG2 i IgG3. Najczęściej i na najwyższym poziomie wykrywano przeciwciała podklasy IgG2. Nie wykryto na diagnostycznie znamiennym poziomie przeciwciał podklasy IgG4. Słowa kluczowe: przeciwciała podklasy IgG, Francisella tularensis, tularemia ABSTRACT Introduction: The present study was aimed at determining the IgG subclass distribution against F. tularensis in patients with tularemia. Methods: The total number of 56 serum samples obtained from patients with serologically confirmed tularemia were tested by in-house ELISA with bacterial sonicate as the antigen for the presence of IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 antibodies to F. tularensis. Based on the results of determining the level of antibodies in the sera of 30 blood donors, the cut-off limit of serum antibodies for each subclass was set at arithmetic mean plus three standard deviations. Results: Antibodies of subclass IgG1 to F. tularensis were diagnosed in 41 (73.2%), IgG2 in 52 (92,9%) and IgG3 in 13 (23,2%) serum samples. The arithmetic mean of OD 450 of antibodies IgG2 was over three-times higher than antibodies IgG1 and IgG3 measured in all of tested serum samples. The concentration of IgG4 was below the detection level. Conclusions: In conclusion, IgG2 antibodies to F. tularensis are predominating IgG subclass in tularemia. This study showed also that subclasses of IgG1 and IgG3 but not IgG4 antibodies to F. tularensis are produced during natural infection in humans. Key words: IgG subclass antibodies, Francisella tularensis, tularemia

2 12 W. Rastawicki, N. Rokosz-Chudziak, N. Wolaniuk Nr 1 WSTĘP Tularemia jest ostrą chorobą zakaźną, wywoływaną przez pałeczki Francisella tularensis. Laboratoryjna diagnostyka tularemii opiera się na potwierdzeniu obecności drobnoustrojów bądź ich DNA w próbkach materiału klinicznego czy też na wykryciu na diagnostycznie znamiennym poziomie swoistych przeciwciał w próbkach surowicy. Przeciwciała dla antygenów pałeczek F. tularensis pojawiają się u osób zakażonych po 1-14 dniach od wystąpienia objawów klinicznych, osiągając swój najwyższy poziom w 4-7 tygodniu choroby (13). Aktualnie w rutynowej serodiagnostyce tularemii wykorzystuje się odczyn aglutynacji probówkowej, wykrywający głównie przeciwciała klasy IgM oraz odczyn immunoenzymatyczny ELISA, umożliwiający wykrycie przeciwciał osobno w poszczególnych klasach immunoglobulin A, G i M (11). We wcześniej przeprowadzonych pracach wykazano, że w przebiegu tularemii dochodzi do wytwarzania wysokiego poziomu swoistych immunoglobulin klasy G (8, 11, 15). Stanowią one około 70-75% całkowitej puli wszystkich immunoglobulin człowieka i ze względu na typ łańcucha ciężkiego można je podzielić na cztery podklasy (5, 14). Jak dotąd brak jest w dostępnym piśmiennictwie danych dotyczących udziału przeciwciał w poszczególnych podklasach IgG w odpowiedzi humoralnej w przebiegu naturalnego zakażenia pałeczkami F. tularensis. Z tego względu, celem prezentowanej pracy była ocena występowania przeciwciał dla pałeczek F. tularensis w poszczególnych podklasach IgG w próbkach surowicy osób z tularemią. MATERIAŁ I METODY Próbki surowicy. Przedmiotem badań było 56 próbek surowicy uzyskanych od osób z tularemią, w których we wcześniej wykonanych, rutynowych badaniach odczynem aglutynacji probówkowej bądź też odczynem ELISA stwierdzono wysoki poziom swoistych przeciwciał dla antygenów pałeczek F. tularensis. Informacje o wieku osób, od których uzyskano próbki surowicy uzyskano tylko w 29 przypadkach; w zdecydowanej większości byli to mężczyźni powyżej 18 roku życia (21 osób). Dodatkowo, w celu wyznaczenia diagnostycznie znamiennego poziomu przeciwciał, przebadano 30 próbek surowicy krwiodawców. Odczyn ELISA. Badania przeprowadzono pośrednim testem immunoenzymatycznym ELISA zgodnie z procedurą podaną uprzednio (8). Odczyn wykonywano na polistyrenowych płytkach Maxi-Sorp firmy Nunc opłaszczonych zawiesiną inaktywowanych pałeczek F. tularensis rozbitych ultradźwiękami. W odczynie ELISA posłużono się mysimi, monoklonalnymi przeciwciałami sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (Invitrogen) dla ludzkich immunoglobulin IgG, IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. W wyniku wstępnego miareczkowania przyjęto rozcieńczenie koniugatu anty-igg 1/4000, koniugatów anty-igg1 i IgG3 1/500, anty-igg2 1/750 i anty-igg4 1/300. Wartość diagnostycznie znamiennego poziomu przeciwciał wyliczano ze średniej arytmetycznej wartości poziomu przeciwciał oznaczonych w 30 próbkach surowicy osób klinicznie zdrowych powiększonej o 3 odchylenia standardowe.

3 Nr 1 Podklasy IgG w tularemii 13 WYNIKI Na podstawie uzyskanych wyników badania odczynem ELISA 30 próbek surowicy krwiodawców obliczono średnie wartości poziomu przeciwciał, odchylenie standardowe oraz wartości indeksu przeciwciał, które należy przyjąć za diagnostycznie znamienne (wartość cut-off). I tak, w przypadku poszukiwania przeciwciał klasy IgG wartość cut-off wynosiła 0,42, podklasy IgG1 0,22, podklasy IgG2 0,66 i podklasy IgG3 0,59. W przypadku poszukiwania przeciwciał podklasy IgG4, wartości OD 450 uzyskane podczas badania próbek surowicy krwiodawców były na poziomie wartości OD 450 blanków, co uniemożliwiło wyznaczenie wartości cut-off. Przeprowadzone badania nie wykazały w próbkach surowicy krwiodawców obecności przeciwciał klasy IgG i IgG1-IgG4 na diagnostycznie znamiennym poziomie. We wszystkich 56 próbkach surowicy osób z tularemią stwierdzono obecność przeciwciał klasy IgG dla F. tularensis. Przeciwciała podklasy IgG1 na diagnostycznie znamiennym poziomie stwierdzono w 41 (73,2%), podklasy IgG2 w 52 (92,9%) i podklasy IgG3 w 13 (23,2%) próbkach surowicy. W badanych próbkach surowicy osób chorych nie wykazano obecności przeciwciał podklasy IgG4 na diagnostycznie znamiennym poziomie (Tabela I). Tabela I. Występowanie i poziom przeciwciał w poszczególnych podklasach IgG dla pałeczek F. tularensis w 56 próbkach surowicy uzyskanych od osób z tularemią. Badany parametr Podklasa badanych przeciwciał: IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Liczba (odsetek) próbek surowicy z diagnostycznie znamiennym 41 (73,2%) 52 (92,0%) 13 (23,2%) - poziomem przeciwciał: X+3SD Liczba (odsetek) próbek surowicy, z wysokim poziomem przeciwciał: 2x(X+3SD) 32 (57,1%) 45 (80,4%) 7 (12,5%) - Średnia arytmetyczna wartości OD 450 uzyskana podczas badania wszystkich 56 surowic osób z tularemią 0,478 1,598 0,580 0,076 Wysoki poziom przeciwciał klasy IgG1 (co najmniej 2 razy wyższy od przyjętego poziomu cut off) wykryto w 32 (57,1%), podklasy IgG2 w 45 (80,4%) i podklasy IgG3 tylko w 7 (12,5%) próbkach surowicy. Średnia arytmetyczna wartości absorbancji (OD 450 ) w przypadku poszukiwania przeciwciał podklasy IgG1 we wszystkich 56 próbkach surowicy wynosiła 0,478, przeciwciał podklasy IgG2 1,598, przeciwciał podklasy IgG3 0,580 i przeciwciał podklasy IgG4 0,076 (średnia OD 450 blanków przy oznaczaniu przeciwciał IgG4 wynosiła 0,062, średnia OD 450 krwiodawców 0,067). W przeprowadzonych badaniach nie stwierdzono istotnych różnic w częstości i poziomie wykrywanych przeciwciał w poszczególnych podklasach IgG w zależności od płci czy wieku badanych osób z tularemią.

4 14 W. Rastawicki, N. Rokosz-Chudziak, N. Wolaniuk Nr 1 DYSKUSJA Przeciwciała poszczególnych podklas IgG różnią się między sobą nie tylko budową lecz także właściwościami biologicznymi. Podczas zakażenia, antygeny białkowe drobnoustrojów najsilniej stymulują produkcję przeciwciał podklasy IgG1 i IgG3, znacznie słabiej klasy IgG4 oraz IgG2. Antygeny lipopolisacharydowe najsilniej stymulują z kolei wytwarzanie przeciwciał podklasy IgG2, znacznie słabiej IgG1 i IgG3 oraz nie indukują powstawania przeciwciał podklasy IgG4 (4, 5). W swoich badaniach, Bavanger i wsp. (2) wykazali, że lipopolisacharydy odgrywają główną rolę w stymulowaniu produkcji przeciwciał w ostrej fazie zakażenia wywołanego pałeczkami F. tularensis. Tak więc, w próbkach surowicy osób z tularemią należałoby spodziewać się przede wszystkim przeciwciał podklasy IgG2. Faktycznie, w przeprowadzonych przez nas badaniach, przeciwciała tej podklasy zdecydowanie dominowały w badanych próbkach surowicy, osiągając z reguły 2-3 krotnie wyższe poziomy niż przeciwciała podklasy IgG1 i IgG3. Na podkreślenie zasługuje fakt, że badania nasze były przeprowadzone odczynem ELISA, przy użyciu pełnokomórkowego antygenu, zawierającego zarówno frakcję białkową jak i lipopolisacharydową pałeczek F. tularensis. Przydatność takiego antygenu w serodiagnostyce tularemii została potwierdzona we wcześniej prowadzonych badaniach (6, 8, 11, 15). W doświadczalnych badaniach na szczurach wykazano, że podskórne podanie atenuowanej szczepionki LVS F. tularensis silnie indukuje produkcję przeciwciał klasy IgM oraz podklas IgG2a i IgG2b. Profilaktyczne podanie szczurom żywej szczepionki czy też oczyszczonych immunoglobulin G łagodzi u nich objawy kliniczne i skraca czas trwania choroby po doświadczalnym, dotchawiczym podaniu zjadliwego szczepu F. tularensis (7). W przeprowadzonych przez nas badaniach dysponowaliśmy jedynie próbkami surowicy uzyskanymi jednokrotnie w przebiegu choroby. Dodatkowo, informacje o wieku badanych osób mieliśmy tylko w 29 przypadkach, z czego zdecydowaną większość stanowili mężczyźni. Z tego powodu nie była możliwa dokładna analiza odpowiedzi humoralnej w poszczególnych podklasach IgG w zależności od okresu choroby, wieku czy płci badanych osób z tularemią. Średnia wartość OD 450 przeciwciał podklasy IgG2 dla F. tularensis była podobna w próbkach surowicy uzyskanych od dzieci do 18 roku życia i od osób dorosłych. Jednakże, w licznych badaniach dotyczących częstości występowania przeciwciał w poszczególnych podklasach IgG zarówno u osób zdrowych, jak i z różnymi zakażeniami bakteryjnymi wynika, że przeciwciała podklasy IgG2 częściej wykrywane są u osób dorosłych niż u dzieci (1, 3, 9, 10, 12). PIŚMIENNICTWO 1. Berkel AI, Tezcan I, Ersoy F, Sanal O. Serum immunoglobulin G subclass values in helthy Turkish children and adults. Turk J Pediatr 1994; 36: Bevanger L, Maeland JA, Kvam AI. Comparative analysis of antibodies to Francisella tularensis antigens during the acute phase of tularemia and eight years later. Clin Diagn Lab Immunol 1994; 1: Gregorek H, Imielska D, Gornicki J i inni. Development of IgG subclasses in healthy Polish children. Arch Immunol Ther Exp 1994; 42:

5 Nr 1 Podklasy IgG w tularemii Hamilton RG. Human IgG subclass measurements in the clinical laboratory. Clin Chem 1987; 33: Jakóbisiak M. Przeciwciała, str W: Immunologia. Red. Gołąb J, Jakóbisiak M, Lasek. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa Koskela P, Salminen A. Humoral immunity against Francisella tularensis after natural infection. J Clin Microbiol 1985; 22: Mara-Koosham G, Hutt JA, Lyons CR, Wu TH. Antibodies contribute to effective vaccination against respiratory infection by type A Francisella tularensis strains. Infect Immun 2011; 79: Rastawicki W, Jagielski M, Gierczyński R. Wykorzystanie odczynu ELISA w serologicznej diagnostyce tularemii. Med Dośw Mikrobiol 2005; 57: Rastawicki W, Jakubczak A. Serum immunoglobulin IgG subclass distribution of antibody responses to Yop proteins and lipopolysaccharide of Yersinia enterocolitica in patients with yersiniosis. Pol J Microbiol 2007; 56: Rastawicki W, Rokosz N, Jagielski M. Występowanie przeciwciał dla antygenów Mycoplasma pneumoniae w poszczególnych podklasach IgG w przebiegu mykoplazmozy. Med Dośw Mikrobiol 2009; 61: Rastawicki W, Wolaniuk N. Porównanie przydatności komercyjnego zestawu ELISA firmy Virion/Serion, zestawu ELISA opracowanego we własnym zakresie oraz odczynu aglutynacji probówkowej w serodiagnostyce tularemii. Med Dośw Mikrobiol 2013; 65: Rastawicki W, Śmietańska K, Rokosz-Chudziak, Jagielski M. Występowanie przeciwciał dla toksyny krztuścowej i włókienkowej hemaglutyniny Bordetella pertussis w poszczególnych podklasach IgG w przebiegu krztuśca. Med Dośw Mikrobiol 2013; 65: Rastawicki W. Tularemia. W: Choroby zakaźne i pasożytnicze epidemiologia i profilaktyka. Baumann-Popczyk A, Sadkowska-Todys M, Zieliński A. α-medica Press, 2014, wyd. VII, str Spiegelberg HL. Biological activities of immunoglobulins of different classes and subclasses. Adv Immunol 1974; 303: Viljanen MK, Nurmi T, Salminen A. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with bacterial sonicate antigen form IgM, IgA, and IgG antibodies to Francisella tularensis: comparison with bacterial agglutination test and ELISA with lipopolysaccharide antigen. J Infect Dis 1983; 148: Otrzymano: 18 III 2014 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH w Warszawie

6