Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych w laboratorium medycznym

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2012 Volume 48 Number Praca poglądowa Review Article Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych w laboratorium medycznym Quality assurance and quality control of microbiology culture media in medical laboratory Marzena Strzyż, Urszula Wendt Laboratoria Medyczne BRUSS Grupa ALAB Sp. z o.o. Streszczenie Medyczne laboratorium mikrobiologiczne wdrażające system zarządzania jakością zobligowane jest do kontrolowania jakości stosowanego wyposażenia, w tym także, pożywek mikrobiologicznych. Pożywki mikrobiologiczne odgrywają kluczową rolę w badaniach mikrobiologicznych. Jakość pożywek determinuje możliwość wzrostu, prawidłową identyfikację i poprawną ocenę lekowrażliwości drobnoustrojów. W laboratoriach mikrobiologicznych kontrola pożywek służy sprawdzeniu ich jakości i potwierdzeniu ich przydatności do stosowania w badaniach mikrobiologicznych. Kontrola ta obejmuje ogólną ocenę właściwości fizycznych i chemicznych oraz ocenę właściwości mikrobiologicznych takich jak jałowość, żyzność, selektywność, specyficzność oraz zdolność do oceny lekowrażliwości. Summary Medical microbiology laboratory which implement quality management system is obligated to control/ evaluation of quality of equipment, including, microbiology culture media. Microbiology culture media play a key role in microbiology examinations. Quality of culture media determinate possibility of growth, correct identification and accurate antimicrobial susceptibility testing. In medical laboratories control of culture media are used for control of their quality and for performance testing of culture media. Quality control include general estimation of physical and chemical characteristics and estimation of microbiological charakteristics like sterility, productivity, selectivity, specificity and ability for antimicrobial susceptibility testing. Słowa kluczowe: kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych, pożywki mikrobiologiczne, właściwości mikrobiologiczne pożywek Key words: quality control of microbiology culture media, microbiology culture media, microbiology characteristics of culture media Wstęp Wdrożenie systemu zarządzania jakością w medycznym laboratorium mikrobiologicznym wymaga uruchomienia i utrzymywania mechanizmów zapewniających wiarygodność uzyskiwanych wyników badań. Zgodnie z ISO/IEC oraz ISO [1, 2], jednym z czynników istotnie wpływających na jakość wyników badań jest wyposażenie laboratorium, którym są nie tylko urządzenia badawczopomiarowe, ale także odczynniki, wzorce odniesienia, itp. W przypadku badań mikrobiologicznych, dodatkowym elementem wyposażenia o szczególnym znaczeniu dla powtarzalności i wiarygodności wyników badań są pożywki mikrobiologiczne. Jakość pożywek determinuje bowiem, zarówno możliwość wykrycia drobnoustrojów w badanej próbce, jak też ich poprawnej identyfikacji i prawidłowej oceny lekowrażliwości. W procesie badawczym, nawet najlepiej dobrane do określonego kierunku badania pożywki, ale niewłaściwej jakości, mogą spowodować uzyskanie niewiarygodnego wyniku. Jest to powód, dla którego pożywki mikrobiologiczne muszą odpowiadać określonym kryteriom jakościowym, a laboratorium powinno zapewniać odpowiednią jakość pożywek oraz sprawdzać i potwierdzać spełnienie kryteriów jakości pożywek. W zależności od możliwości organizacyjnych, medyczne laboratoria mikrobiologiczne wykorzystują podłoża komercyjne lub przygotowują pożywki we własnym zakresie. Pożywki komercyjne są dostarczane do laboratorium w postaci gotowej do użycia lub jako częściowo przygotowane pożywki w postaci odwodnionych granulatów ewentualnie proszków, z których należy przygotować pożywkę. Każda seria pożywki dostarczana jest do laboratorium wraz z certyfikatem jakości, w którym wytwórca potwierdza jej jakość. Certyfikat jakości 187

2 Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych w laboratorium medycznym pożywki potwierdza wykonanie przez wytwórcę badań kontrolnych danej serii pożywki i przedstawia ich wyniki. W przypadku pożywek odwodnionych, certyfikat odnosi się do tej postaci, w jakiej pożywkę dostarczono do laboratorium, gdyż właściwości pożywki w jej ostatecznej postaci będą zależeć od sposobu przygotowania pożywki do użycia przez laboratorium. W przypadku, gdy laboratorium samodzielnie przygotowuje pożywki, cała odpowiedzialność za zapewnienie właściwości pożywek, tj. ich odpowiedniej jakości, spoczywa na laboratorium. W tej sytuacji, laboratorium jest zobligowane do zapewnienia jakości pożywek poprzez standaryzację procesu wytwarzania oraz samodzielnego kontrolowania ich jakości poprzez sprawdzanie właściwości pożywek. W celu określenia zakresu i częstotliwości kontroli pożywek mikrobiologicznych należy posłużyć się dokumentami normatywnymi opisującymi wymagania odnośnie zapewniania jakości pożywek w procesie wytwarzania oraz ich sprawdzania, tj. kontroli jakości. Dokumentami takimi są: norma EN określająca kryteria oceny jakości pożywek do diagnostyki in vitro [3] oraz specyfikacja techniczna ISO/TS [4, 5]. Specyfikacja ta składa się z dwóch części: ISO/TS dokument przedstawiający wytyczne dotyczące kontrolowania jakości pożywek mikrobiologicznych przygotowywanych w laboratorium [4] ISO/TS dokument zawierający wytyczne przygotowywania i wytwarzania pożywek w laboratorium [5]. Zgodnie z wymaganiami ISO/IEC (pkt ) oraz ISO (pkt ), laboratorium powinno poddawać sprawdzeniom wyposażenie i materiały, które w istotny sposób wpływają na wiarygodność wyników badań, przy czym sprawdzeń tych, należy dokonywać przed użyciem danego wyposażenia w procesie badawczym [1, 2]. Oznacza to, że ze względu na kluczową rolę pożywek w badaniach mikrobiologicznych, należy sprawdzać także pożywki. O ile kontrolowanie jakości pożywek wykonywanych w laboratorium wydaje się oczywiste, to jednak pojawia się pytanie o konieczność sprawdzania pożywek komercyjnych. Odpowiedź na to pytanie można znaleźć w dokumencie EA-04/10 Akredytacja laboratoriów mikrobiologicznych [6], w którym w pkt. 7 zapisano wymaganie, iż przed pierwszym użyciem, sprawdzać należy zarówno pożywki przygotowywane w laboratoriach, jak i pożywki gotowe do użycia. Wyjątkiem są gotowe do użycia lub częściowo przygotowane pożywki (pożywki suche), których wytwórca posiada potwierdzony odpowiednim certyfikatem system jakości jakim jest, np. system zarządzania zgodny z wymaganiami normy ISO 9001 lub ISO (system zarządzania obowiązujący wytwórców wyposażenia do diagnostyki in vitro - przyp. autorów) [7, 8]. W takim przypadku, wykorzystywana jest bowiem zasada oczekiwania stałej jakości dostaw, i laboratorium może zakres sprawdzania jakości pożywek istotnie ograniczyć. Zasada ta nie obowiązuje w przypadku wytwórców, którzy nie posiadają potwierdzonego systemu zarządzania, czego konsekwencją jest konieczność sprawdzania przez laboratorium jakości pożywek, mimo dostarczenia przez wytwórcę certyfikatu jakości danej serii pożywki. Od jakich czynników zależy jakość pożywek, na jakie etapy i czynności procesu wytwarzania pożywek należy zwrócić szczególną uwagę w celu zapewnienia ich jakości, jaki powinien być zakres i szczegółowość kontroli, jak przeprowadzić kontrolę pożywek mikrobiologicznych w laboratorium? Niniejsze opracowanie ma na celu udzielenie odpowiedzi na te pytania, szczególnie w odniesieniu do pożywek komercyjnych gotowych do użycia. 1. Parametry jakości pożywek mikrobiologicznych W zależności od kryterium [9], pożywki mikrobiologiczne można klasyfikować ze względu na: skład: podłoża syntetyczne o ściśle określonym składzie chemicznym i podłoża o nie w pełni zdefiniowanym składzie chemicznym ze względu na obecność składników pochodzenia naturalnego, konsystencję: pożywki stałe, półpłynne i płynne, zastosowanie: podłoża namnażające, różnicujące, wybiórcze, wybiórczo-różnicujące, transportowe, itd. postać pożywki: pożywki gotowe do użycia, pożywki suche i niekompletne. (Pochodzące z dokumentów normatywnych podstawowe definicje dotyczące pożywek przedstawia Tabela I). Jednak bez względu na postać, skład, stan czy przeznaczenie, pożywki mikrobiologiczne powinny posiadać odpowiednią jakość [3, 10, 11, 12]. Podstawowymi parametrami jakości pożywek są odpowiednie właściwości fizyczne i chemiczne, a także właściwości mikrobiologiczne takie jak jałowość oraz, zależne od składu chemicznego - żyzność, selektywność, specyficzność i zdolność do badania wrażliwości drobnoustrojów na leki [3]. Wśród właściwości fizycznych jakimi powinna charakteryzować się pożywka o odpowiedniej jakości, można wymienić takie jak np. właściwa grubość warstwy i jednorodność podłoża, prawidłowa wartość ph, itd. Każda z tych cech jest na tyle istotna, że może warunkować użycie pożywki w procesie wykonania badania. Inną, ważną właściwością jest jałowość pożywki, która zapewnia ograniczenie możliwości uzyskania wyniku fałszywie dodatniego hodowli drobnoustrojów, będącego wynikiem zanieczyszczenia mikrobiologicznego pożywki przed jej użyciem do badań. Żyzność to taka cecha, która świadczy o właściwościach odżywczych pożywki wpływających na możliwość wzrostu drobnoustrojów. Pożywka charakteryzująca się odpowiednią żyznością to pożywka umożliwiająca szybki i intensywny wzrost drobnoustrojów. Żyzność wskazuje czy pożywka posiada prawidłowy skład, tj. zawiera wszystkie niezbędne do wzrostu drobnoustrojów składniki oraz czy stężenie tych składników jest prawidłowe. Inną cechą użytkową pożywki jest selektywność (wybiórczość), świadcząca o zdolności pożywki do wybiórczego hamowania wzrostu określonych grup drobnoustrojów. Cecha ta związana jest z obecnością w pożywce takich składników (suplementów), które wybiórczo hamują wzrost jednych drobnoustrojów, ale nie wpływają na możli- 188

3 Tabela I Wybrane definicje dotyczące pożywek mikrobiologicznych, szczepów referencyjnych oraz kontroli właściwości pożywek. Pożywka mikrobiologiczna to zestaw substancji w płynnej, półpłynnej lub stałej postaci, zawierający naturalne i/lub syntetyczne składniki służące do namnożenia lub utrzymania przy życiu drobnoustrojów [PN-EN 1659:2004] Partia pożywki mikrobiologicznej (seria pożywki) to w pełni możliwa do zidentyfikowania jednostka pochodząca z określonej masy półproduktu lub gotowego produktu, jednolitego typu i jakości, która spełnia wymagania produkcyjne (kontrola w trakcie produkcji) i kryteria zapewnienia jakości, wytworzona w tym samym zdefiniowanym okresie produkcyjnym i oznakowana tym samym numerem serii [PN-EN 12322:2005] Pożywka gotowa do użycia to pożywka mikrobiologiczna, która jest dostarczona w pojemnikach, w formie gotowej do użycia (np. w płytkach Petriego, w probówkach lub innych pojemnikach) [PN-EN 1659:2004] Pożywka niekompletna to pożywka mikrobiologiczna, która wymaga co najmniej jeszcze jednego dodatkowego etapu pracy przed jej zamierzonym użyciem (np. rozpuszczenia, wylania do płytek, rozporcjowania, dodania suplementu/suplementów) [PN-EN 1659:2004] Pożywka sucha to pożywka mikrobiologiczna w postaci suchej, która nie jest gotowa do bezpośredniego użycia (np. proszki, granulaty, produkty liofilizowane) [PN-EN 1659:2004] Szczep referencyjny to drobnoustrój oznaczony przynajmniej do poziomu rodzaju i gatunku, skatalogowany i opisany zgodnie z jego właściwościami [PN-EN 12322:2005] Szczep macierzysty to partia fiolek/pojemników z hodowlą uzyskaną w laboratorium z pojedynczego przesiewu szczepu referencyjnego lub wiele fiolek/pojemników z tej samej serii szczepu referencyjnego od dostawcy[pn-en 12322:2005] Szczep kontrolny to drobnoustrój używany do mikrobiologicznej oceny działania pożywek mikrobiologicznych [PN-EN 12322:2005] wość jednoczesnego wzrostu innych drobnoustrojów. Dzięki tej właściwości pożywki, możemy hodować określone, wybrane grupy drobnoustrojów. Specyficzność pożywki to cecha zapewniająca właściwe różnicowanie drobnoustrojów wyhodowanych na danym podłożu. Rozróżnienie drobnoustrojów poprzez makroskopową ocenę stopnia nasilenia reakcji biochemicznych i/lub fizjologicznych (np. wielkość i kolor kolonii, obecność hemolizy, itp.) możliwe jest dzięki obecności w pożywce odpowiednich składników różnicujących. Kolejną właściwością pożywek jest zdolność do oceny wrażliwości drobnoustrojów na leki. Badanie lekowrażliwości wykonywane jest przy użyciu specjalnych pożywek, które mają umożliwić nie tylko wzrost drobnoustroju, ale także właściwą dyfuzję leku w pożywce, dzięki czemu warunkują prawidłowy wynik badania. 2. Czynniki wpływające na jakość pożywek mikrobiologicznych W procesie wytwarzania pożywek, co dotyczy zarówno laboratorium jak i wytwórców pożywek komercyjnych, należy zapewnić nadzorowanie wszystkich tych czynników i etapów postępowania, które mogą mieć wpływ na jakość pożywek mikrobiologicznych, tj. na ich właściwości fizyczne, chemiczne oraz właściwości mikrobiologiczne. Wśród czynników o największym znaczeniu dla jakości pożywek można wymienić [3, 4, 5]: jakość poszczególnych składników, w tym wody i suplementów, z których sporządzane są pożywki, skład ilościowy pożywek warunkujący właściwości odżywcze, sposób przeprowadzenia procedury przygotowania pożywek, proces sterylizacji warunkujący jałowość pożywek, sposób pakowania zabezpieczający przed wtórnym za- nieczyszczeniem mikrobiologicznym, odwodnieniem, destrukcyjnym działaniem światła, sposób i warunki przechowywania pożywek warunkujące stabilność właściwości pożywek, warunki transportu mające wpływ na stabilność pożywek. Nadzorowanie wymienionych czynników poprzez standaryzację procesu wytwarzania i przechowywania pożywek oraz wdrożenie odpowiednich mechanizmów kontrolnych obejmujących, zarówno poszczególne etapy wytwarzania pożywek, jak i sprawdzanie właściwości pożywki w jej końcowej postaci, są działaniami zapewniającymi, że do badań mikrobiologicznych zostaną użyte pożywki o właściwej jakości Pożywki wykonywane w laboratorium W przypadku laboratoriów samodzielnie wykonujących pożywki, istotne jest ustalenie zasad i mechanizmów nadzorowania wszystkich, oprócz transportu, etapów wytwarzania pożywek wpływających na ich jakość [4, 5, 10, 12, 13]. Jakość podłoża bezpośrednio zależy od jakości surowców stosowanych do jej wytworzenia, dlatego też zaleca się, aby laboratorium dokonywało zakupu komponentów i suplementów pożywek u renomowanych dostawców. W przypadku składników do sporządzania pożywek, ale także dla pożywek częściowo przygotowanych dostarczanych do laboratorium w postaci granulatu lub odwodnionego proszku, niezwykle istotne jest kierowanie się zasadą first in - first out (pierwsze przyszło pierwsze wyszło) [4, 13]. Wykorzystywanie tego typu składników i pożywek wiąże się z koniecznością sprawdzania szczelności opakowania, notowaniem daty pierwszego otwarcia oraz każdorazowym dokonywaniem oceny wizualnej zawartości otwieranego pojemnika. W przypadku stwierdzenia zmiany sypkości, zbrylenia, zmiany zabarwienia lub innych zmian fizyko-chemicznych, dane opakowanie 189

4 Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych w laboratorium medycznym składnika lub pożywki należy odrzucić, a do przygotowania pożywki użyć innego opakowania. Jednym z głównych składników pożywek jest woda. W przypadku tego komponentu, parametry, które należy kontrolować to ph i przewodnictwo [13]. Prawidłowo, wartość ph wody powinna mieścić się w zakresie od 5,5 do 7,5 [4, 13]. Wskaźnikiem stopnia czystości wody jest przewodność właściwa, która zależy od zawartości jonów soli organicznych i nieorganicznych, w tym także jonów miedzi, których obecność w pożywce wpływa hamująco na wzrost drobnoustrojów. Prawidłowo, przewodność właściwa wody mierzona w temperaturze 25 0 C nie powinna przekraczać 25 µs cm -1 [4, 13]. Wyższa przewodność świadczy o zwiększonej zawartości jonów, a więc niskiej czystości wody. Jeśli pomiar jest przeprowadzany w innej temperaturze, to w celu uzyskania prawidłowego wyniku przewodności, należy zastosować odpowiedni współczynnik przeliczeniowy dla rzeczywistej temperatury, w której dokonano pomiaru. W laboratorium, które samodzielnie przygotowuje pożywki, cały tok postępowania podczas przygotowywania i wytwarzania pożywek powinien być przeprowadzany zgodnie z recepturą danej pożywki, ustaloną procedurą i szczegółowo dokumentowany. Dokumentacja ta powinna umożliwić odtworzenie przebiegu całego procesu wytwarzania każdej partii pożywek w celu oceny poprawności przygotowania pożywki do użycia. Jałowość pożywki uzależniona jest od właściwego przeprowadzenia procesu sterylizacji. Sterylizację najczęściej wykonuje się za pomocą przegrzanej pary wodnej lub metodą filtracji [14]. Sterylizację za pomocą pary wodnej przeprowadza się w autoklawie, a liczba pożywek jakie jednorazowo można poddać procesowi sterylizacji i czas trwania powinny być ściśle określone, bowiem podczas obróbki cieplej może dojść do niepożądanych reakcji między poszczególnymi składnikami pożywki lub do ich zniszczenia. Z tego powodu, cały proces sterylizacji powinien być stale monitorowany poprzez sprawdzanie temperatury i ciśnienia. Dodatkowym mechanizmem pozwalającym na ocenę poprawności procesu sterylizacji jest także monitorowanie skuteczności procesu sterylizacji za pomocą wskaźników fizycznych, chemicznych i biologicznych. Jakość pożywki w dużej mierze zależy także od warunków jej przechowywania [3, 4]. Pożywkom wytworzonym w laboratorium należy zapewnić takie warunki, aby uchronić je przed zmianą składu i wtórnym zanieczyszczeniem mikrobiologicznym. Zgodnie ze specyfikacja techniczną ISO/TS zaleca się, aby pożywki chronić przed dostępem światła, odwodnieniem i przechowywać je w temperaturze 5±3 0 C [4]. W przypadku dłuższej ekspozycji na światło słoneczne lub sztuczne może dojść do zmian składu chemicznego pożywki, zaś odwodnienie może skutkować zmianą stężenia poszczególnych jej składników. W konsekwencji, w każdym z tych przypadków, dochodzi do zmian właściwości pożywki, a więc obniżenia jej jakości. Specyfikacja ISO/TS zaleca także, aby pożywek rozlanych na płytki nie przechowywać dłużej niż 2-4 tygodni, zaś pożywek rozlanych do butelek i probówek nie dłużej niż 3-6 miesięcy [4]. Okres przechowywania danego typu podłoża można modyfikować na podstawie wyników badań wykonywanych podczas walidacji trwałości podłoża. Okres przydatności pożywek można wydłużać jeśli będą one przechowywane w szczelnych plastikowych opakowaniach zbiorczych. W celu wyeliminowania nadmiernego skraplania wody podczas przechowywania, płytki przed zamknięciem należy schodzić. Dla zapewnienia pełnej identyfikowalności stosowanych podłoży, każda płytka powinna być dokładnie opisana, poprzez umieszczenie na spodzie lub z boku płytki, daty przygotowania i/lub daty ważności, a także kodu wskazującego na rodzaj podłoża. Wszystkie te oznakowania umożliwiają pełną identyfikację serii danej pożywki Pożywki gotowe do użycia W przypadku podłóż gotowych do użycia odpowiednia jakość komponentów, prawidłowy skład pożywki, sposób wytwarzania i sterylizacji, jej właściwości fizyko-chemiczne i mikrobiologiczne gwarantowane są przez wytwórcę [7, 15]. Potwierdzeniem jakości danej serii pożywki jest stosowny certyfikat jakości, który wytwórca zobowiązany jest dostarczyć do laboratorium. W przypadku pożywek gotowych do użycia, jakość pożywki dostarczanej do laboratorium, zależy głównie od warunków transportu do laboratorium i sposobu przechowywania w laboratorium. Podczas transportu do laboratorium, najczęściej zapewnianego i organizowanego przez wytwórcę lub dystrybutora, pożywki powinny być zapakowane w sposób zabezpieczający je przed ewentualnymi uszkodzeniami mechanicznymi, a warunki w jakich są transportowane powinny chronić je przed przegrzaniem lub zamrożeniem oraz odwodnieniem. Transportowanie i przechowywanie pożywek w temperaturze znacznie wyższej od zalecanej przez wytwórcę, może doprowadzić do zmiany składu chemicznego pożywki (degradacja, niepożądane reakcje pomiędzy komponentami) oraz zmiany stężenia składników pożywki, co w konsekwencji może spowodować pogorszenie właściwości pożywki takich jak żyzność, selektywność i specyficzność. Następujące po sobie skrajne zmiany temperatury mogą natomiast doprowadzić do pojawienia się na wieczku płytki z pożywką wilgoci, spowodowanej nadmierną kondensacją wody [4]. Zamrożenie może spowodować, że pożywki agarowe zupełnie nie będą nadawać się do użycia w procesie diagnostycznym, zaś w pożywkach płynnych może dojść do wytrącenia niektórych składników pożywki, co także uniemożliwia ich stosowanie. W przypadku komercyjnych podłóż gotowych do użycia, laboratorium bezwzględnie powinno przestrzegać instrukcji wytwórcy w zakresie warunków przechowywania oraz okresu przydatności pożywek do użycia. Informacje odnośnie warunków przechowywania danej pożywki zawarte są w firmowej instrukcji technicznej pożywki (opisie pożywki). 190

5 3. Kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych Kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych służy do sprawdzania i/lub potwierdzania jakości, a tym samym, przydatności pożywek do wykonywania rutynowych badań mikrobiologicznych. Jak już wspomniano na wstępie, kontroli należy poddać pożywki wykonywane w laboratorium oraz pożywki pochodzenia komercyjnego [6]. Kontrolę tę wykonuje się dla każdej serii pożywki stopniowo, etapami o różnym poziomie szczegółowości [3, 4, 13, 15]. Pierwszym etapem kontroli jest ocena ogólna, obejmująca określenie właściwości fizyko-chemicznych pożywki. Drugi etap, to ocena szczegółowa obejmująca mikrobiologiczne kryteria jakości pożywek charakteryzujące właściwości użytkowe pożywek, tj. jałowość, żyzność, selektywność i specyficzność. Zgodnie z EN 12322, daną partię pożywki można zaakceptować jako przydatną do stosowania w procesie diagnostycznym, tzn. uznać jej jakość za właściwą, jeśli jednocześnie spełnione są ogólne i mikrobiologiczne kryteria jakości [3]. O zakresie kontroli jakości pożywek mikrobiologicznych decyduje laboratorium. Zakres kontroli jest uzależniony od tego, czy laboratorium wykorzystuje pożywki przygotowywane samodzielnie czy pożywki komercyjne. W przypadku pożywek wytwarzanych w laboratorium, należy przeprowadzać pełną kontrolę jakości pożywek [6] - ogólną i szczegółową, zgodnie z zaleceniami obowiązujących norm [3, 4, 5, 10]. W tym miejscu, trzeba zauważyć, że właściwie tylko norma europejska EN bardzo ogólnie odnosi się do kontrolowania pożywek mikrobiologicznych wykorzystywanych do diagnostyki in vitro. Pozostałe dokumenty normatywne, szczegółowo opisujące metody kontrolowania pożywek mikrobiologicznych, np. specyfikacja techniczna ISO/TS [4, 5], przeznaczone są do stosowania w laboratoriach mikrobiologii żywności i pasz. Specyfikacja ta podaje ogólne zasady kontrolowania pożywek mikrobiologicznych (metody kontroli i kryteria oceny), które ze względu na uniwersalność są stosowane do kontrolowania pożywek wykorzystywanych w laboratoriach o innych profilach badań mikrobiologicznych, w tym także w mikrobiologicznych laboratoriach medycznych [10]. W przypadku pożywek komercyjnych wykorzystywanych do diagnostyki in vitro, zakres kontroli uzależniony jest, jak już wspomniano, od posiadania przez wytwórcę potwierdzonego systemu zarządzania jakością [6]. Ze względu na brak szczegółowych wytycznych dotyczących pożywek do diagnostyki in vitro, w celu ustalenia sposobu wykonania kontroli tych pożywek, laboratorium może również oprzeć się na firmowej instrukcji technicznej pożywki. Instrukcja taka, oprócz opisu pożywki, powinna przedstawiać sposób przeprowadzenia kontroli danej pożywki, a także kryteria oceny poszczególnych parametrów jakości pożywki wraz z oczekiwanymi wynikami. Zgodnie z dyrektywą IVD [7] oraz obowiązującymi normami europejskimi [3, 4, 13], wytwórca zobowiązany jest do przekazania takich informacji do laboratorium. W przypadku pożywek komercyjnych, dodatkowym, wstępnym etapem kontrolnym, poprzedzającym właściwą kontrolę jakości pożywek, jest każdorazowe sprawdzenie dokumentacji dostawy oraz ocena opakowania transportowego [4, 13, 15] Kontrola wstępna dostawy pożywek komercyjnych Wstępna kontrola dostawy komercyjnych pożywek mikrobiologicznych obejmuje sprawdzenie dokumentacji potwierdzającej jakość pożywki dostarczanej przez wytwórcę dokumenty dostawy wskazujące na warunki transportu oraz certyfikat jakości [4, 13, 15]. Certyfikat ten dla każdej serii pożywek, powinien zawierać następujące dane: nazwę wytwórcy, nazwę produktu, numer serii i datę ważności, ogólną charakterystykę właściwości fizyko-chemicznych pożywki: kolor, ph, itp., charakterystykę mikrobiologiczną tj. wykaz szczepów kontrolnych użytych do przeprowadzenia kontroli danej serii pożywki wraz z opisem prawidłowej morfologii kolonii wyrosłych na pożywce. Podczas odbioru każdej dostawy pożywek, laboratorium zobowiązane jest do odnotowywania daty otrzymania dostawy oraz wizualnej oceny opakowania transportowego, tj. sprawdzenia jego oznakowania (dane identyfikujące pożywkę), szczelności i integralności [4, 13, 15]. Stwierdzenie uszkodzenia opakowania transportowego pożywek wskazuje na potencjalne obniżenie jakości pożywek i jest podstawą do złożenia reklamacji u wytwórcy lub dystrybutora Kontrola ogólna właściwości fizycznych i chemicznych pożywki Właściwości fizyczne i chemiczne oceniane są głównie poprzez wizualną, makroskopową ocenę wyglądu pożywki. Kontrola ta jest łatwa do przeprowadzenia i bardzo przydatna, gdyż przed rozpoczęciem szczegółowych badań kontrolnych, może wskazywać na zmiany jakości pożywki. Przykładowo, inne niż oczekiwane zabarwienie pożywki może świadczyć o nieprawidłowym jej składzie chemicznym. Właściwości fizyczne i chemiczne należy kontrolować dla każdej partii pożywek, zarówno tych przygotowanych w laboratorium, jak i komercyjnych [3, 4, 13]. Kontrola pożywek do diagnostyki in vitro obejmuje ocenę [3, 15]: ilości produktu w opakowaniu (w przypadku pożywek sypkich), grubości warstwy agaru i formy wypełnienia dla podłoży stałych oraz objętości pożywki płynnej, wyglądu zewnętrznego, tj. zabarwienia, klarowności, obecności artefaktów, jednorodności, stabilności i konsystencji żelu, wyglądu zewnętrznego specyficznych pożywek, np. agaru z krwią, zawartości wilgoci lub homogenność suchych pożywek tj. czy pożywka nie uległa zbryleniu, wartości ph. Jedną z ważniejszych cech fizycznych jest ph, które powinno być sprawdzane szczególnie podczas przygotowywania 191

6 Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych w laboratorium medycznym podłóż w laboratorium, tj. przed i po autoklawowaniu przy użyciu wzorcowanego pehametru. Zasadniczo, przyjmuje się, że schłodzona do temperatury 25 C, pożywka powinna mieć wymaganą wartość ph ± 0,2 jednostki ph [4], np. agar XLD powinien mieć ph 7,4± 0,2. W przypadku gotowych do użycia pożywek komercyjnych, najczęściej spotykane nieprawidłowości dotyczące właściwości fizycznych i chemicznych obejmują [13]: niewystarczającą ilość agaru w płytce tj. < 3 mm lub pożywki w butelce/probówce, pęknięcie lub uszkodzenie płytki, oderwanie agaru od płytki, zamrożenie lub roztopienie agaru, hemolizę krwi w pożywce, chropowatość powierzchni agaru, nadmiar pęcherzyków na powierzchni agaru, nadmiar wilgoci lub odwodnienie, nietypowe zabarwienie pożywki, obecność zanieczyszczeń mikrobiologicznych widocznych gołym okiem. Stwierdzenie jakiejkolwiek z wymienionych nieprawidłowości w makroskopowej ocenie właściwości pożywki, upoważnia do reklamacji danej partii pożywki u wytwórcy/ dostawcy Kontrola szczegółowa właściwości mikrobiologicznych pożywek Metody kontroli poszczególnych parametrów wskazujących na właściwości mikrobiologiczne pożywek oraz kryteria ich oceny zostały opisane w ISO/TR [4, 5, 10]. Wyjątkiem jest badanie przydatności pożywek do oceny lekowrażliwości, które, jak podano w EN 12322, należy wykonywać zgodnie z odpowiednimi metodami referencyjnymi [3]. Kontrola właściwości mikrobiologicznych pożywek ma na celu sprawdzenie obecności zanieczyszczeń mikrobiologicznych w pożywce, intensywności wzrostu drobnoustrojów na danej pożywce, zahamowania wzrostu mikroflory towarzyszącej, potwierdzenie, że wyhodowane drobnoustroje (szczep kontrolny) wykazują charakterystyczne dla swojego gatunku cechy biochemiczne i fizjologiczne oraz sprawdzenie przydatności do badania lekowrażliwości. Dlatego też, kontrola ta obejmuje tzw. mikrobiologiczne kryteria jakości [3]: zanieczyszczenia mikrobiologiczne - badany parametr to jałowość, cechy pożywki wpływające na wzrost drobnoustrojów: właściwości odżywcze - badany parametr to żyzność, właściwości selektywne - badany parametr to selektywność, cechy pożywki wpływające na ocenę właściwości biochemicznych i fizjologicznych drobnoustrojów - badany parametr to specyficzność, przydatność do badania wrażliwości drobnoustrojów na leki. Kontrolę właściwości mikrobiologicznych, określanych też jako właściwości użytkowe pożywek [13], należy wykonywać zawsze wtedy, gdy laboratorium rozpoczyna pracę z nową serią składników pożywek, dla nowej partii pożywek sporządzonych w laboratorium, przy zmianie dostawcy pożywek, a także w przypadku zaistnienia wątpliwości dotyczących jakości danej serii pożywek, o czym można wnioskować na podstawie wyników ogólnej kontroli pożywek mikrobiologicznych [5]. Do oceny właściwości mikrobiologicznych pożywek wpływających na wzrost, tj. żyzności i selektywności drobnoustrojów, należy wykorzystywać metody ilościowe i półilościowe [3], zaś do oceny specyficzności - metody jakościowe. Niezbędnym warunkiem przeprowadzenia tej kontroli jest zastosowanie odpowiednich szczepów kontrolnych Kontrola jałowości pożywek Zgodnie z normą EN 12322, pożywki mikrobiologiczne można podzielić na te, które są sterylizowane w końcowym opakowaniu oraz na pożywki gotowe do użycia wyprodukowane w sposób eliminujący lub ograniczający zanieczyszczenia do akceptowalnego minimum [3]. Norma EN zaleca, aby odpowiednia liczba pożywek z każdej partii była badana pod kątem zanieczyszczeń mikrobiologicznych [3]. Ocenę jałowości przeprowadza się inkubując pożywki w temperaturze odpowiedniej dla stosowanej metody badania przez co najmniej 3 dni ( 72 godziny) [3]. Norma EN nie precyzuje jednak ile pożywek należy poddać kontroli jałowości i w jakiej dokładnie temperaturze je inkubować. Dlatego też, w celu prawidłowego przeprowadzenia badania jałowości możemy oprzeć się na postanowieniach innego dokumentu dotyczącego wytwarzania i kontroli jakości pożywek tj. ISO/TS lub skorzystać z wytycznych wytwórców pożywek. W specyfikacji tej podano, iż pod względem jałowości należy badać, np. jedną płytkę/butelkę lub 1% płytek/butelek z początku i końca partii produkcyjnej, inkubując pożywki co najmniej 18 godzin w temperaturze 37 C lub temperaturze w jakiej pożywka jest stosowana w procedurze badawczej [13]. W przypadku pożywek sterylizowanych w końcowym opakowaniu, jałowość powinna być zagwarantowana poprzez zastosowanie przez wytwórcę zwalidowanego procesu sterylizacji całkowicie eliminującego zanieczyszczenia mikrobiologiczne [3, 7], co oznacza, że w żadnym z końcowych opakowań, pożywki nie powinny wykazywać wzrostu drobnoustrojów. W przypadku pożywek przygotowywanych w warunkach aseptycznych, dopuszcza się zanieczyszczenie mikrobiologiczne w mniej niż 5% całej partii pożywek [3]. Jeżeli poziom zanieczyszczeń mikrobiologicznych przekracza 5% danej partii pożywki, to powinna ona być odrzucona [3]. Kontrolę jałowości należy przeprowadzać zarówno dla pożywek przygotowywanych w laboratorium, jak i dla pożywek komercyjnych Zasady doboru szczepów kontrolnych Prawidłowe przeprowadzenie kontroli żyzności, selektywności i specyficzności, wymaga aby dla każdej kontrolowanej 192

7 pożywki skomponować odpowiednio dobrany zestaw szczepów kontrolnych przygotowanych na bazie szczepów referencyjnych [3]. W tym celu, laboratorium powinno dysponować odpowiednimi szczepami referencyjnymi pochodzącymi z uznanych kolekcji stowarzyszonych w European Culture Collection s Organization (ECCO) lub World Federation for Culture Collection (WFCC) [3]. Przykładem takiej kolekcji jest ATCC (American Type Culture Collection). Prawidłowo skomponowany zestaw szczepów kontrolnych, określanych też jako organizmy testowe [4], powinien zawierać [3]: szczep stanowiący kontrolę dodatnią (tzw. szczep docelowy, target) posiadający typowe cechy, silnie rosnący na danej pożywce, wykazujący dodatni wynik testu, szczep stanowiący kontrolę słabo dodatnią słabo rosnący na badanej pożywce, wykazujący z opóźnieniem wynik testu, szczep stanowiący kontrolę ujemną (non-target) - wykazujący częściowe lub całkowite zahamowanie wzrostu na badanej pożywce, wykazujący ujemny wynik testu. Do oceny selektywności koniecznym wydaje się także zastosowanie szczepu dającego inne od szczepu docelowego reakcje biochemiczne. Zestawy szczepów kontrolnych dla poszczególnych rodzajów pożywek, laboratorium ustala samodzielnie kierując się przedstawionymi powyżej zasadami. Przykładowe zestawy szczepów kontrolnych, jakie można zastosować do kontroli pożywek wykorzystywanych do diagnostyki in vitro przedstawia Tabela II. Dodatkowym warunkiem uzyskiwania wiarygodnych wyników badań kontrolnych jest właściwe postępowanie ze szczepami referencyjnymi. Bardzo dobrym źródłem informacji i wytycznych dotyczących prawidłowego postępowania ze szczepami referencyjnymi jest raport techniczny ISO [4] Ilościowa i półilościowa kontrola żyzności pożywek Ocenę żyzności pożywek stałych należy wykonywać metodą ilościową [3], która opiera się na określeniu tzw. współczynnika żyzności (Productivity Ratio, PR), wyrażającego stosunek całkowitej liczby kolonii wyrosłych na kontrolowanej pożywce do całkowitej liczby kolonii wyrosłych na pożywce referencyjnej [5, 10, 13]. Sposób obliczania tego współczynnika przedstawia następujący wzór: PR = Ns / No gdzie PR współczynnik żyzności (Productivity Ratio) Ns całkowita liczba kolonii na pożywce badanej No całkowita liczba kolonii na pożywce referencyjnej Tak więc, dla poprawnego wykonania tego badania kontrolnego należy zastosować tzw. pożywkę referencyjną, pełnią- Tabela II Przykładowe zestawy szczepów kontrolnych do oceny żyzności, selektywności oraz specyficzności pożywek (opracowanie własne na podstawie certyfikatów kontroli jakości wytwórców, ISO/TS , M22-A3). Nazwa pożywki Cecha Szczepy testowe Kryterium oceny- intensywność wzrostu Kryterium oceny-reakcje charakterystyczne żyzność Salmonella enterica ATCC Dobry wzrost Czerwone kolonie z czarnym środkiem XLD selektywność Enterococcus faecalis ATCC Całkowite zahamowanie wzrostu - specyficzność Escherichia coli ATCC 8739 Częściowe lub całkowite zahamowanie wzrostu Żółte kolonie żyzność E. coli ATCC Dobry wzrost Kolonie laktozo dodatnie MCK selektywność Enterococcus faecalis ATCC Całkowite zahamowanie wzrostu - specyficzność Proteus vulgaris ATCC 6380 Dobry wzrost Kolonie laktozo ujemne żyzność Salmonella enterica ATCC Dobry wzrost Zielone kolonie z czarnym środkiem HEKT selektywność Enterococcus faecalis ATCC Zahamowanie wzrostu - specyficzność E. coli ATCC Częściowe lub całkowite zahamowanie wzrostu Łososiowo -żółte kolonie 193

8 Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych w laboratorium medycznym cą rolę pożywki odniesienia, do której porównujemy pożywkę badaną. Najczęściej, pożywką referencyjną jest pożywka nieselektywna, zapewniająca optymalny wzrost wszystkich szczepów kontrolnych, dodatnich i ujemnych. Jako pożywkę referencyjną można także stosować ten sam rodzaj pożywki innej partii, która została już skontrolowana [5, 13]. W metodzie tej, na pożywkę badaną oraz referencyjną należy posiać po 0,1 ml zawiesiny szczepu kontrolnego o tak dobranym stężeniu drobnoustrojów, aby po inkubacji uzyskać policzalną liczbę kolonii. Zawiesinę bakteryjną dokładnie rozprowadzić na pożywkach za pomocą głaszczki. Po zakończeniu inkubacji, policzyć kolonie wyrosłe na pożywkach i obliczyć współczynnik żyzności (PR). Dodatkowo, ocenić wygląd i wielkość wyrosłych kolonii. Prawidłowo, żyzność pożywki jest właściwa jeśli dla pożywek selektywnych wartość współczynnika żyzności wynosi co najmniej 0,1, zaś dla pożywek nieselektywnych co najmniej 0,7 [5, 10, 13]. W przypadku niektórych pożywek dopuszcza się jednak bardziej liberalne kryteria [13]. Przyjmuje się, że w metodzie tej wzrost szczepu dodatniego na kontrolowanej pożywce powinien wynosić co najmniej 70% wzrostu uzyskanego na pożywce referencyjnej [16]. Inną metodą oceny żyzności pożywek stałych jest półilościowa ekonometryczna metoda posiewu rysowego [5, 13]. W metodzie tej, oceny żyzności dokonuje się poprzez wyznaczenie indeksu wzrostu (Growth Index, GI). Ezą o pojemności 1 µl nachyloną pod kątem 20 o -30 o w stosunku do podłoża, należy wykonać posiew rysowy dokładnie według poniższego schematu (Ryc.1) całej długości 0,5 punktu - uzyskuje linia, na której stwierdzamy wzrost na połowie długości 0 punktów uzyskuje linia, na której nie stwierdzono wzrostu lub wzrost jest mniejszy niż połowa długości posianej linii. Prawidłowo, indeks wzrostu dla szczepu dodatniego powinien wynosić co najmniej 6 punktów [5, 10, 13], zaś wzrost szczepu ujemnego powinien być całkowicie lub częściowo zahamowany. Wykonanie badania kontrolnego tą metodą wymaga sporego doświadczenia w jej stosowaniu (Rycina 2). Rycina 2 Ocena żyzności pożywek agarowych półilościową metodą ekonometryczną. Przykład wzrostu Salmonella enterica ATCC na pożywce XLD Ilościowa kontrola selektywności pożywek Kontrola wybiórczości pożywek selektywnych ma na celu wykazanie prawidłowego działania składników warunkujących selektywność danej pożywki. Kontrolę selektywności pożywki można przeprowadzić metodą ilościową poprzez obliczenie tzw. współczynnika selektywności (Selectivity Factor, SF), który jest różnicą najwyższego rozcieńczenia dającego wzrost co najmniej 10 kolonii na pożywce referencyjnej, a najwyższym rozcieńczeniem dającym porównywalny wzrost na pożywce kontrolowanej [5, 10, 13]. Współczynnik selektywności obliczamy według następującego wzoru: Rycina 1 Schemat posiewu rysowego w metodzie ekonometrycznej wg ISO Odstępy między kolejnymi liniami posiewu powinny wynosić dokładnie 0,5 cm. Do badania należy użyć zawiesiny dodatniego szczepu kontrolnego (target), zawierającej 10 3 do 10 4 jednostek tworzących kolonie (jtk) w 1µl oraz ujemnego szczepu kontrolnego o stężeniu zawiesiny 10 4 do 10 6 jtk w 1µl. Indeks wzrostu wylicza się poprzez zsumowanie punktów przyznawanych każdej posianej linii według następującej skali: 1 punkt - uzyskuje linia, na której stwierdzamy wzrost na SF = Do Ds gdzie: SF współczynnik selektywności (Selectivity Factor) wyrażony w log 10 Do najwyższe rozcieńczenie dające wzrost co najmniej 10 kolonii na pożywce referencyjnej Ds najwyższe rozcieńczenie dające porównywalny wzrost na pożywce badanej W celu wykonania badania należy przygotować szereg rozcieńczeń szczepu kontrolnego będącego kontrolą ujemną (non-target). Następnie, na pożywkę badaną i referencyjną wysiać po 0,1 ml każdego przygotowanego rozcieńczenia, rozprowadzić jałową głaszczką na powierzchni agaru i inkubować w cieplarce przez 48 godzin w temperaturze i atmos- 194

9 ferze w jakiej wykorzystywana jest pożywka w procedurze badawczej. Po inkubacji ocenić wygląd i wielkość kolonii, a do obliczenia współczynnika selektywności (SF) wybrać taką pożywkę kontrolowaną i taką pożywkę referencyjną, na których uzyskano porównywalny wzrost. Wartość współczynnika selektywności wyrażana jest jako logarytm dziesiętny, i prawidłowo dla pożywek selektywnych powinna wynosić co najmniej 2. Na pożywce selektywnej wzrost szczepów badanych powinien być częściowo lub całkowicie zahamowany. Stopień zahamowania wzrostu zależy od rodzaju szczepu kontrolnego i użytej pożywki, zwykle jednak przyjmuje się, że wzrost ulega zredukowaniu o współczynnik wynoszący 10 3 do 10 4 lub więcej, w porównaniu ze wzrostem na nieselektywnej pożywce referencyjnej [16] Jakościowa kontrola właściwości mikrobiologicznych pożywek stałych Innym sposobem oceny właściwości użytkowych pożywek jest jakościowa metoda posiewu rysowego [5,13]. W metodzie tej ezą o pojemności oczka 1µl dokonuje się posiewu rysowego jednego lub kilku szczepów kontrolnych na pożywkę. W przypadku posiewu kilku szczepów, linie posiewu poszczególnych szczepów nie powinny się krzyżować (Rycina 3). Zestaw szczepów kontrolnych można dobrać w taki sposób, aby jednocześnie ocenić żyzności, selektywności i specyficzności pożywki Do oceny żyzności, inokulum szczepu kontrolnego powinno zawierać 10 3 do 10 4 jtk w 1µl, do oceny selektywności inokulum szczepu kontrolnego powinno zawierać powyżej 10 4 jtk w 1 µl [5, 13]. W celu porównywalności wyników kontroli, zaleca się, aby oceny selektywności i specyficzności nie dokonywać wcześniej niż po 48 godzinach inkubacji pożywki. Po zakończeniu inkubacji, każdej posianej linii przyznawana jest odpowiednia liczba punktów w skali od 0 do 2. Liczba przyznawanych punktów odpowiada intensywności wzrostu szczepu kontrolnego na pożywce według następujących zasad: 0 punktów brak wzrostu na całej długości linii 1 punkt słaby wzrost na danej linii 2 punkty dobry wzrost na danej linii Dobry wzrost na całej długości linii posianego szczepu dodatniego (docelowego) pozwala na uzyskanie 2 punktów i oznacza, że kontrolowana pożywka posiada odpowiednią żyzność. Brak wzrostu szczepu docelowego może sugerować nieodpowiednią jakość pożywki, tj. nieprawidłowość składu pożywki. W przypadku pożywek selektywnych, brak wzrostu kontrolnego szczepu ujemnego (non-target) umożliwia ocenę właściwości selektywnych pożywki. Jednoczesna, makroskopowa ocena cech biochemicznych i fizjologicznych wyrosłych drobnoustrojów (morfologia kolonii, hemoliza, itp.), umożliwia dodatkową ocenę specyficzności kontrolowanej pożywki. Przykłady jakościowej oceny właściwości pożywek przy użyciu metody posiewu rysowego przedstawia Rycina 4. Wyniki uzyskane podczas kontroli metodą posiewu rysowego, należy porównywać z wynikami badań kontrolnych tych samych szczepów kontrolnych przedstawionymi przez wytwórcę w certyfikacie kontroli jakości danej serii pożywki (np. opisem wzrostu). Łatwość stosowania metody jakościowej do kontrolowania pożywek wynika z prostoty wykonania oraz możliwości jednoczesnej oceny żyzności, selektywności i specyficzności, i jest szczególnie polecana do kontrolowania pożywek gotowych do użycia. Doświadczenia własne pozwoliły wnioskować, że jakościowa metoda posiewu rysowego jest optymalną metodą do oceny pożywek chromogennych. W przypadku tych pożywek, oceniana jest żyzność, a reakcje barwne, dzięki obecności substratów chromogennych w podłożu umożliwiają ocenę specyficzności. W Tabeli II przedstawiono przykłady gotowych do użycia pożywek komercyjnych wraz z zestawem szczepów kontrolnych oraz kryteriami oceny wyników kontroli Badanie wrażliwości na antybiotyki Jedną z informacji o zasadniczym znaczeniu dla podjęcia właściwej antybiotykoterapii, jest informacja o wrażliwości wyhodowanego drobnoustroju na leki. Dlatego też, bardzo ważne jest zapewnienie wiarygodności wyników oceny lekowrażliwości drobnoustrojów, które najczęściej wykony- Rycina 3 Technika posiewu rysowego w jakościowej metodzie oceny właściwości użytkowych pożywek. a) Schemat posiewu rysowego jednego szczepu kontrolnego b) Schemat posiewu rysowego trzech różnych szczepów kontrolnych. 195

10 Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych w laboratorium medycznym Rycina 4 Jakościowa ocena właściwości mikrobiologicznych (żyzność, selektywność, specyficzność) pożywek agarowych techniką posiewu rysowego, na przykładzie pożywek a) MCK - E. coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Proteus vulgaris ATCC 6380; b) HEKT Salmonella enterica ATCC 13076, Enterococcus faecalis ATCC 29212, E. coli ATCC wane jest metodą dyfuzyjno-krążkową. Na uwagę zasługuje fakt, że wynik tego badania zależy nie tylko od jakości stosowanych pożywek, ale także od jakości krążków z antybiotykami oraz techniki wykonania badania. Dlatego też, kontrola jakości metody dyfuzyjno-krążkowej ma charakter kompleksowy i pełni funkcję kontrolną nie tylko dla sprawdzania jakości stosowanych pożywek, ale także jakości krążków antybiotykowych oraz poprawności techniki wykonania badania. W celu prawidłowego przeprowadzania kontroli jakości pożywek do określania lekowrażliwości, norma EN zaleca stosowanie referencyjnych metod kontroli [3]. Metody takie zostały opracowane przez organizacje fachowe jakimi są np. CLSI i EUCAST (tłumaczenie). Organizacje te opracowały i opublikowały zasady i procedury wykonywania kontroli jakości metody dyfuzyjno-krążkowej przy użyciu szczepów referencyjnych oraz sposób interpretowania i kryteria oceny wyników badań kontrolnych [17, 18, 19, 20]. Wykonanie kontroli jakości metody dyfuzyjno-krążkowej nie powinno przedstawiać większych trudności, gdyż dzięki KORLD, niezbędne procedury i dokumenty są powszechnie dostępne w języku polskim. Podsumowanie Niniejsze opracowanie oparto głównie na dokumentach normatywnych zawierających wymagania akredytacyjne dla laboratoriów mikrobiologicznych ISO/IEC 17025, ISO i EA-04/10 [1, 2, 6] oraz normach dotyczących nadzorowania pożywek mikrobiologicznych [3, 4, 5]. Zapewnienie jakości oraz kontrolowanie jakości pożywek mikrobiologicznych są jednym z zasadniczych elementów systemu zarządzania jakością w laboratorium mikrobiologicznym. Nadzorowanie procesu wytwarzania pożywek i kontrolowanie ich jakości wydają się oczywiste w przypadku pożywek wytwarzanych przez laboratorium na własne potrzeby, jednak konieczność kontrolowania pożywek gotowych do użycia jest stale dyskutowana. Uważa się bowiem, że pożywki komercyjne nie wymagają kontrolowania przez laboratorium, a certyfikat jakości pożywki dostarczony przez wytwórcę, jest wystarczającym dowodem ich właściwej jakości. Faktycznie, w amerykańskich wytycznych dotyczących kontrolowania pożywek komercyjnych (NCCLS, dokument M22-A3), nie wprowadzono obowiązku kontrolowania wszystkich pożywek komercyjnych [15]. Trzeba jednak zwrócić uwagę, że wytyczne te, w zależności od przeznaczenia pożywek do określonych kierunków badań w celu wykrycia określonych grup drobnoustrojów, dzielą pożywki na dwie kategorie: pożywki zwolnione z kontroli (exempt media category), dla których certyfikat jakości wytwórcy może być wystarczającym potwierdzeniem jakości oraz pożywki określane jako nonexempt media category, których jakość obowiązkowo należy potwierdzać w laboratorium. Do pierwszej grupy pożywek zaliczono między innymi agar krwawy, Hektoen (HEK) agar, Columbia (CNA) agar. Do drugiej kategorii zaliczono, np. agar MacConkey z sorbitolem, agar czekoladowy z bacytracyną, bulion odżywczy. W przypadku laboratoriów mikrobiologicznych ubiegających się o akredytację Polskiego Centrum Akredytacji, wymagania dokumentów odniesienia, tj. ISO/ IEC 17025, ISO oraz EA-04/10 stanowiących kryterium oceny w procesie akredytacji, są jednak jednoznaczne i wskazują na obligatoryjny charakter kontroli jakości pożywek bez względu na źródło ich pochodzenia. Wspólnym elementem wymagań, zarówno norm europejskich [3, 4], jak i wytycznych amerykańskich (dokument M22-A3) [15], jest zobowiązanie laboratoriów medycznych do kontrolowania dokumentacji oraz cech fizyko-chemicznych każdej dostawy i/lub serii pożywek komercyjnych dostarczanych do laboratorium. Zgodnie z wymaganiami europejskimi [3], kontrola jakości pożywek powinna także obejmować właściwości mikrobiologiczne pożywek jałowość, żyzność, selektywność, specyficzność oraz zdolność do oceny lekowrażliwości. O ile metody kontroli zdolności pożywek do oceny wrażliwości na leki zostały dobrze opisane w piśmiennictwie fachowym [17, 18, 19, 20], to prawidłowe przeprowadzenie kontroli pozostałych parametrów jakości pożywek do diagnostyki in vitro jest dość trudne ze względu niedostateczną ilość odpowiednich dokumentów normatywnych oraz piśmiennictwa fachowego dotyczącego tego zagadnienia. Dlatego też, wydaje się wskazane korzystanie z innych, 196

11 uniwersalnych dokumentów normatywnych przeznaczonych dla laboratoriów mikrobiologicznych o innym profilu badawczym [10] oraz firmowych instrukcji pożywek komercyjnych, zawierających informacje o sposobie wykonania kontroli i kryteriach oceny wyników kontroli, czego przykładem mogą być pożywki wykorzystywane w automatycznych systemach hodowli krwi i płynów ustrojowych. Laboratoria mikrobiologiczne starające się o akredytację, kontrolę jakości pożywek komercyjnych przeprowadzają nie tylko dla potwierdzenia ich jakości, ale także w celu kwalifikacji dostawców pożywek, gdyż kwalifikacja dostawców wyposażenia jest jednym z podstawowych wymagań akredytacyjnych [1, 2]. Niniejsze opracowanie nie wyczerpuje bardzo rozległego tematu jakim jest zapewnienie i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych do diagnostyki in vitro. Jednak, nawet jeśli laboratorium nie wdraża systemu zarządzania jakością, to w celu zapewnienia wiarygodności wyników badań mikrobiologicznych, w zakresie swoich możliwości organizacyjnych i technicznych, powinno opracować i stosować mechanizmy kontrolowania pożywek mikrobiologicznych i, jeśli samo wytwarza pożywki, zapewniania ich jakości podczas procesu wytwarzania. 15. NCCLS, Quality Control for Commercially Prepared Microbiological Culture Media; Approved Standard-Third Edition, NC- CLS document M22-A3, Ogólna instrukcja dotycząca stosowania. Pożywki gotowe do użycia i częściowo przygotowane, instrukcja firmowa Becton Dickinson, July Antimicrobial susceptibility testing EUCAST disk diffusion method, EUCAST ver. 1.0, Dec EUCAST recommended strains for internal quality control, EU- CAST ver.1.3, Dec CLSI, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twentieth International Supplement, CLSI document M100-S18, Stefaniuk E., Standaryzacja testów lekowrażliwości i kontrola jakości. Aktualności BioMerieux 2006; 39: Zaakceptowano do publikacji: Adres do korespondencji: Dr n. med. Urszula Wendt Laboratoria Medyczne BRUSS Grupa ALAB Sp. z o.o Gdynia, ul. Powstania Styczniowego 9B tel. (58) , fax (58) urszula.wendt@lmbruss.pl Piśmiennictwo 1. PN-EN ISO/IEC 17025:2005/Ap1:2007. Ogólne wymagania dotyczące kompetencji laboratoriów badawczych i wzorcujących, PKN, Warszawa PN-EN ISO 15189:2008. Laboratoria medyczne. Szczególne wymagania dotyczące jakości i kompetencji, PKN, Warszawa PN-EN 12322: Wyroby medyczne do diagnostyki in vitro. Pożywki mikrobiologiczne Kryteria oceny działania pożywek mikrobiologicznych, PKN, Warszawa PKN-CEN ISO/TS : Mikrobiologia żywności i pasz. Wytyczne dotyczące przygotowania i wytwarzania pożywek. Część 1: Ogólne wytyczne dotyczące kontroli jakości pożywek przygotowywanych w laboratorium, PKN, Warszawa Kwiatek K. Kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych według projektu normy pren ISO :2000. Aktualności biomerieux 2002; 20: EA-04/10. Akredytacja laboratoriów mikrobiologicznych, PCA. Warszawa Dyrektywa nr 98/79/WE Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 27 października 1998 r. w sprawie wyrobów medycznych używanych do diagnozy in vitro. 8. PN-EN ISO 13485:2005. Wyroby medyczne. Systemy zarządzania jakością, wymagania dla celów przepisów prawnych. PKN, Warszawa PN-EN 1659: Systemy diagnostyczne in vitro. Pożywki mikrobiologiczne. Terminy i definicje. PKN, Warszawa Stefaniuk E. Laboratoryjna kontrola jakości podłoży mikrobiologicznych. Aktualności biomerieux 2008; 44: Zaręba T. Pożywki mikrobiologiczne. Laboratorium 2007; 6: Basu S, Pal A, Desai PK. Quality control of culture media in a microbiology laboratory. Indian J Med Microbiol 2005; 23: Materiały szkoleniowe Gdańskiej Fundacji Wody. 14. PN-EN ISO 7218:2008/Ap1:2010. Mikrobiologia żywności i pasz. Wymagania ogólne i zasady badań mikrobiologicznych, PKN, Warszawa