A N N A L E S U N I V E R S I T A T I S M A R I A E C U R I E - S K Ł O D O W S K A L U B L I N P O L O N I A

Transkrypt

1 A N N A L E S U N I V E R S I T A T I S M A R I A E C U R I E - S K Ł O D O W S K A L U B L I N P O L O N I A VOL. LXI, 22 SECTIO DD 2006 Zakład Epizootiologii i Klinika Chorób Zakanych Instytutu Chorób Zakanych i Inwazyjnych Akademii Rolniczej w Lublinie MARIUSZ PLISZCZYSKI, DOROTA LUFT-DEPTUŁA, KATARZYNA BIZO, MARIUSZ CHEŁMISKI Odpowied humoralna organizmu zimujcych robotnic pszczoły miodnej Apis mellifera L. (Apidae) Humoral immune defense of the wintering workers of the honey bee Apis mellifera L. (Apidae) STRESZCZENIE Bardzo wan lini obrony pszczoły miodnej, Apis mellifera L., jest dobrze wykształcona zdolno odróniania własnego (self) od obcego (non-self) i do zabijania drobnoustrojów wnikajcych do jamy ciała w odczynach hemocytarnych i humoralnych. W hemocelu przeciwdrobnoustrojowe peptydy i białka wystpuj stale (lizozym) lub s szybko indukowane (hipersynteza lizozymu pod wpływem zakaenia, de novo synteza apidycyn). Zbadano wpływ zimowania rodziny na odpowied humoraln pszczół robotnic. System obrony wewntrznej zimujcych pszczół, reprezentowany przez komponenty humoralne, jest dobrze rozwinity. Natywny poziom lizozymu w trzech okresach badania był niski. Aktywno lizozymu silnie wzrastała u pszczół zimujcych, poddanych indukcji przy uyciu E. coli D31, a take u owadów niepoddanych indukcji bakteryjnej. Najwyszy poziom apidycyn indukowano u pszczół przed zimowaniem i pszczół zimujcych po 72 godz. po iniekcji do jamy ciała ywych komórek E. coli D31. Słowa kluczowe: pszczoła miodna, zimowanie, lizozym, apidycyny WSTP ycie rodziny pszczoły miodnej, Apis mellifera L., zmienia si w zalenoci od pór roku. Decydujc rol odgrywa tu temperatura, wiatło i baza pokarmowa. Zmienia si stan biologiczny rodziny, jej siła i struktura. W procesie tych zmian wany etap stanowi okres zimowania, w którym rodzina tworzy kłb zimowy. W tym okresie pszczoły s przez cały czas aktywne. Spoywaj miód i przez wibracj mini tułowia wytwarzaj ciepło. Zimujce pszczoły nie opuszczaj ula, wyjtkowo tylko dokonuj lotów oczyszczajcych. Gdy temperatura powietrza podnosi si do 8 C, robotnice wylatuj z ula, aby pozby si kału. Zagroenie dla zdrowia zimujcej rodziny stanowi coraz powszechniej wystpujce choroby zakane wywołane przez bakterie warunkowo chorobotwórcze oraz przez Nosema apis [Kauko i Gliski 1994, 1996]. Czstotliwo wystpowania, przebieg i zejcie tych chorób w rodzinie

2 180 M. PLISZCZYSKI, D. LUFT-DEPTUŁA, K. BIZO, M. CHEŁMISKI zimujcej zale w duym stopniu od stanu układu odpornociowego robotnic. Immunosupresja, zwizana ze znacznym zmniejszeniem stanu reaktywnoci immunologicznej organizmu, jest coraz czciej spowodowana skaeniem rodowiska, hodowl pszczół w warunkach odbiegajcych znacznie od naturalnych, jakie panuj w zasiedlanych przez nie niszach ekologicznych, działaniem rónych stresów. Wród stresów wane znaczenie odgrywa niepokojenie zimujcej rodziny, brak lub nieodpowiedni jakociowo pokarm, gwałtowne zmiany temperatury. Jedn z przyczyn immunosupresji jest skaenie rodowiska, stosowanie leków, których niepo- danym efektem działania jest osłabienie odpowiedzi immunologicznej, inwazja roztocza Varroa destructor, Nosema apis, bd zamierzone działanie człowieka, czyli stosowanie rodków immunosupresyjnych [Jarosz 1994, Gliski i Jarosz 1998, Jarosz i Gliski 1999, Gliski i Kauko 2000]. Wan rol przy tym sposobie prowadzenia hodowli odgrywaj: dopływ pokarmu do rodziny, temperatura rodowiska i warunki zimowania. Brak pokarmu, choroby, rozwizanie kłbu zimowego prowadz do mierci zimujcej rodziny lub jej silnego osłabienia na wiosn. Ocena stanu przeciwzakanej odpornoci humoralnej rodziny zimujcej pszczoły miodnej jest celem przeprowadzonych bada. Zastosowano w nich dwa modele eksperymentalne. W jednym modelu, w którym wykorzystano pszczoły robotnice o niepobudzonym eksperymentalnie układzie odpornociowym, okrelono wpływ zimowania na aktywno bakteriolityczn hemolimfy typu lizozymu. W drugim modelu, w którym obiektem bada były pszczoły o odpornoci indukowanej przez zakaenie jamy ciała ywymi komórkami Escherichia coli D31, okrelono wpływ zimowania na dwa humoralne parametry odpornoci nabytej: hipersyntez lizozymu oraz na poziom apidycyn w hemolimfie. Te parametry w pełni odzwierciedlaj stan odpornoci humoralnej owada [Gliski i Jarosz 1993, Gliski i Kostro 2001]. MATERIAŁ I METODY Badania przeprowadzono na robotnicach pszczoły miodnej, Apis mellifera L., pochodzcych z pasieki Oddziału Pszczelnictwa Instytutu Sadownictwa i Kwiaciarstwa w Puławach. Pszczoły pobierano do bada w odstpach 2-tygodniowych w 2003 i 2004 r. (tab. 1). Okres zimowania przypadał na miesice listopad kwiecie. Badania wykonywano na grupie około 200 robotnic po 24-godzinnej aklimatyzacji. W trakcie bada pszczoły utrzymywano w klateczkach, w temperaturze 29 C i wilgotnoci wzgldnej 85% oraz karmiono ciastem miodowo-cukrowym. Okres zimowania trwał od 17 listopada 2003 r. do 15 marca 2004 r. Rodziny, z których pochodziły pszczoły były wolne od warrozy, zgnilca amerykaskiego i zgnilca europejskiego. Aktywno bakteriolityczn typu lizozymu w hemolimfie u pszczół robotnic okrelono w czasie 0 oraz po 48 i 72 godz. aklimatyzacji pszczół, natomiast nasilenie hipersyntezy lizozymu i poziom apidycyn okrelono u robotnic po czasie 0, 48, 72 godz. po zakaeniu jamy ciała pszczoły komórek E. coli D31/2 µl płynu dla Lepidoptera. Zakaenia dokonano po pobraniu próbek hemolimfy w czasie 0. Owady, które poddano immunizacji oraz owady nieimmunizowane, stanowice grup kontroln, były utrzymywane w identycznych warunkach dowiadczalnych. Kadorazowo grupa liczyła od 50 do 100 pszczół robotnic. Hemolimf pobierano z zatoki grzbietowej do probówek Eppendorfa na łani lodowej. Zastosowanie łani lodowej zapobiegało melanizacji hemolimfy. Celem zobiektyzowania, wyniki poddano analizie statystycznej (test chi 2 przy p<0.05 oraz test U Manna-Whitneya przy p<0,05, warto odchylenia standardowego obliczono wg programu Microsoft Excel 7.0 a). Aktywno bakteriolityczn hemolimfy typu lizozym okrelono metod basenikowo-dyfuzyjn w stosunku do Micrococus luteus (M. lysodeikticus) Stenie lizozymu w badanej hemolimfie obliczono z krzywej kalibracyjnej [(analiza regresji, model eksponowany y = exp (a + gx)] sporzdzonej dla nastpujcych ste lizozymu białka jaja kurzego: 125,0, 62,5, 31,0, 15,5, 7,8, 3,9, 1,8, 0,9 µg/ml

3 ODPOWIED HUMORALNA ORGANIZMU ZIMUJCYCH ROBOTNIC 181 i wyraono w µg/ml hemolimfy w przeliczeniu na aktywno lizozymu białka jaja kurzego (EWL, EC ). Na osi odcitych odkładano logarytm stenia lizozymu standardowego, a na osi rzdnych rednic w mm strefy bakteriolizy. Dla kadej serii oznacze aktywnoci lizozymu sporzdzono krzyw kalibracyjn ze wieo przygotowanych rozciecze lizozymu EWL [Gliski i Jarosz 1992]. Poziom cekropin hemolimfy oceniano metod basenikowi-dyfuzyjn wobec szczepu E. coli szczep D31 (E. coli D31) jako drobnoustroju indykatorowego opornego na streptomycyn [Jarosz 1994] i wyraano w stosunku do syntetycznej cekropiny A [Gliski i Jarosz 1992]. Wyniki poddano analizie wariancji w programie Statgraphics vers. 5 (one-way analysis of variance). WYNIKI Stresy rodowiska, zakaenia i inwazje pasoytów indukuj u pszczoły miodnej odpowied immunologiczn, która polega na moblilizacji mechanizmów odpornoci naturalnej i nabytej. W przypadku przedostania si do jamy ciała owada zarówno czynników biotycznych, jak i abiotycznych, sekwencja zdarze obejmuje ich rozpoznanie jako obce (non-self) oraz likwidacj lub eliminacj z organizmu [Ottaviani 2005]. W wielu przypadkach reakcja organizmu owada przypomina reakcje ostrej fazy krgowców [Gliski i Kostro 2003]. W organizmie zakaonych owadów ma miejsce hiperynteza lizozymu (pojawia si tzw. lizozym zakany) i synteza de novo apidycyn abycyny i hymenoptecyny. Te zmiany odzwierciedlaj zaangaowanie czynników humoralnych w odczynach immunologicznych. Lizozym i apidycyny s głównymi składnikami przeciwzakanej odpornoci humoralnej pszczoły [Gliski i Jarosz 1995]. redni fizjologiczny poziom lizozymu w hemolimfie natywnych robotnic przed zimowaniem (grupa A), w czasie zimowania (grupa B) i po zimowaniu (grupa C) był niski i wahał si w granicach od 0,4±0,3 do 3,0±2,6 µg EWL/ml. Był on statystycznie znamiennie wyszy w grupie pszczół zimujcych i po zimowaniu w porównaniu z pszczołami robotnicami przez zimowaniem. Immunizacja spowodowała statystycznie znamienny, ale niewielki, wzrost aktywnoci bakteriolitycznej typu lizozymu u pszczół zimujcych i po zimowaniu w porównaniu z pszczołami przed zimowaniem (rys. 1). µg EWL/ml 3,5 3 2,5 2 1,5 0 h 48 h 72 h 1 0,5 0 A B C Rys. 1. Aktywno bakteriolityczna typu lizozymu (µg EWL/ml, x±sd) w hemolimfie pszczół robotnic przed zimowaniem (grupa A) w trakcie zimowania (grupa B) i po zimowaniu (grupa C) Fig. 1. Bacteriolytic activity of lysozyme (µg EWL/ml, x±sd )n hemolyph of bees before wintering (group A), wintering (group B), after wintering (group C)

4 182 M. PLISZCZYSKI, D. LUFT-DEPTUŁA, K. BIZO, M. CHEŁMISKI Analiza poszczególnych okresów badania wskazuje, e zawsze najwyszy poziom aktywnoci bakteriolitycznej typu lizozymu wystpował w 2. okresie (tab. 2). W hemolimfie robotnic natywnych pszczół przed zimowaniem nie stwierdzono obecnoci apidycyn, okrelonej w stosunku do drobnoustroju wskanikowego, jakim jest E. coli D31. Uyty w badaniach drobnoustrój był wraliwy na stenie cekropiny syntetycznej A Hyalophora cecropia, wynoszce 0,1 µg w 1 ml płynu fizjologicznego dla owadów lub w 1 ml hemolimfy robotnicy pszczoły miodnej niepoddanej immunizacji. µg /ml h 48 h 72 h A B C Rys. 2. Poziom apidycyn (µg/ml, x±sd) w hemolimfie pszczół robotnic przed zimowaniem (grupa A), w trakcie zimowania (grupa B) i po zimowaniu (grupa C) Fig. 2. The level of apidaecins in hemolymph of bees (µg/ml, x±sd) before wintering (group A), wintering (group B) and after wintering (group C) Apidycyny wystpowały w hemolimfie pszczół natywnych w niewielkich ilociach w czasie zimowania i po zimowaniu, osigajc najwysze wartoci po 72 godz. po indukcji bakteryjnej (rys. 2), statystycznie znamienny poziom w odniesieniu do wartoci stwierdzonej po 48 i 72 godz. po indukcji w grupie A i B. W grupie pszczół po zimowaniu poziom apidycyn w porównaniu z dwoma pozostałymi grupami obniył si statystycznie istotnie. Charakterystyczny jest bardzo wysoki wzrost poziomu apidycyn tylko w niektórych okresach badawczych, przy bardzo niskiej lub nawet braku tej aktywnoci w innych okresach (rys. 3), co wiadczy o wyranych rónicach w nasileniu odpornoci typu apidycyn w badanych okresach u pszczół robotnic. Mona przypuszcza, e po indukcji dua cz apidycyn była zaangaowana w proces obronny, np. pełnic role czynnika opsonizujcego w procesie fagocytozy. OMÓWIENIE WYNIKÓW Lizozym pszczoły miodnej naley do drobnoczsteczkowych białek zasadowych o masie kda i właciwociach zblionych do lizozymu białka jaja kurzego. Zaliczany on jest do lizozymów właciwych typu C (chicken) [Jollés i in. 1979]. ródłem lizozymu owada jest ciało tłuszczowe (fat body), bdce głównym organem biosyntezy białek, w tym białek hemolimfy.

5 µ g/m l 500,8 450,8 400,8 350,8 300,8 0 h 48 h 72 h 250,8 200,8 150,8 100,8 50,8 0, Okresy badania Periods of studies Rys. 3. Poziom apidycyn (µg/ml) w hemolimfie pszczoły miodnej w okresie zimowania oraz 4 tygodnie przed i 8 tygodni po zimowli Fig. 3. The level of apidaecins (µg/ml) in hemolymph of wintering bees, 4 weeks before wintering and 8 weeks after wintering

6 Tabela 1. Czas pobierania próbek pszczół do bada Table 1. Days of sampling Okres badania Period of studies Data Date Tabela 2. Aktywno bakteriolityczna typu lizozymu (µg EWL/ml) w hemolimfie pszczoły miodnej (Apis mellifera L.) w okresie zimowania oraz 4 tygodnie przed i 8 tygodni po zimowaniu Table 2. Bacteriolytic activity of blood lysozyme (µg EWL/ml) in wintering worker bees (Apis mellifera L.) and 4 weeks before and 8 weeks after wintering Czas po indukcji, h Okres badania Period of studies After induction ,6 0,1 9,6 3,4 2,1 1,9 1,4 2,6 1,9 2,6 1,6 2,4 1,3 1,6 2,1 48 0,6 0,1 8,6 6,6-1,9 2,4 2,1 1,0-1,8 1,2 1,0 2,4 1,8 72 0,3 0,1 6,0 2,6-1,3 1,6 1,9 3,1-3,8 1,1 1,9 1,6 2,4 Kolorem szarym zaznaczono okres zimowania. Grey colour wintering.

7 ODPOWIED HUMORALNA ORGANIZMU ZIMUJCYCH ROBOTNIC 185 Wzgldnie niska wrodzona aktywno bakteriolityczna typu lizozymu hemolimfy wzrasta w zakaeniach bakteryjnych lub po iniekcji substancji abiotycznych do jamy ciała owada, osigajc maksymalny poziom w hemolimfie po godz. po immunizacji. W wikszoci przypadków zakaenie bakteryjne jamy ciała indukuje maksymalny wzrost poziomu lizozymu w hemolimfie [Buczek 1998]. Spektrum bakteriobójczego działania lizozymu jest wskie i ogranicza si w zasadzie do saprofitycznych bakterii Gram-dodatnich z rodzaju Micrococcus, Bacillus i Sarcina [Mohrig i Messner 1968a, b]. Wzrostowi stenia lizozymu w hemolimfie towarzyszy z reguły niepodatno owada na zakaenie bakteryjne. Boucias i Pendland [1991] uwaaj, e główna rola lizozymu polega na zainicjowaniu odpowiedzi immunologicznej humoralnej, poniewa produkty powstajce w efekcie jego działania na komórk bakteryjn s czsteczkami sygnałowymi (pattern recognition molecules). Zdaniem Bomana i Hultmarka [1987] lizozym spełnia rol sprztacza, poniewa rozkłada murein ciany komórki bakterii zabitych przez indukowane polipeptydy i białka odpornociowe o aktywnoci przeciwbakteryjnej, np. przez cekropiny lub attacyny. Do grupy polipeptydów linearnych o duej iloci reszt aminokwasowych w czsteczce nale apidycyny. Ich czsteczka zawiera du ilo reszt praliny i argininy (linear proline and arginine rich polypeptides). Apidycyny wystpujce w czterech izoformach (Ia, Ib, II i III) stanowi główny składnik humoralnej nabytej odpornoci przeciwbakteryjnej pszczoły miodnej i wywodz si od poszczególnych prekursorów apidycyn. Czsteczka apidycyny jest zbudowana z 18 reszt aminokwasowych i ma mas około 2 kda [Casteels i in. 1989, 1990, 1994, Gliski i Jarosz, 1993, Casteels-Josson i in. 1994]. We wszystkich typach apidycyn wystpuje stały region odpowiedzialny za działanie przeciwbakteryjne. Termostabilno i otwarta (non-helical) struktura czsteczki apidycyn jest uwarunkowana obecnoci w peptydzie 6 reszt proliny. W hemolimfie czerwia pszczoły wystpuje biologicznie nieaktywny prekursor apidycyn proapidycyna (proapidaecin). Forma aktywna (apidycyna) pojawia si w hemolimfie zakaonych (uodpornionych) imago pszczołowatych (Apoidea). Przejcie proapidycyny w apidycyn polega na enzymatycznym rozczepieniu przez aminopeptydaz wizania peptydowego pomidzy glicyn i prolin w czsteczce prekursora, co w efekcie prowadzi do pojawienia si apidycyny oraz biologicznie nieaktywnego peptydu [Casteels i in. 1989, 1990]. Apidycyny stanowi najwaniejszy składnik nabytej odpornoci przeciwbakteryjnej pszczoły miodnej. Aktywno bakteriobójcza hemolimfy pszczoły, zwizana z obecno- ci apidycyn, pojawia si w hemolimfie imago po 8 godzinach po zakaeniu jamy ciała subletaln dawk ywych komórek Escherichia coli i osiga warto maksymaln 36 godz. po zakaeniu bakteryjnym. Ze wzgldu na fakt wystpowania u pszczoły wielu genów kierujcych syntez apidycyn w regionie 15 kb genomu, zakaenie pobudza w rónym czasie te geny. Faza lag, po której pojawia si specyficzny odpornociowy mrna, trwa około 4 godzin. Jakkolwiek w hemolimfie uodpornionej pszczoły jest indukowanych co najmniej 9 peptydów, to tylko 4 sporód nich (apidycyna, abycyna, hymenoptecyna i defenzyna) maj aktywno przeciwbakteryjn. Odporno typu apidycyn jest skierowana przeciwko bakteriom, które najczciej wystpuj w rodowisku bytowania pszczołowatych, a mianowicie jest skierowana na: bakterie patogenne z rodziny Enterobacteriaceae, wystpujce w przewodzie pokarmowym człowieka i zwierzt, wydalane z kałem i zanieczyszczajce wod, gleb i roliny, z którymi pszczoły kontaktuj si podczas zbierania nektaru i pyłku oraz pobierania

8 186 M. PLISZCZY SKI, D. LUFT-DEPTUŁ A, K. BIZO, M. CHEŁ MI SKI wody, bakterie fitopatogenne, np. Erwinia salicis, Pseudomonas syringae, zwizane symbiotycznie z rolinami wyszymi (plant-associated bacteria), takie jak Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium melliloti, z którymi pszczoły kontaktuj si podczas zbierania nektaru i pyłku. µg/ml µg EWL/ml AP LZ Okresy badania Periods of studies 0 Rys. 4. Poziom lizozymu (LZ, µg EWL/ml) i apidycyn (AP, µg/ml) pszczół robotnic przed zimowaniem (1, 2), w trakcie zimowania (3 11) i po zimowaniu (12 15) Fig. 4. The level of blood lysozyme (LZ, EWL/ml) and apidaecins (AP, µg/ml) in native (non induced) worker bees before (1, 2) during (3 11) and after (12 15) wintering Obserwowany, zwłaszcza na pocztku zawizania kłbu, duy wzrost aktywnoci bakteriolitycznej typu lizozymu wiadczy o mobilizujcym wpływie zimowania na składowe odpowiedzi humoralnej owada. Stres zwizany z zimowaniem działa, przynajmniej w pewnym zakresie, jako immunostymulator odpornoci humoralnej pszczoły. Działanie tego stresu, łcznie z hipersyntez lizozymu i wysokim poziomem apidycyn u pszczół robotnic po zakaeniu bakteryjnym jamy ciała, jeszcze w wikszym zakresie przyczynia si do zwikszenia odpornoci owada na zakaenie bakteryjne. Fakt, e z reguły niszym wartociom lizozymu towarzyszył wzrost aktywnoci apidycyn w poszczególnych okresach badania (rys. 4), wiadczy o stabilizujcym ich działaniu na odporno humoraln jamy ciała owada. Wydaje si, e przy wysokim natywnym poziomie lizozymu w hemolimfie zimujcych robotnic, do likwidacji infekcji nie jest konieczny równoczesny silny wzrost poziomu apidycyn. Ostateczn odpowied powinny przynie badania nad stopniem działania ochronnego w trzech wydzielonych okresach rozwoju rodziny. WNIOSKI Oceniono aktywno bakteriolityczn hemolimfy typu lizozymu, poziom apidycyn u robotnic pszczoły miodnej, Apis mellifera L., w czasie zimowania, wczesn wiosn i pón jesieni.

9 ODPOWIED HUMORALNA ORGANIZMU ZIMUJCYCH ROBOTNIC 187 Stres zwizany z zimowaniem pobudza zarówno naturaln, jak i indukowan przeciwzakan odpowied humoraln pszczół robotnic. To działanie jest silniej zaznaczone w pierwszych tygodniach istnienia kłbu, co znajduje odzwierciedlenie w nasileniu aktywnoci bakteriolitycznej typu lizozymu hemolimfy i poziomie apidycyn. Zimujce robotnice pszczoły miodnej dysponuj sprawnym układem humoralnej odpowiedzi przeciwzakanej, reprezentowanej przez aktywno bakteriolityczn hemolimfy typu lizozymu oraz aktywno typu apidycyn. Zarówno u zimujcych pszczół robotnic, jak i u pszczół przed i po zimowaniu efektem zakaenie jamy ciała jest hipersynteza lizozymu i pojawienie si apidycyn. Z reguły w poszczególnych okresach badania niszym wartociom lizozymu towarzyszył wzrost aktywnoci apidycyn. PIMIENNICTWO Boman H.G., Hultmark D Cell-free immunity in insects. Ann. Rev. Microbiol. 41, 103. Boucias D.G., Pendland J.C Attachment of mycopathogens to cuticle: the initial event of mycoses in arthropod host. [in:] The Fungal Spore and Disease Initiation in Plants and Animals. Red. G.T. Cole, H.C. Hoch. Plenum Press, New York, p Buczek K Badania nad przydatnoci Klotrimazolu jako leku w grzybicy otorbielakowej i immunostymulatora pszczoły miodnej. Praca dokt. Wydział Medycyny Weterynaryjnej AR w Lublinie. Casteels P., Romagnolo J., Castle M., Casteels-Josson K., Erdjument-Bromage H., Tempst P Biodiversity of apidaecin-type peptide antibiotics. Prospects of manipulating the antibacterial spectrum, and combating acquired resistance. J. Biol. Chem. 269, Casteels P.R., Ampe C., Jacob F., Vaeck M., Tempst P Apidaecins: antibacterial peptides from honeybees. EMBO J. 8, Casteels P.R., Ampe C., Riviere L., Van Damme J, Elicone C., Fleming M, Jacobs F., Tempst P Isolation and characterization of abaecin, a major antibacterial response peptide in the honeybee (Apis mellifera ). Eur. J. Biochem. 187, 381. Casteels-Josson K., Zhang W., Capaci T., Casteels P., Tempst P Acute transcriptional response of the honeybee peptide-antibiotics gene repertoire and required post-translational conversion of the precursor structure. J. Biol. Chem. 269, Gliski Z., Jarosz J Zarys immunologii owadów. Wydawnictwo AR w Lublinie. Gliski Z., Jarosz J Further evidence for cell-free immunity in the honeybee, Apis mellifera. Apiacta 28, 69. Gliski Z., Jarosz J Immunobiologia pszczoły miodnej. Wydawnictwo AR w Lublinie. Gliski Z., Jarosz J Antibacterial immune response and biological control of agricultural insect pests. Proceedings. Ist Regional Symposium for Applied Biological Control in Mediteranean Countries. Cairo, October 25 29, Gliski Z., Kauko L Problems of immunosuppression and immunotoxicology in respect to the honey bee protection against microbial and parasitic invaders. Apiacta 35, 65. Gliski Z., Kostro K Key stones in insect immunity. Centr. Eur. J. Immunol. 26, 43. Gliski Z., Kostro K Polipeptydy i białka odpornociowe owadów odpowiednikiem białek ostrej fazy krgowców? [w:] Białka ostrej fazy u zwierzt. K. Kostro, Z. Gliski (red.) Wydawnictwo AR w Lublinie, s Jarosz J Modulation of cell-free immune responses in insects. Cytobios 79, 169. Jarosz J., Gliski Z Immunotoxic effects of pesticides on insect cell-free antibacterial immune response. Mat. XIVth International Plant Protection Congress, Jerusalem, July 1999, p. 41.

10 188 M. PLISZCZY SKI, D. LUFT-DEPTUŁ A, K. BIZO, M. CHEŁ MI SKI Jollès J., Schoentgen F., Croizier G., Croizier L., Jollès P Insect lysozymes from theree species of lepidoptera: their structural relatedness to the C (chicken) type lysozyme. J. Mol. Evol. 14, 267. Kauko L., Gliski Z Hafnia alvei-bakterin aiheutamma septikemia mehilaisissa. Suomen Finsk Veterinartidskrift 5, 314. Kauko L., Gliski Z., Buczek K Enterococcus faecalis tartunta mehiläisellä. Suomen Eläinlaak. 102, 266. Mohrig W., Messner B Immunreaktionen bei Insekten. I. Lysozym als grundlegender antibakterieller Faktor im humoralen Abwehrmechanismus der Insekten. Biol. Zentralb. 87, 439. Mohrig W., Messner B. 1968a. Immunreaktionen bei Insekten. II. Lysozym als antimikrobielles Agens im Darmtrakt von Insekten. Biol. Zentralbl. 87, 705. Ottaviani E Insect immunorecognition. Invertebrate Survival J. 2, 142. SUMMARY An important line of defense of the honey bee, Apis mellifera L., is a well developed capacity to discriminate between self and non-self and to kill microbial invaders by hemocytic and humoral immune responses. In the haemocoel antimicrobial peptides and proteins are expressed constitutively (lysozyme) or are readily inducible (lysozyme hipersynthesis on infection and de novo synthesized apidaecins). The influence of wintering on the honey bee humoral immune response was investigated. The internal defense system of the wintering honey bee represented by humoral components is well developed. The native level of blood lysozyme in the three periods of investigations was low. Lysozyme was strongly recruited for immune function in wintering of non- -induced and E. coli D31 induced honey bees. The highest expression of apidaecins was induced after 72 h after intrahaemocoelic injection of live cells of E. coli D31 in bees before wintering and in wintering bees. Key words: honey bee, wintering, lysozyme, apidaecins