REKOMBINACJA NIEHOMOLOGICZNA JAKO PRZYCZYNA RDZENIOWEGO ZANIKU MIĘŚNI.

Transkrypt

1 REKOMBINACJA NIEHOMOLOGICZNA JAKO PRZYCZYNA RDZENIOWEGO ZANIKU MIĘŚNI. Monika Gos Zakład Genetyki Medycznej Kierownik: prof. dr hab. Jerzy Bal , Warszawa, IBB Patologia molekularna wybranych chorób genetycznie uwarunkowanych

2 Mutacje warianty sekwencyjne 1nt-1kb warianty strukturalne 1kb 5Mb rearanżacje genomowe - inwersje / translokacje zrównoważone - delecje / duplikacje - zmiany niezrównoważone mikroduplikacje / mikrodelecje - CNV copy number variants - zmiany kompleksowe 95% genomu sekwencje unikalne 5% - low copy repeats (LCR); duplikacje segmentalne kb, >95-97% homologii

3

4 Mechanizmy powstawania rearanżacji genomowych Niealleliczna rekombinacja homologiczna zachodzi pomiędzy sekwencjami o wysokiej homologii delecje/duplikacje Inwersje Przykłady: NF1 Zespół Charcot-Marie-Tooth typ 1A / Dziedziczna neuropatia z nadwrażliwością na ucisk PMP22 Mejoza zmiany konstytutywne Mitoza mozaikowatość Zmienna częstość występowania zależnie od płci (CMT1A duplikacja 96% od ojca, SMA delecja 85% od ojca, NF1 80% od matki)

5 Mechanizmy powstawania rearanżacji genomowych Niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) Model blokowania widełek i przełączania matrycy (FoSterS) Replikacja indukowana przez pęknięcia w regionach mikrohomologii (MMBiR) Retrotranspozycja z udziałem mrna (MEI) rekombinacja V(D)J nowotwory PLP1, MECP2 DMD - dystrofia

6 Efekt CNV mechanizm patogenny Mechanizm Zmiana dawki genu Brak fragmentu genu Fuzja genów Efekt położenia Choroba / gen CMT1A/HNPP PMP22 Zespół DiGeorga 22q11.2 (TBX1) Rdzeniowy zanik mięśni SMN1 Hemofilia F8 Nadciśnienie i aldosteronizm - CYP11B1, CYP11B2 Dysplazja kampomeliczna SOX9 Ujawnienie allela recesywnego Mukowiscydoza - CFTR

7 Rdzeniowy zanik mięśni postępująca choroba neurodegeneracyjna osłabienie i atrofia mięśni zanik neuronów ruchowych rdzenia kręgowego i pnia mózgu częstość występowania: / żywych urodzeń różne podtypy kliniczne: I-IV

8 Objawy kliniczne osłabienie siły mięśniowej wiotkość objawy wyrażone bardziej w kończynach dolnych i mięśniach dosiebnych najsłabsze: mięśnie obręczy biodrowej choroba nie dotyczy przepony i mięśni zewnętrznych gałki ocznej inne objawy: drżenie palców, odruchy głębokie zniesione lub zanikające (odruch kolanowy) układ czuciowy zachowany rozwój intelektualny - prawidłowy

9 Formy kliniczne SMA Postać Objawy kliniczne SMA 0 SMA1 SMA2 SMA3 SMA4 postać wrodzona; osłabienie ruchów płodu tc., po urodzeniu ciężka niewydolność oddechowa, hipotonia, arefleksja, brak ruchów czynnych, zaburzenia ssania i połykania, wrodzone wady serca (ASD, VSD); rokowanie złe 50%; brak umiejętności samodzielnego chodzenia i siedzenia; wiotkość, niedowład czterokończynowy, brak odruchów głębokich i drżenie paluszków; oddech przeponowy przy jednoczesnym zaniku mięśni międzyżebrowych; śmierć przed 2 rż wskutek niewydolności oddechowej zdolność do samodzielnego siedzenia, brak umiejętności chodzenia; pierwsze półrocze prawidłowy rozwój, później zahamowanie; charakter postępujący (zanik mięśni, przykurcze stawowe, 100% skrzywienie kręgosłupa powikłania oddechowe) objawy choroby występują po osiągnięciu zdolności do samodzielnego chodzenia (18mż.-20rż.); osłabienie mięśni obręczy biodrowej; rokowanie dobre postać dorosłych; osłabienie siły mięśniowej w wieku dorosłym (po 20rż); choroba powoli postępująca, pogorszenie sprawności ruchowej, ale zachowana zdolność samodzielnego chodzenia

10 Rdzeniowy zanik mięśni dziedziczenie AR częstość nosicielstwa: 1:38-1:70 teoretyczna częstość: 2-7/ wyższa niż obserwowana LOCUS SPRZĘŻONY Z CHOROBĄ: 5q (SMN1)

11 5q odwrócona duplikacja 500kb cen tel GTF2H2c YNAIP SERF1B SERF1A SMN1 NAIP GTF2H2t 500kb 500kb NAIP inhibitor apoptozy GTF2H podjednostka czynnika transkrypcyjnego TFIIH SERF1A białko związane z rozwojem układu nerwowego Odwrócona duplikacja, której przyczyną jest rekombinacja niehomologiczna

12 Białko SMN survival motor neuron ekspresja we wszystkich typach komórek najwyższa w neuronach ruchowych (wykazuje ekspresję specyficzną miejscowo i czasowo) lokalizacja komórkowa: cytoplazmatyczna (tworzenia snrnp assembly) i jądrowa (gems, ciała Cajala) tworzy kompleks SMN z geminami (2-8) i białkiem unrip

13 Funkcje SMN: głównie RNA procesowanie snrna transkrypcja histonów procesowanie rrna (snorna) aktywność telomerazy procesowanie mrna Spinal Muscular Atrophy: Disease Mechanisms and Therapy Charlotte J Sumner, Sergey Paushkin, Chien-Ping Ko

14 SMA locus cen tel GTF2H2c YNAIP SERF1B SERF1A SMN1 NAIP GTF2H2t 500kb 500kb G C A A G exons 1-6 intron 6 exon 7 intron 7 exon 8 A T G G A c.840c>t p.=

15 Rdzeniowy zanik mięśni - przyczyny 95% delecja homozygotyczna eksonu 7 SMN1 w większości przypadków: odziedziczona od obojga rodziców 2% - delecja de novo (zazwyczaj dziedziczona od ojca) delecja eksonu 7 SMN1 może wynikać z konwersji SMN1: 5% - złożona heterozygotyczność: delecja eksonu 7 SMN1 i punktowa mutacja patogenna w obecnej kopii genu SMN1 SMN1 2 SMN1 SMN1 SMN1

16 SMN1 i w populacji polskiej brak SMN1 i letalny Neuroepidemiology 2010;34:

17 Techniki molekularne w badaniach SMA PCR-RFLP Real-Time PCR liczba kopii SMN1/ MLPA liczba kopii SMN1/ sekwencjonowanie Sangera mutacje punktowe PCR-RFLP HinfI Analiza MLPA SMN1/ M ND

18 SMA rozpoznanie PCR-RFLP 1 kopia SMN1 Analiza ilościowa qrt-pcr MLPA del ex 7 /del ex 7 POTWIERDZENIE ROZPOZNANIA KLINICZNEGO del ex 7 /? -/- sekwencjonowanie Analiza nosicielstwa 94% - del ex7/- 4% - 2/0 SMN1 2% - mutacja de novo RYZYKO GENETYCZNE del ex 7 / m del ex 7 / - DIAGNOSTYKA RÓŻNICOWA

19 SMN1 G C A A G exons 1-6 intron 6 exon 7 intron 7 exon 8 A T G G A SMN1 100% 20% 80% funkcjonalne białko nieprawidłowa oligomeryzacja ubikwitynacja i degradacja

20 Modyfikatory choroby liczba kopii genu modyfikator pozytywny, im więcej, tym łagodniejszy przebieg choroby wielkość delecji im większa, tym objawy mogą być cięższe ekspresja PLS3 (plastyna) modyfikator pozytywny, płciowo specyficzny; stabilizacja włóknien F-aktyny polimorfizm c.589g>c (ekson 7) w efekt protekcyjny ( poprawne składanie ) ekspresja ZPR1 (zinc finger protein 1) modyfikator pozytywny; stabilizacja kompleksu SMN pojedyncze doniesienia: ekspresja CORO1C i NRN1 (neuritina), deplecja PTEN modyfikatory pozytywne

21 Potencjalne podejścia terapeutyczne zależne od obecności SMN AAV SMN1 terapia genowa G C A A G exons 1-6 intron 6 exon 7 intron 7 exon 8 Inhibitory HDAC: kwas A T G G A walproinowy, fenylomaślan Małe cząsteczki: chinazolina SMN1 wzmocnienie ekspresji 100% 20% 80% ASO małe (15-35nt) cząsteczki DNA przyłączają się do pre-mrna i wpływają na splicing Tutaj: zapobiegają przyłączaniu się represorów do ISS stabilizacja stabilizacja białka SMN inhibitory proteosomów funkcjonalne białko nieprawidłowa oligomeryzacja ubikwitynacja i degradacja