Podstawy cytometrii przepływowej materiały do nauki

Transkrypt

1 Podstawy cytometrii przepływowej materiały do nauki Jeżeli chcecie pogłębić Waszą znajomość podstaw cytometrii przepływowej, zapraszamy do przeczytania naszego artykułu oraz obejrzenia kilku bardzo fajnych filmów, które przybliżą Wam podstawy metody oraz analizy danych. Jest to bardzo cenna pomoc przy przygotowaniu do egzaminu czy kolokwium Dodatni BTA choroba

2 hemolityczna noworodka, ostry i opóźniony odczyn hemolityczny Bezpośredni test antyglobulinowy (BTA, ang. direct antiglobulin test, DAT) stał się podstawowym badaniem w diagnozowaniu reakcji poprzetoczeniowej, choroby hemolitycznej noworodka (ang. haemolytic disease of the fetus and newborn, HDFN) i niedokrwistości autoimmunohemolitycznej (ang. autoimmune haemolytic anemia, AIHA). BTA oparty jest na zjawisku aglutynacji krwinek czerwonych, które mają na swojej powierzchni cząsteczki IgG lub C3 w wyniku reakcji z przeciwciałami in vivo. Po dodaniu odczynnika antyglobulinowego uwidacznia się reakcja aglutynacji. W przypadku techniki probówkowej do wykonania testu potrzebne są gęste krwinki 4-krotnie przemyte dużą objętością roztworu NaCl o temperaturze 4 8 C, z których sporządza 3 4% zawiesinę. Do probówki przenosi się 2 krople zawiesiny, wiruje i dokładnie usuwa nasącz. Po dodaniu 2 kropli odczynnika antyglobulinowego należy materiał odwirować. Po tej czynności należy delikatnie wstrząsnąć osad krwinek i obserwować obecność aglutynatów. BTA należy interpretować porównując wyniki do kontroli dodatniej i ujemnej, wykonanych przy użyciu krwinek opłaszczonych przeciwciałami anty-d. W przypadku dodatniej autokontroli można podejrzewać AIHA, HDFN oraz powikłania poprzetoczeniowe. Wykonanie BTA techniką mikrokolumnową wymaga małego nakładu energii i technicznie jest dość łatwe. Wśród przyczyn dodatniego wyniku BTA można wymienić: HDFN AHTR (ostry odczyn hemolityczny, ang. acute hemolytic transfusion reaction) DHTR (opóźniony odczyn hemolityczny, ang. delayed hemolytic transfusion reaction) biernie nabyte przeciwciała

3 limfocyty pasażerskie niespecyficzne wiązanie IgG dziedziczenie AIHA leki aktywację komplementu Choroba hemolityczna noworodka HDFN jest to zespół objawów klinicznych rozwijających się u noworodka lub płodu w wyniku konfliktu matczyno płodowego. Krwinki czerwone płodu mogą dostać się do krwiobiegu matki w czasie porodu, poronienia czy w końcowym okresie ciąży. Po przedostaniu się krwinek RhD-dodatnich do krwiobiegu matki RhDujemnej jej organizm zaczyna wytwarzać przeciwciała przeciw antygenowi D obecnemu na erytrocytach dziecka. Odpowiedź pierwotna trwa nawet do kilku miesięcy, stąd też po tym czasie w surowicy matki pojawiają się alloprzeciwciała odpornościowe klasy IgG. Przeciwciała IgG mają zdolność przenikania bariery łożyskowej w następnych ciążach. W przypadku płodu RhD-dodatniego przeciwciała IgG matki niszczą jego krwinki czerwone prowadząc do głębokiej niedokrwistości. Po porodzie nadal trwa niszczenie krwinek czerwonych dziecka, co powoduje szybki wzrost poziomu bilirubiny we krwi. Kiedy stężenie bilirubiny przekroczy próg bariery krew-mózg, może dojść do uszkodzenia mózgu noworodka a nawet śmierci. W HDFN dochodzi do hemolizy w wyniku wiązania się matczynych przeciwciał z antygenem na krwinkach czerwonych dziecka i przy łączeniu się fragmentu Fc przeciwciała z receptorem na makrofagach, znajdujących się w śledzionie płodu. Hemoliza wykazuje zależność stopnia jej nasilenia od podklasy przeciwciał IgG (silna hemoliza przy IgG1 i IgG3), miana przeciwciał oraz ekspresji antygenów na powierzchni erytrocytów. Występowanie choroby hemolitycznej noworodka zostało zminimalizowane dzięki wykonywaniu podstawowych badań diagnostycznych w czasie ciąży i po porodzie oraz profilaktyce z wykorzystaniem immunoglobuliny anty-d. Należy pamiętać, że konflikt serologiczny oraz choroba hemolityczna noworodków

4 mogą dotyczyć innych antygenów niż antygen D. Wszystkie przeciwciała z układu Rh mają potencjalny wpływ na HTR (eng. hemolytic transfusion reaction) i HDFN. Przy czym przeciwciała anty-c są najważniejsze zaraz po anty-d, występując 7/10000 porodów i wywołując HDFN, natomiast przeciwciała anty-c, anty-e oraz anty-e rzadko wywołują HDFN. Konflikt serologiczny może także wystąpić w innych układach grupowych przykładowo z powodu przeciwciał anty-k z układu Kell, anty-fya z układu Duffy czy anty-s z układu MNS. Wyjątkowo niebezpieczne są przeciwciała anty-k klasy IgG działając supresyjnie na erytropoezę. W tym przypadku statystyki mówią o tym, że 1/1000 badanych kobiet wytwarza te przeciwciała, 1/20000 ciąż występuje HDFN, 1/ porodów występuje zgon płodu. HDFN może mieć podłoże związane z brakiem zgodności w układzie ABO. U matki z grupą krwi O może dojść do konfliktu matczyno-płodowego z dzieckiem grupy A lub B, gdy kobieta wytworzy przeciwciała anty-a lub anty-b klasy IgG. Konflikt ten jednak zazwyczaj nie zagraża płodowi, gdyż antygeny A i B osiągają prawidłową ekspresję w okresie okołoporodowym lub po porodzie. HDFN występuje już w pierwszej ciąży i jeżeli się rozwinie, ma często łagodny przebieg. Statystycznie w 1/150 porodów pojawia się patologiczna żółtaczka, 1/3000 porodów ciężka postać HDFN i konieczność transfuzji wymiennej. Podczas poszukiwania przeciwciał odpornościowych anty-a lub anty-b w surowicy matki należy pamiętać, że nie wykrycie przeciwciał IgG bezpośrednio po porodzie nie wyklucza HDFN. Reakcje poprzetoczeniowe Reakcje poprzetoczeniowe stanowią różnorodną grupę niekorzystnych reakcji na przetoczenie składników krwi, pojawiając się zazwyczaj w trakcie transfuzji, lub w krótkim czasie po jej zakończeniu. Istnieje wiele podziałów odczynów poprzetoczeniowych. W tej pracy zostanie przytoczony podział według AABB. Reakcje poprzetoczeniowe mogą być wczesne (w trakcie lub do 24 godzin po przetoczeniu) i opóźnione (po 24 godzinach od przetoczenia). Reakcje wczesne można podzielić na immunologiczne (ostry odczyn hemolityczny, niehemolityczny odczyn gorączkowy, pokrzywka, reakcja anafilaktyczna, ostre poprzetoczeniowe uszkodzenie płuc -TRALI) oraz nieimmunologiczne (posocznica poprzetoczeniowa, hipotensja związana ze stosowaniem inhibitorów ACE, przeciążenie krążenia, hemoliza nieimmunologiczna, zator powietrzny,

5 hipokalcemia, hipotermia). Reakcje późne można podzielić na immunologiczne (alloimmunizacja do antygenów krwinek czerwonych, białych, płytkowych lub białek osocza, opóźniony odczyn hemolityczny, poprzetoczeniowa choroba przeszczep przeciw biorcy (GvHD, małopłytkowa plamica poprzetoczeniowa, immunomodulacja) oraz nieimmunologiczne (przeciążenie żelazem). AHTR należy do wczesnych immunologiczmych reakcji poprzetoczeniowych. Przyczyną jego wystąpienia może być przetoczenie jednostek o nieprawidłowej grupie krwi czyli niezgodność w zakresie antygenów krwinek czerwonych w układzie ABO i antygenie D z układu Rh. Przykładem może być przetoczenie 2 jednostek koncentratu krwinek czerwonych grupy A pacjentowi z grupą O. Odczyn objawia się dreszczami, gorączką, hemoglobinemią, hemoglobinurią, hipotensją, niewydolnością nerek ze skąpomoczem, DIC, bólem pleców, bólem w miejscu wkłucia, niepokojem. Istnieją jednak działania pozwalające na uniknięcie wystąpienia problemu poprzez eliminację pomyłek przy przetoczeniu. DHTR należy do opóźnionych reakcji poprzetoczeniowych. Może do niego dojść u osób uczulonych poprzednimi przetoczeniami lub ciążami. Przyczyną jego wystąpienia jest odpowiedź anamnestyczna na antygeny krwinek czerwonych. Odczyn objawia się gorączką, obniżeniem stężenia hemoglobiny, zażółceniem skóry oraz obecnością przeciwciał. DHTR pojawia się zazwyczaj między 3 a 21 dniem po transfuzji krwi zgodnej serologicznie. W takim przypadku ważna jest identyfikacja wytworzonych przeciwciał i przetaczanie odpowiednio dobranej krwi. W przypadku immunizacji w przeszłości, dotyczącej zwykle układów innych niż ABO, kiedy poziom przeciwciał obniży się poniżej progowego, próba krzyżowa będzie ujemna. Natomiast przy ponownym przetoczeniu powstanie odpowiedź wtórna i przetoczone krwinki ulegną hemolizie pozanaczyniowej w śledzionie. Przyczyn dodatniego bezpośredniego testu antyglobulinowego jest wiele. Choroba hemolityczna noworodka oraz odczyny poprzetoczeniowe mogą być niebezpieczne nie tylko dla zdrowia ale i dla życia. To uzmysławia nam istotę wykonywania BTA. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Opracowano na postawie:

6 Kurs doskonalący dla diagnostów Immunologia Krwinki czerwonej aspekt teoretyczny, diagnostyczny i kliniczny. RCKiK, Katowice, Daniels G., Bromilow I. Essential guide to blood groups. Blackwell Publishing, Oxford, Transfusion Science Course. DiaMed GmbH Switzerland, Cressier sur Morat, April 2010 Protokół FISH na EGFR W jaki sposób wykonać FISH? Do analizy techniką fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (ang. Fluorescence In Situ Hybridization, FISH) wykorzystujemy w naszym laboratorium zatopione w parafinie fragmenty tkanki. Tkanki kroimy cienko (5 mikronów) i poddajemy procedurze odparafinowania w ksylenie, a następnie trawimy i utrwalamy jądra komórkowe. Czasy trawienia (25 lub 30 minut) dobieramy w zależności od preparatu tak, aby uzyskać dobrą jakość hybrydyzacji, ale bez nadmiernego uszkodzenia jąder komórkowych. Na tak przygotowane preparaty nakładamy sondę i po pięciominutowej denaturacji DNA przeprowadzamy hybrydyzację przez 21 godzin w hybrydyzatorze (u nas stoi tani, całkiem przyzwoity MP16 Genos-Hiperon, Polska) w 37 C. Następnego dnia nadmiar niezhybrydyzowanej sondy odpłukujemy, a jądra komórkowe uwidoczniamy dzięki zastosowaniu barwnika DAPI specyficznego dla

7 DNA, barwiącego jądra komórkowe. Preparaty obserwujemy pod mikroskopem fluorescencyjnym Dokładna procedura stosowanej metody zamieszczona jest poniżej: Odparafinowanie tkanek 1. Preparaty umieścić w ksylenie I na 10 minut. 2. Przenieść do ksylenu II na 10 minut. 3. Umieścić w etanolu 100% na 5 minut 2x. 4. Przenieść do szeregu etanolowego: 95%, 80%, 70% po 2 minuty, po czym wysuszyć. Przygotowanie procedury poprzedzające trawienie: 5. Preparaty umieścić w 0,2N HCl na 20 minut. 6. Płukać w wodzie destylowanej przez 3 minuty. 7. Płukać w Wash Buffer przez 3 minuty. 8. Przenieść do Pretreatment Solution o temp. 80 C na 30 minut. 9. Płukać w wodzie destylowanej przez 1 minutę (delikatnie). 10. Płukać w Wash Buffer przez 5 minut 2x. 11. W międzyczasie rozpuścić proteazę (25mg, gotowy proszek) w Protease Buffer (37 C). Trawienie proteazą 12. Preparaty wyjąć z Wash Buffer, odsączyć nadmiar buforu i wysuszyć. 13. Trawić w roztworze proteazy w 37 C przez minut. 14. Płukać w Wash Buffer przez 5 minut 2x, po czym wysuszyć na powietrzu. Hybrydyzacja

8 15. Na preparaty nałożyć po 10 ul sondy. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym (22x22mm) i zakleić. 16. Po wysuszeniu kleju preparaty umieścić w hybrydyzatorze. Program: denaturacja (72 C,5 minut), hybrydyzacja: (37 C, 21 godzin). Płukanie po hybrydyzacji (na następny dzień) 17. Preparaty zanurzyć na około 10-15s w Post Hybridization Buffer w temperaturze pokojowej, po czym usunąć szkiełko nakrywkowe. 18. Preparaty umieścić w Post Hybridization Buffer w 72 C na 2 minuty. 19. Po wysuszeniu nałożyć po 10 ul DAPI i przykryć szkiełkami nakrywkowymi. Preparaty należy przechowywać w ciemności, w -20 C. W badaniu genu EGFR metodą FISH my używamy sondy Vysis LSI EGFR (Abbott Molecular) komplementarną do regionu 300kb chromosomu 7, obejmującego całą sekwencję genu EGFR. Sonda jest wyznakowana barwnikiem Spectrum Orange, który daje w mikroskopie fluorescencyjnym sygnał pomarańczowy. Dodatkowa kontrolna sonda CEP7 wiąże się z alfa satelitarnym DNA w rejonie centromerowym chromosomu 7 (7p11.1-q11.1), na którym zlokalizowany jest gen EGFR. Dzięki barwnikowi Spectrum Green sonda ta świeci na zielono. Pozwalało to na zweryfikowanie otrzymanego sygnału i wykluczenie potencjalnych artefaktów. Obie sondy znajdują się w dostarczonym od producenta i gotowym do użycia buforze hybrydyzacyjnym. Przygotowane preparaty oglądamy pod mikroskopem fluorescencyjnym (Leica) i sprawdzamy ilość sygnałów pomarańczowych i zielonych w poszczególnych komórkach. Zliczanie sygnałów w pojedynczych komórkach jest możliwe dzięki dodatkowemu wybarwieniu jąder specyficznym dla DNA barwnikiem DAPI (niebieski). W przypadku prawidłowej liczby kopii genu EGFR i chromosomu 7 obserwuje się dwa pomarańczowe i dwa zielone punkty. Z kolei obecność trzech lub więcej sygnałów pomarańczowych wskazuje na zwiększoną liczbę kopii genu przy zachowaniu prawidłowej liczby chromosomów 7.

9 M.Z. Piśmiennictwo: Własne doświadczenie zawodowe Gravity flow krok naprzód w dziedzinie izolacji DNA Grawitację odczuwamy na co dzień. Jest ona zjawiskiem tak oczywistym i powszechnym, że nie zastanawiamy się nawet nad jej istnieniem. Naukowcy z firmy A&A Biotechnology postanowili skorzystać z siły grawitacji aby znacznie uprościć i przyspieszyć proces izolacji DNA. Jak to działa? Tradycyjne metody wykorzystujące różnego rodzaju złoża do izolacji kwasów nukleinowych wymagają specjalnych urządzeń takich jak: wirówki, pompy próżniowe lub generatory pola magnetycznego. Urządzenia te są niezbędne do wytworzenia sił napędzających kolejne etapy izolacji. Metoda przepływu grawitacyjnego (Gravity flow) opracowana przez A&A Biotechnology korzysta jedynie z naturalnej siły grawitacji i zjawisk kapilarnych. Dzięki specjalnie opracowanej membranie jonowymiennej i probówce odbierającej możliwy jest swobodny przepływ roztworów i elucja wyizolowanego DNA.

10 Metoda Gravity flow. Specjalnie opracowana membrana i probówka lub płytka odbierająca pozwala na swobodny przepływ roztworów pod wpływem siły grawitacji. Tak zaprojektowany układ pozwala zredukować do minimum wszelkie czynności manualne oraz potrzebę stosowania dodatkowych urządzeń. Dzięki temu metoda jest wyjątkowo prosta, szybka i płynna. Dodawanie i przepływ kolejnych roztworów w metodzie Gravity flow przebiega płynnie, bez potrzeby wirowania i wymiany probówek odbierających. Porównanie izolacji DNA metodą wirówkową oraz Gravity flow

11 Ilość czynności manualnych potrzebnych do przeprowadzenia izolacji metodą grawitacyjną w porównaniu do metody wirówkowej jest znacznie mniejsza. Gravity flow na żywo Manualna izolacja DNA metodą Gravity flow. Izolacja DNA metodą Gravity flow z wykorzystaniem Stacji Pipetującej

12 epmotion. Cztery powody, dla których warto izolować DNA metodą Gravity flow. 1. Wyjątkowa prostota, szybkość i płynność procedury Po przeprowadzeniu lizy do izolacji potrzebny jest jedynie statyw i pipeta. Aż do momentu elucji reszta czynności polega jedynie na dodawaniu kolejnych roztworów. Jest to najprostsze i bardzo wygodne dla każdego rozwiązanie, niezwykle pomocne do celów dydaktycznych oraz dla oso b zabezpieczaja cych pro bki poza laboratorium np.pro bki s rodowiskowe. Wszystkie kroki izolacji, aż do samej elucji odbywają się z wykorzystaniem jednej probówki odbierającej. To znacznie zmniejsza ilość czynności manualnych i tym samym okazji do popełnienia pomyłki lub kontaminacji próbek. Mniejsza ilość probówek to także mniejsza ilość plastikowych odpadów. 2. Elastyczność Metoda Gravity flow uniezależnia nas od planowania i oczekiwania na zajęte urządzenia laboratoryjne. Kolejne etapy izolacji nie wymagają nadzoru, a w razie potrzeby można robić pomiędzy nimi przerwy. 3. Większa wydajność W porównaniu do innych metod izolacji, metoda Gravity flow pozwala na uzyskanie do 50 % więcej czystego DNA z tej samej ilości materiału. 4. Łatwość automatyzacji Z uwagi na wyjątkowo nieskomplikowaną procedurę i małą ilość kroków, metoda Gravity flow jest idealna do zastosowania w wielu, nawet najprostszych modelach urządzeń typu liquid handler, na przykład w formacie płytek 96. Właściwy czas, żeby się przekonać Firma A&A Biotechnology do końca roku ustala 40 % rabat na wszystkie swoje zestawy do izolacji DNA metodą grawitacyjną. Ponadto oferujemy

13 darmowe zestawy demonstracyjne oraz nagrody za wypróbowanie tej innowacyjnej metody i podzielenie się z nami swoją opinią. Więcej na Zapraszamy! Labowe know-how rozdział białek SDS-PAGE (Schagger & von Jagow) Przedstawiamy sprawdzony przepis na elektroforezę białek w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących w obecności SDS (SDS- PAGE) w systemie Schagger & von Jagow. Używane bufory Bufor katodowy 5x (na 1 L): 61 g Tris 0,5 M 89,5 g tricyna 0,5 M 5,0 g SDS 0,5% nie korygować ph Bufor anodowy 5x (na 1 L):

14 121,1 g Tris-HCl 1 M ph 8.9 doprowadź do odpowiedniego ph stosując 10 M HCl Roztwory do polimeryzacji żelu poliakrylamidowego Bufor do żelu (na 100 ml): 36,35 g Tris base 3 M 0,3 g SDS 0,3% ph 8.45 Akrylamid/bis do białek, kda (na 100 ml): 49,5% T, 3% C 48 g akrylamidu 1,5 g N,N -metylenobisakrylamidu Akrylamid/bis do peptydów (na 50 ml): 49,5% T, 6% C 23,25 g akrylamidu 1,5 g N,N -metylenobisakrylamidu Uwaga! Roztwory akrylamidu przefiltruj przed użyciem i przechowuj w lodówce w ciemnej butelce. Bufor do próbek (1:2): 2,0 ml 0,5 M Tris ph 6.8 1,6 ml glicerolu 3,2 ml 10% SDS 1,2 ml dh2o na oko CBB G-250 lub bromofenol blue + 37,4 ul na 0,5 ml buforu b-merkaptoetanolu

15 lub + 50 mg/ml DTT Bufor rozporcjuj i przechowuj w -20 st. 10% APS 1 g nadsiarczanu amonu rozpuść w 9 ml dh2o Rozporcjuj i przechowuj w -20 st. Po rozmrożeniu resztę wyrzuć! Skład żeli poliakrylamidowych (na 2 lub 4 żele) Składniki (dodawaj w tej kolejności!) Żel rozdzielający (10%) Żel zagęszczający (4%) dh 2 O 4,86 ml 9,72 ml 8,325 ml 16,65 ml Bufor do żelu 5,00 ml 10,0 ml 3,1 ml 6,2 ml Akrylamid/bis 3,05 ml 6,1 ml 1 ml 2 ml Glicerol bezw. 2,00 ml 4,00 ml TEMED 7,5 µl 15 µl 7,5 µl 15 µl APS 75 µl 150 µl 75 µl 150 µl obj. końcowa 15 ml 30 ml 12,5 ml 25 ml Uwagi: przy pracy z akrylamidem zawsze używaj rękawiczek (nitrylowych)! roztwór TEMED ma bardzo nieprzyjemny zapach dodawaj go pod dygestorium

16 jeśli chcesz, by żel szybciej spolimeryzował wstaw go do ciepłego pomieszczenia (37 st.) lub oświetl go mocno. upewnij się, że bufor katodowy nie wypływa w przeciwnym wypadku rozdział się zatrzyma jeśli chcesz osiągnąć bardzo dokładny rozdział białek, prowadź elektroforezę przy niskim napięciu (40 V przez żel zagęszczający i 60 V przez żel rozdzielający) AM Protokół odparafinowanie tkanek na szkiełku przed FISH Odparafinowanie tkanek przed FISH 1. Preparaty umieścić w ksylenie I na 10 minut. 2. Przenieść do ksylenu II na 10 minut. 3. Umieścić w etanolu 100% na 5 minut 2x. 4. Przenieść do szeregu etanolowego: 95%, 80%, 70% po 2 minuty, po czym wysuszyć.

17 Protokół srebrzenie żeli MDE Srebrzenie żelu MDE Przepis ten pozwala uzyskać elegancki, niezabrązowiony żel MDE. Żele te w metodzie SSCP służą do detekcji mutacji. Po zakończonej elektroforezie żel można poddać srebrzeniu w celu uwidocznienia uzyskanych prążków. Proces barwienia DNA srebrem przebiega w kilku etapach. Pierwszy etap to utrwalanie polegające na odwodnieniu żelu, np. w roztworze etanolu. Następnie żel traktuje się kwas azotowym, który ma na celu utrwalenie obrazu prążków na żelu. Kwas azotowy zapobiega dyfuzji cząsteczek kwasów nukleinowych z żelu oraz pomaga w pozbyciu się i neutralizacji niepożądanych odczynników (np. mocznika czy buforu). Kolejny etap to właściwe barwienie srebrem, po którym następuje wywoływanie. Podczas wywoływania dochodzi do redukcji srebra za pomocą formaldehydu, a węglan sodu zapewnia odpowiednie środowisko reakcji. Związane z DNA zredukowane srebro przyjmuje brązowe zabarwienie, co pozwala na uwidocznienie badanych prążków. Ostatnim etapem jest zatrzymanie reakcji redukcji poprzez obniżenie ph, stosując np. kwas octowy. Tak wysrebrzone żele poddaje się dodatkowo suszeniu, co ułatwia ich przechowywanie. Procedurę srebrzenia żelu MDE zamieszczono poniżej: 1. Żele przenieść do kuwety z 10% etanolem umieszczonej na kołysce na 5 minut.

18 2. Po zlaniu etanolu wlać do kuwety 1% kwas azotowy na 3 minuty. 3. Przepłukać wodą dejonizowaną przez 1 minutę. 4. Żele umieścić w 0,012M azotanie srebra i płukać 20 minut w ciemności. 5. W międzyczasie przygotować 2 litry 0,28M węglanu sodu. 6. Żele przepłukać wodą dejonizowaną przez 1 minutę. 7. Żele zanurzyć w 0,5 litra węglanu sodu na kilka sekund (poczekać aż węglan zbrązowieje) 8. Do reszty węglanu dodać formalinę buforowaną 10% (2835μl na 1,5 litra węglanu sodu). 9. Żele płukać węglanem z formaliną (kilka razy wlewać około 0,5 litra węglanu, po czym zlewać, gdy się zaczerni i dodawać kolejną porcje, dopóki nie pojawią się prążki około 15 minut). 10. Reakcję zatrzymać 10% kwasem octowym 2 minuty. 11. Płukać w wodzie około 1 minutę. 12. Żele przenieść na przezroczysta folię np. spożywczą i i przykryć bibułą filtracyjną Whatmana. Żele suszyć w suszarce do żeli my używamy Gel Dryer (Biorad) podłączonej do pompy próżniowej (u nas jest Hydro Tech, Biorad) przez 45 minut w temperaturze 85 C. Real-Time PCR (IV): Pomiar względny i bezwzględny ilości

19 kopii Ilościowy PCR znajduje zastosowanie w różnych sytuacjach: pozwala oszacować ilość kopii matrycy, porównać kilka różnych próbek pod względem różnic w ilości kopii albo orzec o zmianie ilości cząsteczek matrycy w czasie. Pierwsze zastosowanie wymaga innej strategii postępowania niż dwa kolejne: możemy tu mówić o ilościowaniu bezwzględnym i względnym. Co wyróżnia oba podejścia i gdzie konkretnie maja zastosowanie? 1. Co decyduje o przyjętej formie pomiaru ilości kopii? Decyzja o sposobie pomiaru jest podyktowana zastosowaniem wykonywanego przez nas oznaczenia. Pomiar bezwzględnej liczby kopii jest stosowany w sytuacji, gdy zależy nam nie tylko na określeniu zmian w ilościach produktu np. w czasie kilku eksperymentów, czy też na wykazaniu różnic w ekspresji genu pomiędzy próbami, ale także na konkretnej, bezwzględnej wartości liczbowej. Jest to trudniejsze, gdyż wymagane jest wybranie standardów o ściśle określonej ilości kopii i bardzo zbliżonej kinetyce reakcji co próbka badana. Oznaczenia bezwzględne wykonywane są dlatego rzadziej, służą np. do: szacowania ilości mikroorganizmów w żywności, pomiaru ilości GMO w produktach spożywczych czy też poziomu wiremii w diagnostyce wirusologicznej. 2. Pomiar bezwzględnej ilości transkryptu Pomiar bezwzględny dokonywany jest przez porównanie wartości Ct próbki z krzywą kalibracyjną, wykreśloną na podstawie standardów o dokładnie znanym stężeniu. Nie jest wymagany żaden gen referencyjny, bo nie potrzebujemy obliczać poziomu ekspresji względem niczego, potrzebujemy określonej wartości liczbowej, zależnej tylko od zawartości żądanej matrycy w naszej próbce i od wielkości próbki pobranej do badania z większej całości (stosujemy więc konkretną jednostkę, np. kopie genomu na ml surowicy). W ilościowaniu GMO stosuje się bardziej zaawansowana strategię podobną raczej do względnego pomiaru ilości matrycy: wykonuje się 2 pomiary bezwzględne (jeden dla ilości markera GMO, drugi dla ilości genomów), po czym wyznacza się wartość procentową (genomy GMO/wszystkie genomy *100% lub wagowo: ilość gramów GMO na gram biomasy roślinnej).

20 3. Pomiar względnej ilości transkyptu Pomiar względny ilości kopii opiera się na założeniu, że informacja o zmianie stosunku ilościowego pomiędzy dwoma parametrami jest wystarczająca dla naszego eksperymentu. Tę strategię stosuje się podczas obserwacji zmian ekspresji w czasie, porównywania ekspresji pomiędzy próbami oraz np. przy pomiarze tzw. obciążenia mutacją i szacowaniu ilości kopii genu w genomie. Żeby przeprowadzić taki pomiar potrzebujemy próby odniesienia. Może nią być: -gen referencyjny o stałej ekspresji, tzw. housekeeping gene, czyli kontrola endogenna -sztucznie wprowadzona z zewnątrz cząsteczka kwasu nukleinowego (tzw. spike ), czyli kontrola egzogenna -indeks referencyjny będący średnią z kilku genów referencyjnych -średni poziom genu badanego, otrzymany przez uśrednienie wszystkich pomiarów dla genu badanego Ilościowanie prowadzone jest poprzez porównanie wartości Ct pomiędzy próbą badaną a naszą próbą odniesienia. Wartość jaką otrzymujemy nie posiada jednostki i informuje nas jaka jest ilość kopii amplikonu w odniesieniu do kalibratora. Można takie wartości ze sobą porównywać dzięki zastosowaniu pewnych wzorów matematycznych, np. po to aby: -porównać naszą próbkę z niestymulowana kontrolą -zobaczyć jak zmienia się ekspresja w czasie w stosunku do próbki zmierzonej w czasie T0 -zmierzyć różnice między zdrową populacją a stanami chorobowymi -porównywać wyniki pacjenta w kilku laboratoriach diagnostycznych. W kolejnej części cyklu zajmiemy się w szczegółach sposobami

21 normalizacji wyników Real-Time PCR. Nowy cykl: Jak ugryźć technikę FISH? Jak ugryźć technikę FISH? Planujesz rozpoczęcie badań metodą FISH i nie bardzo wiesz, jak się do tego zabrać? W krótkiej serii artykułów o technice FISH przekonamy Cię, że metoda ta nie jest wcale trudna i że dzięki naszym wskazówkom bez problemu zaprojektujesz eksperyment, przeprowadzisz hybrydyzację i będziesz się cieszyć doskonałej jakości zdjęciami. W serii tej opowiemy również o nowościach odczynnikowych, które ostatnio ukazały się na rynku i podpowiemy Wam jakie narzędzia bioinformatyczne ułatwią Wam pracę z tą techniką. Artykuły o technice FISH ukażą się w najbliższych dniach! Zobacz: Technika FISH od czego zacząć: Wygodna przeglądarka sond: ladarka-sond/

22 Innowacyjne sondy do FISH znakomita rozdzielczość i niska cena: dy-od-firmy-agilent-technologies/ Gruźlica w parze z cukrzycą Diabetycy są narażeni na pięciokrotnie większe ryzyko zachorowania na gruźlicę niż osoby niechorujące na cukrzycę. Podstawy do takiego wniosku dają wyniki badań przeprowadzonych niedawno przez zespół naukowców z University of Texas Health Science Center w Houston. W badaniu wzięło udział 61 pacjentów z południa Teksasu oraz 172 pacjentów z północno-wschodniego Meksyku. Uzyskane rezultaty wskazują na to, że 25% przypadków wystąpienia gruźlicy wykazywało związek z cukrzycą, a około 6% przypadków z HIV. Znaczenie wpływu cukrzycy na rozwój gruźlicy było zróżnicowane, zarówno pod względem regionalnym, jak i zależnie od badanej grupy etnicznej. Najbardziej zauważalna korelacja wystąpiła u Latynosów oraz dwóch głównych populacji o zwiększonym ryzyku wystąpienia obu chorób: Afroamerykanów i Indian [1]. Ujawniony związek przyczynowo-skutkowy sugeruje, że u pacjentów z gruźlicą powinno zostać przeprowadzone badanie w kierunku cukrzycy i vice versa.

23 Społeczeństwa wielu krajów mogłyby z pewnością skorzystać na zintegrowaniu programów profilaktyki i kontroli zachorowalności na tuberkulozę i przewlekłą hiperglikemię. Gruźlica jest chorobą zakaźną, wywoływaną przez Mycobacterium tuberculosis complex. Szacuje się, że jedna osoba prątkująca może w ciągu roku zarazić drogą kropelkową kilkanaście innych osób. Szczególne zagrożenie epidemiologiczne stanowi gruźlica wielolekooporna (ang. multi-drug-resistant tuberculosis, MDR- TB). Jej szczepy bakteryjne są oporne na najpowszechniej stosowane leki przeciwgruźlicze rifampicynę i izoniazyd co sprawia, że leczenie chorych na MDR-TB jest wyjątkowo trudne. Wśród przyczyn zagrożenia gruźlicą wymienia się czynniki globalne: migrację polityczną i ekonomiczną z krajów ubogich, szerzenie się pandemii HIV, rozwój turystyki masowej oraz czynniki regionalne, w tym między innymi lekceważenie zagrożenia gruźlicą w krajach o niskich wskaźnikach zapadalności na tę chorobę i umieralności z nią związanej, a także niekorzystne zmiany infrastruktury organizacyjnej, która służy walce z gruźlicą. Gruźlica co roku zbiera obfite żniwo, zabijając miliony osób na świecie. W 2009 roku zdiagnozowano ponad 9 milionów nowych zachorowań, a niemalże 2 miliony chorych zmarło z powodu tuberkulozy. Word Health Organization przypuszcza, że tak ogromny wzrost zachorowalności na gruźlicę może mieć związek z wciąż zwiększającą się liczbą cukrzyków, która w tej chwili wynosi 285 milionów. Według WHO do roku 2030 liczba ta może wzrosnąć do 438 milionów. *** Zainteresowanym skalą problemu gruźlicy na świecie polecamy najnowszy Raport WHO, obejmujący epidemiologię, prewencję, stosowane leczenie i jego rezultaty, organizowane programy profilaktyczne oraz różne inne statystyki dotyczące tej choroby.