(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 20/37 EP B1 (13) (1) T3 Int.Cl. C07K 19/00 ( ) C07K 14/71 ( ) C07K 16/28 ( ) A61K 38/17 ( ) (4) Tytuł wynalazku: Antagoniści interleukiny IL-17A i IL-17F oraz sposoby ich zastosowania (30) Pierwszeństwo: US P US P US P US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/2 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2011/03 (73) Uprawniony z patentu: ZymoGenetics, Inc., Seattle, US PL/EP T3 (72) Twórca(y) wynalazku: STEVEN D. LEVIN, Seattle, US MARK W. RIXON, Issaquah, US ZEREN GAO, Shanghai, CN (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska PATPOL PRZEDSIĘBIORSTWO RZECZNIKÓW PATENTOWYCH Sp. z o.o. ul. Nowoursynowska 162 J Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis Tło wynalazku [0001] Cytokiny są rozpuszczalnymi, niskocząsteczkowymi białkami, które pośredniczą w wywoływaniu różnorodnych efektów biologicznych obejmujących regulację wzrostu i różnicowanie się wielu typów komórek (patrz np. Arai i wsp., Annu. Rev. Biochem. 9:783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul i Seder, Cell 76:241 (1994)). Białka należące do grupy cytokin obejmują interleukiny, interferony, czynniki stymulujące wzrost kolonii, czynniki martwicy nowotworu oraz inne cząsteczki regulatorowe. Przykładowo, ludzka interleukina 17 jest cytokiną, która stymuluje ekspresję interleukiny 6, cząsteczki adhezji międzykomórowej 1, interleukiny 8, czynnika stymulującego wzrost kolonii granulocytów i makrofagów oraz ekspresję prostaglandyny E2, jak również odgrywa rolę w preferencyjnym dojrzewaniu hematopoetycznych cząsteczek prekursorowych CD34+ w kierunku neutrofili (Yao i wsp., J. Immunol. 1:483 (199); Fossiez i wsp., J Exp. Med. 183:293 (1996)). [0002] Receptory wiążące cytokiny zazwyczaj zbudowane są z jednego lub większej liczby białek błonowych, które z wysokim powinowactwem wiążą cytokinę i przekazują do komórki, poprzez część cytoplazmatyczną pewnych podjednostek receptora, sygnał wynikający z tego wiązania. Receptory cytokin zostały podzielone na kilka klas w oparciu o podobieństwa w obrębie ich zewnątrzkomórkowych domen wiążących ligand. [0003] Wykazywane przez cytokiny i ich receptory aktywności in vivo ilustrują ich potencjał kliniczny oraz zapotrzebowanie na inne cytokiny, receptory cytokin, agonistów oraz antagonistów cytokin. Przykładowo, przedstawione aktywności rodziny prozapalnych cytokin wskazują na ich ogromny potencjał kliniczny oraz zapotrzebowanie na antagonistów prozapalnych cząsteczek. Międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 200/0044 ujawnia przeciwciała i małe cząsteczki przeznaczone do hamowania IL-17A i IL-17F. Międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 200/06711 ujawnia chimeryczne receptory dla IL-17 oraz ligandy tych receptorów. Wspomniane zgłoszenie nie ujawnia natomiast rozpuszczalnego receptora dla IL-17C i IL-17F, który specyficznie wiąże się do IL-17A i IL-17F Krótki opis figur [0004] Figury 1A i 1B przedstawiają schematy graficzne struktury egzonu ludzkiego receptora IL-17RCx1 (SEKW. NR ID: 2). W przypadku aminokwasów, których kodon uległ splicingowi w wyniku połączenia egzon/intron, połączenie to zostało przesunięte tak, aby zawierało cały kodon. [000] Figury 2A i 2B przedstawiają schematy graficzne struktury egzonu ludzkiego receptora IL-17RCx4 (SEKW. NR ID: 166). [0006] Figura 3 przedstawia schemat graficzny struktury egzonu ludzkiego receptora IL-17RA (SEKW. NR ID: 21). [0007] Figury 4A i 4B przedstawiają schematy graficzne struktury egzonu korzystnego rozpuszczalnego polipeptydu według wynalazku opisanego w niniejszym dokumencie i w sekwencjach SEKW. NR ID: 17 i SEKW. NR ID: 18. Ten rozpuszczalny polipeptyd zawiera egzony zarówno ludzkiego receptora IL-17RA (SEKW. NR ID: 21) jak i ludzkiego receptora IL-17RCx1 (SEKW. NR ID: 2). [0008] Figura przedstawia schemat graficzny wyniku otrzymanego po przeprowadzeniu typowego testu z zastosowaniem protokołu opisanego w Przykładzie 34. Wykres wygenerowano wykorzystując oprogramowanie Prizm. Wartości na osi Y reprezentują wartości MFI znormalizowane do maksimum i minimum (0% i 0%) zmierzone względem dołków kontrolnych zawierających jedynie ligand oraz dołków 1

3 kontrolnych nie zawierających ani ligandu ani rozpuszczalnego receptora, tym samym pokazując procent wiązania ligandu do komórek. Wartość IC0 dla każdej krzywej wyliczana jest przez oprogramowanie Szczegółowy opis wynalazku [0009] Niniejszy wynalazek jest odpowiedzią na opisane zapotrzebowanie dostarczając antagonistów prozapalnych cytokin IL-17A i IL-17F. W szczególności prozapalne cytokiny IL-17A i IL-17F charakteryzują się wysokim stopniem podobieństwa w obrębie sekwencji, posiadają wiele wspólnych właściwości biologicznych i obie wytwarzane są przez aktywowane limfocyty T. Obie cytokiny były zaangażowane jako czynniki przyczyniające się do rozwoju różnorakich chorób autoimmunologicznych oraz chorób o podłożu zapalnym, włączając w to reumatoidalne zapalenie stawów i astmę. W rzeczywistości czynniki, które niwelują działanie IL-17A w znaczącym stopniu obniżają częstotliwość występowania choroby oraz łagodzą ciężkość przebiegu choroby w przypadku kilku mysich modeli choroby występującej u człowieka. Skutki działania IL-17A są efektem oddziaływania tej cytokiny z jej specyficznym receptorem - receptorem dla IL-17 (IL-17R), jednak w przypadku IL-17F receptor dla tej cytokiny nie został jeszcze odkryty. Wcześniej przekazaliśmy informacje o tym, że IL-17RC stanowi receptor zarówno dla IL-17A jak i IL-17F oraz wiąże obie te cytokiny z podobnym, wysokim powinowactwem. Zgodnie z powyższym wykazano, że rozpuszczalna forma IL-17R blokuje wiązanie IL-17A oraz przekazywanie sygnału w komórkach wyrażających ten receptor, natomiast nie wpływa na wiązanie i działanie IL-17F względem IL-17RC. [00] Ponieważ ingerencja w działanie IL-17A została zaproponowana jako skuteczna terapia w przypadku kilku autoimmunologicznych chorób, zastosowanie antagonistów według wynalazku, którzy mogą blokować, hamować, obniżać, działać jako antagoniści lub neutralizować aktywność zarówno IL-17A jak i IL-17F, będzie miało przewagę nad terapiami, których działanie nakierowane jest jedynie na jedną z tych dwóch cytokin. Dalej niniejszy wynalazek dostarcza ich zastosowania w przypadkach chorób zapalnych, jak również odnoszących się do tego zastosowania kompozycji i sposobów. A) Omówienie [0011] Choroby o podłożu immunologicznym oraz zapalnym są objawem lub skutkiem działania dość skomplikowanych, często połączonych wzajemnie na wiele różnych sposobów szlaków biologicznych, które w normalnych warunkach fizjologicznych mają istotne znaczenie w przypadkach urazów lub obrażeń, inicjują procesy naprawcze w przypadkach urazów i orażeń oraz podnoszą poziom ochrony przeciwko obcym organizmom zależny od wrodzonej i nabytej odporności. Choroby lub stany patologiczne pojawiają się, kiedy te normalne szlaki fizjologiczne powodują wystąpienie dodatkowych urazów lub obrażeń, zarówno w sposób bezpośrednio związany z intensywnością tej odpowiedzi, będący wynikiem nieprawidłowej regulacji lub nadmiernej stymulacji reakcji układu odpornościowego na własne antygeny lub w wyniku kombinacji wymienionych dróg. [0012] Choć w genezę tych chorób zaangażowane są często wieloetapowe szlaki i wiele różnych systemów/szlaków biologicznych, to ingerencja w krytycznych punktach na jednym lub większej liczbie tych szlaków może mieć łagodzący lub terapeutyczny skutek. Ingerencja o działaniu terapeutycznym może polegać na wykorzystaniu zjawiska antagonizmu w przypadku szkodliwego procesu/szlaku lub na stymulacji korzystnego procesu/szlaku. [0013] Znanych jest wiele chorób o podłożu immunologicznym i były one szeroko badane. Do takich chorób zalicza się stany zapalne o podłożu immunologicznym (takie jak reumatoidalne zapalenie stawów, choroba 2

4 nerek o podłożu immunologicznym, choroby wątroby i dróg żółciowych, nieswoiste zapalenie jelit (IBD), łuszczyca, i astma), stany zapalne nie posiadające podłoża immunologicznego, choroby zakaźne, niedobory odporności, neoplazja itp. [0014] Limfocyty T (ang. T lymphocytes/t cells) są ważnym elementem odpowiedzi immunologicznej u ssaków. Limfocyty T rozpoznają antygeny związane z własną cząsteczką (obecną w organizmie gospodarza) kodowaną przez geny głównego układu zgodności tkankowej (MHC). Antygen może być prezentowany razem z cząsteczkami MHC na powierzchni komórek prezentujących antygen, komórek zakażonych wirusem, komórek nowotworowych, przeszczepów, itp. Limfocyty T eliminują te zmienione komórki, które stanowią zagrożenie dla zdrowia będącego ssakiem gospodarza. Grupa limfocytów T obejmuje pomocnicze limfocyty T i cytotoksyczne limfocyty T. Pomocnicze limfocyty T intensywnie proliferują w następstwie rozpoznania kompleksu antygen-mhc na powierzchni komórki prezentującej antygen. Pomocnicze limfocyty T wydzielają również wiele cytokin, tj. limfokiny, które odgrywają główną rolę w aktywacji limfocytów B, cytotoksycznych limfocytów T i wielu innych komórek biorących udział w odpowiedzi immunologicznej. [001] Kluczowym etapem w przypadku, zarówno humoralnych jak i komórkowych, odpowiedzi immunologicznych jest aktywacja i ekspansja klonalna pomocniczych limfocytów T. Do aktywacji pomocniczego limfocytu T dochodzi w wyniku interakcji kompleksu receptora dla limfocytów T (TCR) z CD3 z kompleksem antygen-mhc na powierzchni komórki prezentującej antygen. W wyniku tego oddziaływania dochodzi do aktywacji kaskady reakcji biochemicznych, które indukują u spoczynkowego pomocniczego limfocytu T wejście w fazę cyklu komórkowego (przejście z fazy G0 do G1), co skutkuje ekspresją charakteryzującego się wysokim powinowactwem receptora dla IL-2 i niekiedy dla IL-4. Aktywowane limfocyty T przechodzą przez cykl proliferując i różnicując się do komórek pamięci lub komórek efektorowych. [0016] Oprócz sygnałów przekazywanych za pośrednictwem TCR, aktywacja limfocytów T obejmuje dodatkową kostymulację indukowaną przez cytokiny uwalniane przez komórkę prezentującą antygen lub w wyniku interakcji z cząsteczkami związanymi z błoną komórki prezentującej antygen i limfocytu T. Wykazano, że cytokiny IL-1 oraz IL-6 wywołują sygnał kostymulacji. Ponadto oddziaływanie pomiędzy cząsteczką B7, wyrażaną na powierzchni komórki prezentującej antygen oraz cząsteczkami CD28 i CTLA-4 wyrażanymi na powierzchni limfocytu T prowadzi do aktywacji limfocytu T. Aktywowane limfocyty T wyrażają zwiększoną liczbę cząsteczek adhezyjnych, takich jak ICAM-1, integryny, VLA-4, LFA-1, CD6 itd. [0017] Proliferacja limfocytu T w mieszanej hodowli limfocytów lub mieszana reakcja leukocytarna (MLR) jest przyjętym wskazaniem zdolności związku do stymulacji układu odpornościowego. W przypadku wielu odpowiedzi immunologicznych dochodzi do nacieku komórek zapalnych w miejscu rany lub zakażenia. Tymi migrującymi komórkami mogą być neutrofile, eozynofile, monocyty lub limfocyty, co można ustalić na podstawie badania histologicznego chorych tkanek. Current Protocols in Immunology, ed. John E. coligan, 1994, John Wiley & Sons, Inc. [0018] Leczenie chorób o podłożu immunologicznym może polegać na zahamowaniu odpowiedzi immunologicznej. Zastosowanie rozpuszczalnych receptorów i/lub przeciwciał neutralizujących, które hamują cząsteczki o aktywności stymulującej układ odpornościowy, byłoby korzystne w leczeniu chorób o podłożu immunologicznym oraz chorób zapalnych. Cząsteczki hamujące odpowiedź immunologiczną (bezpośrednio stosowane białka lub agoniści przeciwciała) mogą być zastosowane do zahamowania odpowiedzi immunologicznej, a tym samym do łagodzenia przebiegu chorób o podłożu immunologicznym. 3

5 [0019] Interleukina 17 (IL-17A) została zidentyfikowana jako obecny w komórce ortolog białka kodowanego przez T-limfotropowego wirusa Herpes Saimiri (HSV) [patrz: Rouvier i wsp., J. Immunol, (12).: (19993); Yao i wsp., J. Immunol., 122(12): (199) i Yao i wsp., Immunity, 3(6): (199)]. Dalsza charakterystyka wykazała, że białko to jest silną cytokiną, która wywołuje indukcję odpowiedzi prozapalnych w wielu różnych tkankach obwodowych. IL-17A jest cytokiną o masie 32 kda będącą homodimerem o podjednostkach połączonych mostkami dwusiarczkowymi. Jest ona syntezowana i wydzielana jedynie przez aktywowane limfocyty T pamięci CD4+ (praca przeglądowa: Fossiez i wsp., Int. Rev. Immunol., 16: 41-1 [1998]). W szczególności IL-17 syntezowana jest jako polipeptyd prekursorowy zbudowany z 1 aminokwasów i zawierający na N-końcu sekwencję sygnałową złożoną z reszt. Ten prekursorowy polipeptyd wydzielany jest w postaci glikoproteiny, która jest homodimerem zawierającym mostki dwusiarczkowe. Il-17A ujawniono w WO (199), WO (1997) i WO (1997), jak również w patencie US nr [0020] IL-17A, pomimo swojej ograniczonej dystrybucji w tkankach, wykazuje plejotropowe aktywności biologiczne względem różnych typów komórek. Wykazano, że IL-17A stymuluje wytwarzanie wielu cytokin. Indukuje wydzielanie IL-6, IL-8, IL-12, czynnika hamującego białaczkę (LIF), prostaglandyny E2, MCP-1 i G- CSF przez komórki adherentne, takie jak fibroblasty, keratynocyty, komórki śródbłonka i nabłonka. IL-17A posiada również zdolność do indukowania ekspresji na powierzchni cząsteczki ICAM-1, proliferacji limfocytów T oraz wzrostu i różnicowania się ludzkich komórek progenitorowych CD34+ do neutrofilów. IL- 17A jest również zaangażowana w metabolizm kości. Sugerowano jej istotną rolę w stanach chorobowych charakteryzujących się obecnością aktywowanych limfocytów T i wytwarzaniem TNF-α, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów i rozluźnienie implantów kości (Van Bezooijen i wsp., J. Bone Miner. Res. 14: [1999]). Okazało się, że aktywowane limfocyty T obecne w maziówce pochodzącej od pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów wydzielają większe ilości IL-17A niż limfocyty T pochodzące od osób zdrowych lub pacjentów z zapaleniem kości i stawów (Chabaud i wsp., Rheum stawów. 42: [1999]). Sugerowano, że ta prozapalna cytokina w aktywny sposób przyczynia się do zapalenia maziówki w reumatoidalnym zapaleniu stawów. Oprócz tego, że IL-17A pełni rolę czynnika prozapalnego, wydaje się, że działając na drodze jeszcze innego mechanizmu, odgrywa ona również rolę w patologii reumatoidalnego zapalenia stawów. Wykazano na przykład, że IL-17A indukuje ekspresję mrna kodującego czynnik różnicowania osteoklastów (ODF) w osteoblastach (Kotake i wsp., J. Clin. Invest., 3: [1999]). ODF stymuluje różnicowanie się komórek progenitorowych do osteoklastów - komórek biorących udział w procesie resorpcji kości. [0021] Ponieważ poziom IL-17A jest znacznie zwiększony w płynie maziowym pacjentów chorych na reumatoidalne zapalenie stawów, wydaje się, że tworzenie się osteoklastów indukowane działaniem IL-17A odgrywa kluczową rolę w resorpcji kości w reumatoidalnym zapaleniu stawów. Sądzi się, że IL-17A odgrywa również kluczową rolę w niektórych innych zaburzeniach autoimmunologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane (Matusevicius i wsp., Mult. Scler., : 1-4 [1999]). Dalej wykazano, że IL-17A, poprzez przekazywanie sygnału wewnątrzkomórkowego, stymuluje dopływ jonów Ca 2+ i zmniejszenie poziomu [camp] w ludzkich makrofagach (Jovanovic i wsp., J. Immunol., 160:313 [1998]). Fibroblasty traktowane IL- 17A indukują aktywację NF-κB [Yao i wsp., Immunity, 3:811 (199), Jovanovic i wsp., supra], natomiast makrofagi pod wpływem IL-17A aktywują NF-κB oraz aktywowane mitogenami kinazy białkowe (Shalom- Barków i wsp., J. Biol. Chem., 273:27467 [1998]). 4

6 [0022] Ponadto, IL-17A posiada sekwencje podobną do sekwencji podobnego do ssaczej cytokiny czynnika 7, który zaangażowany jest we wzrost kości i chrząstki. Innymi białkami, których sekwencja podobna jest do sekwencji polipeptydów IL-17A są z interleukiną ludzki czynnik pochodzenia embrionalnego (EDIRF) oraz interleukina 20. [0023] Okazało się, że obecny na powierzchni komórek receptor dla IL-7A jest powszechnie wyrażany w wielu tkankach i typach komórek, co jest zgodne z szerokim zakresem efektów wywoływanych przez IL17A (Yao i wsp., Cytokin, 9:794 [1997]). Mimo iż sekwencja aminokwasowa ludzkiego receptora dla IL-17A (hil- 17R) (866 aminokwasów) pozwala przewidzieć strukturę białka z pojedynczą domeną transbłonową i długą, obejmującą 2 aminokwasów domeną wewnątrzkomórkową, to sekwencja odpowiadająca części receptorowej jest unikatowa i nie jest podobna do żadnej z sekwencji receptorów należących do rodziny receptorów dla cytokin/czynników wzrostu. Fakt ten, w połączeniu z brakiem podobieństwa IL-17A do innych znanych białek wskazuje, że IL-17A i jej receptor mogą należeć do nowej rodziny białek sygnałowych i receptorów. Wykazano, że w aktywność IL-17A wynika z tego, że wiąże się ona z unikatowym receptorem obecnym na powierzchni komórki, a wcześniejsze badania pokazały, że oddziaływanie limfocytów T z rozpuszczalną formą polipeptydowego receptora dla IL-17A hamuje proliferację limfocytów T i wytwarzanie IL-2 indukowane przez PHA, konkanawalinę A i monoklonalne przeciwciało skierowane przeciwko TCR (Yao i wsp., J. Immunol., 1: [199]). W związku z tym mamy do czynienia ze znacznym zainteresowaniem dotyczącym identyfikacji i charakterystyki nowych polipeptydów wykazujących homologię do znanych receptorów dla cytokin, szczególnie receptorów dla IL-17A. [0024] Profil ekspresji IL-17F wydaje się być podobny do profilu charakterystycznego dla IL-17A, tak, że obejmuje on jedynie aktywowane limfocyty T CD4+ oraz monocyty. (Starnes i wsp., J. Immunol. 167: [2001]). Wykazano, że IL-17F aktywuje G-CSF, IL-6 i IL-8 w fibroblastach (Hymowitz, EMBO J. 20: [2001]) i TGF-β w komórkach śródbłonka (Starnes i wsp., J. Immunol. 167: [2001]). Ostatnio ukazała się informacja o tym, że IL-23, cytokina wytwarzana przez komórki dendrytyczne, może pośredniczyć w wytwarzaniu zarówno IL-17A jak i IL-17F przede wszystkim w limfocytach T pamięci (Aggarwal i wsp., J. Biol. Chem. 278: [2003]). [002] Ponadto, nadekspresję lub podwyższoną aktywację zarówno IL-17A jak i IL-17F wykazano u osób chorych na zapalenia stawów i astmę (praca przeglądowa: Moseley i wsp.,cytokinegrowth Factor Rev 14:1-174 [2003]). W odniesieniu do zapalenia stawów, cytokiny te działają w sposób charakterystyczny dla procesu niszczenia chrząstki i stawów, który związany jest z reumatoidalnym zapaleniem stawów i zapaleniem kości i stawów. Na przykład wykazano, że IL-117A i IL-17F zwiększają degradację macierzy w przypadku przeszczepów chrząstki stawowej poprzez uwalnianie obecnych w chrząstce proteoglikanów, glikozoaminoglikanów oraz fragmentów kolagenu, hamując jednocześnie syntezę nowych cząsteczek proteoglikanu i kolagenu (Cai i wsp.,cytokine 16:-21 [2001]; Attur i wsp Arthritis Rheum 44: [2001]). [0026] W sposób podobny do IL-17A, wykazano, że nadekspresja IL-17F również powoduje zwiększenie rekrutacji neutrofili do płuc i powoduje zwiększoną ekspresję w płucach cytokin wydzielanych przez limfocyty T (Th1), w tym IL-6, IFN-γ, IP- i MIG (Starnes i wsp.,j. Immunol. 167: [2001]). IL-17F wykazywała zwiększony poziom ekspresji w limfocytach T pochodzących od astmatyków poddanych działaniu alergenu (Kawaguchi i wsp., Immunol J. 167: [2001]). Stwierdzono ponadto, że indukuje ona wytwarzanie IL-6 i IL-8 w komórkach NHBE. W przeciwieństwie do IL-17A, wydaje się, że IL-17F hamuje angiogenezę in vitro (Starnes i wsp., J. Immunol. 167: [2001]).

7 [0027] mrna dla IL-7F nie wyrywano przy użyciu techniki Nothern-blot w różnych ludzkich tkankach, natomiast obserwowano gwałtowny wzrost jego poziomu w wyniku aktywacji limfocytów T CD4 + oraz monocytów, Id. Wykazano, że w wyniku aktywacji limfocyty Th2 oraz komórki tuczne myszy wyrażają IL-17F. Patrz: Dumont, Expert Opin. Ther. Patents 13(3) (2003). Podobnie jak w przypadku IL-17A, wykazano, że ekspresja IL-17F u myszy jest również podwyższane przez IL-23. [0028] Rodziny cytokin IL-17/receptorów dla IL-17 wydają się stanowić unikalny system przekazywania sygnału w obrębie sieci cytokin, który będzie źródłem innowacyjnych rozwiązań nakierowanych na manipulację odpowiedziami immunologicznymi i zapalnymi. W związku z powyższym, niniejszy wynalazek oparty jest na odkryciu nowego receptora dla rodziny cytokin IL-17 - receptora IL-17RC oraz jego zdolności do wiązania zarówno IL-17A jak i IL-17F. [0029] IL-17RC był początkowo identyfikowany za pomocą metod bioinformatycznych służących do przeszukiwania białek spokrewnionych z IL-17RA oraz identyfikując cdna kodujące białko spokrewnione z receptorem dla IL-17 - IL-17RC. Pomimo oczywistego podobieństwa do receptora dla IL-17 (IL-17RA), który wiąże się z prototypowym członkiem rodziny cytokin IL-17 - cytokiną IL-17A oraz identyfikacji pięciu innych członków rodziny cytokin IL-17, żadne z wcześniejszych doniesień nie zawierało informacji na temat specyficznego ligandu dla IL-17RC. Jednakże, IL-17A i IL-17F zostały zidentyfikowane jako specyficzne ligandy dla IL-17RC, co opisano w zgłoszeniu patentowym US nr 11/33, zgłoszonym w dniu czerwca 200 i opublikowanym jako publikacja patentowa US nr W szczególności ligandy te zidentyfikowano wykorzystując komórki nerek nowonarodzonych chomików (BHK), które stabilnie transfekowano konstruktami kodującymi albo ludzki IL-17RA (hil-17ra) albo IL-17RC (hil-17rc). Ekspresję receptorów na powierzchni potwierdzano za pomocą analizy FACS wykorzystując w tym celu monoklonalne przeciwciało dla hil-17ra lub surowicę poliklonalną dla hil-17rc. W celu oceny wiązania cytokin, do detekcji wiązania cytokin do transfekowanych komórek przy pomocy cytometrii przepływowej wykorzystano biotynylowane formy ludzkiej IL-17A, C, D, E i F oraz skoniugowaną z fluorochromem streptawidynę. Wyniki wyraźnie pokazały, że tak jak oczekiwano stabilnie transfekowane komórki BHK wyrażające hil-17ra wiążą ludzką IL-17A (hil-17a), podczas gdy komórki transfekowane pustym wektorem ekspresyjnym nie były zdolne do wiązania żadnego z testowanych członków rodziny cytokin IL-17. Obserwowano również stosunkowo słabe wiązanie ludzkiej IL-17F (hil-17f) do komórek transfekowanych hil-17ra. Znaczącego wiązania nie stwierdzono jednak w przypadku pozostałych białek należących do rodziny cytokin IL-17. W przypadku innych członków rodziny cytokin IL-17 badano ich wiązanie do komórek transfekowanych hil- 17RC i stwierdzono, że komórki te wykazywały znaczące wiązanie do hil-17f. Ponadto, obserwowano znaczące wiązanie hil-17a do tych komórek oraz brak wiązania w przypadku hil-17c, D lub E. Dane te dowiodły, że hil-17rc był receptorem zarówno dla hil-17f jak i hil-17a. [0030] Dodatkowo, w celu określenia względnego powinowactwa hil-17a i F względem receptorów hil- 17RA i hil-17rc badano poziom fluorescencji dla zakresu obejmującego różne stężenia cytokin. Porównując średnie intensywności fluorescencji dla poszczególnych cytokin w przypadku każdego transfektantu komórki, zauważono, że hil-17a wiąże się do hil-17ra o wiele lepiej niż hil-17f. Obie cytokiny wykazywały natomiast podobne wiązanie do komórek transfekowanych hil-17rc. Co ciekawe, wiązanie cytokin do komórek wyrażających oba receptory wydawało się mieć charakter działania addytywnego i nie wykazywało żadnych oznak wskazujących na kooperację. [0031] Następnie specyfikę tego wiązania badano przy użyciu testów kompetycyjnych z zastosowaniem niewyznakowanych cytokin. Transfekowane komórki BHK inkubowano z biotynylowanymi cytokinami o 6

8 1 20 stałym stężeniu oraz z nieznakowaną cytokiną obecną w różnych, wzrastających stężeniach. Ilość związanych biotynylowanych cząsteczek była oznaczana przy pomocy analizy FACS. Wykazano, że wiązanie zarówno hil-17a jak i F do hil-17rc było specyficzne, ponieważ zwiększające się stężenia niewyznakowanych cytokin wpływały na wiązanie biotynylowanych cząsteczek. W rzeczywistości, niewyznakowane cytokiny hil F-17A i F skutecznie konkurowały z biotynylowanymi formami obu cytokin o miejsca wiążące obecnego na powierzchni transfekowanych komórek receptora hil-17rc. Sugeruje to, że obie cytokiny były wiązane z podobnym powinowactwem przez hil-17rc oraz, że wiązały się one do wspólnych, jeśli nie identycznych miejsc wiążących. Również niewyznakowana hil-17a skutecznie konkurowała o wiązanie biotynylowanych form hil-17a i F do komórek transfekowanych hil-17ra, podczas gdy niewyznakowana hil-17f nie wykazywała istotnej zdolności do konkurowania z hil-17a o miejsce wiążące receptora hil-17ra. To pokazało, że mimo iż hil-17f wykazywała specyficzne wiązanie do hil- 17RA, awidność tego oddziaływania wydaje się być znacznie niższa niż w przypadku oddziaływania pomiędzy hil-17a i hil-17ra. [0032] Badania wiązania w warunkach wysycenia receptorów przeprowadzono w celu pomiaru powinowactwa wiązania hil-17a i F do receptorów hil-17rc i hil-17ra. Linie komórek BHK stabilnie wyrażające hil-17ra lub hil-17rc inkubowano w warunkach wysycenia receptorów z wyznakowaną jodem hil-17a lub F w celu wyznaczenia stałych powinowactwa dla każdej cytokiny względem każdego z badanych receptorów. hil-17a wiązała z porównywalnym powinowactwem zarówno hil-17ra jak i hil- 17RC (Tabela 1). W szczególności, w celu ustalenia wartości K d dla hil-17 i hil-17f, wykorzystano komórki BHK transfekowane wskazanym receptorem, jak opisano w Metodach. Wyniki przedstawiono jako średnie wartości K d wyznaczone w pomiarach przeprowadzonych dla trzech powtórzeń. Tabela 1 hil-17a hil-17f hil-17rc (x1) 1 0,6 nm 1,0 nm hil-17ra 1,9 nm 1, M 1 odnosi się do splicingowego wariantu x1 receptora hil-17rc [0033] Ponadto, powinowactwo hil-17f do hil-17rc było bardzo podobne do powinowactwa hil-17a względem tego samego receptora (patrz Tabela 1 powyżej). Jednak zgodnie z wynikami uzyskanymi w testach z użyciem biotynylowanych cytokin, powinowactwo hil-17f względem hil-17ra było około 00- krotnie niższe w porównaniu do innych zmierzonych wartości powinowactwa (Id.). Oznacza to, że hil-17a i F wiążą hil-17rc z podobnym powinowactwem, natomiast cytokiny te w dużym stopniu różnią się pod względem ich powinowactwa do hil-17ra. [0034] Obserwacja tego, że hil-17rc z wysokim powinowactwem wiązał zarówno hil-17a jak i F sugeruje, że komórki wyrażające hil-17rc powinny być w sposób identyczny zdolne do odpowiedzi na działanie hil- 17A i F. Z drugiej strony, skoro hil-17ra z wysokim powinowactwem wiązał hil-17a, natomiast powinowactwo to było 00-krotnie mniejsze w przypadku hil-17f, co oznacza, że w warunkach fizjologicznych komórki wyrażające hil-17ra odpowiadałyby jedynie na działanie hil-17a. Wcześniej wykazano, że hil-17ra jest powszechnie wyrażaną cytokiną, przy czym w porównaniu z innymi tkankami jej ekspresja była wyższa w przypadku komórek krwiotwórczych. W związku z tym badano ekspresję hil-17rc w celu określenia stopnia pokrywania się profilów ekspresji. Przy użyciu techniki Northern-blot zidentyfikowano wysoki poziom ekspresji hil-17rc tkankach gruczołowych, takich jak gruczoł nadnercza, prostaty, wątroby i tarczycy, natomiast nie zidentyfikowano ekspresji hil-17rc w tkankach krwiotwórczych. 7

9 [003] W celu dalszego zbadania ekspresji tych receptorów w komórkach krwiotwórczych zbadano również wiązanie biotynylowanej hil-17a i F do komórek krwi obwodowej (PBMC), wykorzystując wieloparametryczną analizę FACS. Wyniki wskazywały na to, że hil-17a wiąże się do niemal wszystkich podgrup badanych PBMC, w przeciwieństwie do hil-17f, która nie wykazywała wiązania do żadnej z populacji tych komórek. Jest to zgodne z obserwowaną zdolnością receptora hil-17ra do wiązania z wysokim powinowactwem hil-17a, natomiast brakiem jego zdolności do wiązania hil-17f oraz z faktem wykrycia obecności mrna dla hil-17rc w PBMC. Podsumowując, z otrzymanych danych wynika, że IL- 17RC jest preferencyjnie wyrażana w tkankach innych niż tkanki krwiotwórcze, natomiast IL-17RA jest preferencyjnie wyrażana w komórkach krwiotwórczych. [0036] Wysokie powinowactwo wiązania hil-17a i F do komórek transfekowanych hil-17rc sugeruje, że rozpuszczalna forma hil-17rc może być skutecznym terapeutykiem. Taka cząsteczka byłaby skutecznym antagonistą tych dwóch cytokin. W celu sprawdzenia tego w sposób bezpośredni, otrzymano rozpuszczalną formę ludzkiej hil-17rc w formie białka fuzyjnego z fragmentem Fc i przetestowano jej zdolność do hamowania wiązania zarówno hil-17a jak i F. Otrzymane wyniki zostały następnie porównane z wynikami dla rozpuszczalnej formy hil-17ra. Reakcje wiązania prowadzono testując zwiększające się stężenia hil- 17RC-Ig lub hil-17ra-ig, a do oceny efektów działania rozpuszczalnych receptorów na wiązanie biotynylowanych cytokin do stabilnie transfekowanych komórek BHK wykorzystano analizę FACS. Rozpuszczalny hil-17rc w podobnym stopniu hamował wiązanie zarówno hil-17a jak i F, podczas gdy efektu tego nie obserwowano dla białka fuzyjnego z fragmentem Fc innego członka rodziny IL-17R - receptora hil-17rd. Z drugiej strony, rozpuszczalny hil-17ra skutecznie blokował wiązanie hil-17a, lecz w zasadzie w żaden sposób nie wpływał na wiązanie hil-17f. Podobne wyniki uzyskano podczas badania wiązania hil-17a do komórek krwiotwórczych. Wiązanie to było skutecznie blokowane, kiedy stosowano hil- 17RA-Ig i hil-17rc-ig, natomiast nie w przypadku, gdy użyto hil-17rd-ig. Dane te są zgodne z wynikami uzyskanymi w testach pomiaru powinowactwa i wskazują na to, że rozpuszczalne receptory zachowują się tak samo jak ich zakotwiczone w błonie formy. [0037] W celu dodatkowej oceny zdolności ludzkiego hil-17rc-ig do wiązania hil-17a oraz F, określono powinowactwo rozpuszczalnego receptora dla tych cytokin przy użyciu analizy przy pomocy aparatu Biacore. Rozpuszczalny hil-17rc z wysokim powinowactwem wiązał zarówno hil-17a jak i F (Tabela 2), co stanowiło dodatkowe wsparcie dla pomysłu dotyczącego zastosowania tego czynnika jako antagonisty działania zarówno hil-17a jak i F in vivo. W szczególności, rozpuszczalne receptory immobilizowano na płytce biosensora i przeprowadzono doświadczenia na wiązanie według procedury opisanej poniżej: ND = niewykrywalne wiązanie Tabela 2 hil-17rc-ig mil17a mil17f k a (stała szybkości asocjacji) k d (stała szybkości dysocjacji) hil17a 1,0E+06 4,90E-04 0,469nM ND ND 1,24E+06 4,38E-04 0,32nM hil17f 9,91 E+0 4,31 E-04 0,43nM 1,11E+06 3,84E-04 0,346nM K D 8

10 ml-17ra-ig k a (stała szybkości asocjacji) EP B1 k d (stała szybkości dysocjacji) mil17a 9,78E+0 6,79E-0 0,069nM mil17f 1,12E+06 7,99E-0 0,072nM ND K D [0038] Liczba wariantów splicingowych u ludzi jest o wiele większa i dlatego też nasze wstępne doświadczenia przeprowadziliśmy jedynie dla pewnej grupy tych cząsteczek. Cząsteczki wybrane do tej analizy różniły się również obecnością włączenia lub wyłączenia egzonu 7, ale w odróżnieniu od myszy, wszystkie warianty splicingowe zawierały egzon 8. Ukryty akceptor (ang. cryptic splice acceptor), znajdujący się w środku sekwencji mysiego egzonu 8, nie jest obecny w ludzkim egzonie 8. Jednakże inne testowane warianty splicingowe posiadały również włączony lub wyłączony egzon 12 hil-17rc. Warianty te zostały oznaczone jako hil-17rcx1 (identyczne pod względem składu egzonów z mysim wariantem x1, patrz powyżej), hil-17rcx4 (identyczne pod względem składu egzonów z mysim wariantem x4, patrz powyżej), hil-17rcx2 oraz hil-17rcx7. Ponownie te warianty splicingowe były przejściowo wyrażane w komórkach 293F i badane pod kątem ich zdolności do wiązania biotynylowanych mysich i ludzkich cytokin IL-17A i F, a otrzymane wyniki przedstawiono w Tabeli 3. Tabela Egzony 1 Wiązanie cytokin 2 Wariant hil-17a hil-17f mil-17a mil-17f Ludzki IL-17RCx IL-17RCx IL-17RCx IL-17RCx Odnosi się do kompletnego repertuaru egzonów w transkrypcie. 2 (+) oznacza wykrywalne, istotne wiązanie cytokiny, co oceniono na podstawie znacznego wzrostu poziomu fluorescencji w analizie FACS. (-) Wskazuje na brak istotnych zmian fluorescencji. [0039] Zgodnie z wynikami doświadczeń prezentowanych wcześniej, hil-17rcx1 wiąże się zarówno do hil- 17A jak i F, natomiast nie wiąże się do żadnej z mysich form cytokin. hil-17rcx4 również wiąże obie ludzkie cytokiny, i podobnie jak jej mysi odpowiednik, wiąże mil-17f, ale nie mil-17a. Receptory hil-17rcx2 i x7 nie wiążą żadnej z czterech badanych cytokin, mimo iż wyraźnie wykazano, stosując poliklonalną surowicę skierowaną przeciwko hil-17rc do analizy komórek CD8 +, że są one wyrażane na powierzchni transfekowanych komórek (danych nie przedstawiono). Otrzymane wyniki wiązania powtórzyły się także w testach z użyciem stabilnie transfekowanych komórek BHK. Podsumowując, dane te stanowią podstawę dla wniosków dotyczących niezbędnych regionów białka IL-17RC wymaganych do wiązania ludzkich cytokin. [0040] Liczne publikacje wykazywały wpływ IL-17A oraz, w mniejszym stopniu, IL-17F na postęp i cięzki przebieg choroby w przypadku indukowanego kolagenem zapalenia stawów u myszy (CIA) i reumatoidalnego zapalenia stawów u ludzi. Badano ekspresję zarówno mil-17a jak i F w stawach oraz w drenujących węzłach chłonnych (DLN) myszy, które immunizowano kolagenem w celu wywołania CIA. Analiza przeprowadzona przy pomocy techniki PCR w czasie rzeczywistym jednoznacznie wykazała, że w porównaniu do nieimmunizowanych myszy z grupy kontrolnej, wyższą ekspresję obu cytokin obserwuje się 9

11 w tkankach chorych myszy, co wyraźnie wskazuje na korelację ekspresji tych cytokin z chorobą. Ponadto, w tych samych tkankach badano również względny poziom ekspresji mil-17ra i mil-17rc. W tym przypadku jednak nie stwierdzono powtarzalnej korelacji pomiędzy poziomem ekspresji każdego z receptorów a chorobą. Ponadto, oczywistym wynikiem była rozbieżność dotycząca poziomu ekspresji charakterystycznego dla DLN w porównaniu do tkanek niekrwiotwórczych (np.: ang. hind foot). Zgodnie z poprzednimi wynikami, biorąc pod uwagę ekspresję ludzkich receptorów, obserwowano wyższą ekspresję receptora mil-17ra w tkankach krwiotwórczych oraz wyższą ekspresję mil-17rc w tkankach innych niż tkanki krwiotwórcze. Dane te sugerują, że istnieje korelacja pomiędzy ekspresją mil-17a i mil-17f a chorobą oraz to, że oba niezbędne receptory obecne są w chorych i zdrowych tkankach, co sugeruje, że neutralizacja tych cytokin może stanowić skuteczną terapię zapobiegającą progresji choroby. [0041] Zgodnie z tym, wykazano, że specyficznym receptorem dla IL-17A i F okazał się być receptor IL- 17RC. Warto zauważyć, że hil-17rc wiąże hil-17a i F z podobnym powinowactwem. Ponieważ tych dwoje członków rodziny cytokin IL-17 posiada sekwencje identyczne w %, nie dziwi więc fakt że cytokiny te posiadają również wspólne receptory. Jednak hil-17ra z wysokim powinowactwem wiąże hil-17a, natomiast w przypadku hil-17f powinowactwo to jest 00-krotnie mniejsze, co oznacza, że hil-17ra nie wiązałby w warunkach fizjologicznych hil-17f. Dlatego też komórki wyrażające hil-17rc powinny odpowiadać na działanie zarówno hil-17a jak i F, podczas gdy komórki wyrażające jedynie hil-17ra odpowiadałyby jedynie na działanie IL-17A. Różnica ta daje możliwość wpływania na to, jak te cytokiny oddziałują na różne tkanki. Przeprowadzając analizę ekspresji wykazano, że mimo iż IL-17RA jest powszechnie wyrażanym receptorem, obserwuje się jego wyższą ekspresję w komórkach krwiotwórczych. Natomiast IL-17RC wydaje się być wyrażany w tkankach innych niż tkanki krwiotwórcze i nie wykrywano jego obecności w komórkach krwiotwórczych. Zgodnie z tym, wszystkie podgrupy ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej wiążą hil-17a, natomiast nie wiążą hil-17f. Co więcej, to sugeruje, że tkanki niekrwiotwórcze powinny odpowiadać na działanie zarówno IL-17A jak i F, podczas gdy komórki krwiotwórcze powinny odpowiadać jedynie na działanie IL-17A. [0042] Przeprowadzone badanie wiązania cytokin do różnych wariantów splicingowych receptora IL-17RC wykazało, że dwa fragmenty receptora są istotne dla wiązania cytokin oraz to, że istnieją subtelne różnice dotyczące właściwości wiązania między mysimi a ludzkimi cytokinami. Co więcej, właściwości te są stałe dla tych cytokin, niezależnie od tego od jakiego gatunku pochodzi badany receptor. Jak wynika z danych przedstawionych w Tabeli 3, egzon 12 oraz wszystkie z egzonów 8 są niezbędne do tego, aby hil-17a i F wiązały się do IL-17RC, ponieważ cytokiny wiążą się jedynie z ludzkimi wariantami x1 oraz x4. Każda z tych izoform zawiera wszystkie z egzonów 8 oraz 12, jednak różnią się one brakiem lub obecnością egzonu 7. Oznacza to, że egzon 7 jest nie jest niezbędny do wiązania ludzkich cytokin. [0043] Znaczenie wytwarzania antagonisty zarówno IL-17A jak i F wydaje się jasne, jeśli weźmie się pod uwagę informacje wskazujące na silną korelację pomiędzy poziomem ekspresji IL-17A i F a progresją wielu chorób autoimmunologicznych i chorób zapalnych. Te dwie cytokiny aktywują inne zapalne cytokiny i chemokiny, jak również metaloproteazy macierzy, które to przyczyniają się do niszczenia kolagenu i kości w przypadkach autoimmunologicznego zapalenia stawów. Czynnik ten powinien posłużyć jako skuteczny terapeutyk przeznaczony do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów oraz innych chorób zapalnych, w których istotną rolę odgrywają hl-17a i F. [0044] W związku z tym opracowano rozpuszczalne formy ludzkiej IL-17RC, które posłużą jako antagoniści zarówno IL-17A jak i IL-17F. Te rozpuszczalne polipeptydy IL-17RC okazały się skuteczne w leczeniu.

12 Jednak ze względu na liczne czynniki, istnieją pewne trudności z wydzielaniem rozpuszczalnego receptora IL-17RC z licznych i różnych systemów ekspresyjnych dostępnych w stanie techniki. Nie jest on także wydzielany w odpowiednich ilościach niezbędnych do celów produkcyjnych. Dlatego w stanie techniki istnieje potrzeba opracowania antagonistów dla IL-17A i IL-17F, którzy mogą być wyrażani i wydzielani w ilościach, które będzie można przenieść na skalę produkcyjną. [004] W związku z powyższym, niniejszy wynalazek wychodzi na przeciw tej potrzebie dostarczając antagonistów dla IL-17A i IL-17F, którzy mogą być wyrażani i wydzielani. W szczególności, niniejszy wynalazek opiera się na opracowaniu i ujawnieniu izolowanego rozpuszczalnego polipeptydu zawierającego egzony 8-16 IL-17RC (reszty aminokwasowe z SEKW. NR ID: 2) oraz egzony 1-6 pochodzące z IL- 17RA, przy czym wspomniany rozpuszczalny polipeptyd swoiście wiąże się z IL-17A i IL-17F. Biorąc pod uwagę ich właściwości, antagoniści aktywności interleukin IL-17F i IL-17A, tacy jak rozpuszczalny receptor IL-17RC/IL-17RA według niniejszego wynalazku, są użyteczni w leczeniu zapaleń, zwłaszcza jako antagoniści zarówno IL-17F jak i IL -17A, działając na jedną lub obie cytokiny, w leczeniu chorób, w które zaangażowane są te cząsteczki. Ponadto, antagoniści aktywności IL-17A i IL-17F są użyteczni w leczeniu terapeutycznym innych chorób zapalnych, przykładowo działając poprzez wiązanie, blokowanie, hamowanie, obniżanie poziomu, działanie jako antagonista lub neutralizację IL-17F i IL-17A (zarówno indywidualnie lub łącznie) w leczeniu łuszczycy, wyprysku kontaktowego, IBD, IBS, zapalenia okrężnicy, zapalenia stawów, reumatoidalnego zapalenia stawów, astmy, przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (COPD), nieswoistych zapaleń jelit, takich jak wrzodziejące zapalenie jelita grubego i choroba Crohna, stwardnienia rozsianego, odrzucenia przeszczepu allogenicznego narządu, odrzucenia przeszczepu nerki, płuca, serca, itp. [0046] Podjednostki receptorów dla cytokin posiadają wiele domen obejmujących domenę wiążącą ligand i domenę efektorową, która jest zazwyczaj zaangażowana w przekazywanie sygnału. Multimeryczne receptory cytokin obejmują monomery, homodimery (np. αα i ββ izoformy receptora PDGF, receptor erytropoetyny, MPL [receptor trombopoetyny] oraz receptor G-CSF), heterodimery, w przypadku których każda z podjednostek posiada domeny wiążące ligand oraz domeny efektorowe (np. izoforma αβ receptora PDGF) oraz multimery o składowych podjednostkach pełniących różne funkcje (np. receptory dla IL-2, IL-3, IL-4, IL-, IL-6, IL-7 i GM-CSF). Niektóre z podjednostek receptora są wspólne dla wielu receptorów. Przykładowo, podjednostka AIC2B, która sama w sobie nie jest zdolna do wiązania ligandu, natomiast zawiera domenę odpowiadającą za wewnątrzkomórkowe przekazywanie sygnału, jest składnikiem receptorów dla IL-3 i GM-CSF. Biorąc pod uwagę struktury i funkcje receptorów dla cytokin, wiele z nich może należeć do jednej z czterech spokrewnionych ze sobą rodzin. Klasa I obejmująca receptory hematopoetyczne, przykładowo, charakteryzuje się obecnością domeny zawierającej konserwatywne reszty cysteiny i motyw WSXWS. W niektórych hematopoetycznych receptorach obecne są dodatkowe domeny, w tym domeny kinazy białkowej, domeny fibronektyny typu III oraz domeny immunoglobulin, które charakteryzują się obecnością pętli połączonych mostkiem disiarczkowym. Struktura receptora dla cytokin została omówiona w pracy przeglądowej: Urdal, Ann. Raporty Med. Chem. 26: , 1991 i Cosman, Cytokine :9-6, Powszechnie uważa się, że w wyniku presji selekcyjnej wywieranej na organizmy w kierunku nabywania nowych funkcji biologicznych, doszło, w wyniku duplikacji istniejących genów, do wytworzenia się nowych członków rodziny receptorów, co doprowadziło do powstania wielogenowych rodzin. Zatem członkowie rodziny zawierają ślady genu obecnego u przodków i te cechy charakterystyczne mogą być wykorzystywane podczas izolacji i identyfikacji dodatkowych członków rodziny. 11

13 [0047] Wobec tego, niniejszy wynalazek dotyczy izolowanego rozpuszczalnego polipeptydu zawierającego egzony 8-16 receptora IL-17RC (reszty aminokwasowe z SEKW. NR ID: 2) oraz egzony 1-6 pochodzące z receptora IL-17RA, przy czym wspomniany rozpuszczalny polipeptyd swoiście wiąże się z IL- 17A i IL-17F. [0048] Receptor IL-17RC posiada dużą liczbę wariantów splicingowych wynikających z włączenia lub wyłączenia poszczególnych egzonów. Jak opisano poniżej, niektóre z tych egzonów są niezbędne dla wiązania ligandu (IL-17A i/lub IL-17F). [0049] Niniejszy wynalazek opiera się po części na odkryciu podobieństwa strukturalnego ("domen") między IL-17RC a innymi członkami rodziny IL-17, takimi jak IL-17RA (SEKW. NR ID: 21). W szczególności, zidentyfikowano trzy domeny: 1) Domena 1 (SEKW. NR ID: 19 i 160) składa się z egzonów 8- receptora IL-17RC. Odpowiada to resztom aminokwasowym (SEKW. NR ID: 2) receptora IL-17RCx1 oraz resztom aminokwasowym (SEKW. NR ID: 166) receptora IL-17RCx4. 2) Domena 2 (SEKW. NR ID: 161 i 162) składa się z egzonów receptora IL-17RC. Odpowiada to resztom aminokwasowym (SEKW. NR ID: 2) receptora IL-17RCx1 oraz resztom aminokwasowym (SEKW. NR ID: 166) receptora IL-17RCx4. 3) Domena 3 (SEKW. NR ID: 163 i 164) składa się z egzonów receptora IL-17RC. Odpowiada to resztom aminokwasowym (SEKW. NR ID: 2) receptora IL-17RCx1 oraz resztom aminokwasowym (SEKW. NR ID: 166) receptora IL-17RCx4. Niniejszy wynalazek dostarcza również rozpuszczalnego polipeptydu według wynalazku do zastosowania w chorobach zapalnych i autoimmunologicznych u ludzi. Rozpuszczalny polipeptyd według niniejszego wynalazku może być wykorzystywany do blokowania, hamowania, zmniejszania poziomu, działania w oparciu o zjawisko antagonizmu lub do neutralizacji aktywności zarówno IL-17A i IL-17F w leczeniu zapalenia i chorób zapalnych, takich jak łuszczyca, reumatoidalne zapalenie stawów, IBD, IBS, zapalenie okrężnicy, astma, odrzucenie przeszczepu, stwardnienie rozsiane i inne stany zapalne ujawnionione w niniejszym dokumencie. [000] Przykładowa sekwencja nukleotydowa, która koduje ludzki IL-17RC ("IL-17RCx1") jest dostarczona przez SEKW. NR ID: 1; kodowany polipeptyd przedstawiono w SEKW. NR ID: 2. IL-17RC funkcjonuje jako receptor zarówno dla IL-17A (SEKW. NR ID: 13 i 14) jak i IL-17F (SEKW. NR ID: 1 i 16). IL-17RC może funkcjonować jako monomer, homodimer lub heterodimer. Jak opisano w niniejszym zgłoszeniu, rozpuszczalny polipeptyd według niniejszego wynalazku zawiera IL-17RC oraz części receptora IL-17RA ("IL-17RC/IL-17RA"). Jako taki, niniejszy wynalazek obejmuje rozpuszczalne receptory, które zawierają fragmenty IL-17RC w połączeniu z IL-17RA. IL-17RC ujawniono we wspólnym zgłoszeniu patentowym US nr /48647 oraz wspólnej publikacji WIPO WO 01/ Analiza ludzkiego klonu cdna kodującego IL- 17RC (SEKW. NR ID: 1) wykazała obecność otwartej ramki odczytu kodującej 692 aminokwasy (SEKW. NR ID: 2) obejmujących domniemaną sekwencję sygnałową o długości około 20 reszt aminokwasowych (reszty aminokwasowe od 1 do 20 z SEKW. NR ID: 2), zewnątrzkomórkową domenę wiążącą ligand o długości około 431 reszt aminokwasowych (aminokwasy z SEKW. NR ID: 2; SEKW. NR ID: 3), domenę transbłonową o długości około 20 aminokwasów (aminokwasy z SEKW. NR ID: 2) i wewnątrzkomórkową domenę o długości około 203 reszt aminokwasowych (aminokwasy od 474 do 677 w SEKW. NR ID: 2). Ponadto domena wiążąca ligand przedstawiona jest w SEKW. NR ID:

14 [001] Jeszcze jedna przykładowa sekwencja nukleotydowa kodująca wariant ludzkiego IL-17RC, oznaczonego jako IL-17RCx4, przedstawiona jest w SEKW. NR ID: 16; kodowany polipeptyd przedstawiono w SEKW. NR ID: 166. Domniemane peptydy sygnałowe obejmują reszty 1-60 w SEKW. NR ID: 16 i reszty 1-20 w SEKW. NR ID: 166; zewnątrzkomórkowa domena obejmuje reszty w SEKW. NR ID: 16 i reszty w SEKW. NR ID: 166; domena transbłonowa obejmuje reszty w SEKW. NR ID: 16 i reszty w SEKW. NR ID: 166; oraz wewnątrzkomórkowa domena obejmująca reszty w SEKW. NR ID: 16 i reszty w SEKW. NR ID: 166. [002] Jeszcze jedna przykładowa sekwencja nukleotydowa kodująca wariant ludzkiego IL-17RC, oznaczony jako IL-17RC-1", przedstawiona jest w SEKW. NR ID: 4; kodowany polipeptyd przedstawiono w SEKW. NR ID:. IL-17RC-1 ujawniono we wspólnym zgłoszeniu patentowym US nr /48647 oraz wspólnej publikacji WIPO WO 01/ Analiza sekwencji wykazała, że IL-17RC-1 jest skróconą formą receptorowego polipeptydu. Oznacza to, że IL-17RC-1 pozbawiony jest reszt aminokwasowych z SEKW. NR ID: 2. SEKW. NR ID: przedstawia sekwencję aminokwasową polipeptydu IL-17RC-1, która obejmuje N-końcowy fragment IL-17RC. [003] Porównanie sekwencji aminokwasowych IL-17RC i IL-17RC-1 pokazało również, że oba te polipeptydy stanowią warianty powstałe w wyniku alternatywnego splicingu. Sekwencja aminokwasowa IL- 17RC zawiera segment zbudowany z 17 aminokwasów (reszty aminokwasowe od 339 do 3 w SEKW. NR ID: 2), które nie występują w IL-17RC-1, podczas gdy IL-17RC nie posiada następującego po aminokwasie 479, segmentu złożonego z 13 aminokwasów obecnego w IL-17RC-1 (reszty aminokwasowe od 30 do 362 z SEKW. NR ID: ). Polipeptyd zawierający oba segmenty aminokwasów przedstawiono w SEKW. NR ID: 11, podczas gdy SEKW. NR ID: 12 przedstawia sekwencję aminokwasową polipeptydu, który pozbawiony jest obu segmentów: segmentu złożonego z 13 reszt aminokwasowych oraz segmentu złożonego z 17 aminokwasów. [004] Jeszcze jedna przykładowa sekwencja nukleotydowa kodująca wariant ludzkiego IL-17RC, oznaczony jako IL-17RC-6", przedstawiona jest w SEKW. NR ID: 23; kodowany polipeptyd przedstawiono w SEKW. NR ID: 24. IL-17RC-6, w porównaniu z IL-17RC, charakteryzuje się obecnością delecji 2 reszt aminokwasowych jak pokazano w SEKW. NR ID: 2. W szczególności, IL-17RC-6 nie zawiera reszt aminokwasowych od 94 do 118 z SEKW. NR ID: 2. Analiza ludzkiego klonu cdna kodującego IL-17RC-6 (SEKW. NR ID: 23) wykazała obecność zewnątrzkomórkowej domeny wiążącej ligand o długości około 427 reszt aminokwasowych (aminokwasy z SEKW. NR ID: 24), domeny transbłonowej o długości około 20 aminokwasów (aminokwasy z SEKW. NR ID: 24) i wewnątrzkomórkowej domeny o długości około 218 reszt aminokwasowych (reszty aminokwasowe 449 to 667 z SEKW. NR ID: 24). [00] Przykładowa sekwencja nukleotydowa kodująca mysi wariant IL-17RC przedstawiona jest w SEKW. NR ID: 2; kodowany polipeptyd przedstawiono w SEKW. NR ID: 26. Mysi IL-17RC funkcjonuje jako receptor dla obu mysich cytokin: IL-17A (SEKW. NR ID: 17 i 18) i IL-17F (SEKW. NR ID: 19 i 20). Analiza mysiego klonu cdna kodującego IL-17RC (SEKW. NR ID: 2) wykazała obecność zewnątrzkomórkowej domeny wiążącej ligand o długości około 449 reszt aminokwasowych (SEKW. NR ID: 27). Ponadto domena wiążąca ligand przedstawiona jest w SEKW. NR ID: 28. [006] Jeszcze inna przykładowa sekwencja nukleotydowa kodująca mysi wariant IL-17RC przedstawiona jest w SEKW. NR ID: 29; kodowany polipeptyd przedstawiono w SEKW. NR ID: 30. [007] Gen kodujący IL-17RC znajduje się na chromosomie 3p2-3p24. Jak zostało omówione poniżej, region ten jest związany z występowaniem różnych zaburzeń i chorób. 13

15 [008] Analizy wykonane z użyciem techniki Nothern-blot wykazały wysoką ekspresję genu dla IL-17RC w tarczycy, gruczole nadnercza, prostaty i tkankach wątroby, natomiast niższą ekspresję w sercu, jelicie cienkim, żołądku i tkankach tchawicy. W odróżnieniu od wymienionych przypadków, niską ekspresję bądź jej brak wykazano w mózgu, łożysku, płucach, mięśniu szkieletowym, nerce, trzustce, śledzionie, grasicy, jądrach, jajniku, okrężnicy, leukocytach krwi obwodowej, rdzeniu kręgowym, węźle chłonnym i szpiku kostnym. Obserwacje te wskazują, że sekwencje IL-17RC mogą być stosowane do rozróżniania różnych typów tkanek. Dalej niniejszy wynalazek obejmuje izolowane cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące izolowany polipeptyd według niniejszego wynalazku. [009] Te i inne aspekty niniejszego wynalazku staną się oczywiste po odwołaniu się do przedstawionego poniżej szczegółowego opisu. Dodatkowo, niektóre z terminów są zdefiniowane poniżej B) Definicje [0060] W poniższym opisie stosowane są szeroko liczne terminy. Następujące definicje przedstawiono w celu ułatwienia zrozumienia niniejszego wynalazku. [0061] Stosowany w niniejszym dokumencie termin kwas nukleinowy lub cząsteczka kwasu nukleinowego odnosi się do polinukleotydów, takich jak kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) lub kwas rybonukleinowy (RNA), oligonukleotydów, fragmentów otrzymanych w wyniku łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) oraz fragmentów otrzymanych w wyniku jakiejkolwiek z reakcji ligacji, cięcia, działania endonukleazy i egzonukleazy. Cząsteczki kwasu nukleinowego mogą byc złożone z monomerów, które są naturalnie występującymi nukleotydami (takie jak DNA i RNA) lub są analogami naturalnie występujących nukleotydów (np. α-enancjomery naturalnie występujących nukleotydów) lub mogą stanowić kombinację obu tych rodzajów. Modyfikowane nukleotydy mogą posiadać zmiany w obrębie ugrupowań cukrowych i/lub w obrębie zasad purynowych i pirymidynowych. Modyfikacje cukrów obejmują na przykład zastąpienie jednej lub większej liczby grup hydroksylowych atomem chlorowca, grupami alkilowymi, aminami i grupami azydowymi lub też cukry mogą być przekształcane w aktywne estrowe lub eterowe pochodne. Ponadto całe ugrupowanie cukrowe nukleotydu może zostać zastąpione strukturami, które są do niego podobne pod względem rozmieszczenia przestrzennego i ładunku, takimi jak azacukry i analogi cukrów zawierające grupę karboksylową. Przykłady modyfikacji dotyczących części zasadowej nukleotydu obejmują alkilowane puryny i pirymidyny, acetylowane puryny i pirymidyny lub inne dobrze znane heterocykliczne substytuty. Monomery kwasu nukleinowego mogą być połączone wiązaniami fosfodiestrowymi lub analogami takich wiązań. Analogi wiązań fosfodiestrowych obejmują tiofosforany, ditiofosforany, selenofosforany, diselenofosforany, amidotiofosforany, amidofosforany, diamidofosforany i tym podobne. Określenie cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje także tak zwane peptydowe kwasy nukleinowe", które zawierają naturalnie występujące lub zmodyfikowane występujące w kwasach nukleinowych zasady przyłączone do łańcucha poliamidowego. Kwasy nukleinowe mogą występować w postaci zarówno jednoniciowej jak i dwuniciowej. [0062] Określenie komplementarna cząsteczka kwasu nukleinowego odnosi się do cząsteczki kwasu nukleinowego o sekwencji nukleotydowej komplementarnej do referencyjnej sekwencji nukleotydowej i posiadającej względem niej odwróconą orientację. Na przykład sekwencja 'ATGCACGGG 3 jest komplementarna do ' CCCGTGCAT 3. [0063] Określenie zdegenerowana sekwencja nukleotydowa oznacza sekwencję nukleotydów, która zawiera jeden lub więcej zdegenerowanych kodonów w porównaniu do referencyjnej cząsteczki kwasu 14

16 nukleinowego, która koduje polipeptyd. Zdegenerowane kodony zawierają różne trójki nukleotydów (kodony), natomiast kodują tą samą resztę aminokwasową (tj. każda z trójek GAU i GAC koduje Asp). [0064] Termin gen strukturalny odnosi się do cząsteczki kwasu nukleinowego, na podstawie której w wyniku procesu transkrypcji syntezowany jest informacyjny RNA (mrna), który to następnie podlega translacji do sekwencji aminokwasów charakterystycznej dla konkretnego polipeptydu. [006] Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego to cząsteczka kwasu nukleinowego, która nie jest zintegrowana z genomowym DNA organizmu. Na przykład, cząsteczka DNA, która koduje czynnik wzrostu, która została oddzielona od genomowego DNA komórki jest izolowaną cząsteczką DNA. Innym przykładem izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego jest syntezowana chemicznie cząsteczka kwasu nukleinowego, która nie jest zintegrowana z genomem organizmu. Cząsteczka kwasu nukleinowego, która została wyizolowana z określonego gatunku jest mniejsza niż kompletna cząsteczka DNA chromosomu pochodzącego od tego gatunku. [0066] Konstrukt cząsteczki kwasu nukleinowego jest cząsteczką kwasu nukleinowego, zarówno jednolub dwuniciową, która została zmodyfikowana w wyniku interwencji człowieka tak, że zawiera segmenty kwasu nukleinowego połączone i zestawione ze sobą w układ, który nie występuje w naturze. [0067] Liniowy DNA odnosi się do niekolistych cząsteczek DNA posiadających wolne końce ' i 3'. Liniowy DNA może być otrzymany z zamkniętych niekolistych cząsteczek DNA, takich jak plazmidy, poprzez enzymatyczne trawienie lub fizyczne przerwanie. [0068] Komplementarny DNA (cdna) jest jednoniciową cząsteczką DNA, która powstaje na matrycy mrna w wyniku działania enzymu - odwrotnej transkryptazy. Zazwyczaj, w celu inicjacji odwrotnej transkrypcji, stosowany jest starter komplementarny do fragmentu mrna. Specjaliści w dziedzinie stosują również określenie cdna w odniesieniu do dwuniciowej cząsteczki DNA składającej się z takiej jednoniciowej cząsteczki DNA i komplementarnej do niej nici DNA. Określenie cdna odnosi się również do klonu cząsteczki cdna syntetyzowanej na matrycy RNA. [0069] Promotor oznacza sekwencję nukleotydów, która kieruje transkrypcją genu strukturalnego. Zazwyczaj promotor znajduje się na '-końcu niekodującego regionu genu, w położeniu proksymalnym względem miejsca rozpoczęcia transkrypcji genu strukturalnego. Elementy sekwencji w obrębie promotorów, które działają podczas inicjacji transkrypcji, często charakteryzują się obecnością konsensusowych sekwencji nukleotydowych. Te elementy promotora obejmują miejsca wiążące dla polimerazy RNA, sekwencje TATA, sekwencje CAAT, elementy specyficzne dla różnicowania (elementy ang. DSE; McGehee i wsp., Mol. Endocrinol. 7:1 (1993)), elementy odpowiedzi na camp (CRE, ang. cyclic AMP response elements), elementy odpowiedzi na surowicę (SRE, ang. serum response elements; Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990)), elementy odpowiedzi na glukokortykoidy (GRE, ang. glucocorticoid response elements) oraz miejsca wiążące dla innych czynników transkrypcyjnych, takich jak CRE/ATF (O'Reilly i wsp., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)), AP2 (Ye i wsp., J. Biol. Chem. 269:2728 (1994)), SP1, białko wiążące element odpowiedzi na camp (CREB; Loeken, Expr Gene. 3:23 (1993)) i czynniki transkrypcyjne wiążące oktamer (patrz ogólnie: Watson i wsp., Ed., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (Benjamin / Cummings Publishing Company, Inc 1987), i Lemaigre i Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)). W przypadku, gdy promotorem jest indukowalny promotor, szybkość transkrypcji wzrasta w odpowiedzi na czynnik indukujący. Natomiast, szybkość transkrypcji nie jest regulowana przez czynnik indukujący, w przypadku, gdy promotor jest promotorem konstytutywnym. Znane są również promotory odpowiedzialne za represję. 1

17 [0070] Promotor minimalny zawiera niezbędne dla swojej funkcji sekwencje nukleotydowe, w tym sekwencję TATA (ang. TATA box) i miejsce startu transkrypcji. Według tej definicji, promotor minimalny może wykazywać lub nie wykrywalną aktywność w przypadku braku określonych sekwencji, które mogą zwiększać aktywność lub zapewniać aktywność specyficzną dla określonych tkanek. [0071] Element regulatorowy to sekwencja nukleotydowa, która moduluje aktywność promotora minimalnego. Na przykład, element regulatorowy może zawierać sekwencję nukleotydową, która wiąże się z komórkowymi czynnikami umożliwiając transkrypcję wyłącznie lub preferencyjnie w określonych komórkach, tkankach lub organellach. Tego typu elementy regulatorowe są zwykle połączone z genami, które są eksprymowane w sposób swoisty dla komórki, swoisty dla tkanki lub swoisty dla organellum". [0072] Enhancer to rodzaj elementu regulatorowego, który może zwiększać wydajność transkrypcji, niezależnie od odległości lub orientacji enhancera w stosunku do miejsca startu transkrypcji. [0073] Heterologiczny DNA odnosi się do cząsteczki DNA, lub populacji cząsteczek DNA, które nie występują naturalnie w danej komórce gospodarza. Cząsteczki DNA heterologiczne względem konkretnej komórki gospodarza mogą zawierać DNA pochodzący od gatunku, z jakiego pochodzi komórka gospodarza (np. endogenny DNA) pod warunkiem, że DNA gospodarza połączone jest z DNA pochodzącym od komórki innej niż komórka gospodarza (np. egzogenny DNA). Na przykład, cząsteczka DNA zawierająca kodujący polipeptyd segment DNA nie pochodzący od komórki gospodarza, który jest funkcjonalnie połączony z segmentem DNA komórki gospodarza zawierającym promotor transkrypcyjny, uważana jest za heterologiczną cząsteczkę DNA. Możliwa jest również sytuacja odwrotna, heterologiczna cząsteczka DNA może zawierać endogenny gen funkcjonalnie połączony z egzogennym promotorem. Innym przykładem jest cząsteczka DNA zawierająca gen pochodzący z komórki typu dzikiego, która uważana jest za heterologiczny DNA, jeśli ta cząsteczka DNA wprowadzona jest do zmutowanej komórki pozbawionej genu typu dzikiego. [0074] Polipeptyd jest polimerem reszt aminokwasowych połączonych wiązaniami peptydowymi, niezależnie od tego czy wytwarzany w sposób naturalny lub jest polipeptydem syntetycznym. Polipeptydy zawierające mniej niż około reszt aminokwasowych są powszechnie określane jako peptydy". [007] Białko jest makrocząsteczką zawierającą jeden lub więcej łańcuchów polipeptydowych. Białko może również zawierać składniki inne niż peptydy, takie jak grupy węglowodanowe. Węglowodany i inne podstawniki nie będące peptydami mogą być dodawane do białek przez komórkę, w której to białko jest wytwarzane, i będą się różniły w zależności od rodzaju komórki. Białka definiowane są w niniejszym dokumencie w odniesieniu do struktury swoich łańcuchów polipeptydowych, podstawniki takie jak grupy węglowodanowe zazwyczaj nie są określone, niemniej jednak mogą być obecne. [0076] Peptyd lub polipeptyd kodowany przez cząsteczkę DNA nie pochodzącą od komórki gospodarza jest peptydem lub polipeptydem heterologicznym". [0077] A. Wektor do klonowania jest cząsteczką kwasu nukleinowego, taką jak plazmid, kosmid lub bakteriofag, która zdolna jest do samodzielnej replikacji w komórce gospodarza. Wektory do klonowania zazwyczaj zawierają jedno lub niewielką liczbę miejsc rozpoznawanych przez endonukleazy restrykcyjne, które umożliwiają wprowadzenie cząsteczki kwasu nukleinowego w sposób pewny, bez utraty istotnych funkcji biologicznych wektora, jak również wprowadzenie nukleotydowych sekwencji kodujących gen markerowy, który nadaje się do zastosowania podczas identyfikacji i selekcji komórek transformowanych tym wektorem do klonowania. Geny markerowe zazwyczaj zawierają geny, które zapewniają oporność na tetracyklinę lub oporność na ampicylinę. 16

18 [0078] Wektor ekspresyjny to cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca gen, który podlega ekspresji w komórce gospodarza. Zazwyczaj wektor ekspresyjny zawiera promotor transkrypcyjny, gen oraz terminator transkrypcji. Ekspresja genów odbywa się zazwyczaj pod kontrolą promotora, a taki gen nazywa się genem funkcjonalnie połączonym z promotorem. Podobnie, element regulujący i promotor minimalny są połączone funkcjonalnie, jeśli element regulujący moduluje aktywność promotora minimalnego. [0079] Rekombinowany gospodarz to komórka, która zawiera heterologiczną cząsteczkę kwasu nukleinowego, taką jak wektor do klonowania lub wektor ekspresyjny. W tym kontekście przykładem rekombinowanego gospodarza jest komórka wytwarzająca IL-17RC w oparciu o wektor ekspresyjny. W przeciwieństwie do sytuacji opisanej powyżej, IL-17RC może być wytwarzany przez komórkę, która jest naturalnym źródłem IL-17RC, i która nie posiada wektora ekspresyjnego. [0080] Transformanty z DNA zintegrowanym z genomem są rekombinowanymi komórkami gospodarza, w których heterologiczny DNA został włączony do genomowego DNA tych komórek. [0081] Białko fuzyjne jest hybrydowym białkiem wyrażanym w oparciu o cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencje nukleotydowe złożone z co najmniej dwóch genów. Na przykład, białko fuzyjne może zawierać co najmniej część polipeptydu IL-17RC połączoną z polipeptydem, który wiąże matrycę powinowactwa. Takie białko fuzyjne zapewnia możliwość izolowania dużych ilości IL-17RC za pomocą chromatografii powinowactwa. [0082] Określenie receptor oznacza białko związane z komórką, które wiąże bioaktywną cząsteczkę nazywaną ligandem". To oddziaływanie wywołuje skutek działania ligandu na komórkę. Receptory mogą być związane z błoną, cytoplazmatyczną lub jądrową; mogą być monomerami (np. receptor dla hormonu tyreotropowego, receptor β-adrenergiczny) lub multimerami (np. receptor PDGF, receptor hormonu wzrostu, receptor IL-3, receptor GM-CSF, receptor G-CSF, receptor erytropoetyny i receptor IL-6). Receptory błonowe charakteryzują się strukturą posiadającą wiele domen, zawierającą zewnątrzkomórkową domenę wiążącą ligand i wewnątrzkomórkową domenę efektorową, która jest zazwyczaj zaangażowana w przekazywanie sygnału. W przypadku niektórych receptorów związanych z błoną, ich zewnątrzkomórkowa domena wiążąca ligand i wewnątrzkomórkowa domena efektorowa znajdują się na oddzielnych polipeptydach, które wchodzą w skład pełnego funkcjonalnego receptora. [0083] Ogólnie rzecz biorąc, wiązanie ligandu do receptora prowadzi do zmiany konformacyjnej w receptorze, która prowadzi do wzajemnego oddziaływania między domeną efektorową i inną cząsteczką/innymi cząsteczkami w komórce, co z kolei prowadzi do zmian w metabolizmie komórki. Procesy metaboliczne, które są często zależne od oddziaływania receptor-ligand obejmują transkrypcję genów, fosforylację, defosforylację, wzrost wytwarzania cyklicznego AMP, mobilizację jonów wapnia w komórce, mobilizację lipidów błonowych, adhezyję komórek, hydrolizę lipidów zawierających inozytol i hydrolizę fosfolipidów. [0084] Rozpuszczalny receptor jest polipeptydowym receptorowym, który nie jest związany z błoną komórkową. Rozpuszczalne receptory są najczęściej występującymi polipeptydami receptorowymi wiążącymi ligand, które nie posiadają domen transbłonowych i cytoplazmatycznych oraz innych elementów wiążących je do błony komórkowej, takich jak glikozylofosfatydyloinozytol (GPI). Rozpuszczalne receptory mogą zawierać dodatkowe reszty aminokwasów, takie jak znaczniki powinowactwa, które zapewniają możliwość oczyszczania polipeptydu lub zapewniają obecność w polipeptydzie miejsc wiążących dla substratu lub sekwencje stałych regionów immunoglobulin. Wiele receptorów obecnych na powierzchni komórek posiada naturalnie występujące rozpuszczalne odpowiedniki, wytwarzane w wyniku proteolizy lub w 17

19 wyniku translacji na bazie cząsteczek mrna powstałych w wyniku alternatywnego splicingu. Rozpuszczalne receptory mogą byc monomerami, homodimerami, heterodimerami lub multimerami, przy czym receptory multimeryczne na ogół nie zawierają więcej niż 9 podjednostek, korzystnie nie zawierają więcej niż 6 podjednostek, a najkorzystniej nie zawierają więcej niż 3 podjednostki. Polipeptydy receptorowe określa się jako zasadniczo wolne od transbłonowych i wewnątrzkomórkowych segmentów polipeptydowych w przypadku, gdy nie posiadają segmentów umożliwiających odpowiednio zakotwiczenie w błonie lub przekazywanie sygnału. Rozpuszczalne receptory receptorów cytokin zawierają na ogół zewnątrzkomórkową domenę wiążącą cytokinę, która nie posiada domeny tranbłonowej oraz domeny wewnątrzkomórkowej. Na przykład, przedstawicielami rozpuszczalnych receptorów są rozpuszczalne receptory dla IL-17RA jak przedstawiono w SEKW. NR ID: 167 (polinukleotyd) i 21 (polipeptyd). Określenie, która z sekwencji znanego receptora dla cytokin obejmuje zewnątrzkomórkową domenę wiążącą cytokinę nie posiadającą domeny transbłonowej i wewnątrzkomórkowej leży w obszarze wiedzy specjalisty w dziedzinie. Ponadto, specjalista w dziedzinie, opierając się na kodzie genetycznym, może łatwo zidentyfikować polinukleotydy, które kodują taki polipeptyd rozpuszczalnego receptora. [008] Określenie sekrecyjna sekwencja sygnałowa oznacza sekwencję DNA, która koduje peptyd ( peptyd sekrecyjny ), który jako element większego polipeptydu, prowadzi ten większy polipeptyd przez szlak wydzielniczy komórki, w której jest on syntetyzowany. Większy polipeptyd jest zazwyczaj cięty podczas przejścia przez szlak wydzielniczy, w celu usunięcia peptydu sekrecyjnego. [0086] Izolowany polipeptyd to polipeptyd, który jest zasadniczo wolny od zanieczyszczeń będących składnikami komórek, takich jak węglowodany, tłuszcze i inne białkopodobne zanieczyszczenia, które towarzyszą temu polipeptydowi w naturze. Zazwyczaj preparat izolowanego polipeptydu zawiera ten polipeptyd w postaci wysoko oczyszczonej, np. o czystości wynoszącej co najmniej około 80%, co najmniej około 90%, co najmniej około 9%, większej niż 9%, takiej jak 96%, 97% lub 98% albo więcej, lub większej niż 99%. Jednym ze sposobów wykazania tego, że dany preparat białka zawiera izolowany polipeptyd polega na wykazaniu obecności jednego prążka na żelu otrzymanym w wyniku przeprowadzenia dla tego preparatu białka elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z użyciem dodecylosiarczanu sodu (SDS) i wybarwieniu tego żelu metodą Coomassie Brilliant Blue. Jednakże termin izolowany nie wyklucza obecności tego samego polipeptydu w alternatywnych formach fizycznych, takich jak dimery lub formy w różny sposób glikozylowane lub pochodne tego polipeptydu. [0087] Określenia znajdujący się na N-końcu i znajdujący się na C-końcu używane są do oznaczenia miejsca położenia w obrębie sekwencji polipeptydów. W przypadu, gdy pozwala na to kontekst, terminy te są stosowane w odniesieniu do określonej sekwencji lub części polipeptydu w celu określenia sąsiedztwa lub względnego położenia. Przykładowo, określona sekwencja położona na C-końcu względem sekwencji referencyjnej w obrębie polipeptydu stanowi sekwencję proksymalną względem C-końca sekwencji referencyjnej, natomiast niekoniecznie stanowi sekwencję na C-końcu kompletnego polipeptydu. [0088] Termin ekspresja odnosi się do biosyntezy produktu genu. Na przykład w przypadku genu strukturalnego, wyrażenie ekspresja obejmuje transkrypcję genu strukturalnego do mrna oraz translację mrna, której wynikiem jest otrzymanie jednego lub większej liczby polipeptydów. [0089] Określenie wariant splicingowy jest używane do oznaczenia alternatywnych form RNA otrzymanych w wyniku transkrypcji genu. Wariacje splicingowe pojawiają się w sposób naturalny w wyniku wykorzystania miejsc alternatywnego splicingu znajdujących się w obrębie utworzonej w wyniku transkrypcji cząsteczki RNA, lub rzadziej między cząsteczkami RNA utworzonymi w wyniku odrębnych procesów transkrypcji oraz 18

20 mogą być wynikiem transkrypcji kilku cząsteczek mrna powstałych na bazie tego samego genu. Warianty splicingowe mogą kodować polipeptydy o zmienionej sekwencji aminokwasowej. Termin wariant splicingowy jest również używany do oznaczenia polipeptydu kodowanego przez wariant splicingowy mrna otrzymany w wyniku transkrypcji genu. [0090] Stosowane tu określenie immunomodulator obejmuje cytokiny, czynniki wzrostu komórek macierzystych, limfotoksyny, cząsteczki kostymulujące, czynniki krwiotwórcze, i im podobne oraz syntetyczne analogi tych cząsteczek. [0091] Określenie para komplementarna/niekomplementarna odnosi się do ugrupowań, które nie są nieidentyczne, ale które w odpowiednich warunkach tworzą niekowalencyjnie związane stabilne pary. Na przykład, biotyna i awidyna (lub streptawidyna) to prototypowi przedstawiciele pary komplementarnej/niekomplementarnej. Innymi przykładami par komplementarnych/niekomplementarnych są pary receptor/ligand, pary przeciwciało/antygen (lub hapten lub epitop), pary sensowny/antysensowny polinukleotyd i tym podobne. W przypadku, kiedy pożądana jest dalsza dysocjacja pary komplementarnej/niekomplementarnej, taka komplementarna/niekomplementarna para korzystnie posiada powinowactwo wynoszące mniej niż 9 M -1. [0092] Przeciwciało antyidiotypowe to przeciwciało, które wiąże się z regionem zmiennym immunoglobuliny. W kontekście niniejszego wynalazku, anty-idiotypowe przeciwciało wiąże region zmienny przeciwciała anty-il-17rc, co oznacza, że przeciwciało antyidiotypowe naśladuje epitop IL-17RC. [0093] Fragment przeciwciała to część przeciwciała, taka jak fragment F(ab ') 2, F (ab) 2, Fab', Fab, i tym podobne. Niezależnie od struktury, fragment przeciwciała wiąże ten sam antygen, który jest rozpoznawany przez całe przeciwciało. Na przykład, fragmentu przeciwciała monoklonalnego anty-il-17rc wiąże epitop IL- 17RC. [0094] Określenie fragment przeciwciała obejmuje także polipeptyd otrzymany w wyniku syntezy lub przy pomocy technik inżynierii genetycznej, który wiąże się ze swoistym antygenem, takim jak polipeptydy składające się z regionu zmiennego łańcucha lekkiego, fragmenty Fv zawierające zmienne regiony łańcuchów ciężkich i lekkich, rekombinowane cząsteczki polipeptydów w postaci pojedynczego łańcucha, w których lekkie i ciężkie zmienne regiony są połączone peptydowym łącznikiem ("białka scfv") oraz minimalne rozpoznawalne jednostki składające się z reszt aminokwasowych, które naśladują hiperzmienny region. [009] Chimeryczne przeciwciało jest rekombinowanym białkiem, które zawiera zmienne domeny i domeny zapewniające komplementarność pochodzące od przeciwciała gryzonia, podczas gdy reszta cząsteczki przeciwciała pochodzi od przeciwciała ludzkiego. [0096] Przeciwciała humanizowane są rekombinowanymi białkami, w których pochodzące od myszy regiony zapewniające komplementarność przeciwciała monoklonalnego zostały przeniesione z ciężkich i lekkich łańcuchów zmiennych immunoglobuliny mysiej do ludzkiej domeny zmiennej. Konstruowanie pochodzących od myszy humanizowanych przeciwciał do zastosowania terapeutycznego u ludzi, takich jak te, które wiążą lub neutralizują ludzkie białko, mieści się w zakresie umiejętności specjalisty w dziedzinie. [0097] Stosowane tu określenie czynnik terapeutyczny odnosi się do cząsteczki lub atomu, który skoniugowano z przeciwciałem w celu otrzymania koniugatu mającego zastosowanie w leczeniu. Przykłady czynników terapeutycznych obejmują leki, toksyny, immunomodulatory, czynniki chelatujące, związki boru, czynniki światłoczułe lub barwniki oraz izotopy promieniotwórcze. 19

21 [0098] Wykrywalny znacznik oznacza cząsteczkę lub atom, który może być koniugowany z przeciwciałem w celu otrzymania cząsteczki użytecznej w diagnozowaniu. Przykłady wykrywalnych znaczników obejmują związki chelatujące, czynniki światłoczułe, radioizotopy, czynniki fluorescencyjne, jony paramagnetyczne lub inne cząsteczki markerowe. [0099] Stosowane w niniejszym dokumencie określenie znacznik powinowactwa odnosi się do segmentu polipeptydowego, który może być dołączony do drugiego polipeptydu w celu zapewnienia możliwości oczyszczania lub wykrywania tego drugiego polipeptydu lub w celu zapewnienia miejsc pozwalających na przyłączenie się drugiego polipeptydu do substratu. Zasadniczo, każdy peptyd lub białko, dla którego dostępne jest przeciwciało lub inny specyficzny środek wiążący, może być stosowany jako znacznik powinowactwa. Znaczniki powinowactwa obejmują region polihistydynowy, białko A (Nilsson i wsp., EMBO J. 4:7 (198); Nilsson i wsp., Methods Enzymol. 198:3 (1991)), S-transferazę glutationową (Smith i Johnson, 67:31 Gene (1988)), znacznik powinowactwa Glu-Glu (Grussenmeyer i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:792 (198)), substancję P, peptyd FLAG (Hopp i wsp., Biotechnologia 6:1204 (1988)), peptyd wiążący streptawidynę lub inny epitop antygenowy lub domenę wiążącą. Patrz ogólnie: Ford i wsp., Protein Expression and Purification 2:9 (1991). Cząsteczki DNA kodujące znaczniki powinowactwa są dostępne u dostawców komercyjnych (np. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). [00] Nagie przeciwciało", w przeciwieństwie do fragmentu przeciwciała, oznacza całe przeciwciało, które nie jest skoniugowane z czynnikiem terapeutycznym. Nagie przeciwciała obejmują zarówno przeciwciała poliklonalne jak i monoklonalne, jak również niektóre rekombinowane przeciwciała, takie jak przeciwciała chimeryczne i humanizowane. [01] Stosowane w niniejszym dokumencie określenie składnik pochodzący od przeciwciała obejmuje zarówno całe przeciwciało jak i fragment przeciwciała. [02] Termin immunokoniugat odnosi się do koniugatu składnika pochodzącego od przeciwciała z czynnikiem terapeutycznym lub wykrywalnym znacznikiem. [03] Stosowany w niniejszym dokumencie termin białko fuzyjne zawierające składnik pochodzący od przeciwciała odnosi się do rekombinowanej cząsteczki, która zawiera składnik pochodzący od przeciwciała oraz składnik pochodzący od polipeptydu IL-17RC. Przykłady białek fuzyjnych zawierających składnik pochodzący od przeciwciała obejmują białko, które składa się z domeny zewnątrzkomórkowej IL-17RC oraz albo z domeny Fc albo z regionu wiążącego antygen. [04] Określenia polipeptyd docelowy lub peptyd docelowy odnoszą sie do sekwencji aminokwasowej, która zawiera co najmniej jeden epitop, i która wyrażana jest w komórce docelowej, takiej jak komórka nowotworowa, czy komórka zawierająca antygen czynnika zakaźnego. Limfocyty T rozpoznają epitopy peptydowe prezentowane polipeptydowi docelowemu lub peptydowi docelowemu przez cząsteczkę głównego układu zgodności tkankowej i zazwyczaj powodują lizę komórki docelowej lub rekrutują inne komórki układu odpornościowego do miejsca w komórce docelowej, w ten sposób prowadzący do śmierci komórki docelowej. [0] Peptyd antygenowy to peptyd, który będzie wiązał cząsteczkę głównego układu zgodności tkankowej, tworząc rozpoznawany przez limfocyty T kompleks MHC-peptyd, co powoduje indukcję odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów w wyniku jego prezentacji limfocytowi T. Tak więc, peptydy antygenowe są zdolne do wiązania odpowiedniej cząsteczki głównego układu zgodności tkankowej i indukowania odpowiedzi cytotoksycznych komórek T, takiej jak liza komórki lub uwalnianie specyficznych cytokin skierowanych przeciwko komórce docelowej, która wiąże lub wyraża antygen. Peptyd antygenowy 20

22 może być związany przez cząsteczkę głównego układu zgodności tkankowej klasy I lub klasy II, znajdującą się na powierzchni komórki prezentującej antygen lub komórki docelowej. [06] U Eucaryota, polimeraza RNA II katalizuje transkrypcję genu strukturalnego prowadzącą do utworzenia mrna. Cząsteczka kwasu nukleinowego może być zaprojektowana tak, że zawiera matrycę dla polimerazy RNA II, w której transkrypt RNA ma sekwencję komplementarną względem sekwencji określonego mrna. Transkrypt RNA jest określany jako antysensowny RNA", a cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca ten antysensowny RNA jest określana jako gen antysensowny. Antysensowne cząsteczki RNA zdolne są do wiązania cząsteczek mrna, co powoduje zahamowanie translacji mrna. [07] Antysensowny oligonukleotyd wyciszający gen dla IL-17RC lub antysensowny oligonukleotyd specyficznie wyciszający gen dla IL-17RC to oligonukleotyd posiadający sekwencję (a) pozwalającą na tworzenie stabilnego tripleksu z częścią genu IL-17RC lub (b) pozwalającą na tworzenie stabilnego dupleksu z częścią transkryptu mrna genu IL-17RC. [08] Rybozym jest cząsteczką kwasu nukleinowego, która zawiera centrum katalityczne. Określenie to obejmuje enzymy będące RNA, cząsteczki RNA zdolne do autokatalizy splicingu i cięcia oraz cząsteczki kwasu nukleinowego, które posiadają te funkcje katalityczne. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca rybozym nazywana jest genem rybozymu". [09] Zewnętrzna sekwencja kierująca to cząsteczka kwasu nukleinowego, która kieruje endogenny rybozym, RNazę P, do określonego rodzaju wewnątrzkomórkowego mrna, co prowadzi do ciecia mrna przez RNazę P. Cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje zewnętrzną sekwencję kierującą nazywana jest genem kodującym zewnętrzną sekwencję kierującą". [01] Określenie wariantu genu IL-17RC odnosi się do cząsteczki kwasu nukleinowego, która koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej, która jest modyfikacją SEKW. NR ID: 2. Takie warianty obejmują naturalnie występujące polimorfizmy genów IL-17RC, jak również syntetyczne geny, które zawierają konserwatywne podstawienia aminokwasów w sekwencji aminokwasowej SEKW. NR ID: 2. Dodatkowe formy wariantów genów IL-17RC to cząsteczki kwasu nukleinowego, które zawierają insercje lub delecje sekwencji nukleotydowych opisanych w niniejszym dokumencie. Wariant genu IL-17RC można zidentyfikować, na przykład, przez ustalenie, czy gen ten hybrydyzuje w rygorystycznych warunkach z cząsteczką kwasu nukleinowego o sekwencji nukleotydowej SEKW. NR ID: 1 lub SEKW. NR ID: 4, lub z sekwencją do niej komplementarną. [0111] Alternatywnie, warianty genu IL-17RC mogą być identyfikowane przez porównanie sekwencji. Dwie sekwencje aminokwasowe posiadają sekwencję aminokwasową identyczną w 0%", jeśli reszty aminokwasowe obu tych sekwencji aminokwasowych są takie same, gdy sekwencje ułożone są wzgledem sibie w sposób zapewniający maksymalną zgodność. Podobnie dwie sekwencje nukleotydowe posiadają sekwencję nukleotydową identyczną w 0%", jeśli reszty nukleotydowe obu tych sekwencji nukleotydowych są takie same, gdy sekwencje te ułożone są względem siebie w sposób zapewniający maksymalną zgodność. Sekwencje można porównać przy pomocy standardowych programów komputerowych, takich jak te zawarte w pakiecie do przetwarzania danych bioinformatycznych LASERGENE firmy DNASTAR (Madison, Wisconsin). Inne sposoby porównywania dwóch sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych przez określenie optymalnego dopasowania są dobrze znane specjalistom w dziedzinie (patrz np.: Peruški i Peruški, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu i wsp., (eds.), Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins, in Methods in Gene Biotechnology, str (CRC Press, Inc. 1997), i Bishop (ed.), 21

23 Guide to Human Genome Computing, edycja 2 (Academic Press, Inc. 1998)). Poszczególne sposoby służące do ustalania identyczności sekwencji są opisane poniżej. [0112] Niezależnie od tego, jaka metoda stosowana jest do identyfikacji wariantu genu IL-17RC lub wariantu polipeptydu IL-17RC, wariant genu lub wariant polipeptydu kodowanego przez wariant genu może być funkcjonalnie scharakteryzowany pod względem swojej zdolności do specyficznego wiązania przeciwciała anty-il-17rc. Wariant genu IL-17RC lub wariant polipeptydu IL-17RC może być również funkcjonalnie scharakteryzowany pod względem zdolności do wiązania swojego ligandu, np.: IL-17A i/lub IL-17F, przy użyciu biologicznego lub biochemicznego testu opisanego w niniejszym dokumencie. [0113] Określenie wariant alleliczny jest używane w niniejszym dokumencie do określenia dowolnej z dwóch lub większej liczby alternatywnych form genu zajmującego ten sam locus na chromosomie. Zmienność alleliczna powstaje naturalnie w wyniku mutacji lub może wynikać z fenotypowego polimorfizmu w obrębie w populacji. Mutacje genu mogą być ciche (bez zmian w kodowanym polipeptydzie) lub mogą kodować polipeptydy o zmienionej sekwencji aminokwasowej. Termin wariant alleliczny jest również używany w niniejszym dokumencie do określenia białka kodowanego przez wariant alleliczny genu. [0114] Określenie ortolog oznacza polipeptyd lub białko uzyskane z jednego gatunku, który jest funkcjonalnym odpowiednikiem polipeptydu lub białka pochodzącego od innych gatunków. Różnice między sekwencjami ortologów są wynikiem specjacji. [011] Paralogi są odrębnymi białkami wytwarzanymi przez organizm, lecz pokrewnymi pod względem struktury. Uważa się, że paralogi powstają w wyniku duplikacji genu. Na przykład, α-globina, β-globina i mioglobina są względem siebie paralogami. [0116] Niniejszy wynalazek obejmuje funkcjonalne fragmenty genów IL-17RC. W kontekście niniejszego wynalazku, określenie funkcjonalny fragment genu IL-17RC odnosi się do cząsteczki kwasu nukleinowego, która koduje część polipeptydu IL-17RC, która jest opisaną w niniejszym dokumencie domeną, lub która co najmniej wiąże się specyficznie z przeciwciałem anty-il-17rc. [0117] Ze względu na nieprecyzyjność, jaka cechuje standardowe metody analityczne, masy cząsteczkowe i długości polimerów są rozumiane jako wartości przybliżone. Gdy wartość taka jest przedstawiana jako około X lub w przybliżeniu X, podana wartość powinna być rozumiana z dokładnością wynoszącą ± % C) Wytwarzanie polinukleotydów lub genów IL-17RA i IL-17RC [0118] Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące ludzki IL-17RA lub IL-17RC lub polinukleotydy kodujące którykolwiek z rozpuszczalnych polipeptydów według niniejszego wynalazku można otrzymać przez przeszukiwanie ludzkiego cdna lub biblioteki genomowej wykorzystując sondy polinukleotydowe oparte o sekwencje SEKW. NR ID: 1, SEKW. NR ID: 4. Są to standardowe i dobrze rozwinięte techniki, które można stosować z użyciem zestawów do klonowania dostępnych u komercyjnych dostawców. Patrz np.: Ausubel i wsp., (Red.), Short Protocols in Molecular Biology, wydanie 3, John Wiley & Sons 199; Wu i wsp., Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc 1997; Aviv i Leder, Mat. Nat'l Acad. Sci. USA 69:1408 (1972); Huynh i wsp., Constructing and Screening cdna Libraries in λgt and λgt11 w DNA Cloning: A Practical Approach Vol. I, Glover (red.), str. 49 (IRL Press, 198), Wu (1997), str [0119] Cząsteczki kwasu nukleinowego, które kodują ludzki IL-17RA lub gen dla IL-17RC można również otrzymać stosując łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) z użyciem oligonukleotydowych starterów o sekwencjach nukleotydowych opartych na sekwencjach nukleotydowych genu lub cdna dla IL-17RA lub IL- 17RC. Ogólne metody przesiewowych badań bibliotek genomowych z zastosowaniem PCR przedstawiono 22

24 1 na przykład w Yu i wsp., Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries, in Methods in Molecular Biology, Vol. 1: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), Humana Press, Inc., Ponadto, oparte na PCR techniki przeznaczone do izolacji genów opisane są, na przykład w Preston, Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members, w Methods in Molecular Biology, Vol. 1: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), Humana Press, Inc Alternatywnie, gen dla IL-17RA lub gen dla IL-17RC można otrzymać w wyniku syntezy cząsteczek kwasów nukleinowych przy użyciu długich oligonukleotydów będących dla siebie starterami oraz sekwencji nukleotydowych opisanych w niniejszym dokumencie (patrz np.: Ausubel (199)). Stosowane techniki wykorzystujące łańcuchową reakcję polimerazy zapewniają możliwość syntezy cząsteczek DNA o długości co najmniej 2 kpz (Adang i wsp., Molec Plant. Biol. 21:1131 (1993), Bambot i wsp., PCR Methods and Applications 2:266 (1993), Dillon i wsp., Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes, w Methods in Molecular Biology, Vol. 1: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), str , (Humana Press, Inc. 1993) oraz Holowachuk i wsp., PCR Methods Appl. 4:299 (199)). W celu przeglądu literatury dotyczącej syntezy polinukleotydów patrz np.: Glick i Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura i wsp., Annu. Rev Biochem. 3:323 (1984), i Climie i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:633 (1990) D) Wytwarzanie wariantów genów dla IL-17RA lub IL-17RC [0120] Niniejszy wynalazek dostarcza różnorodnych cząsteczek kwasu nukleinowego, w tym cząsteczek DNA i RNA, które kodują polipeptydy IL-17RA lub IL-17RC ujawnione w niniejszym dokumencie. Specjaliści w dziedzinie łatwo rozpoznają, że biorąc pod uwagę kod genetyczny, możliwa jest znaczna zmienność w obrębie sekwencji tych polinukleotydów. Ponadto, niniejszy wynalazek dostarcza również izolowanych, rozpuszczalnych monomerycznych, homodimericznych, heterodimerycznych i multimerycznych polipeptydów receptorowych, które zawierają co najmniej część IL-17RC, która jest zasadniczo homologiczna względem polipeptydu receptorowego o sekwencji SEKW. NR ID: 2. Tak więc, niniejszy wynalazek dotyczy cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących polipeptydy IL-17RA lub IL-17RC, zawierających zdegenerowane nukleotydy o sekwencji SEKW. NR ID: 1 lub SEKW. NR ID: 4 oraz odpowiadające im RNA. [0121] Specjaliści w dziedzinie łatwo rozpoznają, że z punktu widzenia degeneracji kodu genetycznego, możliwa jest znaczna zmienność w obrębie sekwencji tych polinukleotydów. SEKW. NR ID: 7 stanowi zdegenerowaną sekwencję nukleotydową, która obejmuje wszystkie cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące polipeptyd IL-17RC o sekwencji SEKW. NR ID: 2. Specjaliści w dziedzinie zorientują się, że gdy reszta T zostanie zastąpiona resztą U, ta zdegenerowana sekwencja SEKW. NR ID: 7 również dostarcza wszystkich sekwencji RNA kodujących SEKW. NR ID: 2. Tak więc, niniejszy wynalazek dotyczy również cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących polipeptyd IL-17RC i zawierających nukleotydy od 14 do 2229 z sekwencji SEKW. NR ID: 1 oraz ich odpowiedników w postaci RNA. Podobnie, w przypadku, gdy reszta T zostanie zastąpiona resztą U, zdegenerowana sekwencja IL-1-17RC o sekwencji SEKW. NR ID: 6 dostarcza również wszystkich sekwencji RNA kodujących sekwencję SEKW. NR ID:. [0122] Tabela 4 przedstawia jednoliterowe kody do oznaczania pozycji zdegenerowanych nukleotydów. W kolumnie Rozwiązania przedstawiono nukleotydy odpowiadające literze kodu. W kolumnie Komplementarny przedstawiono kod dla komplementarnego nukleotydu(-ów). Przykładowo kod Y oznacza 23

25 albo C albo T, a komplementarny do niego R oznacza A lub G, przy czym A jest komplementarne do G, a G jest komplementarne do C. Tabela 4 Nukleotyd Rozwiązanie Komplementarny Rozwiązanie A A T T C C G G G G C C T T A A R A G Y C T Y C T R A G M A C K G T K G T M A C S C G S C G W A T W A T H A C T D A G T B C G T V A C G V A C G B C G T D A G T H A C T N A C G T N A C G T [0123] Zdegenerowane kodony, obejmujące wszystkie możliwe kodony dla danego aminokwasu, przedstawiono w Tabeli. Tabela Aminokwas Kod jednoliterowy Kodony Cys C TGC TGT TGY Ser S AGT AGC TCA TCC TCT TCG Thr T ACA ACG ACG ACT Pro P CCA CCC CCG CCT Ala A GCA GCC GCG GCT Gly G GGA GGC GGG GGT Kodon zdegenerowany WSN ACN CCN GCN GGN Asn N AAC AAT AAY Asp D GAC GAT GAY Glu E GAA GAG GAR Gln Q CAA CAG CAR His H CAC CAT CAY 24

26 Aminokwas Kod jednoliterowy EP B1 Kodony Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGT Kodon zdegenerowany MGN Lys K AAA AAG AAR Met M ATG ATG Ile I ATA ATC ATT ATH Leu L CTA CTC CTG CTT TTA TTG Val V GTA GTC GTG GTT YTN GTN Phe F TTC TTT TTY Tyr Y TAC TAT TAY Trp W TGG TGG Ter TAA TAG TGA TRR Asn Asp B RAY Glu Gln Z SAR Jakikolwiek aminokwas X NNN 1 20 [0124] Specjalista w dziedzinie będzie świadomy pewnych niejasności powstałych podczas definiowania zdegenerowanego kodonu, reprezentatywnego dla wszystkich możliwych kodonów kodujących aminokwas. Na przykład, zdegenerowany kodon dla seryny (WSN) może w pewnych okolicznościach kodować argininę (AGR), a zdegenerowany kodon dla argininy (MGN) może w pewnych okolicznościach kodować serynę (AGY). Podobna zależność istnieje między kodonami kodującymi fenyloalaninę i leucynę. Dlatego niektóre polinukleotydy zawierające zdegenerowaną sekwencję mogą kodować alternatywne sekwencje aminokwasowe, jednakże specjalista w dziedzinie może łatwo zidentyfikować takie sekwencje alternatywne w oparciu o sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID: 6. Sekwencje alternatywne mogą być łatwo testowane pod względem funkcjonalności, jak opisano powyżej. [012] Różne gatunki mogą wykazywać tzw. stosowanie preferowanego kodonu. Ogólnie patrz: Grantham i wsp., Nucl. Acids Res. 8:1893 (1980), Haas i wsp., Curr. Biol. 6:31 (1996), Wain-Hobson i wsp., Gene 13:3 (1981), Grosjean i Fiers, Gene 18:199 (1982), Holm, Nuc. Acids Res. 14:307 (1986), Ikemura, J. Mol. Biol. 18:73 (1982), Sharp i Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4:81 (1994), Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6:494 (199), i Makrides, Microbiol. Rev 60:12 (1996). Stosowane w niniejszym dokumencie określenie stosowanie preferowanego kodonu lub preferowany kodon to termin w stanie techniki, który odnosi się do kodonów związanych z translacją białek, co oznacza, że w komórkach określonych gatunków faworyzowane jest użycie jednego lub kilku z możliwych do wykorzystania kodonów, tym samym faworyzowany jest jeden lub kilka kodonów z grupy kodonów możliwych do wykorzystania, kodujących każdy z aminokwasów (patrz tabela ). Na przykład, aminokwas treonina (Thr) może być kodowany przez ACA, ACC, ACG, lub ACT, ale w przypadku komórek ssaczych najczęściej używanym kodonem jest kodon ACC; w przypadku innych gatunków, przykładowo w komórkach owadów, drożdży, wirusów lub bakterii preferowane mogą być inne kodony dla Thr. Preferowane kodony w przypadku danego gatunku mogą być wprowadzane do polinukleotydów według niniejszego wynalazku przy użyciu różnorodnych metod znanych 2

27 w stanie techniki. Wprowadzenie sekwencji preferowanego kodonu do rekombinowanego DNA może, na przykład, zwiększyć poziom wytwarzania białka powodując, że w przypadku danego rodzaju komórki lub gatunku, proces translacji białka będzie bardziej wydajny. Dlatego ujawnione w niniejszym dokumencie sekwencje zdegenerowanych kodonów służą jako matryca do optymalizacji ekspresji polinukleotydów w różnych typach komórek i gatunków powszechnie wykorzystywanych w stanie techniki i ujawnionych w niniejszym dokumencie. Sekwencje zawierające preferencyjne kodony mogą być testowane i optymalizowane z punktu widzenia procesu ekspresji w różnych gatunkach oraz badane pod kątem funkcjonalności, jak to zostało ujawnione w niniejszym dokumencie. [0126] Cząsteczka cdna kodująca IL-17RA lub IL-17RC może być izolowana różnymi metodami, takimi jak przeszukiwanie przy pomocy sond z użyciem pełnej lub częściowej cząsteczki ludzkiego cdna lub przeszukiwane z zastosowaniem jednej lub większej liczby zestawów sond o zdegenerowanej sekwencji opartych o ujawnione w niniejszym dokumencie sekwencje. cdna można sklonować stosując łańcuchową reakcję polimerazy oraz starterów zaprojektowanych w oparciu o reprezentatywne sekwencje ludzkiego IL- 17RA lub IL-17RC ujawnione w niniejszym dokumencie. Ponadto, biblioteki cdna mogą być wykorzystane do transformacji lub transfekcji komórek gospodarza, a ekspresję będącego przedmiotem zainteresowania cdna można wykryć przy pomocy przeciwciała skierowanego przeciwko polipeptydowi IL-17RA lub IL- 17RC. [0127] Specjaliści w dziedzinie zorientują się, że ujawniona sekwencja SEKW. NR ID: 1 przedstawia jeden allel ludzkiego IL-17RC oraz, że przewiduje się występowanie wariantów allelicznych i alternatywnego splicingu. Warianty alleliczne tej sekwencji można sklonować stosując przeszukiwanie przy pomocy sond DNA lub bibliotek genomowych pochodzących od różnych osobników zgodnie ze standardowymi procedurami. Warianty alleliczne sekwencji nukleotydowych ujawnionych w niniejszym dokumencie, w tym takich, które zawierają ciche mutacje oraz takich, w których mutacje prowadzą do zmian w sekwencji aminokwasowej, są objęte zakresem niniejszego wynalazku, podobnie jak białka, które są wariantami allelicznymi sekwencji aminokwasowych ujawnionych w niniejszym dokumencie. Cząsteczki cdna utworzone w wyniku alternatywnego splicingu cząsteczek mrna, które zapewniają zachowanie właściwości polipeptydu IL-17RC objęte są zakresem niniejszego wynalazku, podobnie jak polipeptydy kodowane przez takie cząsteczki cdna i mrna. Warianty alleliczne i warianty splicingowe tych sekwencji mogą być klonowane za pomocą przeszukiwania przy pomocy sond cdna lub z użyciem bibliotek genomowych pochodzących od różnych osobników lub tkanek, zgodnie ze standardowymi procedurami znanymi w stanie techniki. [0128] Korzystając z metod opisanych powyżej, specjalista w dziedzinie będzie potrafił otrzymać polipeptyd według niniejszego wynalazku E) Wytwarzanie polipeptydów IL-17RC, IL-17RA i IL-17RC/IL-17RA [0129] Polipeptyd według niniejszego wynalazku może być wytwarzany w rekombinowanych komórkach gospodarza przy użyciu następujących konwencjonalnych techniki. W celu ekspresji genu dla IL-17RC/IL- 17RA, cząsteczka kwasu nukleinowego kodującego ten polipeptyd musi być funkcjonalnie połączona w wektorze ekspresyjnym z sekwencjami regulatorowymi, które kontrolują transkrypcyjną ekspresję, a następnie wprowadzona do komórki gospodarza. Oprócz sekwencji regulatorowych istotnych dla transkrypcji, takich jak promotory i enhancery, wektory ekspresyjne mogą zawierać sekwencje regulatorowe translacji oraz gen markerowy odpowiedni do selekcji komórek zawierających ten wektor ekspresyjny. 26

28 [0130] Wektory ekspresyjne, które nadają się do wytwarzania obcych białek w komórkach eukariotycznych zawierają zazwyczaj (1) elementy prokariotycznego DNA kodujące bakteryjne miejsce startu replikacji i marker oporności na antybiotyk w celu zapewnienia namnażania się i selekcji wektora ekspresyjnego w bakteryjnych gospodarzu; (2) elementy eukariotycznego DNA, które kontrolują inicjację transkrypcji, takie jak promotor oraz (3) elementy DNA do kontroli przetwarzania transkryptu, takie jak sekwencja zakończenia transkrypcji/sekwencja poliadenylacji. Jak już wspomniano, wektory ekspresyjne mogą także zawierać sekwencje nukleotydowe kodujące sekwencję sekrecyjną, która kieruje heterologiczny polipeptyd na szlak wydzielniczy komórki gospodarza. Na przykład, wektor ekspresyjny może zawierać gen IL-17RC/IL-17RA oraz sekwencję sekrecyjną pochodzącą z dowolnego genu kodującego białko sekrecyjne. [0131] Polipeptyd według niniejszego wynalazku może być wyrażany w komórkach ssaczych. Przykłady odpowiednich komórek gospodarza pochodzących od ssaków obejmują komórki nerki afrykańskiej małpy zielonej (Vero; ATCC CRL 187), ludzkie zarodkowe komórki nerki (293-HEK; ATCC CRL 173), komórki nerki noworodka chomika (BHK-21, BHK-70; ATCC CRL 844, ATCC CRL 314), komórki nerek psów (MDCK; ATCC CCL 34), komórki jajnika chomika chińskiego (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin i wsp., Som. Cell. Molec. Genet. 12:, 1986)), komórki przysadki mózgowej szczura (GH1; CCL82 ATCC), komórki HeLa S3 (ATCC CCL2.2), komórki wątroby szczura (H-4-II-E; ATCC CRL 148) transformowane SV40 komórki nerki małpy (COS-1; ATCC CRL 160) i zarodkowe komórki myszy (NIH-3T3; ATCC CRL 168). [0132] W przypadku gospodarza będącego ssakiem, źródłem sygnałów regulatorowych transkrypcji i translacji mogą być wirusy, np.: adenowirus, wirus brodawczaka bydła, wirus Simian, itp., w których sygnały regulacyjne związane są z określonym genem charakteryzującym się wysokim poziomem ekspresji. Odpowiednie sekwencje regulatorowe transkrypcji i translacji można również uzyskać z ssaczych genów, na przykład z genów aktyny, kolagenu, miozyny i metalotioneiny. [0133] Sekwencje regulatorowe transkrypcji obejmują region promotora wystarczający do bezpośredniej inicjacji syntezy RNA. Odpowiednie promotory eukariotyczne obejmują promotor myszy dla genu metalotioneiny I (Hamer i wsp., J. Molec. Appl. Genet. 1:273 (1982)), promotor TK wirusa opryszczki Herpes (McKnight, Cell 31:3 (1982)), wczesny promotor wirusa SV40 (Benoist i wsp., Nature 290:304 (1981)), promotor wirusa mięsaka Rousa (Gorman i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:6777 (1982)), promotor wirusa cytomegalii (Foecking i wsp., Gene 4:1 (1980)), promotor wirusa wywołującego guz sutka u myszy (patrz ogólnie: Etcheverry, Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture, in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland i wsp., (eds.), str (John Wiley & Sons, Inc. 1996)). [0134] Alternatywnie, prokariotyczny promotor, taki jak promotor polimerazy RNA bakteriofaga T3, może zostać użyty do kontroli ekspresji genów w komórkach ssaków, jeżeli ten prokariotyczny promotor regulowany jest przez promotor eukariotyczny (Zhou i wsp., Mol. Cell. Biol. :429 (1990) oraz Kaufman i wsp., Nucl. Acids Res. 19:448 (1991)). [013] W określonych wykonaniach niniejszego wynalazku, sekwencja DNA kodująca rozpuszczalny polipeptyd receptorowy jest funkcjonalnie połączona w obrębie wektora ekspresyjnego z innymi elementami genetycznymi wymaganymi dla jej ekspresji, ogólnie obejmującymi promotor i terminator. Zazwyczaj taki wektor będzie zawierał jeden lub większą liczbę markerów selekcyjnych oraz jedno lub więcej miejsc startu replikacji. Jednak dla specjalistów w dziedzinie będzie zrozumiałe, że w niektórych systemach markery selekcyjne mogą być dostarczane na oddzielnych wektorach, a do replikacji egzogennego DNA może dochodzić na drodze integracji z genomem komórki gospodarza. Wybór promotorów, terminatorów, 27

29 markerów selekcyjnych, wektorów oraz innych elementów jest przedmiotem rutynowego projektowania i leży w zakresie wiedzy specjalisty w dziedzinie. Wiele z tych elementów opisano w literaturze i są one dostępne u komercyjnych dostawców. Różnorodne elementy rozpuszczalnego kompleksu receptorowego mogą być przedmiotem kotransfekcji z użyciem osobnych wektorów ekspresyjnych lub znajdować się w jednym wektorze ekspresyjnym. Takie techniki ekspresji różnorodnych składników kompleksów białkowych są dobrze znane w stanie techniki. [0136] Wektor ekspresyjny można wprowadzić do komórki gospodarza przy użyciu rozmaitych standardowych technik, włączając w to transfekcję z użyciem fosforanu wapnia, transfekcję z wykorzystaniem liposomów, wprowadzanie DNA poprzez mikrowstrzeliwanie, elektroporację i tym podobne. Transfekowane komórki mogą być poddane procesowi selekcji i namnażane w celu dostarczenia rekombinowanych komórek gospodarza zawierających wektor ekspresyjny stabilnie zintegrowany z genomem komórki gospodarza. Techniki wprowadzania wektorów do komórek eukariotycznych oraz techniki wyboru takich stabilnych transformantów przy użyciu dominującego markera selekcyjnego opisał np. Ausubel (199) i Murray (red.), Gene Transfer and Expression Protocols (Human Press 1991). [0137] Przykładem odpowiedniego markeru selekcyjnego jest gen zapewniający oporność na antybiotyk neomycynę. W tym przypadku, selekcje przeprowadza się w obecności leku typu neomycyna, takiego jak G- 418, itp. Systemy selekcyjne można również wykorzystać w celu zwiększenia poziomu ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania w procesie określanym jako amplifikacja. Amplifikację przeprowadza się hodując transfektanty w obecności niskiego stężenia czynnika selekcyjnego, a następnie zwiększając ilość czynnika selekcyjnego w celu selekcji komórek wytwarzających wysoki poziom produktu wprowadzonego genu. Odpowiednim dla celów amplifikacji markerem selekcyjnym jest reduktaza dihydrofolianowa (DHFR), której obecność zapewnia oporność na metotreksat. Można zastosować również inny gen oporności na lek (np. gen oporności na higromycynę, oporności wielolekowej, oporności na acetylotransferazę puromycyny). Alternatywnie w celu oddzielenia komórek transfekowanych od komórek nietransfekowanych, stosując sortowanie FACS lub technikę separacji opartą o kuleczki magnetyczne, można użyć markerów wprowadzających zmieniony fenotyp, takich jak białko zielonej fluorescencji lub białka powierzchniowe, takie jak CD4, CD8, cząsteczki MHC klasy I, łożyskowa alkaliczna fosfataza. [0138] Polipeptyd według niniejszego wynalazku może być również wytwarzany w hodowli ssaczych komórek z zastosowaniem opartego na cząsteczkach wirusa systemu wprowadzania kwasu nukleinowego do komórki. Przykładowymi wirusami stosowanymi w tym celu są adenowirusy, retrowirusy, wirusy opryszczki, wirus ospy i wirus towarzyszący adenowirusom (AAV). Adenowirus, zawierający dwuniciowe DNA, jest obecnie najlepiej zbadanym wektorem przeznaczonym do transferu genów służącym do wprowadzania heterologicznego kwasu nukleinowego (patrz praca przeglądowa: Becker i wsp., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994) oraz Douglas i Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)). Zalety systemu opartego na adenowirusach obejmują możliwość upakowania stosunkowo dużych insertów DNA, zdolność do charakteryzującego się wysokim mianem wzrostu, zdolność do zakażania szerokiego zakresu typów komórek ssaczych oraz elastyczność, która pozwala na korzystanie z dużej liczby dostępnych wektorów zawierających różne promotory. [0139] W wyniku usunięcia części genomu adenowirusa, możliwe jest upakowanie większych insertów (do 7 kpz) heterologicznego DNA. Inserty te mogą być włączone do wirusowego DNA poprzez bezpośrednią ligację lub na drodze rekombinacji homologicznej z użyciem kotransfekowanego plazmidu. Jedną z opcji jest delecja istotnego genu E1 z wektora wirusowego, która powoduje, że wirus nie jest zdolny do replikacji, 28

30 chyba że gen E1 dostarczany jest przez komórkę gospodarza. W celu wytworzenia znacznych ilości białka, ludzkie komórki 293 zainfekowane wektorem adenowirusowym (ATCC nr CRL-173, 404, 40), można na przykład namnażać jako komórki adherentne lub jako kultury w zawiesinie o stosunkowo wysokiej gęstości komórek (patrz: Garnier i wsp., Cytotechnol. 1:14 (1994)). [0140] Polipeptyd według niniejszego wynalazku może być również wyrażany w innych komórkach pochodzących od wyższych Eucaryota, takich jak komórki ptaków, grzybów, owadów, drożdży lub roślin. System ekspresyjny oparty na bakulowirusie jest skutecznym środkiem do wprowadzania klonowanych genów do komórek owadów. Odpowiednie wektory ekspresyjne oparte są na wirusie poliedrozy jądrowej Autographa californica (AcMNPV) i zawierają dobrze znane promotory, takie jak promotor białka szoku cieplnego (hsp) 70 u Drosophila, promotor natychmiastowego-wczesnego genu wirusa polihedrozy jądrowej u Autographa californica (ie-1) oraz wczesny-późny promotor 39K, promotor p bakulowirusa oraz promotor metalotioneiny Drosophila. Drugi sposób wytwarzania rekombinowanego bakulowirusa wykorzystuje system oparty na transpozycji zależnej od transpozonu opisany przez Luckowa (Luckow, i wsp., J. Virol. 67:466 (1993)). System ten, wykorzystujący wektory transferowe, sprzedawany jest w zestawie BAC-to-BAC Kit (Life Technologies, Rockville, MD). System ten wykorzystuje wektor transferowy PFASTBAC (Life Technologies), zawierający transpozon Tn7 służący do przenoszenia DNA kodującego polipeptyd do genomu bakulowirusa znajdującego się w E. coli jako duży plazmid nazywany bakmidem, patrz: Hill- Perkins i Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning, i wsp., J. Gen. Virol. 7:11 (1994) oraz Chazenbalk i Rapoport, J. Biol. Chem. 270:143 (199). Ponadto wektory transferowe mogą zawierać połączenie w obrębie tej samej ramki odczytu z DNA kodującym znacznik znajdujący się na C-lub N-końcu wyrażanego polipeptydu, np. znacznik epitopu Glu-Glu (Grussenmeyer i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. 82:792 (198)). Za pomocą znanej w stanie techniki metody, wektor transferowy zawierający gen kodujący polipeptyd według niniejszego wynalazku wprowadzany jest do E. coli. W wyniku przeszukiwania identyfikuje się bakmidy zawierające przerwany gen lacz, który wskazuje na obecność rekombinowanego bakulowirusa. Bakmid DNA zawierający genom rekombinowanego bakulowirusa jest następnie izolowany za pomocą znanych technik. [0141] Przykładowy wektor PFASTBAC może być w znacznym stopniu modyfikowany. Przykładowo można usunąć promotor polihedryny i zastąpić go promotorem podstawowego białka bakulowirusa (znanym również jako promotor Pcor, p6.9 lub promotor MP), który wrażany jest we wczesnej fazie zakażenia bakulowirusem oraz który okazał się być korzystny w ekspresji białek wydzielniczych (patrz np.: Hill-Perkins i Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning, i wsp., J. Gen. Virol. 7:11 (1994), i Chazenbalk i Rapoport, J. Biol. Chem. 270:143 (199). W takich konstruktach wektora transferowego można zastosować krótkie lub długie wersje podstawowego promotora. Co więcej, wektory transferowe można konstruować zastępując natywne sekrecyjne sekwencje sygnałowe sekrecyjnymi sekwencjami sygnałowymi z białek owadzich. Na przykład w celu zastąpienia w konstruktach natywnej sekrecyjnej sekwencji sygnałowej białka IL-17RC, można zastosować sekrecyjną sekwencję sygnałową glukozylotransferazy ekdysteroidu (EGT), melityny z miodu pszczelego (Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA), lub gp67 bakulowirusa (PharMingen: San Diego, CA) [0142] Ten rekombinowany wirus lub bakmid służy do transfekcji komórek gospodarza. Odpowiednie owadzie komórki gospodarza obejmują: linie komórkowe pochodzące z IPLB-Sf-21, linię komórkową jajnika poczwarki Spodoptera frugiperda, takich jak Sf9 (ATCC CRL 1711), Sf21AE i Sf21 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), jak również komórki Schneider-2 Drosophila oraz linię komórkową HIGH FIVEO (Invitrogen) 29

31 pochodząca od Trichoplusia ni (Patent USA nr 30043). W celu namnażania i hodowli komórek można stosować komercyjnie dostępne, wolne od surowicy, podłoża. Odpowiednim podłożem dla komórek Sf9 jest podłoże Sf900 II (Life Technologies) lub EFS 921 (Expression Systems), a w przypadku komórek T. ni: podłoże Ex-cellO40 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) lub Express FiveO (Life Technologies). W przypadkach, gdy stosowany jest wirus rekombinowany, komórki są zazwyczaj namnażane do chwili, gdy hodowla osiągnie gęstość odpowiednią do inokulacji, wynoszącą około od 2- x do 1-2 x 6 komórek. W takim momencie dodawany jest roztwór podstawowy rekombinowanego wirusa o współczynniku zakażenia wynoszącym od 0.1 do, najczęściej około 3. [0143] Opracowane techniki do wytwarzania białek rekombinowanych w systemach opartych na bakulowirusach przedstawił Bailey i wsp.: Manipulation of Baculovirus Vectors, in Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), str (The Humana Press, Inc. 1991), by Patel i wsp., The baculovirus expression system, w DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover i wsp., (eds.), str (Oxford University Press 199), by Ausubel (199) at str to 16-7, by Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 199) oraz Lucknow, Insect Cell Expression Technology, in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland i wsp., (eds.), str (John Wiley & Sons, Inc. 1996). [0144] Do ekspresji genów opisanych w niniejszym dokumencie można również użyć komórek grzybów, w tym komórek drożdży. Gatunki drożdży będące przedmiotem zainteresowania w odniesieniu do niniejszego wynalazku obejmują: Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris i Pichia methanolica. Grupa promotorów odpowiednich do ekspresji w komórkach drożdży obejmuje promotory GAL1 (galaktozy), PGK (kinazy fosfoglicerynianowej), ADH (dehydrogenazy alkoholowej), AOX1 (oksydazy alkoholu), HIS4 (dehydrogenazy histydynolu), i tym podobne. Zaprojektowano wiele drożdżowych wektorów do klonowania i są one łatwo dostępne. Wektory te obejmują wektory oparte na YIp, takie jak YIp, wektory YRp, takie jak YRp 17, wektory YEp, takie jak YEp13 oraz wektory YCp, takie jak YCp 19. Metody transformacji komórek S. cerevisiae obcym DNA oraz metody wytwarzania w tych komórkach, na bazie tego DNA, rekombinowanych polipeptydów ujawnił np. Kawasaki, patent USA nr , Kawasaki i wsp., Patent USA nr , Brake, patent USA nr , Welch i wsp., Patent USA nr oraz Murray i wsp., Patent USA nr Transformowane komórki są selekcjonowane w oparciu o fenotyp nadany im przez marker selekcyjny. Najczęściej jest to oporność na leki lub zdolność do wzrostu w warunkach braku danego składnika odżywczego (np. leucyny). Odpowiednim opartym na wektorach systemem do zastosowania u Saccharomyces cerevisiae jest system POT1 ujawniony przez Kawasaki i wsp., (Patentowy US ), który pozwala na selekcję transfektantów poprzez hodowlę na podłożach zawierających glukozę. Dodatkowe odpowiednie do stosowania w drożdżach promotory i terminatory obejmują te pochodzące od genów enzymów glikolitycznych (patrz np.: Kawasaki, patent USA nr , Kingsman i wsp., Patent USA nr oraz Bitter, patent USA nr ) oraz genów dehydrogenazy alkoholowej. Zobacz także patenty US nr , 06314, oraz [014] W stanie techniki znane są systemy do transformacji innych gatunków drożdży, w tym Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii i Candida maltosa. Patrz np.: Gleeson i wsp., J. Gen. Microbiol. 132:349 (1986) oraz Cregg, patent US nr Można wykorzystać komórki Aspergillus, zgodnie z metodą opisaną przez McKnight i wsp., Patent US nr Metody transformacji 30

32 Acremonium chrysogenumare ujawnił Sumino i wsp., patent US nr Sposoby transformacji Neurospora zostały ujawnione przez Lambowitz, patent USA nr [0146] Na przykład, zastosowanie Pichia methanolica jako gospodarza do wytwarzania białek rekombinowanych zostało ujawnione przez Raymond, patent USA nr , Raymond, patent USA nr , Raymond i wsp., Yeast, 14:11-23 (1998), w międzynarodowej publikacji nr WO 97/1740, WO 97/1741, WO 98/0236 oraz WO 98/026. Cząsteczki DNA przeznaczone do transformacji P. methanolica będą najczęściej przygotowywane w postaci dwuniciowej jako koliste plazmidy, które przed transformacją będą raczej przekształcane w zlinearyzowaną formę. W przypadku wytwarzania polipeptydów w P. methanolica, promotorem i terminatorem w plazmidzie może być promotor lub terminator genu P. methanolica, takiego jak gen wykorzystania alkoholu u P. methanolica (AUG1 lub AUG2). Inne przydatne promotory obejmują promotory genów syntazy dihydroksyacetonu (DHAS), dehydrogenazy mrówczanu (FMD) i katalazy (CAT). W celu ułatwienia integracji DNA z chromosomem gospodarza, korzystne jest, aby cała kaseta ekspresyjna plazmidu posiadała po obu stronach sekwencje flankujące pochodzące od DNA gospodarza. Odpowiednim do stosowania u Pichia methanolica jest pochodzący od P. methanolica gen ADE2, który koduje karboksylazę fosforybozylo--aminoimidazolu (AIRC; EC ) i który pozwala komórkom gospodarza posiadającym gen ADE2 na wzrost w warunkach braku adeniny. W przypadku procesu prowadzonego na skalę przemysłową, gdzie pożądane jest, aby zminimalizować stosowanie metanolu, można zastosować komórki gospodarza, w których delecji uległy oba geny zapewniające wykorzystanie metanolu wykorzystania metanolu (AUG1 i AUG2). W przypadku, gdy wytwarzane są białka wydzielnicze, komórki gospodarza mogą wykazywać braki dotyczące genów proteazy wakuolarnej (PEP4 i PRB1). Elektroporacja stosowana jest w celu ułatwienia wprowadzenia plazmidu zawierającego DNA kodujący polipeptyd będący przedmiotem wynalazku do komórek P. methanolica. Komórki P. methanolica mogą być transformowane na drodze elektroporacji przy użyciu słabnącego wykładniczo, pulsacyjnego pola elektrycznego o natężeniu od 2. do 4. kv/cm, korzystnie około 3.7 kv/cm i stałej czasowej (t) wynoszącej od 1 do 40 milisek., a najkorzystniej około 20 milisek. [0147] Wektory ekspresyjne mogą być wprowadzane do protoplastów roślin, nienaruszonych tkanek roślinnych lub pojedynczych komórek roślinnych. Metody wprowadzania wektorów ekspresyjnych do tkanek roślinnych obejmują bezpośrednie zakażanie lub kohodowlę tkanki roślinnej z Agrobacterium tumefaciens, mikrowstrzeliwanie, iniekcję DNA, elektroporację i tym podobne. Patrz np.: Horsch i wsp., Science 227:1229 (198), Klein i wsp., Biotechnology :268 (1992) oraz Miki i wsp., Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants, w Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick i wsp., (eds.), str (CRC Press, 1993). [0148] Alternatywnie, geny kodujące polipeptyd według niniejszego wynalazku mogą być wyrażane w prokariotycznych komórkach gospodarza. Promotory odpowiednie do ekspresji polipeptydu w prokariotycznych gospodarzach są dobrze znane specjalistom w dziedzinie i obejmują promotory rozpoznawane przez polimerazy T4, T3, SP6 i T7, promotory P R oraz P L bakteriofaga λ, trp, reca, pochodzące od E. coli promotory szoku cieplnego, lacuv, tac, LPP-lacSpr, phoa i lacz, promotory B. subtilis, promotory bakteriofagów Bacillus, promotory Streptomyces, promotor int bakteriofaga λ, promotor bla pochodzący od pbr322, promotor CAT genu acetylotransferazy chloramfenikolu. Promotory prokariotyczne omówiono w: Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987), Watson i wsp., Molecular Biology of the Gene, 4th Ed. (Benjamin Cummins 1987) oraz Ausubeli wsp., (199). 31

33 [0149] Grupa odpowiednich gospodarzy prokariotycznych obejmuje E. coli i Bacillus subtilus. Do odpowiednich szczepów E. coli należą szczepy: BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH, DHI, DHIF, DHIMCR, DHB, DHB/p3, DH11S, C600, HB1, JM1, JM, JM9, JM1, K38, RR1, Y88, Y89, CSH18, ER141 i ER1647 (patrz np.: Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Odpowiednie szczepy Bacillus subtilus to BR11, YB886, MI119, MI120 i B170 (patrz np.: Hardy, Hardy, Bacillus Cloning Methods, w DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 198)). [0] Podczas ekspresji polipeptydu według niniejszego wynalazku, w bakterii takiej jak E. coli, polipeptyd ten może być zatrzymany w cytoplazmie, zazwyczaj w postaci nierozpuszczalnych granulek, lub może być skierowany do przestrzeni periplazmatycznej za pomocą bakteryjnej sekwencji sekrecyjnej. W pierwszym przypadku, komórki ulegają lizie, a granulki są odzyskiwane i poddawane denaturacji przy pomocy np. izotiocyjanianu guanidyny lub mocznika. Zdenaturowany polipeptyd może być następnie poddany ponownemu fałdowaniu i dimeryzacji poprzez rozcieńczenie czynnika denaturującego, na przykład przeprowadzenia dializy do roztworu mocznika i mieszaniny zredukowanego i utlenionego glutationu, a następnie dializy do buforowanego roztworu soli fizjologicznej. W tym drugim przypadku, polipeptyd może być odzyskany z przestrzeni periplazmatycznej w rozpuszczalnej i funkcjonalnej formie poprzez rozbicie komórek (na przykład przy pomocy ultradźwięków lub wstrząsu osmotycznego), w celu uwolnienia zawartości przestrzeni periplazmatycznej i odzyskania białka. Sposób ten pozwala uniknąć etapu denaturacji i refałdowania. [011] Sposoby ekspresji białek w komórkach gospodarza prokariotycznego są dobrze znane specjalistom w dziedzinie (patrz np.: Williams i wsp., Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies, w DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover i wsp., (eds.), str. 1 (Oxford University Press 199), Ward i wsp., Genetic Manipulation and Expression of Antibodies, w Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, str. 137 (Wiley-Liss, Inc. 199) oraz Georgiou, Expression of Proteins in Bacteria, w Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland i wsp., (eds.), str. 1 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)). [012] Standardowe sposoby wprowadzania wektorów ekspresyjnych do komórek bakterii, drożdży, owadów i roślin są opisane przez Ausubel (199). [013] Ogólne metody ekspresji i odzyskiwania obcych białek wytwarzanych przez systemy oparte na komórkach ssaczych są opisane przez Etcheverry w Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture, w Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland i wsp., (eds.), str. 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). Standardowe techniki odzyskiwania białka wytwarzanego przez systemy oparte na bakteriach są opisane np. przez Grisshammer i wsp., Purification of over-produced proteins from E. coli cells, w DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover i wsp., (eds.), str (Oxford University Press 199). Opracowane metody izolacji białek rekombinowanych w systemie opartym na bakulowirusie opisał Richardson (red.), Baculovirus Expression Protocols (Humana Press, Inc 199). [014] Alternatywnie, polipeptyd według niniejszego wynalazku może być syntetyzowany wyłącznie w procesie syntezy na fazie stałej, lub przy użyciu metod częściowo opartych na syntezie na fazie stałej, częściowej kondensacji, klasycznych rozwiązań stosowanych w syntezie. Te metody syntezy są dobrze znane specjalistom w dziedzinie (patrz np.: Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 8:2149 (1963), Stewart i wsp., Solid Phase Peptide Synthesis (2nd Edition), (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer i Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986), Atherton i wsp., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989), Fields i 32

34 Colowick, Solid-Phase Peptide Synthesis, Methods in Enzymology Volume 289 ((Academic Press 1997) oraz Lloyd-Williams i wsp., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)). Standardowe jest również stosowanie odmian strategii opartych na całkowitej syntezie, takich jak ligacja chemiczna form natywnych i ligacja wyrażanego białka (patrz np.: Dawson i wsp., Science 266:776 (1994), Hackeng i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:784 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997), Muir i wsp, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 9:670 (1998) oraz Severinov i Muir, J. Biol. Chem. 273:1620 (1998)). [01] Niniejszy wynalazek przewiduje również chemicznie modyfikowane kompozycje, w których polipeptyd jest związany z polimerem. Zazwyczaj polimer jest rozpuszczalny w wodzie w taki sposób, aby koniugat nie precypitował w środowisku wodnym, takim jak środowisko fizjologiczne. Przykładem odpowiedniego polimeru jest polimer, który został zmodyfikowany tak, że posiada jedną grupę reaktywną, taką jak aktywny ester - do reakcji acylowania lub aldehyd - do reakcji alkilacji. W ten sposób można kontrolować stopień polimeryzacji. Przykładem reaktywnego aldehydu jest aldehyd propionowy glikolu polietylenowego lub jego mono-(c1-c)-alkoksylowe lub aryloksylowe pochodne (patrz np.: Harris, i wsp., Patent USA nr 22714). Polimer może być rozgałęziony lub nierozgałęziony. Ponadto, do wytwarzania koniugatów można użyć mieszaniny polimerów. [016] Stosowane do leczenia koniugaty według niniejszego wynalazku mogą zawierać farmaceutycznie dopuszczalne rozpuszczalne w wodzie ugrupowania polimeru. Odpowiednie rozpuszczalne w wodzie polimery obejmują glikol polietylenowy (PEG), monometoksy-peg, mono-(c1-c)-alkoksy-peg, aryloksy- PEG, poli-(n-winylopirolidon)-peg, 2,2,2-trifluoroetanosulfonylo monometoksy-peg (ang. tresyl monomethoxy PEG), aldehyd propionowy PEG, węglan bis-sukcynoimidylu-peg, homopolimery glikolu propylenowego, kopolimery tlenek propylenu/tlenek etylenu, polioksyetylowane poliole (np. glicerol), alkohol poliwinylowy, dekstran, celulozę lub inne polimery oparte na węglowodanach. Odpowiedni PEG może mieć masę cząsteczkową wynoszącą od około 600 do około 60000, w tym na przykład, 000, 12000, i Koniugat ten może również zawierać mieszaninę takich rozpuszczalnych w wodzie polimerów. [017] Jednym z przykładów koniugatu jest koniugat polipeptydu według niniejszego wynalazku z tlenkiem polialkilenowym przyłączonym na N-końcu tego polipeptydu. Jednym z odpowiednich tlenków polialkilenowych jest PEG. Przykładem jest polipeptyd, który może być zmodyfikowany przez połączenie z PEG w procesie znanym jako pegylowanie". Pegylowanie polipeptydu może być przeprowadzone przy pomocy jakiejkolwiek z reakcji pegylacji znanej w stanie techniki (patrz np.: EP014316, Delgado i wsp., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249 (1992), Duncan i Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994) oraz Francis i wsp., Int J Hematol 68:1 (1998)). Przykładowo, pegylowanie może być wykonane przez zastosowanie reakcji acylowania lub reakcji alkilowania z reaktywną cząsteczką glikolu polietylenowego. W alternatywnym podejściu, koniugaty otrzymywane są w wyniku reakcji kondensacji aktywowanego PEG, w którym terminalna grupa hydroksylowa lub aminowa PEG została zastąpiona przez aktywowany linker (patrz np.: Karasiewicz i wsp., patent USA nr 38267). [018] Pegylowanie przez acylowanie wymaga zazwyczaj, aby zaszła reakcja aktywnej estrowej pochodnej PEG z polipeptydem. Przykładem aktywowanego estru PEG jest PEG estryfikowany do N- hydroksysukcynimidu. Stosowane tu określenie acylacja obejmuje następujące rodzaje połączeń między polipeptydem i rozpuszczalnym w wodzie polimerem: amid, karbaminian, uretan, i tym podobne. Metody wytwarzania pegylowanego IL-17RG/IL-17RA przez acylowanie zazwyczaj obejmują następujące etapy: (a) reakcję polipeptydu IL-17RC/IL-17RA z PEG (takim jak reaktywny ester pochodnej aldehydowej PEG) w 33

35 warunkach, w których do IL-17RC/IL-17RA przyłączana jest jedna lub więcej grup PEG oraz (b) uzyskanie produktów reakcji. Ogólnie, optymalne warunki reakcji, w przypadku reakcji acylacji, będą ustalone w oparciu o znane parametry i oczekiwane wyniki. Na przykład, im większy jest stosunek PEG do IL-17RC/IL-17RA, tym większy będzie odsetek polipegylowanego produktu IL-17RC/IL-17RA. [019] Produkt reakcji pegylacji przez acylowanie jest zwykle produktem poli-pegylowanym, w którym grupy ε-aminowe lizyny są pegylowane przez łączącą je grupę acylową. Przykładem łączącego ugrupowania jest wiązanie amidowe. Zazwyczaj otrzymany IL-17RC/IL-17RA będzie w co najmniej 9% mono-, di-lub tripegylowany, choć w zależności od warunków reakcji tworzone mogą być również pewne produkty charakteryzujące się wyższym stopniem pegylacji. Formy pegylowane mogą być oddzielane od form nieskoniugowanych polipeptydów IL-17RC/IL-17RA za pomocą standardowych metod oczyszczania, takich jak dializa, ultrafiltracja, chromatografia jonowymienna, chromatografia powinowactwa, i tym podobne. [0160] Pegylowanie przez alkilowanie polega z reguły na reakcji terminalnej aldehydowej pochodnej PEG z IL-17RC/1L-17RA w obecności czynnika redukującego. Grupy PEG mogą być przyłączone do polipeptydu porzez ugrupowanie -CH 2 NH. [0161] Derywatyzacja z zastosowaniem redukcyjnego alkilowania do wytwarzania monopegylowanego produktu ma tę zaletę, że pozwala wykorzystać różnice w reaktywności różnych typów pierwszorzędowych grup aminowych dostępnych do derywatyzacji. Zwykle reakcję prowadzi się przy ph, które pozwala wykorzystać różnice pka między ε-aminowymi grupami reszt lizyny i N-końcową grupą α-aminową białka. Zastosowanie takiej selektywnej derywatyzacjj pozwala na kontrolowanie przyłączania do białka rozpuszczalnego w wodzie polimeru, który zawiera grupę reaktywną, taką jak aldehyd. Koniugacja z polimerem zachodzi głównie na N -końcu białka, bez istotnej modyfikacji innych reaktywnych grup, takich jak grupy aminowe bocznych łańcuchów lizyny. Niniejszy wynalazek dotyczy zasadniczo jednorodnego preparatu koniugatów IL-17RC/IL-17RA z pojedynczą cząsteczka polimeru. [0162] Redukcyjne alkilowanie w celu wytworzenia zasadniczo jednorodnej populacji cząsteczki koniugatu IL-17RC/IL-17RA z pojedynczą cząsteczką polimeru może obejmować następujące etapy: (a) reakcję polipeptydu IL-17RC/IL-17RA z reaktywną formą cząsteczki PEG w warunkach redukcyjnego alkilowania w ph umożliwiającym selektywną modyfikację grupy α-aminowej na N-końcu IL-17RC/IL-17RA oraz (b) uzyskanie produktu/(ów) reakcji. Czynnik redukujący stosowany do redukcyjnego alkilowania powinien być stabilny w roztworze wodnym i pozwala na redukcję jedynie tych zasad Schiffa, które powstały w początkowym procesie redukcyjnego alkilowania. Przykładowe czynniki redukujące obejmują borowodorek sodu, cyjanoborowodorek sodu, boran dimetyloaminy, boran trimetyloaminy oraz kompleks pirydyna-boran. [0163] W celu otrzymania zasadniczo jednorodnej populacji koniugatów pojedynczej cząsteczki polimeru z IL-17RC/IL-17RA, stosuje się takie warunki podczas reakcji redukcyjnego alkilowania, które pozwalają na selektywne przyłączenie rozpuszczalnego w wodzie ugrupowania polimeru do N-końca IL-17RC/IL-17RA. Takie warunki reakcji zazwyczaj zapewniają obecność różnicy między pka grup aminowych lizyny a pka grupy α-aminowej na N -końcu. Wartość ph wpływa także na stosowany stosunek polimeru do białka. Ogólnie przy niższym ph wymagany będzie większy nadmiar polimeru względem białka, ponieważ im mniej reaktywna jest N -końcowa grupa α, tym więcej polimeru potrzeba, aby osiągnąć optymalne warunki. Przy wyższym ph stosunek polimer:il-17rc/il-17ra nie musi być tak duży, ponieważ dostępnych jest więcej reaktywnych grup. Zazwyczaj, wartości ph mieszczą się w zakresie od 3 do 9, lub od 3 do 6. Metoda ta może być użyta do wytwarzania homodimerycznych, heterodimerycznych lub multimerycznych rozpuszczalnych receptorowych koniugatów zawierajacych IL-17RC/IL-17RA. 34

36 1 [0164] Innym czynnikiem, który należy rozważyć, jest ciężar cząsteczkowy rozpuszczalnego w wodzie polimeru. Ogólnie, im wyższa jest masa cząsteczkowa polimeru, tym mniejsza jest liczba cząsteczek polimeru, które mogą być przyłączone do białka. W przypadku reakcji pegylacji, typowe masy cząsteczkowe wynoszą od około 2 kda do około 0 kda, od około kda do około 0 kda lub od około 12 kda do 2 kda. Stosunek molowy rozpuszczalnego w wodzie polimeru do IL-17RC/IL-17RA będzie na ogół w zakresie od 1:1 do 0:1. Zazwyczaj stosunek molowy rozpuszczalnego w wodzie polimeru do IL-17RC/IL-17RA będzie wynosił w przypadku polipegylacji od 1:1 do 20:1 oraz w przypadku monopegylacji od 1:1 do :1. [016] Ogólne metody wytwarzania koniugatów zawierających polipeptyd i rozpuszczalne w wodzie ugrupowania polimeru są znane w stanie techniki. Patrz np.: Karasiewicz i wsp., Patent USA nr 38267, Greenwald i wsp., Patent USA nr , Nieforth i wsp., Clin. Pharmacol. Ther. 9:636 (1996), Monkarsh i wsp., Anal. Biochem. 247:434 (1997)). [0166] Niniejszy wynalazek rozważa kompozycje zawierające polipeptyd według niniejszego wynalazku. Takie kompozycje mogą ponadto zawierać nośnik. Nośnikiem może być standardowy organiczny lub nieorganiczny nośnik. Przykłady nośników obejmują wodę, roztwór buforowany, alkohol, glikol propylenowy, makrogol, olej sezamowy, olej kukurydziany, itp G) Izolowanie polipeptydów IL-17RC lub IL-17RC/IL-17RA [0167] Polipeptyd według niniejszego wynalazku może być oczyszczony do poziomu czystości wynoszącego co najmniej 80%, co najmniej o 90%, co najmniej o 9%, lub więcej niż 9%, np. 96%, 97%, 98%, lub więcej niż 99% w odniesieniu do zanieczyszczających go makrocząsteczek, w szczególności innych białek i kwasów nukleinowych oraz być wolny od czynników zakaźnych i pirogennych. Polipeptyd według niniejszego wynalazku może także być oczyszczony do farmaceutycznie czystej postaci, która charakteryzuje się czystością większą niż 99,9%. W niektórych preparatach oczyszczony polipeptyd jest zasadniczo wolny od innych polipeptydów, w szczególności od innych polipeptydów pochodzenia zwierzęcego. [0168] W celu otrzymania preparatów IL-17RC/IL-17RA oczyszczonych z rekombinowanych komórek gospodarza można użyć frakcjonowania i/lub konwencjonalnych metod oczyszczania. Ogólnie, w celu frakcjonowania próbek można zastosować strącanie siarczanem amonu lub ekstrakcję z użyciem kwasu lub czynników chaotropowych. Przykładowe etapy oczyszczania mogą obejmować chromatografię na złożach hydroksyapatytowych, chromatografię ekskluzyjną oraz chromatografię cieczową w odwróconym układzie faz. Odpowiednie złoża chromatograficzne obejmują modyfikowane dekstrany, agarozę, celulozę, poliakryloamid, specjalne rodzaje krzemionek i tym podobne. Odpowiednimi modyfikowanymi złożami są PEI, DEAE, QAE i Q. Przykładowe złoża chromatograficzne obejmują złoża modyfikowane grupami fenylowymi, butylowymi lub oktylowymi, takie jak Phenyl-Sepbarose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl-60 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) i im podobne, lub żywice poliakrylowe, takie jak Amberchrom CG 71 (Toso Haas) i im podobne. Odpowiednie stałe nośniki obejmują szklane perełki, żywice na bazie krzemionki, żywice celulozowe, kulki agarozowe, usieciowaną agarozę, kulki polistyrenowe, usieciowane żywice poliakryloamidowe i tym podobne, które są nierozpuszczalne w warunkach, w których są stosowane. Nośniki te mogą być modyfikowane reaktywnymi grupami, które umożliwiają przyłączenie białek poprzez grupy aminowe, grupy karboksylowe, grupy sulfhydrylowe, grupy hydroksylowe i/lub ugrupowania cukrowe. 3

37 [0169] Przykłady chemicznych reakcji sprzęgania obejmują aktywację bromocyjanem, aktywację imidem kwasu N-hydroksybursztynowego, aktywację grup epoksydowych, aktywacje grup sulfhydrylowych, aktywacje hydrazydu oraz karboksylowe i aminowe pochodne w przypadku reakcji sprzęgania przy użyciu karbodiimidu. Te i inne stałe nośniki są dobrze znane i powszechnie stosowane w stanie techniki i są dostępne u komercyjnych dostawców. Wybór konkretnej metody do izolacji oraz oczyszczania polipeptydu jest przedmiotem rutynowego planowania i determinowany jest przez właściwości wybranego nośnika. Patrz np.: Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988) oraz Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996). [0170] Specjaliści w dziedzinie mogą opracować dodatkowe modyfikacje metod izolacji i oczyszczania IL- 17RC/IL-17RA. [0171] Polipeptyd według niniejszego wynalazku może być również izolowany metodami opartymi na wykorzystaniu jego określonych właściwości. Na przykład, w celu oczyszczenia białek bogatych w reszty histydyny, włączając te zawierające znacznik polihistydynowy, można zastosować chromatografię metalopowinowactwa (IMAC). W skrócie, najpierw do żelu przyłącza sie podwójnie naładowane jony metalu w celu utworzenia chelatu (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (198)). Białka bogate w reszty histydyny będą adsorbowane na tej matrycy z różnym powinowactwem, zależnym od użytego jonu metalu i wymywane na drodze elucji kompetycyjnej obniżenia ph lub przy użyciu silnych czynników chelatujących. Inne metody oczyszczania obejmują oczyszczanie glikozylowanych białek przy pomocy chromatografii powinowactwa z użyciem lektyn i chromatografii jonowymiennej (M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182:29 (1990)). W obrębie dodatkowych wykonań niniejszego wynalazku, w celu ułatwienia oczyszczania można otrzymać białko fuzyjne składające się z będącego przedmiotem zainteresowania polipeptydu oraz znacznika powinowactwa (np. białko wiążące maltozę, domena immunoglobuliny). Ponadto, zdolność rozpuszczalnego polipeptydu IL-17RC/IL-17RA według niniejszego wynalazku do wiązania ligandu można wykorzystać do oczyszczania np. rozpuszczalnych receptorów zawierających IL-17RC; na przykład przy użyciu chromatografii powinowactwa, gdzie na kolumnie związany jest ligand IL-17F, a wiązany jest receptor zawierający IL-17RC, który jest następnie wymywany przy pomocy standardowych metod chromatograficznych. [0172] Polipeptydy IL-17RC/IL-17RA lub ich fragmenty mogą być również przygotowane przy użyciu syntezy chemicznej, jak opisano powyżej. Te polipeptydy mogą być monomerami lub multimerami; mogą być glikozylowane lub nieglikozylowane; pegylowane lub niepegylowane i mogą lub nie zawierać metioninę jako pierwszą resztę aminokwasową I) Terapeutyczne zastosowania polipeptydu IL-17RC/IL-17RA według niniejszego wynalazku [0173] Polipeptyd według niniejszego wynalazku może być stosowany do modulacji układu odpornościowego polegającej na wiązaniu ligandów IL-17A i IL-17F (pojedynczo lub łącznie), a tym samym zapobieganiu wiązania tych ligandów z endogennym receptorem IL-17RC i/lub IL-17RA. Polipeptyd według niniejszego wynalazku może być również stosowany do modulowania układu odpornościowego na drodze hamowania wiązania IL-17A i IL-17F z endogennym receptorem IL-17RC i IL-17RA. W związku z powyższym, niniejszy wynalazek obejmuje zastosowanie polipeptydu według wynalazku do podawaniu osobnikowi, który nie posiada odpowiedniej ilości tego polipeptydu, lub który wytwarza nadmiar IL-17A i/lub IL-17F. Polipeptyd według niniejszego wynalazku (np. IL-17RC/IL-17RA) może być również stosowany do leczenia osobnika, który wytwarza nadmiar albo IL-17A, IL-17F, IL-17RA albo IL-17RC. Grupa odpowiednich 36

38 osobników obejmuje ssaki, takie jak ludzie. Przykładowo, taki rozpuszczalny polipeptyd znajduje zastosowanie do blokowania, hamowania, zmniejszania poziomu, działania jako antagonista lub neutralizacji IL-17A i IL-17F (zarówno każdej z osobna jak i obu) w leczeniu zapalenia i chorób o podłożu zapalnym, takich jak łuszczyca, reumatoidalne zapalenie stawów, IBD, IBS, zapalenie okrężnicy, astma, odrzucenie przeszczepu, stwardnienie rozsiane i inne stany zapalne ujawnionione w niniejszym dokumencie. [0174] Polipeptyd według niniejszego wynalazku wiąże, blokuje, hamuje, zmniejsza poziom, działa jako antagonista lub neutralizuje IL-17F i IL-17A (każdą z osobna lub obie) w warunkach in vivo. [017] Analiza tkanek pod katem występowania mrna odpowiadającego cdna kodującemu IL-17RC wykazała wysoki poziom ekspresji mrna genu kodującego IL-17RC w tarczycy, nadnerczach, prostacie i tkankach wątroby, a w mniejszym stopniu w sercu, jelicie cienkim, żołądku i tkankach tchawicy. W szczególności, IL-17RC jest stale wyrażany w komórkach krwi obwodowej, innych niż limfocyty T, obejmujących monocyty, limfocyty B i komórki mieloidalne. Ponadto, mrna dla IL-17RC jest na pewno wyrażany w liniach komórkowych wywodzących się ze skóry. Innymi liniami komórkowymi wyrażającymi IL- 17RC są wszystkie linii komórkowych pochodzących z jelita grubego, które były obecne na macierzy. W odróżnieniu od wymienionych przypadków, niską ekspresję bądź jej brak wykazano w mózgu, łożysku, płucach, mięśniu szkieletowym, nerce, trzustce, śledzionie, grasicy, jądrach, jajniku, okrężnicy, leukocytach krwi obwodowej, rdzeniu kręgowym, węźle chłonnym i szpiku kostnym. Ligand, do którego wiąże się IL- 17RC (IL-17F i/lub IL-17A) zaangażowany jest w indukcję odpowiedzi zapalnej i przyczynia się do rozwoju chorób zapalnych, przede wszystkim poprzez swoją zdolność do zwiększania wytwarzania mediatorów zapalnych, w tym IL-1β, IL-6 i TNF-α, jak również mediatorów, które biorą udział w proliferacji, dojrzewaniu i chemotaksji neutrofilów (praca przeglądowa: Witowski i wsp., Cell. Mol. Life Sci. 61:67-79 (2004)). [0176] Tak więc, szczególne postaci niniejszego wynalazku dotyczą zastosowania rozpuszczalnych polipeptydów IL-17RC/IL-17RA jako antagonistów w przypadkach chorób zapalnych i immunologicznych lub stanach chorobowych, takich jak łuszczyca, stany zapalne skóry, reumatoidalne zapalenie stawów, IBD, IBS, choroba Crohna, astma, choroba autoimmunologiczna, przeszczep organu lub szpiku kostnego, zapalenia spowodowanego urazem, operacją lub zakażeniem, reakcja przeszczep przeciwko gospodarzowi oraz w przypadkach, w których pożądane jest zahamowanie zapalenia, supresja układu odpornościowego, redukcja proliferacji komórek krwiotwórczych, komórek układu odpornościowego, komórek biorących udział w reakcji zapalnej i komórek limfoidalnych, makrofagów, limfocytów T (włączając w to limfocyty Th1 i Th2), zahamowanie odpowiedzi immunologicznej na patogen lub inne przypadki, w których pożądane jest zahamowanie IL-17F i/lub IL-17A. [0177] Ponadto, rozpuszczalny polipeptyd IL-17RC/IL-17RA jest użyteczny do: [0178] (1) blokowania, hamowania, zmniejszania poziomu, działania jako antagonista lub neutralizacji przekazywania sygnału przez IL-17RA lub IL-17RC w leczeniu ostrego zapalenia, zapalenia będącego wynikiem urazu, uszkodzenia tkanek, operacji, zakażenia i przewlekłych chorób zapalnych, takich jak astma, nieswoiste zapalenie jelit (IBD), IBS, przewlekłe zapalenie okrężnicy, reumatoidalne zapalenie stawów, astma i inne choroby związane z indukcją odpowiedzi ostrej fazy. [0179] (2) blokowania, hamowania, zmniejszania, działania jako antagonista lub neutralizacji przekazywania sygnału przez IL-17RA lub IL-17RC w leczeniu chorób autoimmunologicznych, takich jak IDDM, stwardnienie rozsiane (MS), reumatoidalne zapalenie stawów, IBS i IBD w celu zapobiegania lub zahamowania przekazywania sygnału w komórkach układu odpornościowego (np. limfocyty, monocyty, leukocyty). Blokowanie, hamowanie, zmniejszanie lub działanie jako antagonista przekazywania sygnału przez IL-17RA 37

39 lub IL-17RC, oparte na zastosowaniu polipeptydu według niniejszego wynalazku, może również przynieść korzyści w chorobach trzustki, nerek, przysadki mózgowej i komórek nerwowych. [0180] (3) działania jako agonista, wzmacniania, zwiększania lub inicjacji przekazywania sygnału przez IL- 17RA lub IL-17RC w leczeniu chorób autoimmunologicznych, takich jak MS, reumatoidalne zapalenie stawów, IBS i IBD. Rozpuszczalny polipeptyd według niniejszego wynalazku może wywoływać sygnał inicjujący różnicowanie się limfocytów i innych komórek układu odpornościowego, modyfikować proliferację, modyfikować wytwarzanie cytokin lub białek obecnych na powierzchni komórek, co poprawia własną odpowiedź układu odpornościowego. W szczególności, modulacja odpowiedzi pomocniczych limfocytów T na zmiany w repertuarze wydzielanych cytokin może różnicować reakcję autoimmunologiczną prowadząc do poprawy zdrowia (Smith JA i wsp., J. Immunol. 160: , 1998). Podobnie, rozpuszczalne polipeptydy działające jako agoniści mogą być wykorzystywane do indukcji przekazywania sygnału, usuwania i różnicowania komórek układu odpornościowego zaangażowanych w patologię astmy, alergii i chorób atopowych. Przekazywanie sygnału poprzez IL-17RC i/lub IL-17RA może również mieć korzystny wpływ na przebieg chorób trzustki, nerek, przysadki mózgowej i komórek nerwowych. [0181] Opisany w niniejszym dokumencie rozpuszczalny polipeptyd IL-17RC/IL-17RA może być zastosowany do wiązania, blokowania, hamowania, zmniejszania, działania jako antagonista lub neutralizacji aktywności IL-17F lub IL-17A, każdej z osobna albo obu łącznie, w leczeniu chorób autoimmunologicznych i chorób atopowych jak opisano powyżej. Ta rozpuszczalna forma IL-17RC/IL-17RA może być wykorzystana do indukcji odpowiedzi opartej na przeciwciałach, w której pośredniczą limfocyty Th i/lub do indukcji wytwarzania IL-4 lub innych cytokin przez limfocyty i inne komórki układu odpornościowego. [0182] Rozpuszczalny polipeptyd według niniejszego wynalazku jest użyteczny jako antagonista IL-17A i/lub IL-17F. Takie efekty antagonistyczne można osiągnąć przez bezpośrednią neutralizację lub związanie IL- 17A lub IL-17F. Oprócz zastosowania rozpuszczalnego receptora według niniejszego wynalazku jako antagonisty, może on wiązać IL-17F lub IL-17A i działać jako białko nośnikowe dla ligandu, w celu przetransportowania go do różnych tkanek, narządów i komórek w obrębie organizmu. Jako taki, rozpuszczalny receptor według niniejszego wynalazku może być białkiem fuzyjnym lub występować w połączeniu z cząsteczkami, polipeptydami lub ugrupowaniami chemicznymi, które kierują rozpuszczalny kompleks receptor-ligand do konkretnego miejsca, takiego jak tkanka, określona komórka układu odpornościowego lub nowotwór. Przykładowo, w przypadku ostrego zakażenia lub niektórych nowotworów, korzyści mogą wynikać z indukcji, w wyniku działania IL-17F, stanu zapalnego i odpowiedzi lokalnych białek ostrej fazy. Tak więc, te rozpuszczalne receptory według niniejszego wynalazku mogą być stosowane do bezpośredniego ukierunkowywania działania IL-17A lub IL-17F. Patrz: Cosman, D. Cytokine : 9-6,1993 oraz Femandez-Botran, R. Exp. Onion. Invest. Drugs 9:497-13, [0183] Zapalenie jest ochronną odpowiedzią organizmu mającą na celu obronę przed atakującym czynnikiem Zapalenie jest procesem kaskadowym, w który zaangażowanych jest wiele mediatorów odpowiedzi komórkowej i humoralnej. Z jednej strony, tłumienie reakcji zapalnych, może doprowadzić do obniżenia odporności u gospodarza. Jednak w przypadku, gdy zapalenie nie zostanie powstrzymane może ono doprowadzić do poważnych powikłań, w tym przewlekłych chorób zapalnych (np. łuszczyca, zapalenie stawów, reumatoidalne zapalenie stawów, stwardnienie rozsiane, nieswoiste zapalenie jelit i tym podobne). Co ważne, te różne stany chorobowe posiadają wspólne mediatory zapalne. Przedstawione tu choroby, charakteryzujące się obecnością zapalenia, mają duży wpływ na zachorowalność i śmiertelność u ludzi. Dlatego oczywiste jest, że przeciwzapalne białka, takie jak rozpuszczalny polipeptyd według niniejszego 38

40 wynalazku, mogą mieć kluczowy potencjał terapeutyczny względem wielu chorób ludzi i zwierząt, rozpoczynając od astmy i alergii, a kończąc na chorobach autoimmunologicznych Zapalenie stawów [0184] Zapalenie stawów, w tym zapalenie kości i stawów, reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie stawów powstałe w wyniku urazu, i im podobne, są powszechnymi stanami zapalnymi, których mogłyby dotyczyć korzyści płynące z terapeutycznego wykorzystania przeciwzapalnych białek, takich jak rozpuszczalne polipeptydy według niniejszego wynalazku. Na przykład, reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) jest chorobą ogólnoustrojową, która wpływa na całe ciało i jest jedną z najczęstszych postaci zapalenia stawów. Charakteryzuje się zapaleniem błony wyściełającej staw, które powoduje ból, sztywność, rozgrzanie, zaczerwienienie i obrzęk. Komórki zapalne uwalniają enzymy zdolne do trawienia kości i chrząstki. W wyniku reumatoidalnego zapalenia stawów, objęta stanem zapalnym wyściółka stawu - błona maziowa, może zaatakować i uszkodzić kość i chrząstkę prowadząc, pośród innych efektów fizjologicznych, do degradacji i silnego bólu. Zaatakowany staw może stracić swój kształt i ustawienie, czego efektem może być ból i utrata ruchliwości. [018] Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) jest chorobą o podłożu immunologicznym, charakteryzującą się w szczególności zapaleniem i wynikającym z niego uszkodzeniem tkanek, które prowadzą do ciężkiego inwalidztwa i zwiększonej śmiertelności. W stawach objętych reumatoidalnym zapaleniem wytwarzane są miejscowo różnorodne cytokiny. Liczne badania wykazały, że IL-1 i TNF-α, dwie prototypowe cytokiny prozapalne, odgrywają ważną rolę w mechanizmach zaangażowanych w zapalenie błony maziowej oraz stopniowe niszczenie stawów. Istotnie, podawanie chorym na RZS inhibitorów TNF-α i IL-1 doprowadziło do znaczącej poprawy objawów klinicznych i biologicznych zapalenia oraz zmniejszenia objawów radiologicznych dotyczących nadżerki kości i zniszczenia chrząstki. Jednak pomimo tych obiecujących wyników, znaczny odsetek chorych nie odpowiadał na te czynniki, co sugeruje, że w patofizjologii zapalenia stawów zaangażowane są również inne mediatory (Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2): ). Jednym z tych mediatorów może być IL-17A lub IL-17F, a cząsteczki, które wiążą lub hamują aktywność IL- 17F lub IL-17A, takie jak rozpuszczalne IL-17RC/IL-17RA, mogą posłużyć jako wartościowe leki o działaniu zmniejszającym zapalenie w reumatoidalnym zapaleniu stawów i innych chorobach związanych z zapaleniem stawów. [0186] W stanie techniki znanych jest kilka modeli zwierzęcych reumatoidalnego zapalenia stawów. Przykładowo, w przypadku modelu indukowanego kolagenem zapalenia stawów (CIA), dochodzi u myszy do rozwoju przewlekłego zapalenia stawów, które bardzo przypomina reumatoidalne zapalenie stawów u ludzi. CIA charakteryzują podobne cechy patologiczne i immunologiczne co RZS, a to czyni CIA idealnym modelem do przesiewowych badań potencjalnych, pochodzących od człowieka związków przeciwzapalnych. Model CIA jest dobrze znanym modelem mysim, który wystąpienie objawów chorobowych zależy zarówno od odpowiedzi immunologicznej, jak i reakcji zapalnej. Odpowiedź immunologiczna obejmuje oddziaływanie limfocytów B i limfocytów T CD4 + w odpowiedzi na podawany jest jako antygen kolagen i prowadzi do wytwarzania antykolagenowych przeciwciał. Faza zapalna jest wynikiem reakcji tkanek na mediatory zapalne, i stanowi konsekwencję krzyżowej reakcji niektórych z tych przeciwciał z natywnym mysim kolagenem oraz aktywacji kaskady dopełniacza. Zaletą stosowania modelu CIA jest to, że znane są podstawowe mechanizmy patogenezy. Zidentyfikowano odpowiednie epitopy kolagenu typu II dla limfocytów T i B oraz ustalono różne immunologiczne (np. nadwrażliwość typu opóźnionego i przeciwciała anty-kolagen) 39

41 i zapalne (np. cytokiny, chemokiny i enzymy rozkładające macierz) parametry związane z zapaleniem stawów o podłożu immunologicznym, które mogą być wykorzystywane do oceny skuteczności badanego związku w modelu CIA (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999; Williams i wsp., Immunol. 89: , 1992; Myers i wsp., Life Sci. 61: , 1997 oraz Wang i wsp., Immunol. 92:89-99, 199). [0187] Jedna grupa wykazała, że przeciwciało skierowane przeciwko mysiej IL-17 zmniejsza objawy w mysim modelu CIA w porównaniu do myszy kontrolnych, tym samym wskazując na koncepcję opartą na tym, że rozpuszczalne polipeptydy według niniejszego wynalazku byłyby korzystne w leczeniu chorób człowieka. Podanie szczurzej surowicy specyficznej dla jednej mysiej IL-17 zmniejsza objawy zapalenia stawów u zwierząt, w przypadku gdy surowice podano profilaktycznie lub po wystąpieniu objawów zapalenia stawów w modelu mysim (Lubberts i wsp., Arthritis Rheum. 0:60-9, 2004). Dlatego IL-17RC/IL-17RA-Fc mogą być stosowane do neutralizacji IL-17A i/lub IL-17F w leczeniu konkretnych chorób człowieka, takich jak zapalenie stawów, łuszczyca, nieswoiste zapalenie jelit (IBD), IBS i inne stany zapalne ujawnione w niniejszym dokumencie. [0188] Podawanie rozpuszczalnego polipeptydu według niniejszego wynalazku myszom będącym modelem doświadczalnym CIA wykorzystywane jest do oceny jego zastosowania jako antagonisty IL-17F i IL-17A przeznaczonego do łagodzenia objawów i zmiany przebiegu choroby. Ponadto, wyniki pokazujące zahamowanie lub neutralizację IL-17F i/lub IL-17A przez rozpuszczalny polipeptyd według niniejszego wynalazku dostarczyłyby dowodu dla koncepcji, że do łagodzenia objawów i zmiany przebiegu choroby można zastosować również innych antagonistów IL-17A lub Il-17F. Ponadto, ponieważ IL-17A i/lub IL-17F indukuje wytwarzanie IL-16 i TNF-α, cytokin które zaangażowane są w patogenezę i progresję reumatoidalnego zapalenia stawów, to ogólnoustrojowe lub miejscowe podawanie tych rozpuszczalnych polipeptydów może potencjalnie tłumić reakcję zapalną w przypadkach RZS. Przykładowo, co w żaden sposób nie ogranicza zakresu niniejszego wynalazku, wstrzyknięcie dawki mg IL-17RC-Fc/mysz (od 1 do 7 takich dawek w tygodniu, przez okres do 4 tygodni, nie ograniczony jednak do 4 tygodni, drogi podania: s.c., i.p. lub i.m.) może znacznie zmniejszyć, przedstawiony według skali punktowej, wynik opisujący rozwój choroby (ocena punktowa łapy, incydenty zapalenia lub choroby). W zależności od momentu podania IL-17RC-Fc (np. przed lub w czasie immunizacji kolagenem lub w jakimkolwiek innym punkcie czasowym po drugiej immunizacji kolagenem, włączając punkty czasowe, w których doszło już do rozwoju choroby), IL-17RC mogą być skuteczne w zapobieganiu reumatoidalnemu zapaleniu stawów, jak również w zapobieganiu progresji tej choroby. Inne potencjalne terapeutyki obejmują polipeptydy IL-17RC/IL- 17RA, i im podobne Nieswoiste zapalenie jelit IBD [0189] Około 00 tys. ludzi w Stanach Zjednoczonych cierpi z powodu nieswoistego zapalenia jelit (IBD), które mogą obejmować zarówno okrężnicę, jak i odbytnicę (wrzodziejące zapalenie jelita grubego) lub zarówno jelito cienkie, jak i jelito grube (choroba Crohna). Patogeneza tych chorób jest niejasna, ale w proces chorobowy zaangażowane jest przewlekłe zapalenie zaatakowanych tkanek. Rozpuszczalne polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą służyć jako wartościowe terapeutyki zmniejszające stan zapalny i patologiczne zmiany w przypadkach IBD, UC i chorób pokrewnych. [0190] Wrzodziejące zapalenie okrężnicy (UC) jest chorobą zapalną jelita grubego, powszechnie nazywanego okrężnicą, charakteryzującą się zapaleniem i owrzodzeniami błony śluzowej lub wewnętrznej wyściółki okrężnicy. Zapalenie to powoduje, że dochodzi do częstego wypróżniania okrężnicy, skutkiem 40

42 czego jest biegunka. Objawy obejmują rozluźnienie stolca i towarzyszące temu skurcze brzucha, gorączkę i utratę wagi. Choć dokładna przyczyna UC nie jest znana, ostatnie badania wskazują, że naturalne mechanizmy obronne organizmu działają na białka obecne w organizmie, które organizm niesłusznie uznaje za obce ("reakcja autoimmunologiczna"). Prawdopodobnie dlatego, że białka te są podobne do białek bakteryjnych obecnych w jelicie i mogą one albo indukować albo stymulować proces zapalny, który rozpoczyna się od niszczenia błony śluzowej okrężnicy. Jeśli dojdzie do zniszczenia wyściółki okrężnicy, wrzody wytwarzają wolny śluz, ropę i krew. Choroba zazwyczaj rozpoczyna się w okolicy odbytu i może w końcu rozprzestrzenić się na całe jelito grube. Powtarzające się epizody zapalenia prowadzą do pogrubienia ściany jelita i odbytnicy spowodowanego bliznowaceniem tkanki. W przypadku ostrej formy choroby może dojść do śmierci tkanki okrężnicy lub do rozwoju sepsy. Objawy wrzodziejącego zapalenia jelita grubego różnią się stopniem nasilenia, a ich występowanie może być stopniowe lub nagłe. Ataki mogą być wywołane przez wiele czynników, w tym zakażenia dróg oddechowych lub stres. [0191] Mimo iż obecnie nie ma środka pozwalającego wyleczyć UC, dostępne sposoby leczenia opierają się na hamowaniu nieprawidłowego procesu zapalnego wyściółki okrężnicy. W przypadku tej choroby dostępne jest leczenie włączające immunosupresyjne kortykosteroidy (np. azatiopryna, merkaptopuryna i metotreksat) oraz aminosalicylany. Jednak długotrwałe stosowanie leków immunosupresyjnych, takich jak kortykosteroidy i azatiopryna, może spowodować poważne skutki uboczne, w tym rozrzedzenie kości, zaćmę, zakażenie oraz wpływać na wątrobę i szpik kostny. W przypadku pacjentów, u których nie powiodło się leczenie dostępnymi metodami, jedną z opcji jest operacja. Operacja polega na usunięciu całej okrężnicy i odbytnicy. [0192] Istnieje kilka modeli zwierzęcych, które mogą częściowo naśladować przewlekłe wrzodziejące zapalenie jelita grubego. Najczęściej stosowanym modelem jest model, w którym zapalenie okrężnicy wywoływane jest kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowy/etanol (TNBS), który wywołuje przewlekły stan zapalny i owrzodzenia w obrębie okrężnicy. Gdy do okrężnicy uwrażliwionych myszy podaje się TNBS przez doodbytnicze wkroplenie, środek ten indukuje w obrębie błony śluzowej okrężnicy odpowiedź immunologiczną zależną od limfocytów T, prowadząc w tym przypadku do rozległego zapalenia śluzówki, charakteryzującego się gęstym naciekiem limfocytów T i makrofagów przez całą ścianę jelita grubego. Co więcej, temu histopatologicznemu obrazowi towarzyszy obraz kliniczny charakteryzujący się postępującą utratą masy ciała (wyniszczenie), krwawą biegunką, wypadaniem odbytnicy oraz zgrubieniem ściany jelita grubego (Neurath i wsp., Intern. Rev. Immunol. 19:1-62, 2000). [0193] W innym modelu zapalenia okrężnicy używa się soli sodowej siarczanu dekstranu (DSS), która wywołuje ostre zapalenie okrężnicy przejawiające się krwawą biegunką, utratą masy ciała, skróceniem okrężnicy i owrzodzeniami błony śluzowej z towarzyszącym naciekiem neutrofilów. Zapalenie okrężnicy indukowane DSS charakteryzuje się, z punktu widzenia obrazu histologicznego, naciekiem komórek zapalnych do blaszki właściwej, przerostem tkanki limfatycznej, ogniskowym uszkodzeniem krypt oraz owrzodzeniami nabłonka. Rozważa się, że do tych zmian dochodzi w wyniku toksycznego działania DSS na nabłonek oraz fagocytozy komórek blaszki właściwej i wytwarzania TNF-α i IFN-γ. Pomimo powszechnego stosowania DSS, kilka kwestii dotyczących mechanizmów DSS mających znaczenie dla chorób człowieka pozostaje nierozwiązanych. Zapalenie okrężnicy indukowane DSS uważane jest za model niezależny od limfocytów T, ponieważ efekty działania obserwuje się u zwierząt obarczonych niedoborem limfocytów T, takich jak myszy SCID. [0194] Podawanie rozpuszczalnego polipeptydu według niniejszego wynalazku w badaniach na modelach TNBS lub DSS, może być wykorzystane do oceny zastosowania tego polipeptydu do łagodzenia objawów i 41

43 wpływania na przebieg choroby przewodu pokarmowego. Ponadto, wyniki wskazujące na zahamowanie lub neutralizację IL-17F i/lub IL-17A przez te rozpuszczalne polipeptydy dowodzą słuszności koncepcji, która zakłada, że takie polipeptydy (lub podobne cząsteczki) mogą być również stosowane do łagodzenia objawów zapalenia okrężnicy na modelu IBD i wpływania na przebieg choroby. 3. Łuszczyca [019] Łuszczyca jest przewlekłą chorobą skóry, która dotyka ponad siedem milionów Amerykanów. Łuszczyca pojawia się, gdy dochodzi do nieprawidłowego wzrostu nowych komórek skóry, który prowadzi do stanu zapalnego, obrzęku i złuszczania się skrawków skóry, natomiast proces złuszczania się starych komórek jest niewystarczający. Łuszczyca płytkowa, najbardziej rozpowszechniona forma, charakteryzuje się stanem zapalnym fragmentów skóry ("zmiany") pokrytych srebrzystobiałymi łuskami. Łuszczyca może ograniczać do kilku blaszek lub też obejmować powierzchnię od umiarkowanych do rozległych obszarów skóry, pojawiając się najczęściej na skórze głowy, kolan, łokci i tułowia. Mimo iż łuszczyca jest bardzo widoczna, nie jest ona chorobą zakaźną. W patogenezę tej choroby zaangażowane jest przewlekłe zapalenie zaatakowanych tkanek. Rozpuszczalne polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą służyć jako wartościowe terapeutyki przeznaczone do zmniejszania stanu zapalnego i patologicznych zmian w przypadkach łuszczycy, innych chorobach zapalnych skóry, alergii skórnych i błon śluzowych oraz chorób pokrewnych. [0196] Łuszczyca jest chorobą zapalną skóry, w której pośredniczą limfocyty T, i która może być przyczyną poważnego dyskomfortu. Jest to choroba, na którą nie ma lekarstwa i dotyka ona ludzi w każdym wieku. Na łuszczyce choruje około dwa procent populacji Europy i Ameryki Północnej. Mimo iż osoby cierpiące na łagodną postać łuszczycy często mogą kontrolować swoją chorobę stosując czynniki działające miejscowo, to ponad milion pacjentów na całym świecie wymaga leczenia przy pomocy promieniowania ultrafioletowego lub leczenia immunosupresyjnego. Niestety, problemy i zagrożenia związane z promieniowaniem ultrafioletowym oraz toksyczność wielu terapii ogranicza możliwości ich długotrwałego stosowania. Ponadto u pacjentów dochodzi zazwyczaj do nawrotu łuszczycy, a w niektórych przypadkach do nawrotu choroby dochodzi zaraz po zakończeniu leczenia immunosupresyjnego. [0197] Rozpuszczalny polipeptyd według niniejszego wynalazku może być także wykorzystywany w systemach diagnostycznych do wykrywania stężenia IL-17F lub IL-17A w krwiobiegu oraz do wykrywania IL- 17F lub IL-17A związanych z reakcją zapalną ostrej fazy. Do grupy pokrewnych wykonań wynalazku zalicza się zastosowanie rozpuszczalnego polipeptydu według niniejszego wynalazku do wykrywania obecnych w krążeniu lub działających miejscowo polipeptydów IL-17F lub IL-17A. Podwyższone lub obniżone poziomy polipeptydów będących ligandami lub polipeptydami receptorowymi mogą świadczyć o stanach patologicznych, w tym o obecności zapalenia lub nowotworu. Wiadomo, że IL-17F indukuje reakcję zapalną ostrej fazy. Ponadto, w przypadku pewnych stanów chorobowych (np. astma, łuszczyca, reumatoidalne zapalenie stawów, IBD, IBS), wykrycie białek ostrej fazy lub cząsteczek, takich jak IL-17A lub IL-17F może być oznaką przewlekłego stanu zapalnego. Wykrycie wspomnianych czynników jest pomocne w diagnostyce choroby, jak również pomaga lekarzowi w wyborze właściwego sposobu leczenia. [0198] W uzupełnieniu do opisanych w niniejszym dokumencie różnych modeli chorób, aktywność rozpuszczalnych polipeptydów według niniejszego wynalazku względem tkanki objętej zapaleniem, pochodzącej ze zmian chorobowych wywołanych łuszczycą u ludzi, można mierzyć in vivo przy użyciu modelu mysiego u myszy obarczonych ciężkim złożonym niedoborem odporności (SCID). Opracowano kilka 42

44 mysich modeli, w których ludzkie komórki wszczepiono myszom z niedoborem odporności (wspólnie opisywane jako modele oparte na heteroprzeszczepie), patrz np.: AR Cattan, E Douglas, Leuk. Res. 18:13-22, 1994 oraz Flavell, DJ, Hematological Oncology 14:67-82, W przypadku modelu łuszczycy in vivo opartego o heteroprzeszczep, pochodząca od człowieka tkanka zaatakowana przez łuszczycę wszczepiana jest do modelu myszy SCID i poddana próbie na działanie odpowiedniego antagonisty. Ponadto do oceny działania antagonistów IL-17A i IL-17F można użyć innych dostępnych w stanie techniki modeli zwierzęcych łuszczycy, takich jak model oparty na myszach AGR129, którym wszczepiono pochodzące od człowieka fragmenty skóry zaatakowanej przez łuszczycę. Opisany model poddaje się próbie na działanie odpowiedniego antagonisty (patrz np.: Boyman, O. i wsp., J. Exp. Med., publikacja dostępna w internecie: # , 2004). Rozpuszczalny polipeptyd według niniejszego wynalazku, który wiąże, blokuje, hamuje, zmniejsza, działa jako antagonista lub neutralizuje działanie zarówno IL-17A jak i IL-17F może być wykorzystany w tym modelu. Podobnie, tkanki lub komórki pochodzące z IBD, IBS, zapalenia stawów lub innych zmian zapalnych mogą być wykorzystane w modelu SCID do oceny właściwości przeciwzapalnych opisanych w niniejszym dokumencie antagonistów IL-17A i IL-17F. [0199] Terapie mające na celu usunięcie, zahamowanie lub zmniejszenie stanu zapalnego za pomocą rozpuszczalnego polipeptydu według niniejszego wynalazku mogą być testowane na myszach SCID, obarczonych przeszczepem ludzkiej tkanki objętej zapaleniem (np. zmianami łuszczycowymi itp.) lub na innych modelach opisanych w niniejszym dokumencie. Skuteczność leczenia jest mierzona i poddawana analizie statystycznej obserwowanych wzrastających w czasie efektów przeciwzapalnych w grupie objętej leczeniem z zastosowaniem metod dobrze znanych w stanie techniki. Niektóre z przykładowych metod obejmują, lecz nie są do nich ograniczone, pomiary prowadzone na modelu łuszczycy obejmujące pomiar grubości naskórka, liczby komórek zapalnych w górnych warstwach skóry właściwej oraz stopnia parakeratozy. Metody te znane są w stanie techniki i opisane w niniejszym dokumencie. Patrz np.: Zeigler, M. i wsp., Lab Invest 81:123, 2001; Zollner, T. M. i wsp., J. Clin. Invest. 9:671, 2002; Yamanaka, N. i wsp., Microbio.l Immunol. 4:07, 2001; Raychaudhuri, S. P. i wsp., Br. J. Dermatol. 144:931, 2001; Boehncke, W. H i wsp., Arch. Dermatol. Res. 291:4, 1999; Boehncke, W. H i wsp., J. Invest. Dermatol. 116:96, 2001; Nickoloff, B. J. i wsp., Am. J. Pathol. 146:80, 199; Boehncke, W. H i wsp., J. Cutan. Pathol. 24:1, 1997; Sugai, J., M. i wsp., J. Dermatol. Sci. 17:8, 1998 oraz Villadsen L.S. i wsp., J. Clin. Invest. 112:171, Zapalenie może być również monitorowane w czasie przy użyciu dobrze znanych metod, takich jak cytometria przepływowa (lub PCR) w celu ilościowego oznaczania liczby obecnych w próbce komórek zapalnych lub komórek zmienionych chorobowo, w celu punktowej oceny (spadek masy ciała, biegunka, krwawienie z odbytu, długość okrężnicy) IBD, chorej łapy oraz stanu zapalnego w przypadkach modelu CIA i RZS. Przykładowo strategie terapeutyczne, które nadają się do testowania na takim modelu, obejmują bezpośrednie leczenie z użyciem rozpuszczalnego IL-17RC lub IL- ITRC/IL-17RA lub innych antagonistów IL-17A i IL-17F (stosowanych pojedynczo lub łącznie), lub pokrewnych im koniugatów lub antagonistów. Leczenie to opiera się na przerwaniu oddziaływania między IL- 17RC i/lub IL-17RA a odpowiednimi dla nich ligandami. [0200] Łuszczyca jest przewlekłą chorobą zapalną skóry, która związana jest z rozrostem keranocytów naskórka i naciekaniem komórek jednojądrzastych, w tym limfocytów T pamięci CD4+, neutrofilów i makrofagów (Christophers, Int. Arch. Allergy Immunol., 1:199, 1996). Obecnie uważa się, że to antygeny obecne w środowisku odgrywają znaczącą rolę w inicjowaniu choroby i zaangażowane są w jej patologię. Jednak to utrata tolerancji na własne antygeny uważana jest za czynnik pośredniczący w patologii łuszczycy. 43

45 Uważa się, że komórki dendrytyczne i limfocyty T CD4 + odgrywają prawdopodobnie ważną rolę w prezentowaniu i rozpoznaniu antygenu, które to procesy pośredniczą w odpowiedzi immunologicznej prowadzącej do patologii. Niedawno opracowaliśmy model łuszczycy oparty na modelu transferu komórek CD4+CD4RB (Davenport i wsp., Internat. Immunopharmacol., 2:63-672). Myszy podaje się rozpuszczalny polipeptyd według niniejszego wynalazku. Zahamowanie, opisanych w oparciu o skalę punktową, objawów choroby (zmiany skórne, prozapalne cytokiny) wskazuje na skuteczność tych rozpuszczalnych polipeptydów w przypadkach łuszczycy Astma [0201] IL-17 odgrywa ważną rolę w wywołanej alergenem aktywacji limfocytów T i naciekaniu neutrofili w drogach oddechowych. W drogach oddechowych wyrażany jest receptor dla IL-17 (Yao, i wsp., Immunity 3:811 (199)), a rekrutacja neutrofili w astmie oskrzelowej, w której pośredniczy IL-17, jest w dużym stopniu wywołana przez następujące chemoatraktanty: IL-8, GRO-β i białko zapalne makrofagów-2 (MIP-2), które są wytwarzane przez stymulowane IL-17 ludzkie komórki nabłonka oskrzeli (HBEC) i fibroblasty ludzkich oskrzeli (Yao, i wsp., J Immunol 1:483 (199)); Molet, i wsp., J Allergy Clin Immunol 8:430 (2001)). IL- 17 pobudza także komórki HBEC do uwolnienia IL-6, czynnika aktywującego neutrofile (Fossiez, i wsp, J Exp Med 183:293 (1996) oraz Linden, i wsp., Int. Arch Immunol Allergy 126:179 (2001)). Okazało się, że działa ona synergistycznie z TNF-α przedłużając czas przeżycia ludzkich neutrofili in vitro (Laan i wsp., Eur J Respir 21:387 (2003)). Ponadto, IL-17 może wzmacniać odpowiedź zapalną w astmie poprzez swoją zdolność do zwiększenia wydzielania cytokin zaangażowanych w przebudowę dróg oddechowych, takich jak profibrotyczne cytokiny, IL-6 i IL-11 oraz mediatorów zapalnych - czynnika stymulującego wzrost kolonii granulocytów (G-CSF) oraz czynnika stymulującego wzrost kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) (Molet i wsp., J Allergy Clin Immunol 8:430 (2001)). [0202] Badania kliniczne pokazują, że ostre, charakteryzujące się ciężkim przebiegiem, zaostrzenia astmy związane są z rekrutacją i aktywacją neutrofilów w drogach oddechowych, dlatego też rola IL-17 w astmie może być znacząca. Pacjenci z astmą łagodną wykazują wykrywalny wzrost miejscowego stężenia wolnego rozpuszczalnego białka IL-17A (Molet i wsp., J Allergy Clin Immunol 8:430 (2001)), podczas gdy zdrowi ochotnicy poddani indukowanemu, w wyniku umieszczenia w zamkniętym pomieszczeniu tuczarni (ang. swine confinement), ostremu zapaleniu dróg oddechowych, wykazują wyraźny wzrost stężenia wolnej, rozpuszczalnej formy białka IL-17A w przestrzeni oskrzelowo-pęcherzykowej (Fossiez i wsp., J Exp Med 183:293 (1996) oraz Linden i wsp., Int. Arch Allergy ImmunoI 126:179 (2001)). Odnotowywano ponadto korelację poziomów IL-17 w plwocinie osobników wykazujących nadreaktywność dróg oddechowych: Barczyk i wsp., Respir Med 97:726 (2003). [0203] W modelach zwierzęcych nadreaktywności dróg oddechowych, długotrwałe wdychanie owoalbuminy przez uczulone myszy prowadziło do rozwoju eozynofilowego zapalenia oskrzeli i wczesnej ekspresji mrna dla IL-17 w tkance płucnej objętej zapaleniem wraz z neutrofilią w obrębie oskrzeli (Hellings i wsp., Am J Respir Cell Mol Biol 28:42 (2003)). Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko IL-17 silnie zmniejszały naciek neutrofili w oskrzelach, natomiast zwiększały poziomy IL- w płynie otrzymanym w wyniku płukania oskrzelowo-pęcherzykowego jak i w surowicy oraz nasilały indukowany alergenem napływ eozynofilów w oskrzelach. To sugeruje, że IL-17A może uczestniczyć w określaniu równowagi miedzy akumulacją neutrofilów i eozynofilów, będącą następstwem pojawienia ataku antygenu (Id.). 44

46 [0204] Wśród członków rodziny IL-17, interleukina IL-17F jest najbardziej zbliżona do IL-17A. Aktywności biologiczne, w których pośredniczy IL-17F są podobne do tych wywoływanych przez IL-17A, przy czym IL- 17F stymuluje wytwarzanie IL-6, IL-8 i G-CSF (Hurst i wsp., J Immunol 169:443 (2002)). IL-17F indukuje również wytwarzanie w komórkach śródbłonka IL-2, transformującego czynnika wzrostu (TGF)-β i białka chemotaktycznego monocytów (MCP) (Starnes i wsp., J Immunol 167:4137 (2001)). Podobnie, narażenie na kontakt z alergenem może zwiększyć miejscowy poziom IL-17F u pacjentów z astmą alergiczną (Kawaguchi i wsp., J Immunol 167:4430 (2001)). Dostarczenie genów kodujących IL-17F do płuc myszy powoduje wzrost liczby neutrofili w przestrzeni oskrzelowo-pęcherzykowej, podczas gdy transfer genu dla IL-17F do śluzówki zwiększa poziom indukowanej Ag neutrofili i reaktywność dróg oddechowych na metacholinę (Oda i wsp.,, Am J Respir Crit Care Med 171:12 (200)). [020] Oprócz astmy, inne przewlekłe choroby zapalne dróg oddechowych charakteryzują się rekrutacją neutrofili w drogach oddechowych. Opisywano znaczącą rolę IL-17 w patogenezie schorzeń układu oddechowego, takich jak przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) i mukowiscydoza (Linden i wsp., Eur Respir J 1:973 (2000); Ye i wsp., Am J Respir Cell Mol Biol 2:33 (2001), Rahman, i wsp., Clin Immunol 11:268 (200)). Efektywność terapeutycznych cząsteczek skierowanych przeciwko IL-17A i/lub IL-17F w leczeniu przewlekłej choroby zapalnej dróg oddechowych można wykazać na modelu zapalenia in vitro. Zdolność antagonistów aktywności IL-17F i/lub IL-17A, takich jak rozpuszczalne receptory IL-17RC oraz przeciwciała skierowane przeciwko receptorom IL-17RC, włączając neutralizujące przeciwciała monoklonalne anty-ludzki IL-17RC według niniejszego wynalazku do hamowania cytokin i chemokin indukowanych IL-17A lub i/lub IL-17F i wytwarzanych przez hodowane komórki HBEC lub fibroblasty oskrzeli może być zastosowana do pomiaru skuteczności takich antagonistów w zakresie zapobiegania wytwarzaniu mediatorów zapalnych powstałych w wyniku bezpośredniej stymulacji IL-17A i/lub F. Jeśli w wyniku dodania antagonistów IL-17F i/lub IL-17A, takich jak rozpuszczalny polipeptyd według niniejszego wynalazku, dochodzi do znacznego zmniejszenia wytwarzania i ekspresji mediatorów zapalnych, to należy się spodziewać, że cząsteczki te będą skuteczne w stanach zapalnych związanych z przewlekłym zapaleniem dróg oddechowych Zespół jelita nadwrażliwego (IBS) [0206] Zespół jelita nadwrażliwego jest chorobą charakteryzującą się bólem brzucha lub dyskomfortem i nieregularną czynnością jelit. Biorąc po uwagę czynność jelit, pacjenci chorzy na IBS mogą być przypisani do trzech głównych grup: grupy obejmującej chorych, u których występuje luźny stolec i częste wypróżnianie, grupy obejmującej chorych, u których występuje twardy stolec i rzadkie wypróżnianie oraz grupy obejmującej chorych, u których występuje zmienny lub normalny stolec (Talley et al., 2002). Zmieniona motoryka jelit, zaburzenia w funkcji nabłonka, zaburzenia przejścia stolca i gazu oraz stres mogą przyczynić się do objawów, podczas gdy nadwrażliwość trzewna jest kluczową cechą u większości pacjentów. Czynniki genetyczne wpływające na przekazywanie bólu i zaburzenia w przetwarzaniu sygnałów aferentnych przez centralny układ nerwowy predysponują osobnika do zachorowania na IBS w następstwie ekspozycji na specyficzne czynniki środowiskowe. Badania wykazały również, że reakcje zapalne w obrębie okrężnicy mogą przyczynić się do zwiększenia wrażliwości mięśni gładkich i nerwów jelitowych, a tym samym zaburzać funkcje czuciowo-motoryczne w jelicie (Collins i wsp., 2001). Istnieją podobieństwa w obrazach klinicznych dla IBS i IBD. Objawy podobne do tych charakterystycznych dla IBS często identyfikuje się u pacjentów przed rozpoznaniem IBD. W przypadku pacjentów znajdujących się w stanie remisji IBD obserwuje się 4

47 objawy silniejsze niż te, które są charakterystyczne dla IBS. Tak więc opisane stany chorobowe mogą współistnieć z częstotliwością wyższą niż oczekiwana lub mogą występować w sposób ciągły, prowadząc na końcu zarówno do rozpoznania IBS, jak i IBD. Należy jednak zauważyć, że u większości pacjentów z IBS, obserwuje się normalny obraz biopsji tkanki okrężnicy. Niemniej jednak, IBS dotyka bardzo dużą liczbę osób (prewalencja w USA w 2000 r. wynosiła około 16 mln osób), co skutkuje obciążeniem budżetu w wysokości 1.7 mld dolarów (rok 2000). Tak więc, wśród najbardziej rozpowszechnionych i kosztownych chorób i zaburzeń przewodu pokarmowego, IBS plasuje się na drugim miejscu, zaraz za chorobą refluksową przełyku (GERD). Jednak, w odróżnieniu od GERD, leczenie IBS jest nadal niezadowalające (Talley i wsp., 2002;. Farhadi i wsp., 201;. Collins i wsp., 2001), co pokazuje, że istnieje wyraźne zapotrzebowanie na rozwiązanie tego problemu medycznego. [0207] Zaproponowano konwergentne modele choroby, które zakładają wzmożoną odpowiedz nerwowych, immunologicznych i neuroimmunologicznych obwodów w centralnym systemie nerwowym (CNS) lub w jelitach na centralne (psychospołeczne) lub obwodowe (podrażnienie tkanek, zapalenia, zakażenia) zaburzenia normalnego stanu homeostazy (Talley et al., 2002). Skutkami tej wzmożonej odpowiedzi są: rozregulowanie motoryki przewodu pokarmowego, rozregulowanie czynności nabłonka (odporności, przepuszczalności) i nadwrażliwość trzewna, które powodują objawy IBS. [0208] Wiele różnych cząsteczek może mieć znaczenie w patogenezie IBS, włączając znaczenie cząsteczek pobudzających neurony oraz takich, które biorą udział w inicjacji procesu zapalnego. Znanych jest wiele obecnych w organizmie cząsteczek, które związane są z aktywnością neuronów, ponieważ są bezpośrednio wyrażane w neuronach lub też neurony wyrażają receptory dla tych cząsteczek. Cząsteczkami tymi są IL- 17D, IL-17B i IL-31. Co więcej z zapaleniem jelit związanych jest wielu członków rodziny IL-17 oraz spokrewnionych z nimi cząsteczek, w tym IL-17A, IL-17F, IL-23 i IL-31. [0209] Skuteczność inhibitorów tych cząsteczek można badać w warunkach in vivo na zwierzęcych modelach choroby. Dostępnych jest kilka modeli zwierzęcych, które naśladują kluczowe cechy IBS i włączają bodźce ukierunkowane na centralny układ nerwowy (stres) lub obwodowy układ nerwowy (zakażenie, zapalenie). Oto dwa przykłady modeli zwierzęcych in vivo, które można wykorzystać do określania skuteczności inhibitorów w leczeniu IBS: (i) modele koncentrujące się na pierwszorzędowej roli centralnego systemu nerwowego w patogenezie IBS (modele stresu) oraz (ii) modele koncentrujące na induktorach stresu działających na przewód pokarmowy (np. zapalenie jelit, zakażenie lub obciążenie fizyczne). Należy jednak zauważyć, że procesy zachodzące w obrębie CNS lub w przewodzie pokarmowym (GI) nie są odizolowane, i że objawy IBS najprawdopodobniej są wynikiem złożonej interakcji między sygnałami przekazywanymi z CNS do GI i odwrotnie J) Formulacje farmaceutyczne [02] Dla celów zastosowań farmaceutycznych, rozpuszczalny polipeptyd według niniejszego wynalazku przygotowywany jest w postaci przeznaczonej do podawania pozajelitowego, zwłaszcza dożylnego lub podskórnego, zgodnie z konwencjonalnymi metodami. Planuje się dożylne podawanie w postaci pojedynczych bolusów, w sposób pozwalający na kontrolowane uwalnianie, np. przy użyciu minipomp lub innych odpowiednich technologii, lub w postaci wlewu prowadzonego przez typowy okres czasu, wynoszący od jednej do kilku godzin. Ogólnie, farmaceutyczne formulacje będą zawierały białka krwiotwórcze w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, takim jak roztwór soli, buforowany roztwór soli, % glukoza w wodzie lub podobne. Kompozycje mogą ponadto zawierać jedną lub więcej substancji 46

48 pomocniczych, środków konserwujących, rozpuszczalników, środków buforujących, albuminę chroniącą przed utratą białek w wyniku ich odkładania się na powierzchni fiolki, itp. W przypadku stosowania leczenia skojarzonego, cytokiny mogą być łączone w postaci pojedynczej formulacji lub mogą być podawane w postaci oddzielnych formulacji. Metody przygotowania formulacji są dobrze znane w stanie techniki i zostały ujawnione, na przykład w: Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Co Publishing Mack, Easton PA, Dawki terapeutyczne będą na ogół zawierały się w przedziale od 0.1 do 0 mg/kg masy ciała pacjenta na dzień, korzystnie od 0. do 20 mg/kg na dzień, przy czym dokładna dawka zostanie ustalona przez lekarza zgodnie z podkreślonymi normami i w oparciu o charakter i stopień nasilenia leczonego stanu, cech pacjenta, itp. Określenie dawki mieści w zakresie poziomu wiedzy specjalisty w dziedzinie. Białka będą zazwyczaj podawane przez okres do 28 dni po chemioterapii lub przeszczepieniu szpiku kostnego lub do momentu aż nie zostanie osiągnięty poziom płytek wynoszący > 20000/mm 3, korzystnie > 0000/mm 3. Częściej, białka będą podawane przez jeden tydzień lub krócej, często przez okres od jednego do trzech dni. Ogólnie, terapeutycznie skuteczna porcja rozpuszczalnego polipeptydu według niniejszego wynalazku, w ilości wystarczającej do wywołania istotnego klinicznie zwiększenia proliferacji i/lub różnicowania limfocytów lub komórek progenitorowych szpiku, objawi się w postaci wzrostu stężenia krążących dojrzałych komórek (np. płytek krwi lub neutrofilów). Leczenie zaburzeń płytek krwi będzie tym samym kontynuowane aż do momentu, w którym liczba płytek krwi wyniesie co najmniej 20000/mm 3, korzystnie 0000/mm 3. Rozpuszczalny polipeptyd według niniejszego wynalazku można także podawać w połączeniu z innymi cytokinami, takimi jak IL-3, -6 i -11, czynnik wzrostu komórek pnia (ang. stem cells factor), erytropoetyna, G-CSF i GM-CSF. W ramach schematów leczenia skojarzonego, przyjmuje się następujące dzienne dawki innych cytokin: EPO, U/kg, GM-CSF, -1 1g/kg, IL-3, 1-1g/kg oraz G- CSF, 1-2 1g/kg. Leczenie skojarzone z EPO, przykładowo wskazane jest u pacjentów cierpiących na anemię z niskim poziomem EPO. [0211] Ogólnie, dawka podawanego rozpuszczalnego polipeptydu będzie się zmieniać w zależności od takich czynników, jak wiek pacjenta, jego waga, wzrost, płeć, ogólny stan zdrowia i historia chorób przebytych w przeszłości. Zazwyczaj osobie poddanej leczeniu pożądane jest podawanie takiej dawki rozpuszczalnego polipeptydu, która mieści się w zakresie od około 1 pg/kg do mg/kg (masa substancji/ciężar ciała pacjenta), przy czym, jeżeli okoliczności tego wymagają, dozwolone jest podawanie dawki niższej lub wyższej. [0212] Podawanie rozpuszczalnego polipeptydu według niniejszego wynalazku może odbywać się drogą dożylną, dotętniczą, dootrzewnową, domięśniową, podskórnie, doopłucnowo, dooponowo, poprzez perfuzję za pomocą miejscowego cewnika lub przez iniekcję bezpośrednio do miejsca zmienionego chorobowo. Iniekcję białka terapeutycznego można przeprowadzić dwoma sposobami: stosując infuzję ciągłą lub podając wielokrotne pojedyncze bolusy. [0213] Dodatkowe drogi podania obejmują drogę doustną, przez błony śluzowe, wziewną i przezskórną. Droga doustna jest odpowiednia do podawania mikrosfer poliestrowych, prolaminowych, protenoidowych, policjanoakrylatowych oraz układów opartych na lipidach (patrz na przykład DiBase i Morrel, Oral Delivery of Microencapsulated Proteins w Protein Delivery: Physical Systems, Sanders i Hendren (red.), str (1997 Plenum Press)). Przykładem możliwego podawania donosowego jest sposób wykorzystywany przy podawaniu insuliny (patrz na przykład Hinchcliffe i Illum, Adv. Drug Deliv. Rev., 3:199 (1999)). Suche lub płynne cząstki zawierające rozpuszczalny polipeptyd mogą być odpowiednio przygotowane i wdychane przy pomocy urządzenia rozpraszającego proszek, urządzenia wytwarzającego aerozol lub nebulizera (patrz na 47

49 przykład Pettit i Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton i wsp., Adv. Drug Deliv. Rev., 3:23 (1999)). Przykładem takiego sposobu podawania jest system sterujący AERX używany przez diabetyków do kontroli dostarczania leku. W skład AERX wchodzi ręczny elektroniczny inhalator zapewniający dostarczanie do płuc insuliny w postaci aerozolu. Istnieje również możliwość podawania leku przez skórę. Badania wykazały, że białka o tak dużej masie jak kda dostarczono przez skórę w stężeniach terapeutycznych przy pomocy ultradźwięków o niskiej częstotliwości (Mitragotri i wsp., Science, 269:80 (199)). Kolejnym sposobem podawania rozpuszczalnego polipeptydu według niniejszego wynalazku jest przezskórne dostarczanie leku za pomocą elektroporacji (Potts i wsp., Pharm. Biotechnol. :213 (1997)). [0214] Kompozycja farmaceutyczna zawierająca rozpuszczalny polipeptyd według niniejszego wynalazku może być formułowana według znanych sposobów sporządzania kompozycji przydatnych farmaceutycznie, w których białka terapeutyczne są mieszane z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami. Kompozycja określana jest jako farmaceutycznie dopuszczalny nośnik jeśli jej podanie może być tolerowane przez przyjmującego lek pacjenta. Sterylny roztwór buforowany fosforanem soli jest jednym z przykładów farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika. Inne odpowiednie nośniki są dobrze znane specjalistom w dziedzinie. Patrz na przykład Gennaro (red.), Remington's Pharmaceutical Sciences, Wydanie XIX (Mack Publishing Company 199). [021] Dla potrzeb terapii rozpuszczalny polipeptyd według niniejszego wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik podaje się pacjentowi w ilości terapeutycznie skutecznej. Uważa się, że kombinacja terapeutycznej cząsteczki według niniejszego wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika podawane jest w ilości skutecznej terapeutycznie", jeśli podawana ilość jest fizjologicznie znacząca. Czynnik jest fizjologicznie znaczący, jeżeli jego obecność powoduje wykrywalną zmianę w fizjologii przyjmującego lek pacjenta. Przykładowo, czynnik stosowany w leczeniu zapalenia jest fizjologicznie istotny, jeżeli jego obecność łagodzi odpowiedź prozapalną. [0216] Kompozycja farmaceutyczna zawierająca rozpuszczalny polipeptyd według niniejszego wynalazku może być dostarczona w postaci płynnej, w aerozolu lub w postaci stałej. Przykładami postaci płynnej są roztwory do iniekcji i zawiesiny doustne. Przykładowe postaci stałe obejmują kapsułki, tabletki i postaci o regulowanym profilu uwalniania. Przykładem tej ostatniej postaci podawania leku jest pompa miniosmotyczna i implanty (Bremer i wsp., Pharm. Biotechnol., :239 (1997), Ranade, Implants in Drug Delivery w Drug Delivery Systems, Ranade i Hollinger (red.), str (CRC Press 199); Bremer i wsp., Protein Delivery with Infusion Pumps w Protein Delivery: Physical Systems, Sanders i Hendren (red.), str (Plenum Press 1997), Yewey i wsp., Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant w Protein Delivery: Physical Systems, Sanders i Hendren (red.), str (1997 Plenum Press)). [0217] Użycie liposomów są jednym ze sposobów dostarczania leczonemu osobnikowi terapeutycznych polipeptydów. Polipeptydy te można dostarczać drogą dożylną, dootrzewnowo, dooponowo, domięśniowo, podskórnie lub doustnie, przez inhalację lub donosowo. Liposomy są mikroskopijnymi pęcherzykami, które składają się z jednej lub więcej lipidowych dwuwarstw otaczających wodne przedziały (patrz ogólnie Bakker- Woudenberg i wsp., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 12 (Uzup. 1): S61 (1993 ), Kim, Drugs 46:618 (1993) i Ranade Site-Specific Drug Delivery w Drug Delivery Using Liposomes as Carriers w Drug Delivery Systems, Ranade i Hollinger (red.), str (CRC Press 199)). Pod względem składu liposomy są podobne do błon komórkowych i dlatego ulegają biodegradacji, a ich podawanie jest bezpieczne. W zależności od sposobu przygotowania, liposomy mogą być jednowarstwowe lub wielowarstwowe, mogą różnić się wielkością w zakresie średnic od 0.02 µm do ponad µm. W liposomach można zamykać 48

50 czynniki o różnych właściwościach: hydrofobową frakcję czynników w dwuwarstwie, a hydrofilową frakcję czynników w wewnętrznym przedziale wodnym/przedziałach wodnych (patrz na przykład Machy i wsp., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987), Ostro i wsp., American J. Hosp. Pharm. 46:176 (1989)). Ponadto, różnicując wielkość liposomu, ilość dwuwarstw, kompozycję lipidową, a także ładunek i właściwości powierzchni liposomów możliwe jest kontrolowanie dostępności terapeutycznej zamkniętych w liposomach leków. [0218] Liposomy mogą ulegać adsorpcji na powierzchni dowolnego rodzaju komórek, a następnie powoli uwalniać zamknięty we wnętrzu czynnik. Alternatywnie, zaadsorbowany liposom może ulegać endocytozie przez komórki fagocytujące. Po endocytozie liposomalne lipidy są degradowane w lizosomach, a zamknięte we wnętrzu liposomu czynniki są uwolnione (Scherphof i wsp., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368 (198)). Po podaniu dożylnym, małe liposomy (od 0.1 µm do 1.0 µm) są zwykle pobierane przez komórki układu siateczkowo-śródbłonkowego znajdujące się głównie w wątrobie i śledzionie, a liposomy większe niż 3.0 µm odkładają się w płucach. Zjawisko preferencyjnego wychwytywania mniejszych liposomów przez komórki układu siateczkowo-śródbłonkowego zostało wykorzystane w celu dostarczania chemioterapeutyków do makrofagów i do guzów nowotworowych wątroby. [0219] Układu siateczkowo-śródbłonkowy można ominąć kilkoma sposobami obejmującymi wysycenie dużymi dawkami cząsteczek liposomów lub za pomocą selektywnej inaktywacji makrofagów środkami farmakologicznymi (Claassen i wsp., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984)). Ponadto wykazano, że włączenie do błon liposomów pochodnych fosfolipidów sporządzonych na bazie glikolipidu lub glikolu polietylenowego spowodowało znaczne zmniejszenie wychwytywania tych liposomów przez system siateczkowo-śródbłonkowy ( Allen i wsp., Biochim. Biophys. Acta 68:133 (1991), Allen i wsp., Biochim. Biophys. Acta 1:9 (1993 )). [0220] Zmieniając skład fosfolipidów lub umieszczając na liposomach ligandy albo receptory można sporządzić takie liposomy, które docierają do konkretnych komórek lub narządów. Przykładowo, liposomy charakteryzujące się wysoką zawartością niejonowych surfaktantów były specyficznie wychwytywane przez komórki wątroby (Hayakawa i wsp., Patent Japonia Nr , Kato i wsp., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993)). Kompozycję tą sporządzono mieszając ze sobą fosfatydylocholinę sojową, α-tokoferol i etoksylowany uwodorniony olej rycynowy (HCO-60) w metanolu, zagęszczając mieszaninę pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie rekonstytuując tą mieszaninę w wodzie. Wykazano, że liposomowa formulacja dipalmitoilofosfatydylocholiny (DPPC) z mieszaniną glukozydu sterolu (SG) i cholesterolu (Ch) pochodzących z soi jest również specyficznie wychwytywana przez komórki wątroby (Shimizu i wsp., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997)). [0221] Alternatywnie, z powierzchnią liposomów można związać różne specyficznie ukierunkowujące je ligandy, takie jak przeciwciała, fragmenty przeciwciał, węglowodany, witaminy i białka transportowe. Przykładowo, aby liposomy specyficznie wiązały się z receptorami asjaloglikoproteinowymi wyrażanymi wyłącznie na powierzchni komórek wątroby, można je modyfikować rozgałęzionymi pochodnymi galaktozylolipidowymi (Kato i Sugiyama, Crit. Rev Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997), Murahashi i wsp., Biol. Pharm. Bull.20: 29 (1997)). Podobnie Wu i wsp., Hepatology 27:772 (1998) wykazali, że znakowanie liposomów asjalofetuiną spowodowało skrócenie ich czasu półtrwania w osoczu oraz znacznie zwiększyło wychwyt tych liposomów przez hepatocyty. Z drugiej strony, akumulacja w wątrobie liposomów zawierających rozgałęzione pochodne galaktozylolipidowe może być hamowana przez wcześniejszą iniekcję asjalofetuiny (Murahashi i wsp., Biol. Pharm. Bull.20: 29 (1997)). Innym sposobem podejścia do problemu 49

51 specyficznego dostarczania liposomów do komórek wątroby jest użycie liposomów zawierających albuminę ludzkiej surowicy zmodyfikowaną bezwodnikiem akonitynowym (Kamps i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681 (1997)). Ponadto Geho i wsp., Patent USA Nr opisuje liposomy wychwytywane przez system kierujący je do hepatocytów, który jest specyficzny dla receptorów dróg żółciowych związanych z wyspecjalizowanymi metabolicznie komórkami wątroby. [0222] W bardziej ogólnym podejściu do problemu specyficznego kierowania do tkanki docelowej, komórki docelowe są wcześniej znakowane biotynylowanymi przeciwciałami specyficznymi dla wyrażanego przez nie ligandu (Harasym i wsp., Adv. Drug Deliv. Rev 32:99 (1998)). Po usunięciu z osocza wolnych przeciwciał, podawane są sprzężone ze streptawidyną liposomy. W innym sposobie podejścia do problemu docelowe przeciwciała są bezpośrednio przyłączone do liposomów (Harasym i wsp., Adv. Drug Deliv. Rev 32:99 (1998)). [0223] Polipeptydy i przeciwciała mogą być zamykane w liposomach przy użyciu standardowych technik mikrokapsułkowania białka (patrz na przykład Anderson i wsp., Infect. Immun. 31:99 (1981), Anderson i wsp., Cancer Res. 0:183 (1990) i Cohen i wsp., Biochim. Biophys. Acta 63:9 (1991),Alving i wsp., Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies, w Liposome Technology, Wyd. II, Tom III, Gregoriadis (red.), str. 317 (CRC Press 1993), Wassef i wsp., Meth. Enzymol. 149:124 (1987)). Jak wspomniano powyżej, terapeutycznie użyteczne liposomy mogą zawierać różnego rodzaju składniki. Przykładowo, liposomy mogą zawierać lipidowe pochodne glikolu polietylenowego (Allen i wsp., Biochim. Biophys. Acta 1:9 (1993 )). [0224] Degradowalne mikrosfery polimerowe zostały zaprojektowane w taki sposób, aby utrzymać wysokie ogólnoustrojowe poziomy białek terapeutycznych. Mikrosfery, w których białka uwięziono w polimerze, są wytwarzane z ulegających degradacji polimerów, takich jak poli(laktyd-ko-glikolid) (PLG), polibezwodniki, poli(orto-estry), niebiodegradowalne polimery poli(octanu winylu) (Gombotz i Pettit, Bioconjugate Chem., 6:332 (199), Ranade, Role of Polymers in Drug Delivery, w Drug Delivery Systems, Ranade i Hollinger (red.), str (CRC Press 199), Roskos i Maskiewicz, Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery w Protein Delivery: Physical Systems, Sanders i Hendren (red.), str (Plenum Press 1997), Bartus i wsp., Science 281:1161 (1998), Putney i Burke, Nature Biotechnology 16:13 (1998), Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:48 (1998)). Nanosfery opłaszczone glikolem polietylenowym (PEG) mogą także służyć jako nośniki do dożylnego podawania białek terapeutycznych (patrz na przykład Gref i wsp., Pharm. Biotechnol. :167 (1997)). [022] Specjaliści w danej dziedzinie mogą opracować inne postaci dawkowania, jak pokazano na przykład w Ansel i Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Wyd. V (Lea & Febiger 1990), Gennaro (red.), Remington's Pharmaceutical Sciences, Wyd. XIX (Mack Publishing Company 199) oraz Ranade i Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996). [0226] Przykładowo, kompozycje farmaceutyczne mogą być dostarczane jako gotowy zestaw zawierający pojemnik z rozpuszczalnym polipeptydem według niniejszego wynalazku. Polipeptyd terapeutyczny może być dostarczony w postaci roztworu do wstrzykiwania pojedynczych lub wielokrotnych dawek lub w postaci sterylnego proszku, który będzie przed wstrzyknięciem rekonstytuowany. Alternatywnie, taki zestaw może zawierać urządzenie do podawania terapeutycznego polipeptydu, takie jak urządzenie rozpylające suchy proszek, urządzenie wytwarzające aerozol cieczy lub nebulizer. Taki zestaw może ponadto zawierać pisemne informacje o zaleceniach i zastosowaniu kompozycji farmaceutycznej. Ponadto, informacje te mogą 0

52 zawierać oświadczenie, że u pacjentów ze stwierdzoną nadwrażliwością na IL-17RC lub IL-17RA istnieje przeciwwskazanie do przyjmowania takiej kompozycji. [0227] Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji rozpuszczalnego polipeptydu według niniejszego wynalazku oraz sposobów i terapeutycznych zastosowań obejmujących ten sam polipeptyd opisany w niniejszym dokumencie. Takie kompozycje mogą dodatkowo zawierać nośnik. Nośnikiem może być zwykły nośnik organiczny bądź nieorganiczny. Przykłady nośników obejmują wodę, roztwór buforowany, alkohol, glikol propylenowy, makrogol, olej sezamowy, olej kukurydziany i tym podobne K) Otrzymywanie myszy transgenicznych [0228] W specjalnie przygotowanych myszach transgenicznych gen dla IL-17F, IL-17A, IL-17RA lub dla IL- 17RC może być silnie wyrażany we wszystkich tkankach lub pod kontrolą specyficznego tkankowo lub tkankowo preferowanego element regulatorowego. Zwierzęta z nadekspresją danego białka można użyć do scharakteryzowania fenotypu, który powstaje w wyniku nadmiernej ekspresji danego genu. Zwierzęta transgeniczne mogą służyć jako model dla chorób występujących u ludzi spowodowanych nadmiarem IL- 17F, IL-17A, IL-17RA lub IL-17RC. Myszy transgeniczne, które nadmiernie wyrażają którekolwiek z wymienionych białek, stanowią jednocześnie model eksperymentalny bioreaktora do wytwarzania IL-17RA lub IL-17RC, jak i innych dowolnych polipeptydów według niniejszego wynalazku w mleku lub krwi większych zwierząt. Metody uzyskiwania myszy transgenicznych są dobrze znane specjalistom w dziedzinie (patrz na przykład Jacob, Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice, w Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (red.), str (Academic Press, Ltd. 1994), Monastersky i Rob1 (red.), Strategies in Transgenic Animal Science (ASM Press 199), Abbud i Nilson, Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice w Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Fernandez i Hoeffler (red.), str (Academic Press, Inc 1999)). [0229] Przykładowo, uzyskanie myszy transgenicznych, które eksprymują gen kodujący IL-17RC, można rozpocząć dysponując dorosłymi rozpłodowymi samcami (ang. stud) (B6C3F1, 2-8 miesięcy (Taconic Farms, Germantown, NY)), samcami po wazektomii (ang. duds) (B6D2f1, 2-8 miesięcy, (Taconic Farms)), niedojrzałymi płodnymi samicami (dawca) (B6C3F1, 4- tygodni (Taconic Farms)) i dorosłymi płodnymi samicami (biorca) (B6D2f1, 2-4 miesięcy, (Taconic Farms)). Aklimatyzacja dawców trwa jeden tydzień. Następnie, w celu wywołania hiperowulacji, dawcom podano w iniekcji i.p. gonadotropinę Pregnant Mare's Serum (Sigma Chemical Company, St Louis, MO) w ilości około 8 IU/mysz godz. później dawcom podano w iniekcji i.p. ludzką gonadotropinę kosmówkową (hcg (Sigma)) w ilości 8 IU/mysz. Po wstrzyknięciu hormonu dawców krzyżowano z samcami rozpłodowymi. Owulacja występuje zazwyczaj w ciągu 13 godz. od iniekcji hcg. Kopulację potwierdza się na podstawie obecności czopa pochwowego następnego dnia rano po dniu krycia. [0230] Zapłodnione jaja pobierano podczas zabiegu chirurgicznego. Jaja z zebranych jajowodów uwalniano wprost na szkiełka do analizy moczu zawierające hialuronidazę (Sigma). Jaja płukano jeden raz w roztworze hialuronidazy, a następnie dwa razy w podłożu W640 Whitten (opisane na przykład przez Menino i O'Claray, Biol. Reprod. 77:19 (1986) i Dienhart i Downs, Zygote 4:129 (1996)), które wcześniej inkubowano w atmosferze % CO 2, % O 2 i 90% N 2 w temperaturze 37 C. Następnie jaja przechowywano w inkubatorze w temperaturze 37 C i atmosferze % CO 2 do momentu mikroiniekcji. [0231] do 20 μg plazmidowego DNA, zawierającego sekwencję kodującą IL-17RC linearyzowano, oczyszczono na żelu i do celów mikroiniekcji ponownie zawieszono w mm Tris-HCl (ph 7.4), 0.2 mm 1

53 EDTA (ph 8.0) w końcowym stężeniu - ng na 1 µl. Przykładowo sekwencje kodujące IL-17RC mogą kodować polipeptyd zawierający reszty aminokwasowe od 21 do 42 z SEKW. NR ID: 2. [0232] Plazmidowe DNA wprowadzano do zebranych jaj za pomocą mikroiniekcji. Jaja znajdowały się w otoczonej ciepłym olejem mineralnym kropli podłoża W640 zrównoważonego CO 2. DNA aspirowano do igły iniekcyjnej (wyciąganej z kapilary ze szkła borokrzemowego (średnica wewnętrzna 0,7 mm, średnica zewnętrzna 1 mm) i wstrzykiwano do poszczególnych jaj. W każdym jaju penetrowano za pomocą igły iniekcyjnej jedno lub oba haploidalne przedjądrza. [0233] Drogą mikroiniekcji do przedjądrza wprowadzano ilości DNA rzędu pikolitrów. Wycofywana igła iniekcyjna nie wchodziła w kontakt z jądrami. Procedurę tą powtarzano do momentu, w którym dokonano iniekcji wszystkich jaj. Jaja, które pomyślnie przeszły procedurę mikroiniekcji przenoszono do naczynia hodowlanego z podłożem W640 wcześniej nasyconym gazem i przechowywano przez noc w inkubatorze w atmosferze % CO 2 i w temperaturze 37 C. [0234] Następnego dnia dwukomórkowe embriony transferowano do biorców będących w ciąży urojonej. Biorców identyfikowano na podstawie obecności czopa kopulacyjnego powstającego po kopulacji z samcami poddanymi wcześniej wazektomii. Biorców znieczulono i ogolono po stronie dorsalnej, a następnie przeniesiono pod mikroskop operacyjny. W skórze i przez ścianę mięśnia wykonano małe nacięcie, które biegnie od środka części brzusznej wzdłuż krawędzi klatki piersiowej, siodła i tylnej nogi, w połowie odległości między kolanem i śledzioną. Narządy płciowe wyciągnięto na małą serwetę chirurgiczną. Poduszeczkę tłuszczową rozciągnięto nad serwetą chirurgiczną i obciążono zwisającym od spodu regulowanym mikrozaciskiem chirurgicznym (ang. baby serrefine) (Roboz, Rockville, MD), co zapobiega zsuwaniu się organów z powrotem do jamy brzusznej. [023] Za pomocą cienkiej pipety zawierającej olej mineralny, a następnie na przemian W640 i pęcherzyki powietrza, transferowano zdrowych dwukomórkowych embrionów. Napęczniałą bańkę jajowodu odpowiednio pozycjonowano. Trzymając jajowód między bańką jajowodu a wnęką jajnika, w jajowodzie zrobiono igłą o grubości 28 g mały otwór, w taki sposób, by nie uszkodzić ani bańki ani wnęki jajnika. [0236] Pipety umieszczono w otworze jajowodu, a zarodki wypchnięto pozwalając, aby pęcherzyk powietrza wyszedł z pipety. Poduszeczkę tłuszczową delikatnie wciśnięto do jamy otrzewnowej, a narządy płciowe wsunięto do środka. Ścianę otrzewnową zamknięto jednym szwem, a skórę zespolono klamrą. Myszy odzyskują przytomność na podgrzewanym do 37 C szkiełku przez minimum 4 godz. [0237] W każdej klatce umieszczono 2 biorców na okres dni ciąży dni po porodzie następuje odstawienie. Odstawione mysie noworodki seksowano, a osobniki różnej płci separowano w różnych klatkach. Do genotypowania za pomocą czystych nożyczek pobrano 0. cm wycinka ogona. [0238] Genomowe DNA izolowano z wycinków ogona przy pomocy przykładowo gotowego zestawu firmy Qiagen DNeasy zgodnie z protokołem producenta. Genomowy DNA jest analizowany metodą PCR przy użyciu starterów zaprojektowanych do amplifikacji genu dla IL-17RC lub wybranego genu markerowego, który wprowadzono do tego samego plazmidu. Po potwierdzeniu cech transgeniczności zwierzęta krzyżowano wsobnie kojarząc transgeniczną samicę z samcem dzikiego typu lub transgenicznego samca z jedną lub dwoma samicami dzikiego typu. Młode po urodzeniu i odstawieniu seksowano, osobniki różnej płci separowano, a następnie pobierano wycinek ogona w celu oznaczenia genotypu. [0239] W celu sprawdzenia ekspresji transgenu w żywym zwierzęciu przeprowadza się częściową hepatektomię. Do zabiegu chirurgicznego przygotowano górną część brzuszną bezpośrednio poniżej wyrostka mieczykowatego. Przy zastosowaniu aseptycznej techniki dokonano małego nacięcia o długości 2

54 ,-2 cm poniżej mostka i wyeksponowanego lewego bocznego płata wątroby. Wokół dolnego płata założono węzeł z jedwabnej nici 4-0 zabezpieczając go poza jamą ciała. Drugą pętlę, proksymalnie do pierwszej, założono przy użyciu wchłanialnych nici Dexon (American Cyanamid; Wayne, NJ). Podczas zakładania drugiej pętli do przytrzymywania węzła użyto atraumatycznego zacisku. Dystalnego cięcia dokonano z węzła Dexon. Z wątroby pobrano około 0 mg tkanki i umieszczono na sterylnej szalce Petriego. Wycięty fragment wątroby przeniesiono do okrągłodennej probówki polipropylenowej o pojemności 14 ml i gwałtownie zamrożono w płynnym azocie, a następnie przechowywano na suchym lodzie. Miejsce po cięciu chirurgicznym zszyto, a ranę zamknięto klamrami. Klatki ze zwierzętami po zabiegu umieszczono na bloku grzejnym nagrzanym do temperatury 37 C na okres 24 godz. Po zabiegu codziennie sprawdzano stan zwierząt. Klamry usunięto 7- dni po zabiegu. Poziom ekspresji mrna dla IL-17RC analizowano u każdej myszy transgenicznej przy użyciu testu hybrydyzacji RNA lub reakcji łańcuchowej polimerazy. [0240] Oprócz myszy transgenicznych z nadekspresją genów dla IL-17F, IL-17A, IL-17RA lub IL-17RC, warto wygenerować mysz transgeniczną z bardzo niską ekspresją lub całkowitym brakiem ekspresji tych genów. Takie myszy transgeniczne stanowią użyteczne modele chorób związanych z brakiem IL-17F, IL- 17A, IL-17RA lub IL-17RC. Jak wspomniano powyżej, ekspresję genu dla IL-17RC można zahamowana za pomocą genów antysensownych, genów rybozymów lub genów zewnętrznych sekwencji kierujących. Przykładowo, aby uzyskać myszy transgeniczne, które charakteryzuje niska ekspresją genu dla IL-17RC, wspomnianymi sekwencjami inhibitorowymi oddziaływuje się na mrna dla IL-17RC. Metody uzyskiwania myszy transgenicznych o obniżonej ekspresji konkretnego genu są znane specjalistom w dziedzinie (patrz, na przykład Wu i wsp., Gene Underexpression in Cultured Cells and Animals by Antisense DNA and RNA Strategies w Methods in Gene Biotechnology, str (CRC Press 1997)). [0241] Alternatywne podejście do strategii myszy transgenicznych, które mają niski lub zerowy poziom ekspresji genu dla IL-17RC, polega na otrzymaniu myszy posiadających co najmniej jeden normalny allel IL- 17RC zastąpiony przez niefunkcjonalny gen dla IL-17RC. Jedną z metod uzyskania niefunkcjonalnego genu dla IL-17RC jest insercja w obrębie cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego IL-17RC innego genu, jak wybrany gen markerowy. Standardowe metody uzyskiwania myszy knock-out są dobrze znane specjalistom w dziedzinie (patrz na przykład Jacob, Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice w Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (red.), str (Academic Press, Ltd ) oraz Wu i wsp., New Strategies for Gene Knockout w Methods in Gene Biotechnology, str (CRC Press 1997 )). [0242] Wynalazek ilustrują przykłady, które go do nich nie ograniczają. PRZYKŁADY 3 40 PRZYKŁAD 1 Ekspresja genu kodującego IL-17RC [0243] Analizy przeprowadzono techniką Northern blot wykorzystując zestaw Human Multipleks Tissue Blots (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). W oparciu o produkty reakcji PCR oczyszczone na żelu uzyskano dwie sondy. Pierwszą sondę uzyskano za pomocą starterów C21798 (' CGG CGT GGT GGT CTT GCT CTT 3', SEKW. NR ID: 8) i ZC21808 (' TCC CGT CCC CCG CCC CAG GTC 3', SEKW. NR ID: 31). Sondę znakowano radioaktywnie za pomocą zestawu do znakowania Multiprime z Amersham (Arlington Heights, IL) zgodnie z protokołem producenta, a następnie oczyszczono przy użyciu kolumny NucTrap Push 3

55 (Stratagene, La Jolla, CA). Do prehybrydyzacji i hybrydyzacji na membranie w analizie Northern blot użyto roztworu ExpressHyb (Clontech). Hybrydyzację przeprowadzono przez noc w temperaturze 6 C. Po hybrydyzacji, membrany przemywano przez 30 min. w roztworach, które zawierały 0,1% SDS i SSC w następującej kolejności: dwa razy w 2 x SSC w temperaturze pokojowej, trzy razy w 0,1x SSC w 0 C, raz w 0,1x SSC w temperaturze C i raz w 0,1 x SSC w temperaturze 6 C. Wyniki hybrydyzacji pokazały, że gen dla IL-17RC był silnie wyrażany w tarczycy, nadnerczu, prostacie i tkankach wątroby, w mniejszym stopniu w sercu, jelicie cienkim, żołądku i tkankach tchawicy. Natomiast niewielką ekspresję tego genu lub jej całkowity brak obserwowano w mózgu, łożysku, płucach, mięśniach szkieletowych, nerce, trzustce, śledzionie, grasicy, jądrach, jajniku, okrężnicy, leukocytach krwi obwodowej, rdzeniu kręgowym, węzłach chłonnych i szpiku kostnym PRZYKŁAD 2 Dystrybucja mrna w panelu linii komórkowych testowana przy użyciu techniki PCR [0244] Z hodowanych na miejscu komórek będących w stanie spoczynku i komórek stymulowanych izolowano całkowity RNA, który oczyszczono za pomocą zestawu RNeasy firmy Qiagen (Valencia, CA) zgodnie z protokołem producenta lub według protokołu oczyszczania z użyciem fenolu zrównoważonego kwasem (Chomczyński i Sacchi, Analytical Biochemistry, 162:16-9, 1987). Jakość RNA oceniano za pomocą Agilent Bioanalyzer. Jeśli dana próbka RNA była w znacznym stopniu zdegradowana, nie wykorzystywano jej w następnym etapie do przepisywania nici RNA na nić cdna. Obecność zanieczyszczenia genomowym DNA oceniono przy pomocy reakcji PCR, do której użyto porcji RNA i starterów zc411 ('CTCTCCATCCTTATCTTTCATCAAC 3', SEKW. NR ID: 32) oraz zc412 (' CTCTCTGCTGGCTAAACAAAACAC 3', SEKW. NR ID: 33). Za pomocą tych starterów amplifikuje się pojedyncze miejsce w intronach genomowego DNA. Warunki reakcji PCR dla zanieczyszczającego próbkę genomowego DNA były następujące: 2, μl x buforu i 0, μl polimerazy DNA Advantage 2 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), 2 μl 2, mm roztworu dntp (Applied Biosystems, Foster City, CA), 2, μl x buforu Rediload (Invitrogen, Carlsbad, CA) i 0, μl 20 μm starterów zc411 i zc412 w końcowej objętości 2 μl. Parametry programu były następujące: 94 C przez 20 sek., 40 cykli w 94 C przez 20 sek., 60 C przez 1min. i 20 sek., 1 cykl w 72 C przez 7 min. μl każdej mieszaniny reakcyjnej poddano elektroforezie w żelu agarozowym. Żele oceniano pod względem obecności produktu PCR pochodzącego od zanieczyszczeń genomowym DNA. Jeśli obserwowano zanieczyszczenia genomowym DNA, całkowity RNA był traktowany DNA-zą przy użyciu odczynników wolnych od DNA (Ambion, Inc,, Austin, TX) zgodnie z protokołem producenta. Następnie próbki testowano ponownie jak opisano powyżej. Tylko te próbki RNA, które okazały się wolne od zanieczyszczenia genomowym DNA były wykorzystywane do generowania pierwszej nici cdna. [024] 20 μg całkowitego RNA z 82 linii komórkowych pochodzenia ludzkiego doprowadzono za pomocą H 2 O do objętości 98 μl, a następnie podzielono na dwie porcje po 49 μl. Każda porcja zawierała μg całkowitego RNA. Odpowiadające sobie porcje umieszczono na 2 różnych 96-dołkowych płytkach do PCR. Do każdej porcji dodano następujące odczynniki do syntezy pierwszej nici cdna (Invitrogen First Strand cdna Synthesis System, Carlsbad, CA): 20 µl 2mM MgCl 2, μl x buforu do RT, μl 0,1 M DTT, 2 µl oligo dt, 2 μl RNAse Out. Następnie do jednej porcji RNA z każdej linii komórkowej dodano 2 μl odwrotnej transkryptazy Superscript II, a do odpowiadającej jej kontroli negatywnej (bez odwrotnej transkryptazy) dodano 2 µl H 2 O. Wszystkie próbki inkubowano w 2 C przez min., następnie w 42 C przez 0 min. i w 4

56 C przez 1 min. Próbki umieszczono na płytce o głębokich dołkach i rozcieńczono H 2 O do objętości 1.7 ml. Do ich rozporcjowania użyto robota Multipette (Saigan). Każdą próbkę w kilku powtórzeniach rozporcjowano w objętości 16. µl na dołek 96-dołkowej płytki do PCR. W ten sposób uzyskano gotowe jednorazowe płytki z panelem cdna dla wszystkich testowanych linii komórkowych. Płytki zamknięto szczelnie folią i przechowywano w temperaturze -20 C. Każdy dołek w tych panelach reprezentuje pierwszą nić cdna uzyskaną z około 0 ng całkowitego RNA. cdna pochodzące z komórek 82 linii rozdzielono na dwa panele: panel-matrycę nr 118A i panel-matrycę nr 118B. Jakość pierwszej nici cdna w panelach oceniono w multipleksowej reakcji PCR używając do tego celu jednego z paneli i starterów do dwóch powszechnie eksprymowanych na umiarkowanym poziomie genów: CLTC (klatryna) i TFRC (receptor transferyny C). 0, µl każdego startera dla klatryny zc42901 (' CTCATATTGCTCAACTGTGTGAAAAG 3', SEKW. NR ID: 34) i zc42902 (' TAGAAGCCACCTGAACACAAATCTG 3', SEKW. NR ID: 3) oraz starterów dla TFRC zc4299 (' ATGTTGCGTTGTATGTTGAAAATCAATT 3', SEKW.NR 36) i zc42600 (' TTCTCCACGAGGTAAACAAGTCTAC 3', SEKW NR 37) zmieszano z 2, μl x buforu i 0, μl polimerazy DNA Advantage 2 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), 2 µl 2, mm roztworu dntp (Applied Biosystems, Foster City, CA), 2, μl x buforu Rediload (Invitrogen, Carlsbad, CA). Tak sporządzoną mieszaninę reakcyjną dodano do dołków każdego z paneli-matryc nr 118A i nr 118B. Parametry programu były następujące: 94 C przez 20 sek., 3 cykli w 94 C przez 20 sek., 67 C przez 80 sek. i 1 cykl w 72 C przez 7 sek. µl każdej mieszaniny reakcyjnej poddano elektroforezie w żelu agarozowym. Dla każdego genu żele oceniano pod względem obecności silnego sygnału pochodzącego od produktu PCR specyficznie syntetyzowanego w dołkach, do których dodano odwrotną transkryptazę. [0246] Dla każdej próbki w panelu zawierającym pierwszą nić cdna zbadano ekspresję mrna dla IL-I7RC stosując oligonukleotyd sensowny ZC4276 (' ctctccaggcccaagtcgtgctct 3', SEKW. NR ID: 38) i oligonukleotyd antysensowny ZC4277 (' ttgtcctgggggcctcgtgtctcc 3', SEKW. NR ID: 39). Warunki reakcji PCR były następujące: 2, μl x buforu i 0. μl polimerazy cdna Advantage 2 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), 2 ul 2, mm roztworu dntp (Applied Biosystems, Foster City, CA), 2, μl x buforu Rediload (Invitrogen, Carlsbad, CA) i 0, μl 20 μm sensownego i antysensownego startera. Warunki programu były następujące: 94 C przez 2 sek., 3 cykli w 94 C przez 1 sek., 66 C przez 30 sek., 72 C przez 1, sek. i 1 cykl w 72 C przez 7 sek. μl każdej mieszaniny reakcyjnej poddano elektroforezie w żelu agarozowym. Żele oceniano pod względem negatywnej lub pozytywnej ekspresji IL-17RC. [0247] mrna dla IL-17RC jest powszechnie wyrażane w wielu liniach komórkowych reprezentujących szerokie spektrum typów tkanek i komórek. W szczególności, IL-17RC jest konstytutywnie wyrażany w limfocytach T krwi obwodowej, a także w innych komórkach krwi, takich jak monocyty, limfocyty B i komórki mieloidalne. Wykazano, że mrna dla IL-17RC jest również obecny w liniach komórkowych pochodzących z komórek skóry. Innymi liniami komórkowymi, które wyrażają IL-17RC jest linii komórkowych jelita grubego. Materiał z tych linii uwzględniono przy sporządzaniu macierzy. 40 PRZYKŁAD 3 Dystrybucja mrna w panelu linii komórkowych testowana przy użyciu techniki RT-PCR [0244] Z hodowanych na miejscu komórek 60 różnych linii komórkowych będących w stanie spoczynku i komórek stymulowanych izolowano całkowity RNA, który oczyszczono za pomocą zestawu RNeasy firmy Qiagen (Valencia, CA) zgodnie z protokołem producenta, według protokołu oczyszczania z użyciem fenolu

57 zrównoważonego kwasem (Chomczyński i Sacchi, Analytical Biochemistry, 162:16-9, 1987 ) lub według protokołu z użyciem odczynnika Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). [0249] Do każdego dołka na 96-dołkowej płytce dodano μg całkowitego RNA z każdej linii komórkowej, a następnie 12 μl 3M octanu sodu, 0 μl Pellet Paint (Novagen, Madison, WI) i doprowadzono za pomocą H 2 O do końcowej objętości 1,2 ml. Do każdego dołka 96-dołkowej płytki do PCR przy pomocy robota Multipette (Saigan) w wielu powtórzeniach dodano 2 μl RNA, a następnie 7 μl EtOH. Otrzymano w ten sposób wiele jednorazowego użytku paneli PCR linii komórkowych. Płytki szczelnie zamknięto i przechowywano w temperaturze -20 C. Przeszukiwanie techniką RT-PCR przeprowadzono rozpoczynając od wirowania panelu przez min. przy 6000 rpm w wirówce firmy Qiagen z rotorem przeznaczonym dla 96- dołkowych płytek (Valencia, CA). Supernatant usunięto odsączając go po odwróceniu płytki na bibule. Pelety RNA przemyto 70% EtOH (0 μl), a następnie wirowano przez min. przy 6000 rpm. Supernatant ponownie usunięto i płytki suszono na powietrzu aż do całkowitego odparowania EtOH. Pelet RNA zawieszono w 1 μl H 2 O. [020] Ekspresję mrna dla mil-17rc w panelach RNA pochodzącego z mysich komórek oznaczano metodą RT-PCR przy użyciu starterów zc389 (' acgaagcccaggtaccagaaagag 3', SEKW. NR ID: 40) i zc38679 (' aaaagcgccgcagccaagagtagg 3', SEKW. NR ID: 41) za pomocą zestawu Superscript One-Step PCR z polimerazą Platinum Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA). Warunki programu były następujące: 1 cykl 48 C przez 30 min., 94 C przez 2 min., a następnie 3 cykli w 94 C przez 1 sek., C przez 30 sek., 72 C przez 1, min., a następnie 1 cykl w 72 C przez 7 min. μl każdej mieszaniny reakcyjnej poddano elektroforezie w żelu agarozowym. Następnie żele oceniano pod względem ekspresji lub braku ekspresji IL- 17RC. [021] mrna dla mysiego receptora IL-17RC jest wyrażany w kilku mysich liniach komórkowych, zwłaszcza w liniach komórkowych pochodzących ze szpiku kostnego, w tym w liniach komórkowych osteoblastów, adipocytów i preadipocytów. Ponadto, mrna dla receptora mil-17rc jest obecny w kilku próbkach pochodzących z układu hormonalnego, takich jak linie komórek podścieliska trzustki, linie wysepek trzustki i podwzgórza, gruczołów ślinowych, oraz jądra PRZYKŁAD 4 Refałdowanie i oczyszczanie pil-17f wyrażanego w E. coli A) Izolowanie ciałek inkluzyjnych i ekstrakcja pil-17f [022] Po indukcji ekspresji białka w hodowli wsadowej lub w kolbach z wytrząsaniem, zawiesinę E. coli w pożywce wirowano w butelkach o obj. 1 l przy 3000 rpm w rotorze wychyłowym Sorvall. Resztki pożywki bakteryjnej odmywano przy pomocy 0 mm Tris ph 8,0 zawierającego 200 mm NaCl i mm EDTA aż do momentu, kiedy supernatant był klarowny. [023] W następnym kroku pelet komórkowy zawieszano w schłodzonym na lodzie buforze do lizy (0 mm Tris ph 8,0, mm EDTA, 200 mm NaCl, % sacharoza (w/v), mm DTT; mm benzamidyny) i rozcieńczano do gęstości odpowiadającej - 20 OD mierzonej przy długości fali 600 nm. Zawiesinę poddano następnie trzykrotnej lizie ultradźwiękami przy ψ w schłodzonym homogenizatorze APV 2000 Lab Homogenizer. Frakcję nierozpuszczalną (ciałka inkluzyjne) odzyskano przez wirowanie lizatu komórek przy x g przez 1 godz. w temperaturze 4 C. [024] Pelet ciałek inkluzyjnych otrzymany po wirowaniu przy x g zważono i ponownie zawieszono w buforze do przemywania (0 mm Tris, ph 8,0) zawierającym 200 mm NaCl, mm EDTA, μm DTT, mm 6

58 1 benzamidyny w proporcji ml buforu/g ciałek inkluzyjnych. Kompletną dyspersję osiągnięto przez homogenizację przy pomocy homogenizatora Rotor Stator Generator firmy OMNI International. Zawiesinę wirowano przy x g przez 30 min. w temperaturze 4 C. Cykl przemywania powtarzano 3 - razy, aż do momentu, kiedy supernatant był klarowny. [02] Przemyty osad ostatecznie rozpuszczono w buforze zawierającym 7 M chlorek guanidyny, 40 mm Tris, ph 8,0, 0,1 M siarczynu sodu i 0,02 M czterotionianu sodu. Reakcja ekstrakcji i sulfitolizy zachodzi przy delikatnym mieszaniu w temperaturze 4 C przez noc. Otrzymany różowawy roztwór wirowano przy 3000 x g przez 1 godz. w temperaturze 4 C, a klarowny supernatant zawierający rozpuszczalną pil-17f filtrowano przez filtr o wielkości porów 4 μm. B) Procedura refałdowania pil-17f [026] Rozpuszczony i poddany sulfitolizie preparat pil-17f jest refałdowany przez powolne rozcieńczanie schłodzonym buforem do refałdowania zawierającym mm MES,,6 mm NaCl, 0,44 mm KCl, 0,0% PEG (3400 K), 1,1 mm EDTA, 20% gliceryny, 0, M chlorku guanidyny, 0.7 M argininę i parę redoks Glutationu w stosunku 1:1 (1 mm GSH : 1 mm GSSG). ph buforu do refałdowania doprowadzono za pomocą HCl do wartości 6,. Stężenie końcowe pil-17f rozcieńczonego w tym buforze wynosiło 0 μg/ml. Po rozcieńczeniu mieszaninę delikatnie mieszano w chłodni przez 72 godz C) Odzyskiwanie produktu i jego oczyszczanie [027] Zrefałdowany pil-17f dziesięciokrotnie zagęszczono na membranie o granicy rozdziału kd w laboratoryjnym systemie TFF. Następnie preparat filtrowano przez filtr o wielkości porów 4 μm, a ph doprowadzano do wartości,1 za pomocą kwasu octowego. Preparat o ustalonym ph wiązano do złoża na kolumnie typu Pharmacia SP Fast Flow z jonowymieniaczem wiążącym kationy o ph zrównoważonym 0 mm kwasem octowym do wartości.1. pil-17f nanoszono na kolumnę w stosunku objętościowym 1: buforu równoważącego przy przepływie 190 cm/godz. Rozcieńczenie obniża siłę jonową umożliwiając efektywne wiązanie preparatu do złoża. Po załadowaniu próbek, kolumnę przemywano buforem równoważącym do uzyskania wartości absorbancji tego buforu. Kolumnę przemywano 0.4 M NaCl w 0 mm buforze octanowym przy ph.1, a związane białko wymywano objętościami (t.j. objętościami kolumny) buforu w gradiencie NaCl od 0.4 M do 1. M w 0 mm buforze octanowym przy ph.1. Białko wymywano przy około 1M NaCl. Na podstawie analizy w SDS PAGE wiadomo, że około 8% białka we frakcjach elucyjnych jest w formie dimeru. Przed ostatnim etapem oczyszczania na sicie molekularnym i wymianą buforu, frakcje zawierające pil-17f zlewano i zagęszczano w naczyniu Amicon z membraną o granicy rozdziału kda D) Sączenie molekularne i wymiana buforu oraz formułowanie [028] Zagęszczone i zlane frakcje (stanowiące 3-4% objętości kolumny) wstrzyknięto przy przepływie 30 cm/godz. na kolumnę Pharmacia Superdex 7 zrównoważoną 0 mm buforem z fosforanem sodu zawierającym 9 mm NaCl, ph 7,2. Frakcje symetrycznego szczytu elucji zawierające produkt rozcieńczono do stężenia 1 mg/ml w buforze z 0 mm fosforanem sodu zawierającym 9 mm NaCl, ph 7.2. Ostatecznie frakcje pil-17f filtrowano przez sterylny filtr o wielkości porów 0,2 μm, podzielono na porcje i przechowywano w temperaturze - 80 C. Ostateczna wydajność procesu wynosi 20%. 7

59 PRZYKŁAD Otrzymanie konstruktu do ekspresji ssaczego rozpuszczalnego receptora IL-17RC [029] Konstrukt ekspresyjny zawierający ludzkie białko fuzyjne hil-17rc[l21-k41]-mfc1 (myszy BALB/c μ2a Fc) otrzymano w tzw. overlapping PCR oraz w wyniku rekombinacji homologicznej fragmentu DNA (SEKW. NR ID: 42) kodującego polipeptyd IL-17RC (SEKW. NR ID: 43) z fragmentem DNA kodującym mfc1 (SEKW. NR ID: 44). Do tego celu użyto również wektora ekspresyjnego pzmp20. Wymienione fragmenty generowano przez amplifikację w reakcji PCR. [0260] Fragment PCR IL-17RC [L21-K41] zawiera ' końcową sekwencję pokrywającą się ze zoptymalizowanym regionem kodującym pre-proliderową sekwencję sekrecyjną tkankowego aktywatora plazminogenu w wektorze pzmp20, zewnątrzkomórkową domeną kodującą [L21-K41] receptora IL-17RC i sekwencją na końcu 3' pokrywającą się z regionem kodującym mfc1. W reakcji PCR użyto oligonukleotydu ' [GTTTCGCTCAGCCAGGAAATCCATGCCGAGTTGAGACGCTTCCGTAGACTGGAGAGGCT TGTGGGGCCT, SEKW. NR ID: 46] i oligonukleotydu 3' [TGTGGGCCCTCTGGGCTCCTTGTGGATGTATTTGTC, SEKW. NR ID: 47], a jako matrycy użyto otrzymane wcześniej DNA klonu dla receptora IL-17RC. [0261] Fragment PCR kodujący mfc1 zawiera koniec ' pokrywający się z sekwencją IL-17RC oraz koniec 3' pokrywający się z sekwencją wektora pzmp20 w obrębie regionu wewnętrznego miejsca wiązania rybosomu (IRES) pochodzącego z wirusa polio. W reakcji PCR użyto oligonukleotydu ' [GACAAATACATCCACAAGGAGCCCAGAGGGCCCACA; SEKW. NR ID: 48] i oligonukleotydu 3' [CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGTCCGGGA; SEKW. NR ID: 49], a jako matrycy użyto wcześniej otrzymany DNA klonu dla mfc1. [0262] Warunki amplifikacji w reakcji PCR są następujące: 1 cykl w 94 C przez min., 3 cykli w 94 C przez 1 min., C przez 2 min., 72 C przez 3 min., 1 cykl w 72 C przez min. Mieszaniny reakcyjne po PCR rozdzielono w 1% żelu agarozowym, a fragmenty DNA odpowiadające prążkom o spodziewanej masie izolowano z żelu za pomocą zestawu QLAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Kat. Nr 28704). [0263] Dwa fragmenty PCR łączono w tzw. overlapping PCR. Około 1 μl każdego z dwóch fragmentów izolowanych z żelu łączono w reakcji PCR przy użyciu oligonukleotydu ' [GTTTCGCTCAGCCAGGAAATCGATGCCGAGTTGAGACGCTTGCGTAGACTGGAGAGGGT TGTGGGGCCT; SEKW. NR ID: 46] i oligonukleotydu 3' [CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGTCCGGGA; SEKW. NR ID: 49]. Warunki amplifikacji w reakcji PCR są następujące: 1 cykl w 94 C przez min., 3 cykli w 94 C przez 1 min., C przez 2 min., 72 C przez 3 min., 1 cykl w 72 C przez min. Mieszaninę reakcyjną po PCR rozdzielono w 1% żelu agarozowym, a fragment DNA odpowiadający wielkością insertowi izolowano z żelu za pomocą gotowego zestawu QlAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Kat. Nr 28704). [0264] Plazmid pzmp20 jest ssaczym wektorem ekspresyjnym zawierającym kasetę z promotorem MPSV, miejsce startu linearyzacji przed rekombinacją w komórkach drożdży oraz sekwencję sygnałową peptydu otpa, sekwencję IRES pochodzącą z wirusa polio, zewnątrzkomórkową domenę CD8 skróconą na C-końcu domeny transmembranowej, miejsce startu replikacji E. coli, kasetę ekspresyjną ssaczego markera selekcyjnego obejmującą promotor SV40, enhancer i miejsce startu replikacji, gen kodujący DHFR oraz terminator SV40, niezbędne do selekcji i replikacji w S. cerevisiae sekwencje URA3 i CEN-ARS. [026] Przed rekombinacją w komórkach drożdży plazmid pzmp20 trawiono enzymem Bgl II. Następnie trawione plazmidowe DNA poddano rekombinacji z wyizolowanym z żelu produktem PCR IL-17RC[L21- K41]-mFc1. 0 µl zawiesiny kompetentnych komórek drożdży (S.cerevisiae) zmieszano z µl DNA insertu IL-17RC[L21-K41]-mFc1 i 0 ng wektora pzmp20 trawionego wcześniej enzymem Bgl II. Całość 8

60 1 20 przeniesiono do kuwety elektroporacyjnej ze szczeliną o szerokości 0,2 cm. Mieszaninę komórek drożdży i DNA elektroporowano przy pomocy elektroporatora (BioRad Laboratories, Hercules, CA) stosując parametry pulsu wynoszące 0,7 kv ( kv/cm), Ω i 2 µf. Do kuwety dodano 600 µl 1,2 M sorbitolu, a komórki drożdży wysiano w objętości 0 µl i 300 µl na dwie płytki URA-D i inkubowano w temperaturze 30 C. Po 72 godz. transformanty Ura+ z pojedynczej płytki zawieszono w 1 ml H 2 O i zwirowano do osadu. Osad zawieszono w 0, ml buforu do lizy (2% Triton X-0, 1% SDS, 0 mm NaCl, mm Tris, ph 8,0, 1 mm EDTA). 00 µl lizatu przeniesiono do probówki Eppendorfa zawierającej 20 µl umytych kwasem szklanych kuleczek i 300 µl mieszaniny fenol-chloroform. Mieszaninę wytrząsano przez 3 min. i wirowano przez min. w wirówce firmy Eppendorf przy największej prędkości obrotowej. 300 µl fazy wodnej przeniesiono do nowej probówki. DNA wytrącono objętością 600 µl etanolu i wirowano przez 30 min. przy największej prędkości obrotowej. Etanol zdekantowano, a osad przemyto 70% etanolem. Etanol ponownie zdekantowano, a osad DNA rozpuszczono w 30 µl mm Tris, ph 8,0, 1 mm EDTA. [0266] Transformację elektrokompetentnych komórek bakteryjnych E. coli (DH12S) przeprowadzono mieszaniną µl drożdżowego DNA i 0 µl DNA z E.coli. Komórki elektroporowano stosując parametry pulsu wynoszące 0,2 kv, 2 µf i 400 Ω. Po elektroporacji do mieszaniny dodano 1 ml SOC (2% Bacto Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0.% ekstrakt drożdżowy (Difco), mm NaCl, 2, mm KCl, mm MgCl 2, mm MgSO 4, 20 mm glukoza). Komórki wysiano w objętości 0 µl i 200 µl na dwie płytki z LB AMP (pożywka LB (Lennox), 1,8% Bacto Agar (Difco), 0 mg/l ampicyliny. [0267] Inserty z trzech różnych klonów DNA poddano sekwencjonowaniu. Wybrano jeden klon posiadający poprawną sekwencję. Plazmid izolowano w preparacji na dużą skalę przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu (QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA) zgodnie z protokołem producenta PRZYKŁAD 6 Otrzymanie konstruktu do ekspresji wariantów ssaczego rozpuszczalnego receptora IL-17RC IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS i IL-17RC-CFLAG. [0268] Konstrukt ekspresyjny zawierający ludzki IL-17RC[L21-K41] z C-końcowym znacznikiem Glu-Glu (CEE), 6xHis (His) lub FLAG (CFLAG) otrzymano w reakcji PCR i za pomocą homologicznej rekombinacji przy użyciu fragmentu DNA kodującego IL-17RC[L21-K41] (SEKW. NR ID: 42) i wektora ekspresyjnego pzmp20. [0269] Fragment otrzymany w PCR i kodujący IL-17RC-CEE zawiera sekwencję ' pokrywającą się ze zoptymalizowanym regionem kodującym pre-proliderową sekwencję sekrecyjną tkankowego aktywatora plazminogenu w wektorze pzmp20, zewnątrzkomórkową domenę IL-17RC kodującą fragment [L21-K41], sekwencję znacznika Glu-Glu (Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu, SEKW. NR ID: 3) i 3' końcowy odcinek pokrywający się z regionem w obrębie miejsca wewnętrznego wiązania rybosomu (IRES) pochodzącego z wirusa polio w wektorze pzmp20. W reakcji PCR użyto oligonukleotydu ' [GTTTCGCTCAGCCAGGAAATCCATGCCGAGTTGAGACGCTTCCGTAGACTGGAGAGGCT TGTGGGGCCT; SEKW. NR ID: 46] i oligonukleotydu 3' [TGTGGGCCCTCTGGGCTCCTTGTGGATGTATTTGTC, SEKW. NR ID: 47], a jako matrycy użyto otrzymanego wcześniej DNA klonu dla IL-17RC. [0270] Warunki amplifikacji w reakcji PCR są następujące: 1 cykl w 94 C przez min., 3 cykli w 94 C przez 1 min., C przez 2 min., 72 C przez 3 min., 1 cykl w 72 C przez min. Mieszaninę reakcyjną PCR rozdzielano w 1% żelu agarozowym, a fragment DNA odpowiadający wielkością insertowi izolowano z żelu przy pomocy gotowego zestawu QlAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Kat. Nr 28704). 9

61 [0271] Przed rekombinacją w komórkach drożdży plazmid pzmp20 trawiono enzymem Bgl II. Następnie trawione plazmidowe DNA poddano rekombinacji z wyizolowanym z żelu produktem PCR IL-17RC [L21- K41]-mFc1. 0 µl zawiesiny kompetentnych komórek drożdży (S. cerevisiae) mieszano z µl DNA insertu IL-17RC-CEE i 0 ng wektora pzmp20 trawionego wcześniej enzymem Bgl II. Mieszaninę przeniesiono do kuwety elektroporacyjnej ze szczeliną o szerokości 0.2 cm. Mieszaninę komórek drożdży i DNA elektroporowano przy pomocy elektroporatora (BioRad Laboratories, Hercules, CA) stosując parametry pulsu wynoszące 0.7 kv ( kv/cm), Ω i 2 µf. Do kuwety dodano 600 µl 1.2 M sorbitolu, a komórki drożdży wysiano w objętości 0 µl i 300 µl na dwie płytki URA-D i inkubowano w temperaturze 30 C. Po 72 godz. transformanty Ura+ z pojedynczej płytki zawieszono w 1 ml H 2 O i zwirowano do osadu. Osad zawieszono w 0, ml buforu do lizy (2% Triton X-0, 1% SDS, 0 mm NaCl, mm Tris, ph 8,0, 1 mm EDTA). 00 µl lizatu przeniesiono do probówki zawierającej 20 µl umytych kwasem szklanych kuleczek i 300 µl mieszaniny fenol-chloroform. Mieszaninę wytrząsano przez 3 min. i wirowano przez min. w wirówce firmy Eppendorf przy największej prędkości obrotowej. 300 µl fazy wodnej przeniesiono do nowej probówki. DNA wytrącono za pomocą 600 µl etanolu i wirowano przez 30 min. przy największej prędkości obrotowej. Etanol zdekantowano, a osad przemyto 70% etanolem. Etanol ponownie zdekantowano, a osad DNA rozpuszczono w 30 µl mm Tris, ph 8,.0, 1 mm EDTA. [0272] Transformację elektrokompetentnych komórek bakteryjnych E. coli (DH12S) przeprowadzono sporządzając mieszaninę µl drożdżowego DNA i 0 µl DNA z E. coli. Komórki elektroporowano stosując parametry pulsu 0.2 kv, 2 µf i 400 Ω. Po elektroporacji do mieszaniny dodano 1 ml SOC (2% Bacto Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0,% ekstrakt drożdżowy (Difco), mm NaCl, 2, mm KCl, mm MgCl 2, mm MgSO 4, 20 mm glukoza). Komórki wysiano w objętości 0 µl i 200 µl na dwie płytki z LB AMP (pożywka LB (Lennox), 1,8% Bacto Agar (Difco), 0 mg/l ampicyliny. [0273] Trzy inserty DNA poddano sekwencjonowaniu. Wybrano jeden klon posiadający poprawną sekwencję. Plazmid izolowano w preparacji na dużą skalę przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu (QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA) zgodnie z protokołem producenta. [0274] Tą samą procedurę zastosowano do przygotowania IL-17RC z C-końcowym znacznikiem His składającym się z: Gly Ser Gly Gly His His His His His His His His His His (IL-17RC-CHIS, SEKW. NR ID: 1) lub C-końcowym znacznikiem FLAG składającym się z: Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (IL-17RC-CFLAG, SEKW. NR ID: 2). W celu przygotowania tych konstruktów zamiast oligonukleotydu 3' z SEKW. NR ID: 0 do skonstruowania IL-17RC-CHIS użyto oligonukleotydu 3' [CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGATGTCCA CCAGATCCCTTGTGGATGTATTTGTC, SEKW. NR ID: 4], a do skonstruowania IL-17RC-CFLAG użyto oligonukleotydu 3' [CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTACTTATCATCATCATCCTTATAAT CGGATCCCTTGTGGATGTATTTGTC, SEKW. NR ID: ]. PRZYKŁAD 7 Transfekcja i ekspresja konstruktów wyrażających rozpuszczalny receptor IL17RC, białko fuzyjne IL-17RC-mFc1 i białka z C-końcowym znacznikiem IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS i IL-17RC-CFLAG. [027] Trzy porcje po 200 µg każdego z konstruktów wyrażających białko fuzyjne IL-17RC lub białko IL- 17RC ze znacznikiem poddano trawieniu w obecności 200 j, enzymu restrykcyjnego PvuI w temperaturze 37 C przez 3 godz. Następnie DNA wytrącono alkoholem izopropylowym i odwirowano w mikrowirówkowych probówkach o objętości 1, ml. Supernatant zdekantowano znad osadu, a osad przemyto 1 ml 70% etanolu i 60

62 pozostawiono przez min. w temperaturze pokojowej. Probówkę wirowano w mikrowirówce przez min. przy rpm, supernatant zdekantowano znad osadu, a osad rozpuszczono w 70 μl sterylnej zawiesiny komórek CHO w podłożu hodowlanym, inkubowano w temperaturze 60 C przez 30 min. i pozostawiono do schłodzenia w temperaturze pokojowej. W każdej z trzech probówek po zwirowaniu znajdowało się około x 6 komórek CHO, które zawieszono w roztworze DNA rozcieńczonym podłożem hodowlanym. Mieszaniny DNA i komórek umieszczono w kuwecie ze szczeliną o szerokości 0,4 cm i elektroporowano stosując parametry pulsu wynoszące 90 uf, 300 V i wysoką pojemność. Następnie zawartość kuwet połączono, rozcieńczono do 2 ml za pomocą podłoża hodowlanego dla komórek CHO i umieszczono w kolbie do hodowli z wstrząsaniem o pojemności 12 ml. Kolbę umieszczono w inkubatorze na wytrząsarce w temperaturze 37 C, atmosferze 6% CO 2 z wytrząsaniem przy 120 rpm. [0276] Komórki CHO poddano selekcji składnikiem odżywczym zwiększając stężenie metotreksatu (MTX) z 200 nm do 1 µm. Ekspresja białka fuzyjnego lub białka znakowanego została potwierdzona metodą Western blotting. Dla potrzeb następnego etapu, którym jest oczyszczanie, zwiększono ilość komórek w hodowli PRZYKŁAD 8 Ekspresja rozpuszczalnego receptora IL-17RC [0277] Plazmid ekspresyjny zawierający IL-17RC-Tbx-C(Fc9) (SEKW. NR ID: 64) skonstruowano przez rekombinację homologiczną przy użyciu fragmentu DNA z IL-17RC _Tbx i wektora ekspresyjnego pzmp40. Fragment ten otrzymano w reakcji amplifikacji PCR przy użyciu starterów zc4431 i zc444. [0278] Fragment IL-17RC_Tbx otrzymany w PCR zawiera część regionu kodującego domenę zewnątrzkomórkową IL-17RC. Fragment ten powstał przy użyciu jako matrycy uprzednio otrzymanego klonu IL-17RC. Fragment ten zawiera odcinek ', którego sekwencja jest komplementarna z sekwencją pzmp40 w obrębie regionu kodującego otpa, fragment IL-17RC (reszty aminokwasowe od 21 do 41 w SEKW. NR ID: 2), sekwencję łącznikową, miejsce cięcia dla trombiny i odcinek 3' komplementarny z sekwencją wektora pzmp40 w regionie kodującym Fc9. Warunki reakcji PCR są następujące: 1 cykl w 94 C przez min., 3 cykli w 94 C przez 1 min., C przez 2 minuty, 72 C przez 3 min., 1 cykl w 72 C przez min. [0279] Mieszaniny reakcyjne PCR rozdzielono w 1% żelu agarozowym, a fragment DNA odpowiadający wielkością insertowi izolowano z żelu za pomocą gotowego zestawu QlAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Kat. Nr 28704). [0280] Plazmid pzmp40 jest ssaczym wektorem ekspresyjnym zawierającym kasetę z promotorem MPSV, polilinker do klonowania sekwencji kodujących, sekwencję sygnałową peptydu otpa, sekwencję dla Fc9, sekwencję wewnętrznego miejsca wiązania rybosomu pochodzącą z wirusa polio, zewnątrzkomórkową domenę CD8 skróconą na C-końcu domeny transmembranowej, miejsce startu replikacji E. coli, kasetę ekspresyjną ssaczego markera selekcyjnego obejmujący promotor SV40, enhancer i miejsce startu replikacji, gen kodujący DHFR oraz terminator SV40, niezbędne do selekcji i replikacji w S. cerevisiae sekwencje URA3 i CEN-ARS. Plazmid ten otrzymano wykorzystując plazmid pzmp21 (Patent USA Nr 2003/ A1, zdeponowany w American Type Culture Collection i oznaczony jako ATCC Nr PTA- 266). [0281] Przed rekombinacją w komórkach drożdży plazmid pzmp40 trawiono enzymem Bgl II. Następnie trawione plazmidowe DNA poddano rekombinacji z produktem PCR. 0 µl zawiesiny kompetentnych komórek drożdży (S. cerevisiae) zmieszano z µl DNA insertu (SEKW. NR ID: 66) i 0 ng wektora pzmp40. Całość przeniesiono do kuwety elektroporacyjnej ze szczeliną o szerokości 0,2 cm. Mieszaninę 61

63 komórek drożdży i DNA elektroporowano przy pomocy elektroporatora (BioRad Laboratories, Hercules, CA) stosując parametry pulsu wynoszące 0,7 kv ( kv/cm), Ω i 2 µf. Do kuwety dodano 600 µl 1,2 M sorbitolu, a komórki drożdży wysiano w objętości 0 µl i 300 µl na dwie płytki URA-D i inkubowano w temperaturze 30 C. Po 72 godz. transformanty Ura+ z pojedynczej płytki zawieszono w 1 ml H 2 O i zwirowano do osadu. Osad zawieszono w 0, ml buforu do lizy (2% Triton X-0, 1% SDS, 0 mm NaCl, mm Tris, ph 8,0, 1 mm EDTA). 00 µl lizatu przeniesiono do probówki Eppendorfa zawierającej 20 µl umytych kwasem szklanych kuleczek i 300 µl mieszaniny fenol-chloroform. Mieszaninę wytrząsano przez 3 min. i wirowano przez min. w wirówce firmy Eppendorf przy największej prędkości obrotowej. 300 µl fazy wodnej przeniesiono do nowej probówki. DNA wytrącono objętością 600 µl etanolu i wirowano przez 30 min. przy największej prędkości obrotowej. Etanol zdekantowano, a osad przemyto 70% etanolem. Etanol ponownie zdekantowano, a osad DNA rozpuszczono w 30 µl TE. [0282] Transformację elektrokompetentnych komórek bakteryjnych E. coli gospodarza (DH12S) przeprowadzono z użyciem mieszaninyskładającej się z µl drożdżowego DNA i 0 µl komórek. Komórki podano elektroporacji stosując parametry pulsu wynoszące 2,0 kv, 2 mf i 400 Ω. Po elektroporacji do mieszaniny dodano 1 ml SOC (2% Bacto Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0.% ekstrakt drożdżowy (Difco), mm NaCl, 2, mm KCl, mm MgCl 2, mm MgSO 4, 20 mm glukoza). Komórki wysiano w objętości 0 µl i 200 µl na dwie płytki z LB AMP (pożywka LB (Lennox), 1.8% Bacto Agar (Difco), 0 mg/l ampicyliny. [0283] Inserty z trzech różnych klonów DNA poddano sekwencjonowaniu. Dla każdego konstruktu wybrano jeden klon posiadający poprawną sekwencję. [0284] Trzy porcje zawierające po 200 μg konstruktu IL-17RC[L21-K41 _Tbx_C (FC9) poddano trawieniu w obecności 200 j. enzymu restrykcyjnego PvuI w temperaturze 37 C przez 3 godz., a następnie wytrącono za pomocą IPA i zwirowano w probówkach mikrowirowkowych o objętości 1, ml. Supernatant zdekantowano znad osadu, a osad przemyto 1 ml 70% etanolu i pozostawiono przez min. w temperaturze pokojowej. Probówkę wirowano w mikrowirówce przez min. przy rpm, a supernatant ponownie zdekantowano znad osadu. Następnie osad zawieszono w 70 μl sterylnego podłoża hodowlanego dla PF-CHO, inkubowano w temperaturze 60 C przez 30 min., i pozostawiono do schłodzenia w temperaturze pokojowej. Komórki E6 APFDXB11 zwirowano w każdej z trzech probówek i zawieszono w podłożu hodowlanym zawierającym DNA. Mieszaninę DNA i komórek umieszczono w kuwecie ze szczeliną o szerokości 0,4 cm i elektroporowano stosując parametry pulsu wynoszące 90 μf, 300 V i wysoką pojemność. Zawartość kuwet połączono, rozcieńczono do 2 ml podłożem hodowlanym dla PF-CHO i umieszczono w kolbie do hodowli z wytrząsaniem o pojemności 12 ml. Kolbę umieszczono w inkubatorze na wytrząsarce w temperaturze 37 C, atmosferze 6% CO 2 z wytrząsaniem przy 120 rpm. [028] Komórki CHO poddano selekcji składnikiem odżywczym zwiększając stężenie metotreksatu (MTX) z 200 nm do 1 µm. Obecność wyrażanego białka potwierdzono metodą Western blotting. Dla potrzeb następnego etapu, którym jest oczyszczanie, ilość komórek w hodowli zwiększono. 40 PRZYKŁAD 9 Oczyszczanie rozpuszczalnej formy receptora IL-17RC z komórek CHO [0286] Kondycjonowane podłoże z hodowli komórek CHO wyrażających IL-17RC-TBX-FC9 (SEKW. NR ID: 64) -krotnie zagęszczono za pomocą systemu filtracji Pellicon-II w przepływie stycznym w kasecie z membraną Biomax 0,1 m2 o granicy rozdziału 30 kd (Millipore, Bedford, MA). ph zagęszczonego podłoża doprowadzono lodowatym kwasem octowym do wartości,, filtrowano przez sterylny filtr o wielkości porów 62

64 1 20 0,2 µm, a następnie dodano do złoża sefaroza-białko G zapewniającego szybki przepływ w chromatografii bezkolumnowej (ang. Batch chromatography) (Pharmacia, Piscataway, NJ) i rozdzielano prze noc w temperaturze 4 C. Przed naniesieniem kondycjonowanego podłoża o ustalonym ph, żywicę z białkiem G równoważono objętościami ( objętościami kolumny) (ok. ml) buforu o składzie: 2 mm octan sodu, mm NaCl, ph,. Stosunek objętościowy filtrowanego kondycjonowanego podłoża o ustalonym ph do żywicy wynosił 33:1 (v/v). [0287] Chromatografię bezkolumnową prowadzono w temperaturze otoczenia (ok. 21 C). Po inkubacji ze złożem sefaroza z białkiem G kondycjonowane podłoże hodowlane filtrowano przez filtr o wielkości porów 0.22 µm, wlano do pustej szklanej kolumny o rozmiarach, x 20, cm (BioRad, Hercules, CA) i grawitacyjnie upakowano. Kolumnę przemywano objętością 300 ml ( objetości kolumny) buforu o składzie 2 mm octan sodu, mm NaCl, ph,. Związane białko wymywano przy odpowiednim ph za pomocą roztworu 0 mm glicyny, ph 2,7. Zbierano frakcje o objętości 0,9 ml, a ich ph natychmiast neutralizowano buforem o składzie 1,0 ml, 2,0 M Tris, ph 8,0. Zebrane frakcje analizowano po rozdziale w SDS PAGE na żelu barwionym Coomassie. Frakcje zawierające IL-17RC-Tbx-Fc9 łączono i zagęszczano około 6 razy przy użyciu kolumienki wirówkowej z membraną Biomax o granicy rozdziału kd (Millipore, Bedford, MA) zgodnie z protokołem producenta. [0288] Połączone i zagęszczone frakcje dializowano w temperaturze 4 C do 1 x buforu fosforanowego, ph 7.3 (Sigma, St. Louis, MO) przy użyciu Slide-A-Lyzer z membraną o granicy rozdziału 7 kd (Pierce, Rockford, IL). IL-17RG-TbX-Fc9 po dializie do buforu fosforanowego o ph 7,3 filtrowano przez sterylny filtr o wielkości porów 0,22 µm, a następnie rozporcjowano i przechowywano w temperaturze - 80 C PRZYKŁAD Wiązanie interleukiny IL-17A oraz IL-17F do ludzkiego receptora IL-17RC A) Wiązanie biotynylowanych cytokin do transfekowanych komórek [0289] Komórki BHK (Baby Hamster Kidney) transfekowano wektorem ekspresyjnym kodującym receptor dla interleukiny IL-17 (SEKW. NR ID: 21) lub receptor hil-17rc (SEKW. NR ID: 2) lub dwoma wspomnianymi wektorami. Uważa się, że zarówno receptor dla interleukiny IL-17 jak i receptor IL-17RC wiążą biotynylowane hil-17a i hil-17f. Komórki zbierano za pomocą wersenianu wapniowo-sodowego (ang.versene), liczono i rozcieńczono do gęstości 7 komórek/1 ml przy użyciu podłoża do znakowania (SM) o składzie HBSS, 1 mg/ml albuminy z surowicy wołowej (BSA), mm Hepes i 0.1% azydku sodu (w/v). Biotynylowaną interleukinę hil-17a (SEKW. NR ID: 14) i hil-17f (SEKW. NR ID: 16) o różnych stężeniach inkubowano z komórkami przez 30 min na lodzie. Po upływie 30 min. nadmiar cytokin odmywano buforem SM, a komórki inkubowano przez 30 min. na lodzie ze streptawidyną skoniugowaną z fikoerytryną (SA-PE) i rozcieńczoną w stosunku 1:0. Nadmiar SA-PE odmyto, a komórki analizowano w cytometrii przepływowej. Ilość związanych cytokin obliczono na podstawie średniej intensywności sygnału fluorescencji pochodzącego od wyznakowanych cytokin. Na podstawie tej analizy stwierdzono, że interleukina hil-17a w równym stopniu wiąże zarówno receptor hil-17r jak i hil-17rc. hil-17f wiąże receptor hil-17rc na podobnym poziomie co hil-17a, natomiast receptor IL-17R na poziomie wykrywalnym, lecz znacznie niższym niż w przypadku hil-17a. 63

65 B) Wiązanie biotynylowanych cytokin do ludzkich jednojądrzastych komórek krwi obwodowej [0290] Ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) izolowano z krwi obwodowej wirując krew w gradiencie gęstości na Fikolu. Zawiesinę PBMC o gęstości 7 komórek/ml w tym samym czasie inkubowano z biotynylowaną IL-17A lub IL-17F w stężeniu 1µg/ml i ze skoniugowanym z fluorochromem przeciwciałem skierowanym przeciwko specyficznym dla różnych linii komórkowych białkom, dzięki którym można te linie od siebie odróżnić. Markery białkowe obejmują CD4, CD8, CD19, CD11b, CD6 i CD16. Nadmiar przeciwciała i cytokin odmywano. Specyficzne wiązanie cytokin wykrywano inkubując komórki z SA-PE jak opisano powyżej. Próbki analizowano w cytometrii przepływowej. Na podstawie tej analizy stwierdzono, że hil-17a wiąże się w zasadzie do wszystkich badanych populacji komórek, natomiast hil- 17F nie wiąże się w wykrywalnym stopniu do żadnej z tych populacji C) Hamowanie nieznakowaną cytokiną specyficznego wiązania do biotynylowanej IL-17A i IL-17F [0291] Badania wiązania przeprowadzono jak omówiono powyżej, ale do mieszaniny reakcyjnej dodano nadmiar hil-17a i hil-17f. W badaniach z użyciem komórek BHK zastosowano różne stężenia nieznakowanej cytokiny. Stwierdzono, że nieznakowana interleukina IL-17A konkuruje o wiązanie do receptora IL-17RC i do receptora IL-17R zarówno z IL-17A jak i z IL-17F. Natomiast nieznakowana IL-17F konkuruje zarówno z IL-17A jak i z IL-17F o wiązanie do receptora IL-17RC, ale nie konkuruje efektywnie z IL-17A i z IL-17F o wiązanie do receptora IL-17R. Wynik ten sugeruje, że zarówno IL-17A jak i IL-17F specyficznie wiążą receptor IL-17RC. Ponadto wiązanie krzyżowe wskazuje na to, że miejsce wiązania jest dla obu białek identyczne lub w znacznym stopniu podobne. IL-17A konkuruje ze stosunkowo słabym kompetytorem, jakim jest IL-17F o wiązanie do receptora IL-17R. Sugeruje to, że obie badane interleukiny wiążą się do podobnego regionu w cząsteczce IL-17R, z tą jednak różnicą, że IL-17F wiąże się do IL-17R ze znacznie mniejszym powinowactwem niż do IL-17RC D) Hamowanie specyficznego wiązania biotynylowanej interleukiny hil-17a i hil-17f za pomocą rozpuszczalnego receptora IL17RC i IL-17R [0292] Badania wiązania przeprowadzono jak opisano powyżej, z tą różnicą, że do mieszaniny reakcyjnej dodano rozpuszczalną formę receptora IL-17RC lub IL-17R. Rozpuszczalne receptory to białka fuzyjne składające się z domeny zewnątrzkomórkowej każdego z receptorów połączonej ze stałym regionem (Fc) ludzkiej IgG1. Wykazano, że rozpuszczalny receptor IL-RC hamuje wiązanie obu interleukin, zarówno hil- 17A jak i hil-17f, do transfekowanych komórek BHK wyrażających IL-17R i IL-17RC. Rozpuszczalny receptor IL-17R hamuje wiązanie hil17a do obu receptorów, ale nie blokuje efektywnie wiązania hil17f do IL-17RC, co pozostaje w zgodzie z obserwacją, że IL17F słabo wiąże się do IL-17R PRZYKŁAD 11 Wiązanie interleukiny IL-17A oraz IL-17F do receptora hil-17rc A) Hamowanie wiązania za pomocą tzw. zimnego ligandu [0293] Dwa dni przed testem komórki BHK transfekowane hil-17rc (SEKW. NR ID: 2) i IL-17R (SEKW. NR ID: 21) wysiano na 24-dołkowa płytkę (Costar 327) w ilości komórek na dołek. Interleukiny IL-17A (SEKW. NR ID: 14) i IL-17F (SEKW. NR ID: 16) wyznakowano radioaktywnie za pomocą kuleczek z jodogenem. Białka te w trzech powtórzeniach i w stężeniu ng/ml dodano do osobnych dołków, w których znajdowało się 20 µl buforu wiążącego (podłoże hodowlane RPMI 1640 (JRH 2-00M) z dodatkiem 64

66 albuminy z surowicy wołowej w stężeniu mg/ml (Gibco ). Zimny kompetytor dodano w 0- krotnym molarnym nadmiarze. Testowane kompetytory obejmowały IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F i IL-21. Płytki inkubowano przez 1 godz. na lodzie, a następnie dwa razy przemywano PBS (Invitrogen ) i jeden raz roztworem soli (1, M NaCl, 0 mm HEPES ph 7.4). Następnie do dołków dodawano 00 µl roztworu 0,8 M NaOH i inkubowano przez 30 min. w temperaturze pokojowej. Pomiar przeprowadzano mierząc sygnał w jednostkach cpm na liczniku gamma (Packard Cobra II A00). [0294] Rezultaty sugerują, że 0-krotny molowy nadmiar zimnego IL-17A i IL-17F około siedmiokrotnie zmniejszał wiązanie IL-17A znakowanego za pomocą 12 I do hil-17rc na powierzchni komórek BHK, podczas gdy IL-17B, C, D, E i IL-21 nie miały wpływu na to wiązanie. 0-krotny molowy nadmiar zimnego IL-17A około czterokrotnie zmniejszał wiązanie IL-17A znakowanego 12 J do hil-17r, podczas gdy IL-17B, C, D, E, F i IL-21 nie miały wpływu na wiązanie. 0-krotny molowy nadmiar zimnego IL-17A i IL-17F odpowiednio około czterokrotnie lub pięciokrotnie zmniejszał wiązanie IL-17F znakowanego za pomocą 12 I do hil-17r na powierzchni komórek BHK, podczas gdy IL-17B, C, D, E i IL-21 nie miały wpływu na to wiązanie. B) Hamowanie wiązania rozpuszczalnym receptorem [029] Wiązanie do komórek BHK transfekowanych hzytor14 (SEKW. NR ID: 2) i IL-17R (SEKW. NR ID: 21) przeprowadzono jak poprzednio dla komórek BHK wyrażających każdy z receptorów osobno, ale w tym doświadczeniu do mieszaniny reakcyjnej zamiast zimnego ligandu dodano 0-krotny molarny nadmiar rozpuszczalnego hil-17rcx1/fc9 (Przykład 8) i rozpuszczalnego IL-17R/Fc (otrzymane z R&D; Ref IR). Komórki przemyto, poddano lizie i przeprowadzono pomiar jak w części pierwszej. [0296] Rozpuszczalny hil-17rc/fc hamował wiązanie IL-17F znakowanego 12 J do komórek z ekspresją hil-17rc przy IC0 wynoszącym -krotny molarny nadmiar (średnia z trzech eksperymentów). hil- 17RC/Fc i IL-17R/Fc hamowały wiązanie IL-17A znakowanego 12 J do komórek tej samej linii przy IC0 wynoszącym 20-krotny molarny nadmiar C) Wysycenie wiązania [0297] Transfekowane komórki BHK wysiano na 24-dołkowa płytkę jak poprzednio. Znakowane izotopowo IL-17A i IL-17F dodawano w ośmiu rozcieńczeniach (1:3) rozpoczynając od stężenia 4 nm do stężenia 1.83 pm w końcowej objętości 20 µl buforu wiążącego na dołek. Każde stężenie analizowano w trzech powtórzeniach. Do dołka z każdym rozcieńczeniem dodawano 0-krotny molarny nadmiar zimnego ligandu. Komórki przemyto, poddano lizie i przeprowadzono pomiar jak w części pierwszej. Wynik przedstawiono w postaci wykresu zależności ilości cpm od stężenia dodanego radioaktywnego ligandu. Wyniki normalizowano odejmując pomnożone przez 0 wartości cpm otrzymane dla wiązania radioaktywnego ligandu zmieszanego z ligandem zimnym. Dla każdej kombinacji radioaktywnie znakowanego ligandu i transfekowanych komórek wykorzystano normalizowane wartości, które posłużyły do sporządzenia krzywej wysycenia wiązania. W Tabeli 7 przedstawiono wartości powinowactwa ze wszystkich trzech eksperymentów. 40 6

67 Tabela 7 12 I IL-17A + BHK hil-17rc 12 I IL-17A + BHK IL-17R pm /- 0.2 nm pm /- 0.3 nm pm /- 0.1 nm 12 J IL-17F + BHK hil-17rc 12 J IL-17F + BHK IL-17R 1. 0 pm 1. Bardzo niskie powinowactwo pm 2. Bardzo niskie powinowactwo pm 3. Bardzo niskie powinowactwo [0298] Największą zgodność dopasowania krzywej wiązania kompetytywnego do jednego miejsca wiążącego uzyskano dla wiązania IL-17A i IL-17F do IL-17R. Największą zgodność dopasowania krzywej wiązania kompetytywnego do dwóch miejsc wiążących uzyskano dla wiązania IL-17A i IL-17F do hil-17rc. Wartości wiązania do miejsca o wysokim powinowactwie pokazano powyżej. Miejsce wiązania o niskim powinowactwie posiadało bardzo niskie powinowactwo, którego wartość była inna w każdym z trzech eksperymentów PRZYKŁAD 12 Mysie komórki NIH3T3 reagują na działanie hil-17a i hil-17f A) Wysianie komórek oraz infekcja adenowirusem kz142 [0299] Linię NIH3T3 wyprowadzono z komórek mysich fibroblastów (opisano w ATCC). NIH3T3 w ilości x 3 /dołek wysiano w podłożu hodowlanym DMEM/% FBS zawierającym glutaminę i dodatek pirogronianu na opłaszczoną 96-dołkową płytkę z białego nieprzezroczystego tworzywa (Nr kat Costar). Komórki hodowano przez noc w temperaturze 37 C i atmosferze % CO 2. Na drugi dzień podłoże hodowlane usunięto i do komórek dodano cząsteczki adenowirusa Kz142 o MOI 000 cząsteczek/komórkę rozcieńczone za pomocą DMEM/1% FBS z dodatkiem glutaminy i pirogronianu. Zainfekowane wirusem komórki hodowano przez noc w temperaturze 37 C i atmosferze % CO 2. B) Test lucyferazy mierzący aktywację infekowanych wirusem kz142 reporterowych komórek NIH3T3 przez interleukiny IL-17A i IL-17F [0300] Po nocnej inkubacji z cząsteczkami adenowirusa do następnych etapów badań przygotowano ligandy hil-17a i hil17f, rozcieńczając je w wolnym od surowicy podłożu hodowlanym z dodatkiem 0.28% BSA. Następnie cząsteczki adenowirusa oraz podłoże hodowlane usunięto, a do komórek w trzech powtórzeniach dodano odpowiednią dawkę ligandu. Inkubację w temperaturze 37 C i atmosferze % CO 2 kontynuowano przez 4 godz., po czym podłoże usunięto, a komórki poddano 1-minutowej lizie. Następnie w teście aktywności lucyferazy zmierzono intensywność średniej fluorescencji (MFI) wykorzystując do tego celu odpowiednie odczynniki (Kat. nr 131 Promega Madison, WI) oraz luminometr mikropłytkowy. Pomiarów aktywności hil-17a i hil-17f dokonano dla stężenia w przedziale wynoszącym ng/ml. Dla obu ligandów otrzymano wartości EC0 odpowiadające stężeniu ligandu wynoszącemu 0 ng/ml. Dane te sugerują, że komórki NIH3T3 posiadają receptory dla tych ligandów, oraz że IL-17A i IL-17F aktywują czynnik transkrypcyjny NfKb/Ap-1. 66

68 PRZYKŁAD 13 Mysie komórki NIH3T3 wyrażają zarówno IL-17RA jak i IL-17RC [0301] Analiza za pomocą RT-PCR pochodzącego z komórek NIH3T3 RNA wykazała, że komórki te wyrażają zarówno IL-17RA jak i IL-17RC. Wyniki analizy zgadzają się z wcześniej obserwowaną odpowiedzią komórek (aktywacją czynnika NfKb/Ap-1) na hil-17a i hil-17f, w której bierze udział jeden lub oba wspomniane receptory. 1 SZCZEGÓŁY reakcji RT-PCR A) Analiza mysiego IL-17RC przy pomocy reakcji PCR [0302] Z komórek NIH3T3 standardowymi metodami wyizolowano całkowity RNA, który następnie użyto jako matrycy do otrzymania pierwszej nici cdna. W reakcji PCR zastosowano polimerazę hot start zgodnie z protokołem producenta (Qiagen, Valencia, CA), starter sensowny zc389 ' ACGAAGCCCAGGTACCAGAAAGAG 3' (SEKW. NR ID: 6) i starter antysensowny zc ' AAAAGCGCCGCAGCCAAGAGTAGG 3' (SEKW. NR ID: 7) oraz 3 cykli amplifikacji. Analiza elektroforetyczna w żelu agarozowym wykazała obecność dużej ilości amplikonu o spodziewanej masie 80 pz B) Analiza mysiego IL-17RA przy pomocy reakcji PCR [0303] Z komórek NIH3T3 standardowymi metodami wyizolowano całkowity RNA, którego następnie użyto jako matrycy do otrzymania pierwszej nici cdna. W reakcji PCR zastosowano polimerazę hot start zgodnie z protokołem producenta (Qiagen, Valencia, CA), starter sensowny zc3820 ' CGTAAGCGGTGGCGGTTTTC 3' (SEKW. NR ID: 8) i starter antysensowny zc 3821 ' TGGGCAGGGCACAGTCACAG 3' (SEKW. NR ID: 9) oraz 3 cykli amplifikacji. Analiza elektroforetyczna w żelu agarozowym wykazała obecność dużej ilości amplikonu o spodziewanej masie 498 pz. PRZYKŁAD 14 Opracowanie stabilnego klonu komórek NIH3T3 do testu wyrażającego czynnik transkrypcyjny ap1/nfkb [0304] Opisaną powyżej linię mysich komórek NIH3T3 stabilnie transfekowano konstruktem reporterowym kz142 ap1/nfkb zawierającym marker selekcyjny, którym jest gen oporności na neomycynę. Populację oporną na neomycynę wysiano w klonalnej gęstości. Klony izolowano przy użyciu pierścieni do klonowania i przeszukiwano pod względem aktywności lucyferazy przy użyciu ligandu hil-17a jako czynnika indukującego. Wybrano klony charakteryzujące się najwyższą średnią wartością fluorescencji (MFI) (w teście aktywacji lucyferazy przez czynnik ap1/nflcb) i najniższym sygnałem tła. Następnie dokonano wyboru stabilnego transfektanta, z którego wyprowadzono linię komórkową o nazwie nih3t3/kz PRZYKŁAD 1 Zahamowanie aktywacji wywołanej przez hil-17a lub hil-17f wykorzystując rozpuszczalne IL-17RC i IL-RA/FC w mysich komórkach NIH3T3 [030] Rozpuszczalną formę IL-17RC lub IL-17RA zastosowano w teście aktywności lucyferazy jako antagonistów aktywacji ap1/nfkb wywołanej przez hil-17a i hil-17f. Rozpuszczalne receptory to białka fuzyjne składające się z domeny zewnątrzkomórkowej każdego z receptorów połączonej ze stałym regionem 67

69 (Fc) ludzkiej IgG1. Rozpuszczalne białko fuzyjne hil-17r FC zostało zakupione (rekombinowane białko chimeryczne- hil-17r/fc, Kat. nr 177-IR-0, R&D Systems, Inc., Minneapolis, Mn.) Rozpuszczalne białko chimeryczne hil-17rc FC (IL-17RCsR/FC9) skonstruowano jak opisano powyżej. Stwierdzono, że w mysich komórkach nih3t3/kz142.8 nadmiar IL-17RCsR/FC9 i białka chimerycznego hil17rsr/fc hamuje poziomy EC0 zarówno hil-17a jak i hil-17f aktywującego ap1/nfkb. [0306] Białko IL-17RCsR/FC9 najsilniej hamuje aktywację indukowaną przez IL-17F, natomiast białko chimeryczne IL17RsR/FC najsilniej hamuje aktywację wywołaną przez IL-17A PRZYKŁAD 16 Podniesiony poziom mrna dla IL-17F w mysim modelu astmy [0307] Poziomy mrna dla IL-17F mierzono w modelu mysim u uczulonych myszy poddanych próbie wziewnej. Grupy myszy w wieku od 8 do tyg. życia sensytyzowano w dniach 0 i 7 przez dootrzewnową iniekcję rekombinowanych alergenów Dermatophagoides pteronyssinus 1 (DerP1) (Indoor Biotechnologies, Cardiff, UK) w ilości µg rozpuszczonych w 0% Imject Alum (Pierce). Siedem dni później, myszy zostały poddane próbie wziewnej z 20 µg DerP1 w 0 µl PBS przez 3 kolejne dni (14, 1 i 16). Grupę tę reprezentowały cztery myszy. W grupie kontrolnej znajdowało się myszy, które sensytyzowano buforem fosforanowym (PBS), a następnie poddawano próbie wziewnej z tym buforem. Dodatkowo 3 myszy sensytyzowane za pomocą DerP1 poddawano próbie wziewnej buforem PBS. Czterdzieści osiem godzin po podaniu alergenu lub kontrolnej próby wziewnej z myszy pobrano tkankę płucną i wyizolowano z niej RNA. [0308] Pierwszą nić cdna generowano wykorzystując za każdym razem identyczne ilości RNA. Reakcję PCR dla IL-17F przeprowadzono stosując polimerazę hot start firmy Qiagen (Qiagen, Valencia, CA) zgodnie z protokołem producenta. Zastosowano 3 cykli amplifikacji oraz starter sensowny zc46098, ' ACTTGCCATTCTGAGGGAGGTAGC 3' (SEKW. NR ID: 60) i starter antysensowny 46099, ' CACAGGTGCAGCCAACTTTTAGGA 3' (SEKW NR 61). Aby ustalić, czy jakość matrycy jest taka sama we wszystkich próbkach, przeprowadzono PCR dla β-aktyny z wykorzystaniem takiej samej ilości materiału jak w mieszaninie reakcyjnej do amplifikacji IL-17F. W reakcji PCR zastosowano 2 cykli oraz starter sensowny zc44779, ' GTGGGCCGCTCTAGGCACCA 3' (SEKW. NR ID: 62) i antysensowny zcc44776 ' CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGG 3' (SEKW NR 63). [0309] W materiale pobranym ze wszystkich 4 myszy z grupy sensytyzowanej DerP1oraz poddanej próbie wziewnej z DerP1 (symulacja astmy) obserwowano znaczny wzrost ilości produktu PCR dla IL-17F. Natomiast dla oby grup kontrolnych, zarówno dla 3 myszy sensytyzowanych DerP1 i poddanych próbie wziewnej z PBS, jak i myszy z grupy sensytyzowanej PBS i poddanej próbie wziewnej z PBS obserwowano małą ilość produktu PCR dla IL-17F. Sygnał dla β-aktyny był tak samo silny dla kontroli jak i dla myszy z grupy ze stymulowaną astmą, co dowodzi, że powodem słabej amplifikacji dla negatywnej kontroli IL-17F nie jest problem techniczny związany z matrycą. 40 PRZYKŁAD 17 Transfekcja komórek COS i metoda tzw. pułapki sekrecyjnej (ang. secretion trap) A) Transfekcja komórek COS i testy tzw. pułapki sekrecyjnej przeprowadzone na transfektantach pokazują, że IL-17RCsR/Fc9 i IL-17F są parą receptor/ligand. [03] Test pułapki sekrecyjnej posłużył do badania wiązania hil-17rc (SEKW. NR ID: 2) i hil-17f (SEKW. NR ID: 16). Rozpuszczalne białko fuzyjne IL-17RCsR/Fc9 (Przykład 8) zostało wykorzystywane w teście 68

70 pułapki sekrecyjnej jako czynnik wiążący. Komórki COS przejściowo transfekowano wektorami ekspresyjnymi z ori pochodzącym z SV40, zawierającymi cdna dla hil-17b, C, D, E, F. Stosując test pułapki sekrecyjnej opisany poniżej przeprowadzono wiązanie IL-17RCsR/Fc9 do transfekowanych komórek COS. Wiązanie IL-17RCsR/Fc9 obserwowano wyłącznie dla hil-17f. Wyniki te pokazują, że hil-17rc i IL- 17F stanowią parę receptor/ligand. 1 B) Transfekcje komórek COS [0311] Transfekcję komórek COS przeprowadzono w następujący sposób: 3 µl mieszaniny spulowanego DNA i ul Lipofectaminy w 92 µl podłoża hodowlanego DMEM wolnego od surowicy ( mg pirogronianu sodu, 146 mg L-glutaminy, mg transferyny, 2, mg insuliny, 1 μg selenu i mg fetuiny w 00 ml DMEM), inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 min. Następnie do powyższej mieszaniny dodano 400 µl podłoża hodowlanego DMEM wolnego od surowicy. Do 1, x komórek COS/dołek na 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej dodano 00 µl mieszaniny transfekcyjnej i inkubowano przez godz. w temperaturze 37 C. Następnie dodano 00 µl podłoża DMEM z 20% FBS (0 ml FBS, mg pirogronianu sodu i 146 mg L-glutaminy w 00 ml DMEM) i inkubowano przez noc C) Test pułapki sekrecyjnej [0312] Test pułapki sekrecyjnej przeprowadzono w następujący sposób: znad komórek usunięto podłoże hodowlane, a komórki przepłukano PBS i utrwalano 1.8% formaldehydem w PBS. Po utrwaleniu komórki przemyto buforem TNT (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl i 0,0% Tween-20 w H 2 O), permeabilizowano za pomocą 0.1% Tritonu-X w PBS przez 1 min. i ponownie przemyto TNT, a następnie blokowano przez 1 godz. buforem TNB (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl i 0,% Odczynnik Blokujący (NEN Renaissance TSA- Direct Kit) i przemyto ponownie TNT. Następnie komórki inkubowano przez 1 godz. z ludzkim rozpuszczalnym receptorowym białkiem fuzyjnym IL-17RCxlsR/FC9 w stężeniu 1μg/ml. Po inkubacji komórki płukano buforem TNT i inkubowano przez następną godzinę z kozim przeciwciałem skierowanym przeciwko ludzkiej Ig-HRP (specyficznie skierowane przeciwko Fc) rozcieńczonym w stosunku 1:200. Po etapie inkubacji z przeciwciałem komórki ponownie przemyto TNT. [0313] Wiązanie przeciwciał wykrywano przy użyciu odczynnika tyramidu fluoresceiny FITC-TSA) rozcieńczonego w stosunku 1:0 buforem rozcieńczającym (zestaw NEN). Komórki inkubowano z FITC-TSA przez 4-6 min., przemyto TNT i utrwalano przy pomocy odczynnika Vectashield Mounting Media (Vector Labs Burlingame, CA) rozcieńczonego w stosunku 1: w TNT. Komórki obserwowano pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu filtra do fluorochromu FITC PRZYKŁAD 18 Generowanie mysich przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko hil-17rc. A. Immunizacja w celu otrzymania przeciwciał anty-il-17rc 1. Rozpuszczalny IL-17RC-muFc [0314] Sześcio-dwunastotygodniowe myszy typu dzikiego lub z nokautem dla IL-17RC immunizowano zgodnie z harmonogramem co dwa tygodnie podając dootrzewnowo 2-0 µg rozpuszczalnego ludzkiego białka IL-17RC-muFc (Przykład 23) zmieszanego w stosunku objętościowym 1:1 z adjuwantem Ribi (Sigma). Siedem do dziesięciu dni po trzecim szczepieniu, metodą skrwawiania ze splotu pozagałkowego pobrano próbki krwi, z której pozyskano surowicę. Surowicę poddano ocenie zdolności hamowania wiązania IL-17 lub 69

71 IL-17F do IL-17RC w teście neutralizacji (np. tu opisanym). Pozyskaną surowicę wykorzystano także do znakowania komórek 293 typu dzikiego i komórek 293 transfekowanych IL-17RC, które następnie poddano analizie w FACS. Immunizację myszy, pobieranie próbek krwi i ich analizę kontynuowano w sposób opisany powyżej do chwili, kiedy krzywa miana neutralizacji osiągnęła plateau. W tym czasie myszom, których surowica wykazywała najwyższe miana neutralizacji, dożylnie podawano 2-0 µg rozpuszczalnego białka IL-17RC-Fc zawieszonego w PBS. Trzy dni później z myszy tych pobrano śledzionę i węzły chłonne, które wykorzystano w procedurze uzyskania hybrydomy. Do uzyskania hybrydomy zastosowano standardowe metody znane w stanie techniki oraz odpowiednie linie komórkowe również w stanie techniki znane np. komórki szpiczaka mysiego (P3-X63-Ag ) (patrz np. Kearney, J.F. i wsp. J Immunol. 123:148-0, 1979 oraz Lane, R.D. J Metody Immunol 81:223-8, 198 ) Rozpuszczalny IL-17RC, IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS, IL-17RC-CFLAG [031] 6-12-tygodniowe myszy typu dzikiego lub z nokautem dla IL-17RC immunizowano zgodnie z harmonogramem co dwa tygodnie podając dootrzewnowo 2-0 µg rozpuszczalnego ludzkiego białka IL- 17RC-CEE, IL-17RC-CHIS lub IL-17RC-CFLAG zmieszanego w stosunku objętościowym 1:1 z adjuwantem Ribi (Sigma). Siedem do dziesięciu dni po trzecim szczepieniu, metodą skrwawiania ze splotu pozagałkowego pobrano próbki krwi, z których pozyskano surowicę. Surowicę poddano ocenie zdolności hamowania wiązania IL-17 lub IL-17F do IL-17RC w teście neutralizacji (np. tu opisanym). Pozyskaną surowicę wykorzystano także do znakowania komórek 293 typu dzikiego i komórek 293 transfekowanych IL- 17RC, które następnie poddano analizie w FACS. Immunizację myszy, pobieranie próbek krwi i ich analizę kontynuowano w sposób opisany powyżej do chwili, kiedy krzywa miana neutralizacji osiągnęła plateau. W tym czasie myszom, których surowica wykazywała najwyższe miana neutralizacji, dożylnie podawano 2-0 µg rozpuszczalnego białka antygenowego IL-17RC, IL-17RC-CEE, zcytor-chis lub IL-17RC-CFLAG zawieszonego w PBS. Trzy dni później z myszy tych pobrano śledzionę i węzły chłonne, które wykorzystano w procedurze uzyskania hybrydomy. Do uzyskania hybrydomy zastosowano standardowe metody znane w stanie techniki oraz odpowiednie linie komórkowe również znane w stanie techniki np. komórki szpiczaka mysiego (P3-X63-Ag ) (patrz np. Kearney, J.F. i wsp. J Immunol. 123:148-0, 1979 oraz Lane, R.D. J Metody Immunol 81:223-8, 198 ) Transfektanty P81 wyrażające IL-17RC [0316] 6--tygodniowe samice myszy szczepu DBA/2 immunizowano podając dootrzewnowo 1 x żywych transfekowanych komórek P81, na przykład komórek P81/IL-17RC (przykładowo 0, ml przy gęstości komórek 2 x komórek/ml). Przed podaniem do myszy komórki utrzymywano w wykładniczej fazie wzrostu. Przed podaniem komórki zebrano, przemyto trzykrotnie PBS i zawieszano w PBS w ilości 2 x komórek/ml. W przypadku tego modelu pojawienie się wysięku w jamie otrzewnowej obserwowano w ciągu 2-3 tygodni, a śmierć myszy następowała w ciągu 4-6 tygodni, chyba że odpowiedź immunologiczna na antygen wprowadzony do komórek drogą transfekcji wzrastała. Trzytygodniowe myszy, u których nie obserwowano opuchliny brzusznej (symptomu obecności wysięku) były po 2-3 tygodniach ponownie immunizowane, jak opisano powyżej. Siedem do dziesięciu dni po drugim szczepieniu metodą skrwawiania ze splotu gałkowego pobrano próbki krwi, z których pozyskano surowicę. Surowicę poddano ocenie zdolności hamowania wiązania IL-17 lub IL-17F do IL-17 lub IL-17RC w teście neutralizacji (np. tu opisanym). Wykorzystano ją także do znakowania komórek 293 typu dzikiego i komórek

72 transfekowanych IL-17RC, które następnie poddano analizie w FACS. Immunizację myszy, pobieranie próbek krwi i ich analizę kontynuowano w sposób opisany powyżej do chwili, kiedy krzywa miana neutralizacji osiągnęła plateau. W tym czasie myszom, których surowica wykazywała najwyższe miana neutralizacji, dootrzewnowo podawano 1 x żywych transfekowanych komórek P81. Cztery dni później z myszy tych pobrano śledzionę i węzły chłonne, które wykorzystano w procedurze uzyskania hybrydomy. Zastosowano standardowe metody znane w stanie techniki oraz odpowiednie linie komórkowe również znane w stanie techniki np. komórki szpiczaka mysiego (P3-X63-Ag ) (patrz np. Kearney, J.F. I wsp. Supra., Lane, R.D. supra.). [0317] Alternatywą dla powyższego schematu szczepienia z użyciem żywych transfekowanych komórek P81 jest dootrzewnowe podanie co 2-3 tygodnie 1- x 6 napromieniowanych transfektantów. Przy tym sposobie podejścia ani jedno zwierzę nie wytworzyło wysięku i ani jedno nie zginęło z powodu opuchliny brzusznej. Natomiast zwierzęta monitoruje się w sposób opisany powyżej pod kątem neutralizującego potencjału immunologicznej odpowiedzi na IL-17RC przez surowicę, począwszy od skrwawienia po drugiej immunizacji. Kiedy miana neutralizacji osiągnęły najwyższy poziom, myszom z najwyższym mianem podano dootrzewnowo w fazie tzw. pre-fuzji (ang. pre-fusion) x 6 napromieniowanych komórek. Cztery dni później z myszy pobrano śledzionę i węzły chłonne, które wykorzystano w procedurze otrzymywania hybrydomy. Zastosowano standardowe metody znane w stanie techniki oraz odpowiednie linie komórkowe również znane w stanie techniki np. komórki szpiczaka mysiego (P3-X63-Ag (patrz np. Kearney, J.F. I wsp. Supra., Lane, R.D. supra.). B. Przeszukiwanie hybrydom po fuzji pod katem wytwarzania przeciwciał, które wiążą IL-17RC oraz hamują wiązanie IL-17 i IL-17F do IL-17RC [0318] W 8- dni po fuzji przeprowadzono trzykrotne przeszukanie supernatantów znad komórek hybrydoma. W pierwszym teście, przeciwciała w supernatantach zbadano metodą ELISA pod kątem zdolność do wiązania na płytce rozpuszczalnego białka hil-17rc, IL-17RC-muFc, IL-17RC-CEE, IL-17RC- CHIS i IL-17RC-CFLAG. Do tego celu wykorzystano kozie przeciwciała skierowane przeciwko mysiemu łańcuchowi κ skoniugowane z HRP, przeciwciała skierowane przeciwko lekkiemu łańcuchowi λ oraz odczynniki do detekcji związanych mysich przeciwciał. Aby udowodnić specyficzność wiązania przeciwciał do fragmentu IL-17RC białka fuzyjnego IL-17RC supernatanty, które we wstępnych testach wykazały pozytywny sygnał, oceniano także pod kątem niespecyficznego wiązania do regionu Fc mysich przeciwciał (mg2a), sekwencji EE, HIS lub FLAG. Za specyficzne dla IL-17RC uznano przeciwciała pochodzące z supernatantów, które wiązały białko fuzyjne IL-17RC, ale nie wiązały mufc lub innych białek fuzyjnych. W drugim teście przeciwciała ze wszystkich supernatantów znad komórek hybrydomy oceniono metodą ELISA pod względem zdolności do hamowania wiązania biotynylowanej ludzkiej IL-17 lub IL-17F do płytki opłaszczonej białkami fuzyjnymi IL-17RC-muFc lub IL-17RC. [0319] Wszystkie supernatanty zawierające przeciwciała, które wiążą specyficznie IL-17RC, hamując wiązanie IL-17 lub IL-17F do IL-17RC w teście ELISA lub w innym teście, sprawdzano następnie pod kątem zdolności do hamowania wiązania IL-17 lub IL-17F do IL-17RC wyrażanego na powierzchni transfekowanych komórek Baf3, BHK lub na powierzchni normalnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli. Wszystkie supernatanty, które w testach hamowania wiązania były zdolne do neutralizacji IL-17 lub IL-17F lub IL-17 i IL-17F jednocześnie, oceniano następnie pod kątem znakowania komórek Baf3 lub BHK. Znakowanie transfekowanych komórek Baf3 lub BHK porównywano ze znakowaniem nie transfekowanych 71

73 1 komórek Baf3 lub BHK w analizie FACS. Analiza ta miała potwierdzić, że hamowanie wiązania IL-17 lub IL- 17F do IL-17RC było rzeczywiście zależne od przeciwciała specyficznego dla tego receptora. Ze względu na to, że analizę FACS przeprowadzono stosując drugorzędowe przeciwciała anty-igg, wydaje się, że neutralizujące przeciwciało jest najprawdopodobniej przeciwciałem klasy IgG. Opisanym sposobem zidentyfikowano wyjściowy dołek, z którego supernatant razem z drugorzędowym przeciwciałem anty-mysie IgG wiązał IL-17RC na płytce ELISA, hamował wiązanie IL-17 lub IL-17F do IL-17RC w teście hamowania typu ELISA, blokował wiązanie IL-17 i IL-17F do IL-17RC wyrażanego na powierzchni transfekowanych komórek Baf3 i BHK i dawał odpowiednio silny pozytywny sygnał znakowania IL-RC17 na powierzchni transfekowanych komórek Baf3 lub BHK. [0320] W trzecim teście sprawdzano, czy w odpowiedzi na traktowanie IL-17F pierwotne komórki nabłonka oskrzelowego wyrażające IL-17RC, mogą wydzielać IL-8 i IL-6. Testowano zatem zdolność specyficznego przeciwciała monoklonalnego do hamowania wiązania interleukiny IL-17 i IL-17F, a w konsekwencji do zahamowania wytwarzania IL-8 lub IL-6. Wytwarzanie IL-8 i IL-6 w odpowiedzi na IL-17 i IL-17F testowano jak opisano w niniejszym dokumencie. [0321] Alternatywą dla testów z użyciem przeciwciała monoklonalnego jest test neutralizacji wytwarzania lucyferazy zachodzącego pod wpływem działania IL-17 lub IL-17F w komórkach NIH 3T3 lub innych komórkach wyrażających IL-17RC. Test aktywności lucyferazy pod wpływem NFkB w komórkach NIH 3T3 opisano w niniejszym dokumencie C) Subklonowanie komórek hybrydoma wytwarzających przeciwciało anty-il-17rc [0322] Linia komórek hybrydomy wytwarzająca specyficzne przeciwciało anty-il-17rc, które krzyżowo neutralizuje wiązanie IL-17 i IL-17F do odpowiednio transfekowanych komórek Baf3 lub BHK, subklonowano standardową metodą granicznych rozcieńczeń (mniej niż 1 komórka na dołek). Około -7 dni po wysianiu do naczynia hodowlanego, klony przeszukiwano metodą ELISA, wykorzystując płytkę z dołkami opłaszczonymi ludzkim IL-17RC-muFc. Wyselekcjonowane klony, których supernatanty wiążą IL-17RC-muFc i nie wiążą kontrolnego niespecyficznego białka fuzyjnego zawierającego mufc, testowano następnie pod kątem aktywności przeciwciała powtarzając test neutralizacji oraz analizę FACS. Wszystkie wyselekcjonowane klony, pozytywne pod względem wiązania IL-17RC subklonowano co najmniej dwa razy aby mieć pewność co do ich klonalności. Powtórne subklonowanie i przeszukanie przeprowadzono jak już tu opisano. Korzystnie, co najmniej 9% otrzymanych klonów było pozytywnych pod względem wytwarzania neutralizującego przeciwciała anty-il-17rc D) Biochemiczna charakterystyka cząsteczki rozpoznawanej przez mabs anty-il-17rc [0323] Biochemiczne potwierdzenie tego, że cząsteczka docelowa IL-17RC rozpoznawana przez potencjalne przeciwciała anty-il-17rc jest rzeczywiście receptorem IL-17RC przeprowadzono standardowymi metodami immunoprecypitacji w analizie na żelu SDS-PAGE w połączeniu z metodą Western blotting. Obie metody wymagają preparacji błony komórkowej z nie transfekowanych komórek Baf3 i BHK oraz z komórek Baf3 i BHK transfekowanych IL-17RC. Ponadto preparacja rozpuszczalnej błony z linii komórek nie transfekowanych, które wyrażają IL-17RC pokazała, że przeciwciała rozpoznają nie tylko IL- 17RC wyrażany po transfekcji, ale również receptor natywny. Alternatywnie, wiązanie przeciwciał do rozpuszczalnego IL-17RC-muFc testowano w specyficznej immunoprecypitacji lub metodą Western blotting. 72

74 1 20 PRZYKŁAD 19 Neutralizacja hil-17rc przez surowice z myszy, które wcześniej poddano iniekcji transfekowanymi hil-17rc komórkami P81. [0324] Przeprowadzono komórkowy test neutralizacji, w którym surowicę z myszy wcześniej poddanych iniekcji żywymi komórkami P81 transfekowanymi IL-17RC naniesiono na płytkę w następującej serii rozcieńczeń: 1%, 0.%, 0.2%, 0.13%, 0.06%, 0.03%, 0.02% i 0%. Płytki testowe inkubowano w temperaturze 37 C i atmosferze % CO 2 przez 4 dni. W tym czasie do każdego dołka dodano 20 µl Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL). Płytki ponownie inkubowano w temperaturze 37 C, atmosferze % CO 2 przez 16 godz. Wyniki pokazały, że surowica pochodząca z czterech spośród zaszczepionych zwierząt potencjalnie mogłaby neutralizować przekazywanie sygnału będące konsekwencją wiązania huil-17 i huil- 17F do hil-17rc. [032] Powyższe rezultaty dostarczają dodatkowych dowodów na skuteczność hamowania działania IL- 17RC przez wiązanie, blokowanie, hamowanie, redukcję, reakcję z antagonistami i neutralizację aktywności interleukiny IL-17 lub IL-17F (jednej lub obu jednocześnie). Neutralizacja IL-17 i IL-17F, na przykład przeciwciałem monoklonalnym anty-il-17rc według niniejszego wynalazku, mogłaby korzystne zmniejszyć efekty wywołane przez IL-17 i IL-17F (osobno lub razem) in vivo i zredukować proces zapalny wywołany przez IL-17 i/lub IL-17F, jaki obserwuje się w przypadku łuszczycy, IBD, zapalenia okrężnicy, przewlekłej obturacyjnej choroby płuc, mukowiscydozy i w przypadku innych chorób zapalnych indukowanych przez IL- 17 i/lub IL-17F w tym w IBD, zapaleniu stawów, w astmie, łuszczycy, zapaleniu okrężnicy, stanów zapalnych skóry i atopowego zapalenia skóry PRZYKŁAD 20 Farmakokinetyka przeciwciała monoklonalnego anty IL-17RC [0326] Testowane przeciwciało monoklonalne anty hil-17rc dostarczono w postaci 3 porcji po 3 ml każda o stężeniu około 1 mg/ml (stężenie oznaczono na podstawie absorbancji przy 280 nm) i przechowywano do momentu użycia w temperaturze -80 C. Rozpuszczalnikiem preparatu jest 1 x PBS (0mM NaPO 4, 9 mm NaCl), ph 7,3. Przeciwciało przed użyciem rozmrożono w temperaturze pokojowej. Porcje I i II wykorzystano w dawce odpowiednio 0 µg dla grupy biorców I.V. i S.C. Połowę III porcji rozcieńczono w stosunku 1:2 za pomocą 1 x PBS, aby otrzymać porcję 0 µg podawaną grupie biorców 0 µg S.C., a drugą połowę III porcji rozcieńczono w stosunku 1:, aby otrzymać dawkę µg podawaną grupie biorców µg S.C.. Samice SCID (96 sztuk) otrzymano z Charles River Labs. Po otrzymaniu zwierząt i przed rozdzieleniem grup eksperymentalnych do klatek (3 sztuki na klatkę) sprawdzono ich stan zdrowotny. Myszy mają 12 tygodni i na początku badań ważą średnio około 22 g. A) Protokół dawkowania [0327] Samice SCID (24 osobniki/grupę otrzymujące określoną dawkę) zostały w sposób przypadkowy rozdzielone na cztery grupy otrzymujące określoną dawkę (Tabela 8). Grupa nr 1 otrzymała przeciwciało anty hil-17rc w dawce około 93 µl podane drogą iniekcji i.v do żyły ogonowej. Grupy nr 2, 3 i 4 otrzymały przeciwciało anty-hil-17rc w dawce około 93 µl drogą iniekcji s.c. w kark. B) Zbieranie próbek [0328] Przed zebraniem próbek krwi myszy poddano całkowitemu znieczuleniu za pomocą halotanu i izofluoranu. Dla każdego punktu czasowego z wyjątkiem 168 godziny (krew zbierana spoza splotu oczodołowego) próbki krwi pobrano z karku. Te same zwierzęta skrwawiono ponownie po 04 godzinach 73

75 drogą wkłucia dosercowego). Krew zbierano do probówek przeznaczonych do rozdziału od surowicy i pozwalano na utworzenie skrzepu przez 1 min. Następnie próbki wirowano przez 3 min. przy rpm. Po wirowaniu, porcje o objętości 12- µl rozdzielono do oznakowanych probówek Eppendorfa i natychmiast zamrożono w temperaturze -80 C, w której próbki przechowywano do chwili analizy. Tabela 8 Nr grupy Dawka (ROA) Zwierzęta Punkty czasowe PK 1 0 µg (IV) 3 myszy/punkt czasowy* 2 0 µg (SC) 3 myszy/punkt czasowy* 3 0 µg (SC) 3 myszy/punkt czasowy* 4 µg (SC) 3 myszy/punkt czasowy* 0,2, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 i 04 godz. 0,2, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 i 04 godz. 0,2, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 i 04 godz. 0,2, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 i 04 godz. * Próbki pobrane z tych samych zwierząt dla punktu czasowego 168 godzina i 04 godzina 1 20 C) Ilościowe oszacowanie stężenia przeciwciała anty-hil-17rc w surowicy metodą ELISA [0329] Do analizy próbek mysiej surowicy pobranej od osobników, którym podczas badań farmakokinetycznych podawano mab anty-il-17rc opracowano test immunoenzymatyczny. Założeniem tego testu jest wykorzystanie komercyjnie dostępnych drugorzędowych przeciwciał i kolorymetryczna detekcja przy użyciu TMB. Rozcieńczenia stosowane do sporządzenia krzywej standardowej zostały zmodyfikowane w celu poprawienia zdefiniowanej liniowej części krzywej standardowej. Krzywa standardowa w zakresie od 0 ng/ml do ng/ml (kolejne dwukrotne rozcieńczenia) umożliwia ilościowe oszacowanie próbek surowicy myszy. Badane próbki QC rozcieńczono w stosunku 1:0, 1:00 i 1:000 w % surowicy myszy z syndromem SCID i przeliczono na podstawie krzywej standardowej. D) Analizy farmakokinetyczne [0330] Dane dotyczące stężenia surowicy w funkcji czasu wprowadzono do programu WinNonlin 4.0 Professional (Pharsight, Inc Cary, NC) w celu przeprowadzenia analizy farmakokinetycznej. Analiza niekompartmentowa służy do określenia parametrów farmakokinetycznych na podstawie średniej z danych w każdym punkcie czasowym PRZYKŁAD 21 Neutralizacja aktywności IL-17A i IL-17F za pomocą przeciwciała monoklonalnego anty hil-17rc [0331] W komórkowym teście neutralizacji oczyszczone mysie przeciwciało monoklonalne anty-hil17rc dodawano w serii rozcieńczeń, na przykład w stężeniu μg/ml, μg/ml, 2,μg/ml, 1,2 μg/ml, 62 ng/ml, 313 ng/ml, 16 ng/ml i 78 ng/ml. Płytki testowe inkubowano w temperaturze 37 C i atmosferze % CO 2 przez 4 dni. W tym czasie do każdego dołka dodano 20 μl Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL). Płytki ponownie inkubowano w 37 C i w atmosferze % CO 2 przez 16 godz. Test pozwala zademonstrować, że oczyszczone przeciwciało monoklonalne anty-hil-17rc jest zdolne do neutralizacji przekazywania sygnału za pośrednictwem IL-17RC indukowanego zarówno przez hil-17 jak i przez hil-17f. Przeciwciała o wysokiej efektywności, stosowane w stężeniu około μg/ml, całkowicie neutralizują proliferację wywołaną przez hil- 17 lub hil-17f, przy czym hamowanie proliferacji przy niższych stężeniach interleukin malało w sposób zależny od dawki. Przeciwciało mogło służyć jako negatywna kontrola izotypowa pod warunkiem, że 74

76 testowane w stężeniach opisanych powyżej, nie dawało efektu hamowania proliferacji lub neutralizacji żadnej cytokiny. Uzyskane wyniki demonstrują, że przeciwciała monoklonalne anty-il-17rc są zdolne do hamowania działania prozapalne ligandów IL-17 i IL-17F przy niskich stężeniach PRZYKŁAD 22 IL-17A wywołuje podwyższone poziomy IFN-g i TNF-a w komórkach jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej [0332] Ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) oczyszczano przez wirowanie w gradiencie gęstości Ficolu, a następnie inkubowano przez noc w temperaturze 37 C w samym podłożu hodowlanym, w roztworze przeciwciała anty-hcd3 o stężeniu 0 ng/ml lub w mieszaninie przeciwciała anty-hcd3 i przeciwciała anty-hcd28. Dla każdych warunków założono równoległe hodowle, do których dodano hil-17a w stężeniu 2 ng/ml lub hil-17f w stężeniu 2 ng/ml. Po 24-godzinnej inkubacji supernatanty znad każdej kultury zbierano i analizowano pod kątem ilości cytokin za pomocą testu Cytometric Bead Array (CBA) (BD Bioscience) i w oparciu o ludzkie komórki Th1/Th2. Okazało się, że kultury, do których dodawano IL-17A oraz stymulowano przeciwciałem anty-cd3 lub mieszaniną przeciwciał anty-cd3 i anty-cd28, zawierały istotnie podwyższone stężenia IFN-γ i TNF-α (dla każdego zwiększone 3.-krotnie) w porównaniu do hodowli nie traktowanych cytokinami lub w porównaniu do hodowli traktowanych IL-17F. Hodowle, których nie stymulowano przeciwciałem anty-cd3, nie wykazały większych różnic w poziomach cytokin. Ponadto, dodanie IL-17A nie wywołało żadnych istotnych zmian pod względem ekspresji cytokin, co potwierdzono testem CBA dla cytokiny IL-2, IL-4, IL- i IL-. Uzyskane dane wskazują, że IL-17A, ale nie IL-17F, może zwiększyć wytwarzanie IFN-γ i TNF-α w hodowlach PBMC stymulowanych przeciwciałem anty-cd3 lub mieszaniną przeciwciał anty-cd3 i anty-cd PRZYKŁAD 23 IL-17RC-Fc obniża ilość zachorowań i progresję choroby w modelu mysiego kolagenowego zapalenia stawów (CIA) A) Model mysiego kolagenowego zapalenia stawów (CIA) [0333] Dziesięciotygodniowe samce myszy DBA/1J (Jackson Labs) podzielono na 3 grupy po 13 myszy przypadające na grupę 21 dnia zwierzętom śródskórnie i doogonowo podano 0-0 μl roztworu (1 mg/ml) pochodzącego z kurcząt kolagenu typu II. Kolagen sporządzono w mieszaninie z kompletnym adjuwantem Freunda (przygotowane przez Chondrex, Redmond, WA). Trzy tygodnie później, w dniu 0, myszom wstrzyknięto ten sam preparat, ale przygotowany z niekompletnym adjuwantem Freunda. 3 razy w tygodniu przez 4 tygodnie myszom podawano IL-17RC-Fc. Preparat podawano w różnych punktach czasowych od dnia 0 do dnia, w którym większość myszy wykazywała umiarkowane objawy choroby. Grupy otrzymywały dawkę mg lub 0 mg preparatu IL-17RC-Fc na biorcę, a grupy kontrolne otrzymywały rozpuszczalnik PBS (Life Technologies, Rockville, MD). Zwierzęta zaczynały manifestować objawy zapalenia stawów po drugim wstrzyknięciu kolagenu. W przypadku większości zwierząt zapalenie rozwijało się po upływie 1.-3 tygodni. Stopień zaawansowania choroby oceniano na podstawie pomiaru grubości każdej łapy suwmiarką ortopedyczną. Każdej łapie przyznawano punktację kliniczną od 0 do 3 punktów, przy czym (0) oznacza stan normalny, (0.) oznacza stan zapalny palucha, (1) oznacza łagodne zapalenie łapy, (2) oznacza umiarkowany stan zapalny łapy i (3) oznacza ciężkie zapalenie łapy jak opisano poniżej. 7

77 B) Monitorowania choroby [0334] Objawy zapalenia łapy mogą pojawiać się u zwierząt w krótkim czasie po drugim wstrzyknięciu kolagenu. U niektórych osobników objawy zapalenia palucha pojawiły się przed drugim wstrzyknięciem kolagenu, natomiast u większości zwierząt zapalenie stawów rozwinęło się w ciągu 1.-3 tygodni po wstrzyknięciu. U niektórych jednak choroba rozwijała się przez dłuższy okres czasu. W badaniach obejmujących grupę 40 zwierząt obserwowano, że częstość występowania choroby w tym modelu wynosiła zazwyczaj 9-0%, a na leczenie nie odpowiadało od 0 do 2 osobników (ustalono po 6 tygodniach obserwacji). Należy zauważyć, że na początku procesu zapalnego słabe zapalenie może objąć zarówno łapę jak i paluch. Dlatego przyjmuje się, że dane zwierzę rozwinęło chorobę, jeżeli obserwowany u niego obrzęk łapy jest trwały. [033] W celu ustalenia stopnia zaawansowania choroby, przeprowadzano codzienną obserwację wszystkich zwierząt, a każdą łapę oceniano jakościowo przypisując jej kliniczną punktację. Każde zwierzę codziennie oceniano pod względem zaawansowania choroby i przyznawano punktację kliniczną określającą stan wszystkich czterech łap osobno. Aby ustalić punktację kliniczną, łapy można traktować jako 3 strefy: palce, łapy (manus lub pes), nadgarstek lub staw skokowy. Notowano zatem zakres i stopień zaawansowania choroby każdej strefy osobno, w tym: obserwacje obrzęku każdego palca, zaczerwienienie lub podarte paznokcie palców, jakiekolwiek oznaki obrzęku lub zaczerwienienie w którejkolwiek łapie, symptomy dotyczące anatomicznego oddzielenia się ścięgien lub kości, ocenę obrzęku lub zaczerwienienia nadgarstka lub stawu skokowego i zasięg zapalenia w proksymalnych wyższych partiach nóg. Punktacja łapy wynosząca 1, 2 lub 3 jest w pierwszej kolejności oparta na ogólnym wrażeniu zaawansowania choroby, a po drugie na tym jak wiele stref jest włączonych do obserwacji. Rozpiętość punktacji klinicznej przedstawiono poniżej. C) Punktacja kliniczna [0336] 0 = Stan normalny 0, = Jeden lub więcej paluchów objętych zapaleniem. Stan zapalny dotyczy tylko paluchów. 1 = Łagodne zapalenie obejmujące łapę (1 strefa). Może także obejmować paluch lub paluchy. 2 = Zapalenie łapy o umiarkowanym nasileniu, które może obejmować niektóre paluchy i /lub nadgarstek i/lub staw skokowy (2 strefy). 3 = Silny stan zapalny łapy, nadgarstka/stawu skokowego obejmujący niektóre lub wszystkie paluchy (strefa 3). [0337] Rozwinięta choroba definiowana jest jako punktacja oceniająca zaawansowanie zapalenia łapy wynosząca 2 punkty i więcej oraz przyznawana przez dwa dni pod rząd. Data stwierdzenia obecność choroby uznawana jest za pierwszy dzień pełnoobjawowej choroby. [0338] Pobierane w czasie eksperymentu próbki krwi służyły do monitorowania w surowicy poziomów immunoglobulin, cytokin i przeciwciał anty-kolagen. Poziom przeciwciał anty-kolagen z surowicy koreluje ze stopniem nasilenia choroby. 21 dnia eksperymentu dokonano eutanazji zwierząt. Z pobranych próbek krwi pozyskano surowicę i CBD. Do analizy histologicznej od każdego zwierzęcia pobrano dwie zmienione chorobowo łapy. Jedną z nich utrwalano w % NBF, a drugą zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -800 C do analizy mrna. Do analizy RNA zachowano w odczynniku RNAlater takie organy jak połowa śledziony, połowa trzustki, połowa węzła chłonnego krezkowego, jeden płat wątroby, lewa nerka. Do analizy histologicznej w % NBF utrwalono połowę śledziony, połowę trzustki, połowę węzła chłonnego, pozostałą część wątroby i prawą nerkę. 76

78 Do testów wykrywających obecność immunoglobulin i cytokin zebrano surowicę, którą zamrożono w temperaturze -800 C. [0339] W grupie myszy otrzymujących IL-17RC-Fc we wszystkich punktach czasowych zapalenie łapy pojawia się z opóźnieniem, a samo zapalenie postępuje wolniej. Wyniki wskazują na to, że w modelu CIA IL- 17RC jest zdolny zredukować nasilenie procesu zapalnego, zmniejszyć częstotliwość występowania choroby i ograniczyć jej rozwój. Ponadto wniosek ten poparto obserwacjami, że podanie IL-17RC-Fc powodowało obniżenie poziomów TNF-α, IL-1b i przeciwciał anty-kolagen. 1 PRZYKŁAD 24 Stabilna nadekspresja IL-17RC w komórkach mysiej linii Nih3t3/kz142.8 wyrażającej czynnik transkrypcyjny ap1/nfkb. [0340] Komórki mysiej linii nih3t3/kz142.8 transfekowano IL-17RCx1 (SEKW. NR ID: 2) znajdującym się w wektorze ekspresyjnym z genem oporności na metotreksat (gen reduktazy dihydrofolianowej, DHFR). Transfekcję przeprowadzono przy użyciu powszechnie dostępnego gotowego zestawu odczynników zgodnie z protokołem producenta (Mirus, Madison, WI. Kat. nr MIR218) Komórki umieszczono w podłożu hodowlanym z dodatkiem metotreksatu o stężeniu 1 µm w celu wyselekcjonowania komórek zawierających transgen hil-17rcx1 Po selekcji otrzymano pulę komórek transfekowanych hil-17rcx1 o nazwie nih3t3/kz142.8/hcytor14x A) Test aktywności lucyferazy z wykorzystaniem komórek linii nih3t3/kz [0341] Ze względu na to, że po stabilnej transfekcji komórki linii nih3t3/kz142.8 posiadają już gen reporterowy, nie ma potrzeby podczas infekcji adenowirusowej wprowadzania do komórek drugiego genu reporterowego. Dlatego też protokół testu aktywności lucyferazy skrócono, a test przeprowadzono w następujący sposób: 1. Wysianie komórek do naczynia hodowlanego [0342] Komórki linii nih3t3/kz142.8 wysiano na nieprzezroczystą białą 96-dołkową płytkę w ilości 000 komórek/dołek (Kat. nr 3917 Costar) w podłożu hodowlanym DMEM/% FBS, zawierającym glutaminę i dodatek pirogronianu. Komórki hodowano przez noc w temperaturze 37 C i atmosferze % CO 2. Następnego dnia podłoże hodowlane usunięto i zmieniono na DMEM/1% FBS zawierający glutaminę i dodatek pirogronianu. Komórki hodowano przez noc w temperaturze 37 C i atmosferze % CO Test aktywności lucyferazy mierzący aktywację stabilnie ekpresjonowanego genu reporterowego kz142 indukowanego przez IL-17A i IL-17F [0343] Po całonocnej inkubacji w podłożu DMEM/1% FBS sporządzono rozcieńczenia ligandów hil-17a i hil-17f. Białka rozcieńczono w podłożu wolnym od surowicy z dodatkiem 0.28% BSA. Po dodaniu rozcieńczonych ligandów do komórek inkubację w temperaturze 37 C i atmosferze % CO 2 kontynuowano przez 4 godz., po czym podłoża usunięto, a komórki poddano 1-minutowej lizie. Intensywność średniej fluorescencji (MFI) mierzono w teście aktywności lucyferazy wykorzystując odczynniki przeznaczone do tego testu (Madison, WI.) oraz luminometr mikropłytkowy. Aktywność wykryto dla obu ligandów użytych w stężeniach zawartych w zakresie ng/ml. Aktywność komórek linii Nih3t3/kz142.8/hcytor14x1 pod wpływem mysiego ligandu IL-17A była podobna do aktywności komórek linii wyjściowej (Przykład 14). 77

79 1 Jednakże komórki linii cytor14x1 wykazały podwyższoną wrażliwości na działanie hil-17a i hil-17f nawet przy bardzo niskim stężeniu ligandu wynoszącym 20 fg. Obserwowane podobieństwa w aktywacji szlaku przekazywania sygnału przez mil-17a w komórkach transfekowanych i wyjściowych (Przykład 14) sugerują, że w przypadku komórek wyrażających hil-17rc nie występuje problem nieswoistego sygnału. mil-17a najprawdopodobniej uruchamia szlak przekazywania sygnału za pośrednictwem endogennie występujących w komórkach NIH3T3 receptorów IL-17R lub IL-17RC. Tak więc obserwacja, że hil-17a i hil-17f podnoszą MIF przy bardzo niewielkich niskich stężeniach, może wskazywać na specyficzną bardzo silną reakcję komórek na te ligandy, wywoływaną za pośrednictwem nadeksprymowanego ludzkiego receptora IL-17RC. [0344] Wynik ten ma istotne implikacje kliniczne i biologiczne oraz znaczenie praktyczne. Przykładowo, w warunkach fizjologicznych może dojść do lokalnego zwiększenia ekspresji receptora IL-17RC, co powoduje, że rejon ten jest bardzo wrażliwy na działanie IL-17A i IL-17F. Zwiększona ekspresja receptora spowoduje aktywację biologiczną przy znacznie niższych stężeniach ligandu niż stężenia niezbędne do wywołania takiej samej aktywacji przy normalnym poziomie ekspresji receptora IL-17RC. Może się zatem okazać, że do przeciwdziałania efektom wywołanym przez te ligandy wystarczy znacznie niższy poziom rozpuszczalnego receptora niż sądzono lub uważano wśród specjalistów w dziedzinie PRZYKŁAD 2 Antagoniści IL-17F i IL-17A - Ograniczenie częstości występowania oraz postępu choroby w modelu zapalenia jelit (IBD). [034] Model ten wykorzystano do zademonstrowania, że hodowane tkanki jelita pacjentów z IBD wytwarzają więcej mediatorów prozapalnych w porównaniu do tkanek zdrowych. Zwiększona produkcja mediatorów prozapalnych (obejmujących lecz nie ograniczających się do IL-1β, IL-4, IL-, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-1, IL-17 i F, IL-18, IL-23, TNF-α, IFN-γ, mediatorów z rodziny MCI, MCP-1, G- i GM-CSF, itp.) przyczynia się do powstania objawów i stanów patologicznych związanych z IBD takich jak choroba Leśniowskiego-Crohna (ChL-C), wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC). Mediatory prozapalne powodują także aktywację szlaków przekazywania sygnału i w konsekwencji aktywację komórek efektorowych. Aktywacja szlaków przekazywania sygnału związanych z zapaleniem oraz obecność mediatorów prozapalnych, jak obserwowano in vivo, może doprowadzić do uszkodzenia komórek i tkanek. Obserwacje takie poczyniono wykorzystując hodowle tkanek zdrowego jelita lub komórki linii nabłonka jelita ludzkiego (IEC). Opisywany model może zatem służyć do symulacji niszczącego działania zapalenia w kontekście IBD. [0346] Terapeutyki działające w modelu IBD in vivo działają w powyższym modelu ex vivo lub w modelu IEC hamując lub neutralizując wytwarzanie i/lub obecność mediatorów prozapalnych. [0347] Dla potrzeb tego modelu tkanki ludzkiego jelita pobrano od pacjentów cierpiących na IBD, od pacjentów post-mortem lub od pacjentów zdrowych poddanych biopsji jelita lub ponownemu zabiegowi chirurgicznemu. Pobrane próbki tkanek poddano obróbce według zmodyfikowanego protokołu wg Alexakis i wsp. (Gut 3:8-90; 2004). W warunkach aseptycznych, próbki delikatnie lecz obficie płukano buforem PBS, a następnie oczyszczano przez hodowlę fragmentów homogenizowanej tkanki w obecności pełnego podłoża hodowlanego z dodatkiem antybiotyków, aby zapobiec zakażeniu bakteryjnemu. Próbki z tej samej puli homogenizowanej tkanki traktowano nośnikiem PBS lub rekombinowanym ludzkim białkiem rhil-17a lub rhil-17f lub rhil-17a i rhil-17 jednocześnie. Ponadto, próbki hodowano w obecności lub przy braku antagonisty IL-17A lub antagonisty IL-17F lub w obecności obu tych antagonistów (np. rozpuszczalnego IL- 78

80 17RC). Ten protokół postępowania stosowano także w eksperymentach z użyciem komórek ludzkiej linii IEC, przy czym komórki te pasażowano z istniejących przechowywanych zapasów. Po zakończeniu hodowli prowadzonej prze okres od 1 godziny do kilku dni supernatanty znad hodowli zbierano i analizowano pod kątem obecności mediatorów prozapalnych, w tym mediatorów wymienionych powyżej. W próbkach pochodzących od pacjentów z IBD lub w próbkach poddanych działaniu rhil-17a i/lub rhil-17f obserwowany poziom cytokin i chemokin był wyższy w porównaniu do próbek nie traktowanej zdrowej tkanki kontrolnej. Dodanie antagonistów aktywności IL-17F i/lub IL-17A, takich jak rozpuszczalne receptory IL- 17RC oraz skierowanych przeciwko nim przeciwciał, w tym monoklonalnych przeciwciał anty-ludzki receptor IL-17RC i przeciwciał neutralizujących według niniejszego wynalazku znacząco obniżyło wytwarzanie prozapalnych mediatorów. Można się zatem spodziewać, że wymienione czynniki będą również skutecznymi terapeutykami w leczeniu IBD u ludzi PRZYKŁAD 26 Antagoniści IL-17F i IL-17A - Ograniczenie częstości występowania oraz postępu choroby w modelu stwardnienia rozsianego (SM) [0348] Stwardnienie rozsiane (SM) to zespół chorobowy, który, jak się uważa, jest wywołany działaniem szeregu czynników, w tym obecnością zapalnych nacieków komórek limfocytarnych i jednojądrzastych oraz demielinizacji w całym CUN. Komórki mikrogleju są komórkami makrofagopodobnymi. Zasiedlają centralny układ nerwowy (CUN) i ulegają aktywacji w wyniku urazu lub infekcji. Komórki mikrogleju odgrywają niezwykle istotną rolę w wielu schorzeniach CUN, w tym w SM, a także w badaniach nad mechanizmem/mechanizmami powstawania, progresji i leczenia tych schorzeń (Nagai i wsp. Neurobiol Dis 8:7-68, 2001, Olson i wsp. J Neurosci Methods 128:33-43; 2003). Linie unieśmiertelnionych ludzkich komórek mikrogleju i/lub ustalonych linii ludzkich komórek astrogleju można zatem wykorzystać do badań wpływu mediatorów prozapalnych na tego rodzaju komórki i możliwości ich neutralizacji. Zwiększona produkcja mediatorów prozapalnych (obejmujące lecz nie ograniczone do IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL- 1, IL-17A i F, IL-18, IL-23, TNF-a, IFN-g, mediatory z rodziny MIP, RANTES, IP-, MCP-1, G-i GM-CSF, itp.) może przyczyniać się do powstania objawów i stanów patologicznych związanych z SM wskutek wywołanej przez nie aktywacji szlaków przekazywania sygnału i w konsekwencji aktywację komórek efektorowych. [0349] Aby ocenić działanie prozapalnych IL-17A i IL-17F oraz działanie neutralizujących ich antagonistów takich jak rozpuszczalne receptory IL-17RC i skierowanych przeciwko nim przeciwciał, w tym monoklonalnych przeciwciał neutralizujących anty-hil-17rg według niniejszego wynalazku, hodowane komórki glejowe traktowano jednym z następujących czynników: nośnikiem, rhil-17a; rhil-17f; rhil-17a i IL-17F jednocześnie. Ponadto, komórki hodowano w obecności lub przy braku antagonisty IL-17A lub antagonisty IL-17F lub antagonistów IL-17A i IL-17F (np. rozpuszczalnego IL-17RC). Po zakończeniu hodowli prowadzonej prze okres od 1 godziny do kilku dni supernatanty znad hodowli zbierano i analizowano pod kątem obecności i/lub ekspresji mediatorów prozapalnych, w tym mediatorów wymienionych powyżej. Poziomy cytokin i chemokin w komórkach hodowanych w obecności rhil-17a i/lub IL-17F były wyższe niż w komórkach hodowanych w obecności nośnika. Dodanie antagonistów aktywności IL-17F i/lub IL-17A, takich jak rozpuszczalne receptory IL-17RC oraz skierowane przeciwko nim przeciwciała, w tym monoklonalne przeciwciała anty-ludzki receptor IL-17RC oraz dodanie przeciwciał neutralizujących według niniejszego 79

81 wynalazku znacząco obniżyło wytwarzanie prozapalnych mediatorów. Można się zatem spodziewać, że wymienione czynniki będą również skutecznymi terapeutykami w leczeniu SM u ludzi PRZYKŁAD 27 Antagoniści IL-17F i IL-17A - Ograniczenie częstości występowania oraz postępu choroby w modelu reumatoidalnego zapalenia stawów (RZS) oraz zapalenia kości i stawów (OA) [030] Model ten wykorzystano do zademonstrowania, że hodowane komórki błony maziowej (w tym maziowe makrofagi, fibroblasty błony maziowej i chondrocyty stawowe) i eksplanty pochodzące od pacjentów cierpiących na RZS i OA wytwarzają więcej mediatorów prozapalnych w porównaniu do komórek i eksplantów pochodzących od pacjentów zdrowych. Zwiększona produkcja mediatorów zapalnych (obejmujących lecz nie ograniczających się do onkostatyny M, IL-17β, IL-6, IL-8, IL-12, IL-1, IL-17 A i F, IL- 18, IL-23, TNF-α, IFN-γ, IP-, RANTS, RANKL, przedstawicieli rodziny MCI, MCP-1, G-i GM-CSF, tlenku azotu, itp.) przyczynia się do powstania objawów i stanów patologicznych związanych z RZS i OA wskutek wywołanej przez nie aktywacji szlaków przekazywania sygnału i w konsekwencji aktywację komórek efektorowych. Wspomniane szlaki przekazywania sygnału i mediatory prozapalne prowadzą do powstania nacieków zapalnych, zniszczenia chrząstki, macierzy zewnątrzkomórkowej i kości, a także do zwiększenia produkcji prostaglandyn i cyklooksygenaz. Dlatego też opisywany model może służyć do symulacji niszczącego działania zapalenia w kontekście RZS i OA in vitro i ex vivo. Ponadto, hodując eksplanty i komórki błony maziowej w obecności kilku z wymienionych mediatorów prozapalnych (np. onkostatyny M, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17A i F, IL-1, itp.) można obserwować aktywację szlaku przekazywania sygnału związanego z zapaleniem. Terapeutyki, które dają pozytywne efekty w powyższych modelach in vitro i ex vivo hamując i/lub neutralizując wytwarzanie i/lub obecność mediatorów prozapalnych, będą także skuteczne w leczeniu RZS i OA u ludzi. [031] Dla potrzeb tego modelu ludzkie eksplanty błony maziowej pobierano od pacjentów cierpiących na RZS lub OA lub od pacjentów post-mortem lub od pacjentów zdrowych w trakcie zabiegu wymiany stawu. Pobrane próbki tkanek poddano obróbce według zmodyfikowanego protokołu wg Wooley i Tetlow (Arthritis Res 2: 6-70, 2000) oraz van 't Hof i wsp. (Reumatologii 39:04-08, 2000). W badania włączono komórki z hodowli maziowych fibroblastów, makrofagów pochodzących z mazi stawowej i chondrocytów. Próbki w kilku powtórzeniach traktowano jedną z następujących substancji: nośnikiem (PBS), rhil-17a, rhil-17f lub rhil-17a i rhil-17f jednocześnie. Niektóre próbki zawierały różne kombinacje takich czynników jak onkostatyna M, TNF-α, IL-1b, IL-6, IL-17A, IL-17F, IL-1. Ponadto, próbki hodowano w obecności lub przy braku antagonisty IL-17F i/lub IL-17A, takiego jak rozpuszczalne receptory IL-17RC, przeciwciała skierowane przeciwko tym receptorom, w tym monoklonalne przeciwciała neutralizujące według niniejszego wynalazku. Po zakończeniu hodowli prowadzonej prze okres od 1 godziny do kilku dni supernatanty znad hodowli zbierano i analizowano pod kątem obecności mediatorów zapalnych, w tym mediatorów wymienionych powyżej. W próbkach od pacjentów cierpiących na RZS albo OA lub w próbkach poddanych działaniu rhil-17a i/lub rhil-17f (w monoterapii lub w skojarzeniu z innymi cytokinami zapalnymi) obserwowano podwyższony poziom cytokin i chemokin w porównaniu do próbek nietraktowanych zdrowych eksplantów kontrolnych lub w nie traktowanych hodowlach komórkowych. Dodanie antagonistów aktywności IL-17F i/lub IL-17A, takich jak rozpuszczalne receptory IL-17RC oraz skierowanych przeciwko nim przeciwciał, w tym monoklonalnych przeciwciał anty-ludzki receptor IL-17RC i przeciwciał neutralizujących 80

82 według niniejszego wynalazku znacząco obniżyło wytwarzanie prozapalnych mediatorów. Można się zatem spodziewać, że wymienione czynniki będą również skutecznymi terapeutykami w leczeniu RZS i OA u ludzi. PRZYKŁAD 28 Funkcjonalne odpowiedzi na działanie IL-17A i IL-17F. [032] Komórki NIH-3T3/KZ142 stabilnie transfekowano hil-17rcx1 (SEKW. NR ID: 1) i mil-17rcx1 (SEKW. NR ID: 2). Jak opisano powyżej, każda linia była przez 7 i 1 min. traktowana zależnymi od odpowiedzi dawkami IL-17A, IL-17F, mil-17f i odpowiednimi czynnikami kontrolnymi. W komórkach transfekowanych IL-17RCx1 (SEKW. NR ID: 1) zarówno IL-17A jak i IL-17F wywołały zależną od dawki odpowiedź, w wyniku której zaszła fosforylacja czynników transkrypcyjnych IκB-α i p38 MAPK o około 30% większa niż fosforylacja zwykle zachodząca w komórkach linii kontrolnej. W komórkach transfekowanych mil-17rcx1 (SEKW. NR ID: 2) IL-17A i IL-17F nie wywołały podobnego efektu. mil-17f nie wywołała wzrostu sygnału ani dla ludzkiego ani dla mysiego IL-17RCx PRZYKŁAD 29 Ekspresja IL-17A, IL-17F, IL-17RA i IL-7RC w mysich modelach choroby [033] Wykorzystując znane sposoby ekspresji IL-17A, IL-17F, IL-17R i IL-17RC przeprowadzono analizę czterech mysich modeli choroby (astma, zapalenie okrężnicy, DSS, atopowe zapalenie skóry i eksperymentalne alergiczne zapalenie mózgu). [034] W modelu astmy ekspresja IL-17A i IL-17F występuje na bardzo niskim, a nawet niewykrywalnym poziomie, w płucach, śledzionie, płucnych węzłach chłonnych i komórkach naciekających płuca u myszy chorych i zdrowych. Wykazano, że IL-17RC jest wprawdzie silniej wyrażany w płucach, a słabiej w śledzionie i węzłach chłonnych, lecz poziom jego ekspresji nie zmienia się wraz z postępem choroby. [03] W przeciwieństwie do obserwacji poczynionych przy badaniach z wykorzystaniem modelu astmy, poziom ekspresji IL-17A i IL-17F znacznie wzrósł u myszy chorych na zapalenie okrężnicy DSS (w odcinku proksymalnym i dystalnym okrężnicy), nie zmienił się natomiast u myszy zdrowych. Poziom obu cytokin w kontekście nabytego ostrego zapalenia okrężnicy DSS jak i przewlekłej postaci tej choroby jest podniesiony, natomiast nie wykazano zwiększonego poziomu cytokin w węzłach chłonnych krezkowych. W porównaniu do ekspresji w proksymalnym i dystalnym odcinku jelita grubego IL-17R jest wyrażany w węzłach chłonnych krezkowych jelita grubego na znaczącym poziomie, lecz poziom tej cytokiny nie zmienia się wraz z postępem choroby. W przeciwieństwie do powyższych obserwacji, w porównaniu do węzłów chłonnych krezkowych jelita grubego, IL-17RC jest silnie wyrażany w proksymalnym i dystalnym odcinku jelita grubego. Ekspresja IL-17RC nie zmienia się wraz z postępem choroby. [036] W atopowym zapaleniu skóry, poziom mrna dla IL-17A był niewykrywalny. Wykazano, że IL-17F jest wyrażana zarówno w komórkach skóry jak i w węzłach chłonnych drenujących limfę z miejsca uszkodzenia skóry, lecz jej poziom nie zmienia się wraz z postępem choroby. mrna dla IL-17R jest silniej wyrażany w węzłach chłonnych drenujących limfę z miejsca uszkodzenia skóry niż w skórze i nie zmienia się wraz z postępem choroby. W porównaniu do węzłów chłonnych drenujących limfę z miejsca uszkodzenia skóry IL- 17RC był silnej wyrażany w skórze, lecz poziom jego ekspresji nie zmieniał się wraz z postępem choroby. [037] W modelu doświadczalnym alergicznego zapalenia mózgu i rdzenia, poziom ekspresji zarówno IL- 17A jak i IL-17F w rdzeniu kręgowym objętym zapaleniem był podwyższony w porównaniu do myszy zdrowych. IL-17F może być silniej wyrażana w węzłach chłonnych w porównaniu do rdzenia kręgowego, ale 81

83 jej ekspresja w węzłach chłonnych nie zmienia się wraz z postępem choroby. Ogólnie poziom ekspresji IL- 17F w wymienionych tkankach był dość niski. IL-17R był silnej wyrażany w węzłach chłonnych niż w mózgu i rdzeniu kręgowym. Ekspresji IL-17RC nie testowano. [038] Krótko podsumowując, wydaje się, że ekspresja IL-17A i IL-17F ulega zmianie wraz z postępem choroby w kontekście nabytego zapalenia okrężnicy DSS oraz eksperymentalnego modelu alergicznego zapalenia mózgu, ale nie zmienia się w przypadku astmy lub atopowego zapalenia skóry. Wydaje się, że ekspresja IL-17R i IL-17RC nie zmienia się wraz z postępem choroby, ale ekspresja IL-17R jest wyższa w tkankach limfatycznych, podczas gdy ekspresja IL-17RC jest wyższa w tkankach nielimfoidalnych. 1 PRZYKŁAD 30 IL-17RC jest mediatorem aktywacji zarówno IL-17A jak i IL-17F [039] Komórki mysiej linii nih3t3/kz142.8 transfekowano IL-17RCX (SEKW. NR ID: 2) znajdującym się w wektorze ekspresyjnym z genem oporności na metotreksat (reduktaza dihydrofolianowa, DHFR). Analogicznie linie tę transfekowano hil-17ra (SEKW. NR ID: 21). Transfekcję przeprowadzono przy użyciu powszechnie dostępnego zestawu i zgodnie z protokołem producenta (Mirus, Madison, WI, Kat. Nr MIR218). W celu wyselekcjonowania komórek z wektorem ekspresyjnym zawierającym konstrukty hodowlę prowadzono w podłożu hodowlanym z dodatkiem metotreksatu o stężeniu 1 µm. Po selekcji otrzymano populację komórek o nazwie nih3t3/kz142.8/hcytor14xl i nih3t3/kz142.8/il-17r A) Test aktywności lucyferazy w oparciu o linie komórkowe wyprowadzone z linii nih3t3/kz142.8 [0360] Ze względu na to, że po stabilnej transfekcji komórki linii wyprowadzonych z linii nih3t3/kz142.8 posiadają już gen reporterowy apl/nfkb (kz142), nie ma potrzeby podczas infekcji adenowirusowej wprowadzania do komórek drugiego genu reporterowego. Dlatego też protokół testu aktywności lucyferazy skrócono, a test przeprowadzono w następujący sposób: 1. Wysianie komórek do naczynia hodowlanego [0361] Komórki linii nih3t3/kz142.8 wysiano na nieprzezroczystą białą 96-dołkową płytkę w ilości 000 komórek/dołek (Kat. nr 3917 Costar) w podłożu hodowlanym DMEM/% FBS, zawierającym glutaminę i dodatek pirogronianu. Komórki hodowano przez noc w temperaturze 37 C i atmosferze % CO 2. Na drugi dzień podłoże hodowlane usunięto i zmieniono na DMEM/1% FBS zawierający glutaminę i dodatek pirogronianu. Komórki hodowano przez noc w temperaturze 37 C i atmosferze % CO Test aktywności lucyferazy mierzący aktywację stabilnie ekpresjonowanego genu reporterowego kz142 indukowanego przez IL-17A i IL-17F [0362] Po całonocnej inkubacji w podłożu DMEM/1% FBS sporządzono rozcieńczenia ludzkich ligandów IL- 17A i IL-17F. Białka rozcieńczono w podłożu wolnym od surowicy z dodatkiem 0.28% BSA. Po dodaniu ligandów inkubację w temperaturze 37 C i atmosferze % CO 2 kontynuowano przez 4 godz., po czym podłoża usunięto, a komórki poddano 1-minutowej lizie. Intensywność średniej fluorescencji (MFI) zmierzono w teście aktywności lucyferazy wykorzystując odczynniki przeznaczone do tego testu (Madison, WI.) oraz luminometr mikropłytkowy. Aktywność wykryto dla obu ligandów użytych w stężeniach zawartych w zakresie 0,1-00 ng/ml. 82

84 1 20 [0363] EC0 omówione poniżej jest średnią obliczoną na podstawie wyników z co najmniej 4 eksperymentów. Przy EC0 wynoszącym około 4 ng/ml aktywność dla mysiego ligandu IL-17A była podobna dla komórek linii Nih3t3/kz142.8/hcytor14x1 i komórek linii wyjściowej. (Przykład 14). Obserwacja, że sygnał indukowany dla mil-17a w komórkach linii hcytor14x1 jest porównywalny z sygnałem w komórkach linii wyjściowej (Przykład 14) sugeruje, że najprawdopodobniej w komórkach NIH3T3 mil-17a przekazuje sygnał za pośrednictwem endogennych receptorów IL-17RA lub IL- 17RC i nie aktywuje komórek poprzez hcytor14x1. Jednak komórki transfekowane hil-17rcx1 wykazały większą wrażliwość na ludzką IL-17A (EC0 średnia z 4 doświadczeń 41 ng/ml) niż komórki linii wyjściowej (EC0 średnia z 4 doświadczeń 2.8 ng/ml) (EC0 dla komórek linii rekombinowanej 6.8 razy większe). Ponadto linia rekombinowana hil- 17RCX1 wykazywała większą wrażliwość na hil-17f (EC0 0,61ng/ml) niż komórki linii wyjściowej (EC0 ng/ml) (EC0 dla komórek linii rekombinowanej 17 razy większe). Obserwacja zwiększonej siły oddziaływania hil-17a i F na komórki transfekowane hil-17rcx1 jest zgodna z faktem, że ludzki receptor IL-17RCX1 charakteryzuje się wysokim powinowactwem dla tych cytokin. Dla kontrastu komórki z ekspresją hil-17ra wykazywały zwiększoną wrażliwość tylko na działanie hil-17a (EC0 0,6 ng/ml w porównaniu do EC0 2,8 ng/ml dla komórek linii wyjściowej). Nie obserwowano zwiększonej wrażliwości na oddziaływanie hil-17f w przypadku komórek z ekspresją IL-17RA (EC0 12,4 ng/ml) w porównaniu do komórek linii wyjściowej (EC0 8,9 ng/ml). [0364] Wynik ten jest istotny, ponieważ dotyczy hil-17rcx1 w roli mediatora aktywacji zarówno hil-17a jak i hil-17f oraz wskazuje na to, że hil-17ra pośredniczy w przekazywaniu sygnału powstałego w wyniku aktywacji przez hil-17a, ale nie w wyniku aktywacji przez hil-17f PRZYKŁAD 31 Dożylne podanie IL-17A i IL-17F [036] Aby określić wpływ podania i.v. mysich lub ludzkich IL-17A iil-17f na morfologię krwi (CBC), cytokiny i chemokiny w surowicy myszy BALB/c w różnych punktach czasowych. [0366] Efektem dożylnego podania mil-17a w ilości 1 µg było około 2-krotne zwiększenie liczby krążących we krwi neutrofilów (stwierdzone w CBC) i około -krotne zwiększenie w surowicy KC i MCP-1 (stwierdzone za pomocą Luminexu) obserwowane 1-2 godz. po podaniu. Podobny efekt jeżeli chodzi o chemokiny wywołało podanie µg hil-17a. Po 2 godz. poziomy monocytów we krwi były istotnie wyższy u myszy, którym podano 1 µg mil-17a (grupa ta wykazała największy wzrost), µg hil-17a i µg hil-17f. Efektem dożylnego podaniu mysiej i ludzkiej IL-17F był odnotowany po 1 i 2 godz. w surowicy znaczący wzrost IL-1 (stwierdzone za pomocą Luminexu) i niewielki wzrost KC i MCP PRZYKŁAD 32 Neutralizacja podanych dożylnie IL-17A i IL-17F [0367] W celu neutralizacji za pomocą rozpuszczalnych receptorów (mil-17ra:fc dla ligandów mysich; rozpuszczalnymi hil-17rc dla ligandów ludzkich) nadmiaru cytokin i chemokin powstałych po dożylnym podaniu IL-17A i IL-17F trzy godz. przed iniekcją do żyły ogonowej samicom BALB/c w iniekcji dootrzewnowej poddawano PBS lub 0 µg mil-17ra:fc lub 0 µg rozpuszczalnego hil-17rc. W iniekcji do żyły ogonowej myszom podawano PBS, 2 µg mil-17a albo 2 µg mil-17f lub 2 µg mil-17a i mil-17f (w przypadku myszy, które otrzymały mil-17ra:fc) albo 2 µg hil-17a lub 2 µg hil-17f albo 2 µg hil-17a i hil- 83

85 17F (w przypadku myszy, które otrzymały rozpuszczalny ludzki IL-17RC). Surowicę pobierano 1 godz. po podaniu ligandu i analizowano pod względem obecności kilku cytokin i chemokin. [0368] W surowicy myszy wstępnie traktowanych podanymi dootrzewnowo rozpuszczalnymi białkami receptora w porównaniu do myszy traktowanych PBS z IL-17A stwierdzono znacząco mniejsze stężenie indukowanych przez IL-17A KC i interleukiny IL-17A PRZYKŁAD 33 Płytkowy test wiązania rozpuszczalnego białka IL-17RC oraz polipeptydów IL-17RC/IL-17RA [0369] Immunadsorpcyjny EIA przeprowadzono w następujący sposób: płytkę do testu ELISA opłaszczono kozim przeciwciałem anty ludzkie IgG w stężeniu 1 mg/ml i inkubowano przez noc w temperaturze 4 C. Następnie płytkę przemyto i blokowano za pomocą 1% BSA w ilości 200 µl/dołek przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Płytkę przemyto i dodano rozpuszczalne warianty receptorów (A186F, A187F) lub IL17RCx1 (A34F) w serii rozcieńczeń (od 0 mg/ml do 0, mg/ml). Inkubację prowadzono przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Płytkę ponownie przemyto, dodano ligandu znakowanego biotyną w stosunku :01 (IL17A) lub 6:1 (IL17F) i inkubowano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Płytkę ponownie przemyto, dodano koniugat streptawidyny z HRP w stężeniu 0. µg/ml i inkubowano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Płytkę przemyto, dodano substratu TMB i inkubowano przez 4 min. Reakcję zatrzymano dodając odczynnik Stop Solution. (uwaga: wszystkie objętości odczynników wynosiły 0 μl/dołek o ile nie zaznaczono inaczej). Za pozytywny wynik uważa się wysokie OD, na ogół powyżej 0,. Na podstawie otrzymanych wyników testu stwierdzono, że białko wyrażane w oparciu o konstrukt 1342 (SEKW. NR ID: 74) nie wiąże IL-17A oraz słabo wiąże IL-17F. Białko wyrażane w oparciu o konstrukt 1341 (SEKW. NR ID: 72) bardzo silnie wiąże zarówno IL-17A jak i IL-17F. IL-17RCx1 wiąże IL-17A i IL-17F. [0370] Test neutralizacji EIA przeprowadzono w sposób następujący: płytkę do testu ELISA opłaszczono rozpuszczalnym receptorem (A34F) w stężeniu 1 µg/ml i inkubowano przez noc w temperaturze 4 C. Następnie płytkę przemyto i blokowano za pomocą 200 μl 1% BSA na dołek przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Podczas blokowania, na osobnej płytce inkubowano warianty rozpuszczalnego receptora (A186F, A187F) w serii rozcieńczeń (od 0 mg/ml do 0,0 mg/ml) z ligandem znakowanym biotyną w stosunku :01 (IL17A) lub 6:1 (IL17F) w równych objętościach przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Po blokowaniu płytkę przemyto, dodano kompleksów receptor-ligand i inkubowano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Płytkę ponownie przemyto, dodano koniugat streptawidyny z HRP w stężeniu 0, µg/ml i inkubowano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Płytkę przemyto, dodano substratu TMB i inkubowano przez 7 min. Reakcję zatrzymano dodając odczynnik Stop Solution. (uwaga: objętości wszystkich odczynników wynosiły 0 μl na dołek o ile nie zaznaczono inaczej). Za pozytywny wynik uważa się wysokie OD, na ogół powyżej 0,. Na podstawie otrzymanych wyników testu stwierdzono, że białko wyrażane w oparciu o konstrukt 1342 (SEKW. NR ID: 74) słabo neutralizuje wiązanie IL-17A do IL-17RCx1 natomiast silnie neutralizuje wiązanie IL-17F do IL-17RCx1. Na podstawie otrzymanych wyników testu stwierdzono, że białko wyrażane w oparciu o konstrukt 1341 (SEKW. NR ID: 72) słabo neutralizuje wiązanie do IL-17RCx1 zarówno IL-17A jak i IL-17F. Obserwowany efekt neutralizacji wskazuje na to, że wariant białkowy wiąże biotynylowany ligand. 84

86 PRZYKŁAD 34 Protokół testu wiązania w analizie FACS [0371] Aby ocenić zdolność rozpuszczalnych polipeptydów IL-17RC i IL-17RC/IL-17RA według niniejszego wynalazku do wiązania ligandów IL-17A i IL-17F zastosowano test kompetycyjnego wiązania w oparciu o cytometrię przepływową. Inkubacja komórek linii BHK stabilnie transfekowanych pełnej długości IL17RCx4 w obecności ligandów IL17A lub IL17F i rozpuszczalnego receptora pozwala na wykrywanie oraz względną ocenę ilościową ligandu związanego z powierzchnią komórek (a więc nie związanego przez rozpuszczalny receptor). Biotynylacja ligandu umożliwia detekcję w FACS z wykorzystaniem drugorzędowego koniugatu streptawidyny sprzężonej z fluoroforem. Zmniejszenie ilości ligandu związanego z komórkami w wyniku miareczkowania rozpuszczalnym receptorem jest rejestrowana jako obniżenie średniej fluorescencji komórek. Biotynylowane ligandy pojedynczo mieszano w stężeniu 1µg/ml z używanymi do miareczkowania ilościami rozpuszczalnego receptora w buforze do znakowania (HBSS, 1% BSA, 0,1% azydek sodu, mm HEPES) w objętości koncowej 0 µl i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 min. Komórki linii BHK stabilnie transfekowane IL17RCx4 o pełnej długość przygotowano do znakowania ligandem zawieszając je w wersenianie sodowo-wapniowym (Invitrogen Nr kat ) w gęstości 2 x komórek/0 µl. Następnie komórki zwirowano, a osad zawieszono we wcześniej przygotowanym roztworze ligand/rozpuszczalny receptor. Znakowane komórki inkubowano w temperaturze 4 C przez 30 min., przemyto 1 x buforem do znakowania i znakowano streptawidyną-pe (BD Pharmingen,Nr kat. 4061) w rozcieńczeniu 1:0. Komórki inkubowano w temperaturze 4 C w ciemności przez 30 min., dwukrotnie przemyto buforem do znakowania i ponownie zawieszono w buforze do znakowania z Cytofix (BD Bioscience 46) w stosunku 1:1. Cytometr przepływowy BD LSRII lub podobny instrument posłużył do zbierania i analizy danych. Figura przedstawia standardowy wykres analizy w FACS. Wykres otrzymano za pomocą programu Prizm. Wartości Y oznaczają MIF normalizowane do wartości maksymalnej i minimalnej (0% i 0%) na podstawie wartości procentowej wiązania ligandu do komórek w dołkach kontrolnych, do których dodawano wyłącznie ligandu lub nie dodawano ani ligandu ani rozpuszczalnego receptora. Wartość IC0 dla każdej krzywej obliczana jest przez oprogramowanie PRZYKŁAD 3 Hamowanie specyficznego wiązania biotynylowanej ludzkiej IL-17A i IL-17F do rozpuszczalnego polipeptydu IL-17RC/IL-17RA [0372] Poniżej opisano test wiązania do wyznaczenia zdolności wiązania interleukin IL-17A i IL17F przez rozpuszczalne polipeptydy IL-17RC i IL-17RC/IL-17RA. Badania wiązania przeprowadzono jak opisano powyżej, z tą różnicą, że dodatkowe rozpuszczalne polipeptydy, takie jak SEKW. NR ID: 17 i 18 włączono do reakcji wiązania. Ten rozpuszczalny polipeptyd hamował wiązanie obu interleukin hil-17a i hil-17f do IL-17RC na powierzchni transfekowanych komórek BHK w takim samym stopniu jak rozpuszczalne białko fuzyjne hil-17rcx1 Fc (SEKW. NR ID: 64). Pozostałe rozpuszczalne polipeptydy, w tym rozpuszczalny polipeptyd o SEKW. NR ID: 17 i 18, zamieszczono w Tabeli 9 poniżej. 8

87 Table 9* Rozpuszczalny polipeptyd Wariant IC0 - IL17A Rozpuszczalny polipeptyd Wariant IC0 - IL17F IL17RA/RC IL17RC IL17RA/RC IL17RA/RC IL17RA/RC IL17RA/RC IL17RA/RC IL17RA/RC IL17RA/RC IL17RA/RC IL17RC IL17RA/RC IL17RA/RC IL17RC IL17RC 12 3 IL17RC IL17RC IL17RC IL17RC IL17RA/RC IL17RC IL17RC IL17RC IL17RC * Wiązanie w kompetycyjnym teście komórkowym IC0 (ng/μl); konstrukty uporządkowano od najsilniej do najsłabiej wiążącego w oparciu o IC0 dla każdego ligandu. 1 PRZYKŁAD 36 Powinowactwo wiązania rozpuszczalnego polipeptydu IL-17RC i IL-17RC/IL-17RA do IL-17A i IL-17F [0373] IL-17RCx1, IL-17RC i rozpuszczalny polipeptyd IL-17RC/IL-17RC (SEKW. NR ID: 17 i 18) testowano pod kątem powinowactwa wiązania IL-17A i IL-17F w następujący sposób: kozie przeciwciało specyficzne dla fragmentu Fc ludzkiej IgG (Jackson, Nr kat ) rozcieńczono do stężenia 0 mg/ml za pomocą octanu sodu o ph.0 i immobilizowano na biosensorze CM do pomiaru powierzchniowego rezonansu plazmonowego przy pomocy aparatu Biacore. W celu obserwacji asocjacji i dysocjacji, protokół zoptymalizowano w taki sposób, aby przed wstrzyknięciem serii różnych stężeń każdego ligandu uzyskać maksymalne wartości wiązania dla receptora. Wiązanie rozpuszczalnych receptorów i polipeptydu IL-17RC/IL-17RA testowano stosując serię różnych stężeń dla każdego ligandu. Między cyklami powierzchnię biosensora dwukrotnie regenerowano wstrzykując przez 30 sek. glicynę o ph 1.7. W celu wyznaczenia wartości kinetycznych, dane analizowano przy użyciu oprogramowania Biacore Evaluation, a wyniki przedstawiono w poniższej Tabeli. Tabela * Powinowactwo hil17rcx1 do hil-17a ka (1/Ms) kd (1 / s) KD (M) Rmax (RU) Chi 2 (RU 2 ) 1,0E +06 4,90E-04 4,69E- 9,02 0,424 1,24E +06 4,38E-04 3,2E- 8,86 0,324 Powinowactwo hil17rcx1 do hil-17f ka (1/Ms) kd (1 / s) KD (M) Rmax (RU) Chi 2 (RU 2 ) 9,91E +0 4,31E-04 4,3E- 7,22 0,378 1,11E +06 3,84E-04 3,46E- 7,7 0,49 86

88 Rozpuszczalny ligand polipeptydowy IL-17RC/IL-17RA dla hil-17a ka (1/Ms) kd (1 / s) KD (M) Rmax (RU) Chi 2 (RU 2 ) 1,42E +06 6,22E-0 4,39E-11 20, 0,460 2,61E +06 9,9E-0 3,82E-11 18,3 0,888 Rozpuszczalny ligand polipeptydowy IL-17RC/IL-17RA dla hil-17f ka (1/Ms) kd (1 / s) KD (M) Rmax (RU) Chi 2 (RU 2 ) 1,82E +06 2,61E-04 1,43E-,2 0,49 2,49E +06 3,1E-04 1,26E- 11,2 0,44 Powinowactwo hil-17ra do hil-17a ka (1/Ms) kd (1 / s) KD (M) Rmax (RU) Chi 2 (RU 2 ) 3,70E +0 8,6E-0 2,34E- 29, 0,249 2,89E +0 8,7E-0 2,96E- 3,1 0,197 Powinowactwo hil-17ra do hil-17f ka (1/Ms) kd (1 / s) KD (M) Rmax (RU) Chi 2 (RU 2 ) 2,09E +04,6E-04 2,66E-08 20,3 0,071 2,E +04 4,40E-04 1,72E-08 9,9 0,076 * Stałe równowagi i szybkości oraz wartości mieszczą się w zakresie czułości urządzenia. Chi2 odnosi się do sumy kwadratu reszt między krzywymi wiązania i krzywymi dopasowania. Im wartości danych są bliższe zeru tym bardziej dokładne dane. Zaprezentowane dane przedstawiono na wysokim poziomie ufności. [0374] Otrzymane wyniki wskazują na wiązanie hil-17a i hil-17f do hil-17ra i hil-17rc. W szczególności, hil-17rc wykazuje podobne powinowactwo wiązania dla hil-17a i hil-17f ze stałą równowagi dysocjacji (Kd) w zakresie 400 pikomolarnym (pm). Rozpuszczalny polipeptyd IL-17RC/IL-17RA wiązał hil-17a z nieco większym powinowactwem (Kd~40 pm) niż hil-17f (Kd~140 pm). hil-17ra wykazywał największe różnice w powinowactwie do badanych ligandów - 0-krotną różnicę między Kd dla hil-17a (Kd~300 pm) i Kd dla hil-17f (Kd~30 nm) PRZYKŁAD 37 Tworzenie rekombinowanych reporterowych linii komórkowych hil-17ra/nih3t3/kz142.8 i IL- 17RCx4/NIH3T3/KZ142.8 [037] Mysia reporterowa linia komórkowa NIH3T3/KZ142.8 opisana w niniejszym dokumencie została wykorzystana do otrzymania nowych linii komórkowych wyrażających IL-17RA (SEKW. NR ID: 21) lub IL- 17RCx4 (SEKW. NR ID: 166). Linie te otrzymano transfekując wspomnianie komórki linii wyjściowej konstruktami opartymi o wektory ekspresyjne zawierające odpowiednie fragmenty cdna. Do transfekcji wykorzystano wektor ekspresyjny pzmp11 zawierający gen reduktazy dihydrofolianowej. Populację stabilnych transfektantów wyselekcjonowano za pomocą podłoża hodowlanego z dodatkiem metotreksatu o stężeniu 1 µm. Wyselekcjonowane reporterowe linie komórkowe nazwano hil-17ra/nih3t3/kz142.8 i IL- 17RCx4/NIH3T3/KZ

89 1 PRZYKŁAD 38 Rozpuszczalny polipeptyd IL-17RC/IL-17RA przeciwdziała aktywacji wywołanej przez IL-17RA wyrażany przez rekombinowane komórki IL-17RA/NIH3T3/KZ142.8 [0376] Efektywność rozpuszczalnego polipeptydu IL-17RC/IL-17RA (SEKW. NR ID: 17 i 18) w przeciwdziałaniu aktywacji komórek IL-17RA/NIH3T3/KZ142.8 przez IL-17A mierzono w następujący sposób: wysianie komórek do naczynia hodowlanego oraz przygotowanie do testu na aktywność lucyferazy przebiegała tak samo jak już wcześniej tu opisano. W dniu testu, komórki traktowano w trzech powtórzeniach serią dwukrotnych rozcieńczeń dwukrotnie stężonego roztworu rozpuszczalnych receptorów IL-17RA i IL- 17RC o wartości 2 µg/ml (po dodaniu ligandu daje stężenie końcowe o wartości 1 µg/ml). Następnie dodano do nich jedną objętość IL-17A o stężeniu 1 ng/ml, które jest dwukrotnym stężeniem końcowym 0, ng/ml uzyskanym po zmieszaniu ligandu z receptorem. Największą aktywację oznaczono w trzech powtórzeniach próbek, które zawierały 0. ng/ml IL-17A, a nie zawierały receptora. Aktywację na poziomie tła oznaczono w próbkach w trzech powtórzeniach, które zawierały jedynie podłoże hodowlane i nie zawierały ani ligandu ani rozpuszczalnego receptora. Analiza danych wykazała, że IC0 rozpuszczalnego polipeptydu dla aktywacji IL-17A wynosiło 7 ng/ml. Nawet najwyższe dawki (1 µg/ml) rozpuszczalnego receptora IL-17RA lub IL-17RC nie przeciwdziałały skutecznie aktywacji linii komórkowej IL-17RA/NIH3T3/KZ142.8 za pomocą IL-17A w dawce 0. ng/ml PRZYKŁAD 39 Rozpuszczalny polipeptyd IL-17RC/IL-17RA przeciwdziała aktywacji komórek IL-17RA/NIH3T3/KZ142.8 wyrażających rekombinowany IL-17RA wywołanej przez hil-17f. [0377] Efektywność rozpuszczalnego polipeptydu IL-17RC/IL-17RA (SEKW. NR ID: 17 i 18) w przeciwdziałaniu aktywacji komórek IL-17RA/NIH3T3/KZ142.8 przez IL-17F mierzono w następujący sposób: wysianie komórek do naczynia hodowlanego oraz przygotowanie do testu na aktywność lucyferazy przebiegała tak samo jak już wcześniej tu opisano. W dniu testu komórki traktowano w trzech powtórzeniach serią dwukrotnych rozcieńczeń dwukrotnie stężonego roztworu rozpuszczalnych receptorów IL-17RA i IL- 17RC o wartości 4 µg/ml (po dodaniu ligandu do receptora stężenie końcowe wynosi 2 µg/ml). Następnie dodano jedną objętość IL-17F o stężeniu 40 ng/ml, które jest dwukrotnym stężeniem końcowym wynoszącym 20 ng/ml uzyskanym po zmieszaniu ligandu z receptorem. Największą aktywację oznaczono w próbkach (w trzech powtórzeniach), które zawierały 20 ng/ml IL-17F, a nie zawierały receptora. Aktywację na poziomie tła oznaczono w próbkach (w trzech powtórzeniach), które zawierały jedynie podłoże hodowlane i nie zawierały ani ligandu ani rozpuszczalnego receptora. Analiza danych wykazała, że IC0 rozpuszczalnego polipeptydu IL-17RC/IL-17RA dla aktywacji wyżej wymienionej linii komórkowej przez IL- 17F wynosiło 0,48 µg/ml. Nawet najwyższe dawki (2 µg/ml) rozpuszczalnego receptora IL-17RA lub IL-17RC nie przeciwdziałały skutecznie aktywacji linii komórkowej za pomocą IL-17F w dawce 20 ng/ml. 40 PRZYKŁAD 40 Rozpuszczalny polipeptyd IL-17RC/IL-17RA przeciwdziała aktywacji komórek IL-17RCx4/NIH3T3/KZ142.8 wyrażających rekombinowany IL-17RCx4 wywołanej przez hil-17f. [0378] Efektywność rozpuszczalnego polipeptydu IL-17RC/IL-17RA (SEKW. NR ID: 17 i 18) w przeciwdziałaniu aktywacji komórek IL-17RA/NIH3T3/KZ142.8 przez IL-17F mierzono w następujący sposób: wysianie komórek do naczynia hodowlanego oraz przygotowanie do testu na aktywność lucyferazy 88

90 przebiegała tak samo jak już wcześniej tu opisano. W dniu testu komórki traktowano (w trzech powtórzeniach) serią dwukrotnych rozcieńczeń dwukrotnie stężonego roztworu rozpuszczalnych receptorów. W dniu testu komórki te w pierwszej kolejności traktowano (w trzech powtórzeniach) serią pięciokrotnych rozcieńczeń dwukrotnie stężonego roztworu rozpuszczalnych receptorów IL-17RA i IL-17RC o wartości 4 µg/ml. Następnie dodano jedną objętość IL-17F (numer serii A127F) o stężeniu 2 ng/ml, które jest dwukrotnym stężeniem końcowym (po dodaniu ligandu do receptora stężenie końcowe wynosi 1 ng/ml). Największą aktywację oznaczono w próbkach w trzech powtórzeniach, które zawierały 1 ng/ml IL-17F, a nie zawierały receptora. Aktywację na poziomie tła oznaczono w próbkach (w trzech powtórzeniach), które zawierały jedynie podłoże hodowlane i nie zawierały ani ligandu ani rozpuszczalnego receptora. Analiza danych wykazała, że w przypadku rozpuszczalnego polipeptydu IL-17RC/IL-17RA dla aktywacji przez IL-17F IC0 wynosiło 0,8 µg/ml, a dla IL-17RC wynosiło 6 µg/ml, natomiast IL-17RA nie wykazywał żadnego efektu hamującego w żadnej z zastosowanych dawek PRZYKŁAD 41 Rozpuszczalny polipeptyd IL-17RC/IL-17RA neutralizuje indukcję G-CSF, IL-6 i IL-8 wywołaną przez hil-17a i hil-17f [0379] Komórki ludzkiego nabłonka oddechowego (SAEC) traktowano hil-17a lub hil-17f. Po 48 godz. znad komórek zbierano supernatanty, które testowano pod kątem obecności G-CSF, IL-6 i IL-8. Stwierdzono, że ilość G-CSF, IL-6 i IL-8 jest zależna od dawki interleukiny, co pokazano w Tabeli 11 poniżej. Tabela 11 Komórki traktowane: SAEC Krotność indukcji w supernatantach po upływie 48 godz. G-CSF IL-6 IL-8 hil-17a 0 ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml hil-17a 20 ng/ml ng/ml 8 3 ng/ml ng/ml [0380] Komórki SAEC traktowano również rozpuszczalnym polipeptydem IL-17RC/IL-17RA (SEKW NR 17 i 18) w dawce o stężeniu 0,01- µg/ml w kombinacji z hil-17a w dawce o stężeniu ng/ml lub hil-17f w dawce o stężeniu 0 ng/ml (przed dodaniem do komórek oba ligandy i rozpuszczalny polipeptyd inkubowano razem przez 30 min. w temperaturze 37 C). Po 48 godz. znad komórek zbierano supernatant. Jak przedstawia Tabela 12 (poniżej), w zebranych supernatantach spadł poziom G-CSF, IL-6 i IL-8. Wynik ten sugeruje, że rozpuszczalny polipeptyd IL-17RC/IL-17RA skutecznie neutralizował aktywność zarówno hil- 17A jak i hil-17f oraz zahamował indukcję wymienionych cytokin. Należy zauważyć, że ustalenie wartości IC0 dla neutralizacji IL-6 nie było możliwe, ponieważ już przy najniższej dawce testowanego 89

91 rozpuszczalnego polipeptydu IL-17RC/IL-17RA (0.01 ug/ml) obserwowano neutralizację IL-6 na poziomie 0% wartości maksymalnej. Tabela 12 Rozpuszczalny receptor IL-17RA/RC neutralizuje działanie hil-17a/f: Indukcja G-CSF za pomocą hil-17a ( ng/ml) 0,14 Indukcja G-CSF za pomocą hil-17f ( ng/ml) 1,20 Indukcja IL-8 za pomocą hil-17a ( ng/ml) 0,03 Indukcja IL-8 za pomocą hil-17f (0 ng/ml) 0,7 Indukcja IL-6 za pomocą hil-17a ( ng/ml) Indukcja IL-6 za pomocą hil-17f (0 ng/ml) IC0 IL-17RA/RC (mg/ml) 94% neutralizacja przy dawce µg/ml 49% neutralizacja przy dawce 0,01 µg/ml 72% neutralizacja przy dawce µg/ml 7% neutralizacja przy dawce 0,01 µg/ml PRZYKŁAD 42 Efektywność działania rozpuszczalnego polipeptydu IL-17RC/IL-17RA w próbkach modelu stwardnienia rozsianego u człowieka [0381] Stwardnienie rozsiane (SM) to zespół chorobowy, który, jak się uważa, jest wywołany działaniem szeregu czynników, w tym obecnością zapalnych nacieków komórek limfocytarnych i jednojądrzastych oraz demielinizacji w całym CUN. Komórki mikrogleju są komórkami makrofagopodobnymi. Zasiedlają centralny układ nerwowy (CUN) i ulegają aktywacji w wyniku urazu lub infekcji. Komórki mikrogleju odgrywają niezwykle istotną rolę w wielu schorzeniach CUN, w tym w SM, a także w badaniach nad mechanizmem/mechanizmami powstawania, progresji i leczenia tych schorzeń (Nagai i wsp. Neurobiol Dis 8:7-68, 2001, Olson i wsp. J Neurosci Methods 128:33-43; 2003). Linie unieśmiertelnionych ludzkich komórek mikrogleju i/lub ustalonych linii ludzkich komórek astrogleju można zatem wykorzystać do badań wpływu mediatorów prozapalnych na tego typu rodzaju komórki i możliwości ich neutralizacji. Zwiększona produkcja mediatorów prozapalnych (obejmujące lecz nie ograniczone do IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL- 1, IL-17A i F, IL-18, IL-23, TNF-a, IFN-g, mediatory z rodziny MIP, RANTES, IP-, MCP-1, G- i GM-CSF, itp.) może przyczyniać się do powstania objawów i stanów patologicznych związanych z SM wskutek wywołanej przez nie aktywacji szlaków przekazywania sygnału i w konsekwencji aktywację komórek efektorowych. [0382] Aby ocenić oddziaływania o charakterze prozapalnym interleukin IL-17A i IL-17F na wymienione wyżej rodzaje komórek i zdolność rozpuszczalnych polipeptydów według wynalazku, takich jak rozpuszczalny polipeptyd IL-17RC/IL-17RA (SEKW. NR ID: 18), do neutralizacji lub zmniejszenia skutków oddziaływań tych interleukin, hodowane komórki glejowe lub neuronalne traktowano jednym z następujących czynników: nośnik, rhil-17a, rhil-17f, rhil-17a i IL-17F jednocześnie. Ponadto niektóre próbki traktowano, a niektórych nie traktowano rozpuszczalnym polipeptydem IL-17RC/IL-17RA (SEKW. NR ID: 18) według wynalazku. W osobnym zestawie hodowli komórkowych, limfocyty T izolowane z krwi obwodowej pacjentów i aktywowane przy pomocy przeciwciała anty-cd3, dodawano do hodowli komórek neuronalnych i glejowych nie zawierających egzogennej interleukiny IL-17A lub IL17-F. Taki model daje możliwość badania niszczącego wpływu aktywowanych limfocytów T na wymienione wyżej rodzaje komórek. Limfocyty T traktowano rozpuszczalnym polipeptydem według wynalazku, takim jak IL-17RC/IL-17RA (SEKW. NR ID: 90

92 ). W próbie kontrolnej limfocytów T nie traktowano tym polipeptydem. Po zakończeniu hodowli prowadzonej prze okres od 1 godziny do kilku dni supernatanty znad hodowli zbierano i analizowano pod kątem obecności i/lub ekspresji mediatorów zapalnych, w tym mediatorów wymienionych powyżej, a także pod kątem przeżywalności komórek. Poziomy prozapalnych cytokin i chemokin oraz śmiertelność komórek neuronalnych traktowanych rhil-17a i/lub IL-17F są podwyższone w porównaniu do komórek z hodowli traktowanej wyłącznie nośnikiem. Dodanie rozpuszczalnego polipeptydu według niniejszego wynalazku, takiego jak IL-17RC/IL-17RA (SEKW. NR ID: 18), znacząco zmniejszyło wytwarzanie i ekspresję mediatorów prozapalnych w hodowlach komórkowych traktowanych rhil-17a i/lub IL-17F oraz zwiększyło przeżywalność komórek neuronalnych. [0383] W doświadczeniach ex vivo pokazano, że rozpuszczalny polipeptyd według wynalazku, taki jak rozpuszczalny polipeptyd IL-17RC/IL-17RA (SEKW. NR ID: 18), może zmniejszyć niszczące działanie procesów prozapalnych leżących u podstaw patobiologii SM u człowieka. Można by zatem oczekiwać, że leczenie za pomocą wspomnianych rozpuszczalnych polipeptydów skutecznie zmniejsza różnego rodzaju przejawy zapalenia, obumieranie komórek neuronalnych i/lub demielinizację związaną z SM u człowieka. PRZYKŁAD 43 Efektywność działania rozpuszczalnych polipeptydów IL-17RC i IL-17RC/IL-17RA w próbkach modelu reumatoidalnego zapalenia stawów (RZS) i zapalenia kości i stawów (OA). [0384] Model ten wykorzystano do zademonstrowania, że hodowane komórki błony maziowej (w tym maziowe makrofagi, fibroblasty błony maziowej i chondrocyty stawowe) i eksplanty pochodzące od pacjentów cierpiących na RZS i OA wytwarzają więcej mediatorów prozapalnych w porównaniu do komórek i eksplantów pochodzących od pacjentów zdrowych. Mediatory te mogą brać udział w procesie degradacji składników macierzy zewnątrzkomórkowej (np. kości, chrząstki, itd.) co jest symptomem wspomnianych chorób. Ponadto, modele kokultury opisane poniżej wykorzystano do pokazania, że mediatory prozapalne obecne w płynie maziowym pacjentów cierpiących na RZS/OA i/lub aktywowane limfocyty T działając razem mogą prowadzić do zwiększenia stanu zapalnego i degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej. [038] Zwiększone wytwarzanie mediatorów prozapalnych (obejmujących lecz nie ograniczających się do onkostatyny M, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IL-1, IL-17 A i F, IL-18, IL-23, TNF-α, IFN-γ, IP-, RANTS, RANKL, przedstawicieli rodziny MCI, MCP-1, MMP-9, G-i GM-CSF, tlenku azotu, itp.) przyczynia się do pojawienia się objawów i stanów patologicznych związanych z RZS i OA wskutek wywołanej przez nie aktywacji szlaków przekazywania sygnału i w konsekwencji aktywację komórek efektorowych. Wspomniane szlaki przekazywania sygnału i mediatory prowadzą do powstania nacieków zapalnych, uszkodzenia/utraty chrząstki i macierzy zewnątrzkomórkowej, ubytku kości, a także do zwiększenia produkcji pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej metaloproteinaz, prostaglandyn i cyklooksygenaz. Dlatego wspomniane linie komórkowe mogą służyć jako modele w eksperymentach in vitro i ex vivo do symulacji niszczącego działania zapalenia w kontekście RZS i OA. Ponadto, gdy eksplanty i oraz komórki błon maziowych pochodzące od osobników zdrowych są hodowane w obecności egzogennych mediatorów prozapalnych (np. onkostatyny M, TNF-α, IL-1b, IL-6, IL-17A i F, IL-1, itp.) lub alternatywnie w obecności płynu stawowego pochodzącego od pacjentów cierpiących na RZS, w którym znajdują się endogenne mediatory prozapalne, można obserwować włączenie prozapalnego szlaku przekazywania sygnału i towarzyszącego mu procesy uszkadzające tkanki. Za skuteczne w leczeniu pacjentów cierpiących na RZS uważa się takie terapeutyki, które wykazują 91

93 efektywne działanie w eksperymentach in vitro i ex vivo z wykorzystaniem wymienionych modeli, neutralizując mediatory prozapalne lub hamując działanie tych mediatorów. [0386] We wspomnianych modelach eksplanty błony maziowej pobrane od pacjentów cierpiących na RZS lub OA, od pacjentów post-mortem lub od pacjentów w trakcie wymiany stawu kolanowego poddano obróbce według zmodyfikowanego protokołu wg Wooley i Tetlow (Arthritis Res 2: 6-70, 2000) i van 't Hof i wsp. (Reumatologii 39:04-08, 2000). Badano również hodowle fibroblastów maziówkowych, makrofagów mazi stawowej i chondrocytów stawowych. Próbki w dwóch powtórzeniach traktowano jednym z następujących czynników: nośnikiem (PBS), rhil-17a, rhil-17f lub rhil-17a i rhil-17f jednocześnie. Niektóre próbki zawierają także różne kombinacje takich czynników jak onkostatyna M, TNF-α, IL-1b, IL-6, IL-17A, IL-17F, IL-1. Oddzielny zestaw próbek traktowano aktywowanymi ludzkimi limfocytami T lub płynem maziówkowym pochodzącym od osób zdrowych lub chorych na RZS lub OA. Ponadto, wszystkie te próbki są traktowane lub nie traktowane rozpuszczalnym polipeptydem według wynalazku, takim jak rozpuszczalny polipeptyd IL-17RC lub rozpuszczalny polipeptyd IL-17RC/IL-17RA (SEKW. NR ID: 18). Po hodowli prowadzonej w różnych okresach czasu (od 1 godz. do kilku dni) supernatanty i komórki zbierano i analizowano pod kątem obecności mediatorów prozapalnych i biomarkerów tkanki chrzęstnej/tkanki kostnej/macierzy zewnątrzkomórkowej, w tym wymienionych powyżej. W próbkach pochodzących od pacjentów z RZS lub OA lub w próbkach poddanych działaniu mazi stawowej, aktywowanych komórek T, rhil-17a i/lub rhil-17f (w monoterapii lub w skojarzeniu z innymi cytokinami zapalnymi) poziomy cytokin zapalnych i chemokin oraz markerów uszkodzenia tkanki chrzęstnej/tkanki kostnej/macierzy zewnątrzkomórkowej są podwyższone w porównaniu do nie traktowanych niczym zdrowych eksplantów kontrolnych lub nie traktowanych hodowli komórkowych. Dodanie rozpuszczalnego polipeptydu według niniejszego wynalazku znacząco obniżyło wytwarzanie mediatorów prozapalnych i czynników uszkadzających tkankę chrzęstną, kostną lub macierz zewnątrzkomórkową, co sugeruje, że wspomniany polipeptyd może skutecznie działać także w leczeniu RZS i OA u ludzi. Przykład 44 Skuteczność rozpuszczalnego polipeptydów IL-17RC i IL-17RC/IL-17RA w próbkach pochodzących od pacjentów cierpiących na nieswoiste zapalenie jelit (IBD) pobranych podczas biopsji błony śluzowej [0387] Model ten wykorzystano do zademonstrowania, że hodowane tkanki jelitowe pochodzące od pacjentów z IBD wytwarzają więcej mediatorów prozapalnych niż tkanki zdrowe. Zwiększona produkcja mediatorów prozapalnych (obejmujących lecz nie ograniczających się do IL-1β, IL-4, IL-, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-1, IL-17 i F, IL-18, IL-23, TNF-α, IFN-γ, mediatorów z rodziny MCI, MCP-1, G- i GM-CSF, itp.) przyczynia się do powstania objawów i procesów patologicznych związanych z IBD, takich jak choroba Leśniowskiego-Crohna (ChL-C) oraz wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) powodując aktywację szlaków przekazywania sygnału i w konsekwencji aktywację komórek efektorowych. Procesy te i mediatory prozapalne w czasie IBD prowadzą do obserwowanego in vivo uszkodzenia oraz zniszczenia komórek i tkanek. Ponadto, gdy tkanki jelita pochodzące od zdrowych osobników lub ludzkie komórki nabłonka jelitowego (IEC) hodowano w obecności tych mediatorów prozapalnych, obserwowano uruchomienie szlaków przekazywania sygnału dla procesu zapalnego, a także oznaki uszkodzenia komórek i tkanek. 92

94 [0388] Terapeutyki, które dają pozytywne efekty w powyższych modelach IEC in vitro i ex vivo hamując i/lub neutralizując wytwarzanie i/lub obecność mediatorów prozapalnych, będą także skuteczne w leczeniu IBD u ludzi. [0389] Dla potrzeb tego modelu tkanki ludzkiego jelita pobrano od pacjentów cierpiących na IBD, od pacjentów post-mortem lub od pacjentów zdrowych poddanych biopsji jelita lub ponownemu zabiegowi chirurgicznemu. Pobrane próbki tkanek poddano obróbce według zmodyfikowanego protokołu wg Alexakis i wsp. (Gut 3:8-90; 2004). W warunkach aseptycznych, próbki delikatnie lecz obficie płukano buforem PBS, a następnie oczyszczano przez hodowlę fragmentów homogenizowanej tkanki w obecności pełnego podłoża hodowlanego z dodatkiem antybiotyków, aby zapobiec zakażeniu bakteryjnemu. Próbki z tej samej puli homogenizowanej tkanki traktowano nośnikiem PBS lub rekombinowanym ludzkim białkiem rhil-17a lub rhil-17f lub rhil-17a i rhil-17 jednocześnie. Ponadto, próbki hodowano w obecności lub przy braku antagonisty IL-17A lub antagonisty IL-17F lub w obecności obu tych antagonistów (np. rozpuszczalnego IL- 17RC). Ten protokół postępowania stosowano także w eksperymentach z użyciem komórek ludzkiej linii IEC, przy czym komórki te pasażowano z istniejących przechowywanych zapasów. Po zakończeniu hodowli prowadzonej prze okres od 1 godziny do kilku dni supernatanty znad hodowli zbierano i analizowano pod kątem obecności mediatorów prozapalnych, w tym mediatorów wymienionych powyżej. W próbkach pochodzących od pacjentów z IBD lub w próbkach poddanych działaniu rhil-17a i/lub rhil-17f obserwowany poziom cytokin i chemokin był wyższy w porównaniu do próbek nie traktowanej zdrowej tkanki kontrolnej. Dodanie antagonistów aktywności IL-17F i/lub IL-17A, takich jak rozpuszczalne receptory IL- 17RC oraz skierowanych przeciwko nim przeciwciał, w tym monoklonalnych przeciwciał anty-ludzki receptor IL-17RC i przeciwciał neutralizujących według niniejszego wynalazku znacząco obniżyło wytwarzanie mediatorów prozapalnych. Dodanie rozpuszczalnego polipeptyd według wynalazku znacznie zmniejsza wytwarzanie mediatorów prozapalnych. Można się zatem spodziewać, że polipeptyd ten będzie również skutecznym terapeutykiem w leczeniu IBD u ludzi. [0390] Dodatkowym przedmiotem badań może być porównanie wytwarzania mediatorów prozapalych w tkankach z biopsji pacjentów cierpiących na IBD i będących w trakcie leczenia oraz pacjentów cierpiących na IBD, którym nie podawano żadnych leków lub którzy nie odpowiadają na leczenie Przykład 4 Skuteczność rozpuszczalnych polipeptydów IL-17RC i IL-17RC/IL-17RA w próbkach pochodzących od pacjentów cierpiących na nieswoiste zapalenie jelit (IBD) spowodowane upośledzeniem funkcji nabłonka jako bariery ochronnej [0391] Utrzymanie integralności bariery jaką jest nabłonek, stanowi krytyczny czynnik w zachowaniu zdrowego układu pokarmowego. Dowody doświadczalne wskazują na to, że nieszczelności nabłonka w jelitach może przyczynić się do rozwoju IBD. Ogólnie komórki układu odpornościowego znajdujące się w blaszce właściwej jelita wchodzą w interakcje z komórkami nabłonka jelita przez bezpośredni kontakt komórka-komórka lub wytwarzanie rozpuszczalnych czynników służących do utrzymania nadzoru nad nabłonkiem i jego integralnością. Jednak długotrwałe lub niekontrolowane zapalenie może przyczynić się do uszkodzenia integralności bariery, jaką stanowią komórki nabłonka. Niniejsze badanie opracowano w celu określenia bezpośredniego wpływu(ów) IL-17A i/lub IL-17F z limfocytów T na integralność bariery nabłonkowej. 93

95 1 [0392] W niniejszym przykładzie komórki linii nabłonka jelit, takie jak komórki Caco-2, są różnicowane na półprzepuszczalnych membranach i hodowane stroną basolateralną wspólnie z limfocytami T lub monocytami pochodzącymi z biopsji od pacjentów cierpiących na IBD lub od osób zdrowych. Integralności monowarstwy nabłonka monitorowano w czasie oceniając przeznabłonkowy opór elektryczny lub odporność monowarstwy na dyfuzję barwnika. Obniżenie przeznabłonkowego oporu elektrycznego wskazuje na pojawienie się w monowarstwie uszkodzeń związanych z aktywnością limfocytów T lub monocytów będących we wspólnej hodowli. Inhibitory interleukin IL-17A i IL-17F, takie jak rozpuszczalne polipeptydy według niniejszego wynalazku IL-17RC lub IL-17RC/IL-17RA (SEKW. NR ID: 18) można wykorzystać do określenia względnego udziału IL-17A i IL-17F w powstawaniu uszkodzeń monowarstwy nabłonka jednowarstwowego oraz testowania skuteczności inhibitorów interleukin IL-17A i IL-17F w utrzymaniu integralności bariery nabłonka. Ochronne działanie rozpuszczalnych polipeptydów IL-17RC i IL-17RC/IL- 17RA na monowarstwy nabłonka i ich przeciwdziałanie uszkodzeniom spowodowanym przez aktywowane limfocyty T sugeruje, że rozpuszczalne polipeptydy IL-17RC i IL-17RC/IL-17RA według wynalazku mogą być również skutecznymi terapeutykami w leczeniu IBD u ludzi. [0393] Kokultury można także założyć wykorzystując komórki nabłonka podstawowego pochodzącego od pacjentów cierpiących na IBD w celu ustalenia, czy komórki te są bardziej wrażliwe na IL-17A i IL-17F niż komórki nabłonka pochodzącego od osób zdrowych. Potwierdzenie powyższego założenia oznaczałoby, że hamowanie IL-17A i IL-17F jest korzystną strategią leczenia IBD Przykład 46 Wpływ IL-17A i IL-17F na limfocyty T i monocyty/makrofagi błony podstawnej w próbkach pochodzących od pacjentów cierpiących na IBD i w próbkach pochodzących od osób zdrowych [0394] Niekontrolowany lub przedłużający się stan zapalny wywołany czynnikami immunologicznymi może przyczyniać się do pojawienia się objawów i powstawania stanów patologicznych związanych z IBD w wyniku uszkodzenia tkanki lub trwałego lub długiego upośledzenia powstawania prawidłowej odpowiedzi układu odpornościowego. Przy pomocy tego modelu można określić wpływ cytokin IL-17A i IL-17F znajdujących się w bezpośrednim otoczeniu tkanek jelitowych na związane ze stanem chorobowym limfocyty T i monocyty. [039] Terapeutyki, które dają pozytywne efekty w powyższych modelach in vitro i ex vivo i w modelu EIC hamując i/lub neutralizując wytwarzanie i/lub obecność mediatorów prozapalnych (obejmujących, ale nie ograniczonych do IL-1β, IL-4, IL-, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-1, IL-17 A i F, IL-18, IL-23, TNF-α, IFN-, przedstawicieli rodziny MIP, MCP-1, G- and GM-CSF, etc.) będą także skuteczne w leczeniu IBD u ludzi. [0396] W modelu tym limfocyty T i monocyty/makrofagi izolowano z próbek pobranyc w biopsji. Próbki te homogenizowano za pomocą nożyczek w buforze HBSS, traktowano kolagenazą i dispazą II, a następnie inkubowano mieszając przez 1 godz. w temperaturze 37 C. Zawiesinę komórek filtrowano przez nylonowa siatkę w celu usunięcia zanieczyszczeń i agregatów komórkowych oraz przemyto kilkukrotnie buforem HBSS. Limfocyty T i makrofagi/monocyty można izolować stosując bezpośrednie sortowanie komórek, izolację za pomocą kuleczek magnetycznych albo wzbogacanie w porządaną populację komórek. Izolowane komórki inkubowano w obecności IL-17A i IL-17F, co indukuje wytwarzanie mediatorów prozapalnych przez limfocyty T i monocyty/makrofagi lub powoduje, że limfocyty T reagują nieprawidłowo lub nadmiernie. Porównano rodzaje mediatorów prozapalnych wytwarzanych przez komórki pacjentów cierpiących na IBD i przez komórki osób zdrowych. Porównanie to sugerować, że komórki T oraz monocyty/makrofagi 94

96 pochodzące od pacjentów z IBD wykazują więcej cech prozapalnych w obecności IL-17A i IL-17F. Dodanie rozpuszczalnego polipeptydu według niniejszego wynalazku, takiego jak rozpuszczalny polipeptyd IL-17RC lub rozpuszczalny polipeptyd IL-17RG/IL-17RA (SEKW. NR ID: 18) w celu zneutralizowania mediatorów prozapalnych wytwarzanych pod wpływem IL-17A i IL-17Fwskazuje na to, że rozpuszczalne polipeptydy IL- 17RC i IL-17RC/IL-17RA mogą być skutecznym terapeutykiem w leczeniu pacjentów cierpiących na IBD Przykład 47 Skuteczność rozpuszczalnego polipeptydów IL-17RC i IL-17RC/IL-17RA w próbkach pochodzących od pacjentów cierpiących na zespół jelita nadwrażliwego (IBS). Patogeneza związana z CUN [0397] Model IBS dotyczy patogenezy tego schorzenia związanej z funkcjonowaniem CUN, a dokładnie indukcji objawów typowych dla IBS pod wpływem bodźców stresu. Psychospołeczny model stresu u noworodków posiada pewne cechy kliniczne wspólne z IBS, w tym ból otrzewnej, biegunkę i wrażliwość na stres. Skutkiem oddzielenia miotu od matki przez 180 min. dziennie przez okres 4-18 dni po narodzeniu jest zmiana zachowania matki, co objawia się znaczącym skróceniem czasu lizania/opiekowania się potomstwem. Stres noworodków objawia się trwałymi zmianami w CUN, co prowadzi do zmiany wrażliwości na indukowany bodźcami stresogennymi ból typu trzewnowego i ból somatyczny. W odpowiedzi na stres u zwierząt zwiększa się motoryka okrężnicy, a wstępne dane wskazują na wzrost przepuszczalności jelit (Mayer i wsp., 2002). Niniejszy model otrzymano wstrzykując codziennie do jelita noworodkom zwierząt olej z gorczycy. Olej z gorczycy drażni układ nerwowy, a podany bezpośrednio do jelita wywołuje hiperalgezję trzewną. Taki model symuluje główne cechy charakterystyczne dla IBS w tym nadwrażliwość trzewną oraz zmiany w funkcjonowaniu jelit. W modelu tym u zwierząt wystąpiła biegunka lub zaparcia t.j. główny objaw u pacjentów cierpiących na EBS (Mayer i wsp., 2002, Kimball i wsp., 200). Można zatem w oparciu o powyższy model IBS obserwować zmiany w powstawaniu różnego rodzaju objawów po podaniu rozpuszczalnego polipeptydu według wynalazku, takiego jak rozpuszczalny polipeptyd IL-17RC lub rozpuszczalny polipeptyd IL-17RC/IL-17RA (SEKW. NR ID: 18). Zmniejszenie częstości występowania objawów po leczeniu powyższymi inhibitorami sugerowałoby potencjalne możliwości skutecznego zastosowania tych cząsteczek w leczeniu IBS Przykład 48 Skuteczność rozpuszczalnych polipeptydów IL-17RC i IL-17RC/IL-17RA w zespole jelita nadwrażliwego (IBS): Główne czynniki indukujące stres i zaburzające funkcję jelit [0398] Model ten skupia się wokół czynników indukujących stres i zaburzających funkcje jelit (np. zapalenie jelit, zakażenie lub stres fizyczny). Badania na zwierzętach wykazały, że niewielki stan zapalny lub aktywacja układu immunologicznego mogą być przyczyną zmiany funkcji aferentnej jelita i pokrywającego go nabłonka (Mayer i in. 2002). W modelu tym doprowadza się do podrażnienia jelita grubego codziennie wstrzykując noworodkom zwierząt dojelitowo olej z gorczycy. Olej z gorczycy drażni układ nerwowy, a podany bezpośrednio do jelita wywołuje hiperalgezję trzewną. Taki model symuluje główne cechy charakterystyczne dla IBS w tym nadwrażliwość trzewną oraz zmiany w funkcjonowaniu jelit. W modelu tym u zwierząt wystąpiła biegunka lub zaparcia tj. główny objaw u pacjentów cierpiących na EBS (Mayer i wsp., 2002, Kimball i wsp., 200). Można zatem w oparciu o powyższy model IBS obserwować zmiany w powstawaniu różnego rodzaju objawów po podaniu rozpuszczalnego polipeptydu według wynalazku, takiego jak rozpuszczalny polipeptyd IL-17RC lub rozpuszczalny polipeptyd IL-17RC/IL-17RA (SEKW. NR ID: 18). 9

97 Zmniejszenie częstości występowania lub stopnia zaawansowania nadwrażliwości trzewnej i zmiany motoryki przewodu pokarmowego po leczeniu inhibitorami sugerowałoby potencjalne możliwości skutecznego zastosowania tych cząsteczek w leczeniu IBS Przykład 49 Zaprojektowanie procesu produkcji rozpuszczalnego białka antagonistów IL-17A i IL-17F na dużą skalę [0399] Planując strategię opracowania procesu produkcji rozpuszczalnej postaci białka IL-17RC, napotkano wiele trudności związanych z doborem takiego systemu ekspresyjnego, który pozwalałby na otrzymywanie w kondycjonowanych mediach białka o wysokim stężeniu. Za pomocą techniki blotting pokazano, że białka gromadzące się w komórce są wydzielane na niskim poziomie. W trakcje badań nad rozpuszczalnymi polipeptydami według niniejszego wynalazku zaprojektowano, sporządzono i przetestowano ponad siedemdziesiąt różnych konstruktów ekspresyjnych w komórkach linii BHK, CHO lub HEK 293. Niektóre konstrukty testowano w więcej niż jednej linii komórkowej gospodarza. Modyfikacje w kasecie ekspresyjnej rozpuszczalnego IL-17RC obejmowały: 1) Alternatywne sekwencje sygnałowe, takie jak: a) natywna b) otpa, c) pochodzące z regionu zmiennego mysiej immunoglobuliny, d) ludzki hormon wzrostu, e) mysi IL17RA. 2) Dwa różne naturalnie występujące warianty splicingowe: IL-17RCx1, (SEKW. NR ID: 2) oraz IL-17RCx4, (SEKW. NR ID: 166). 3) Dodanie sekwencji łącznika pomiędzy domenę zewnątrzkomórkową IL-17RC (ECD) i część Fc, takiej jak: a) brak łącznika, b) 9-aminokwasowy łącznik oparty o sekwencję GlyGlyGlySer, c) 20-aminokwasowy łącznik oparty o sekwencję GlyGlyGlySer. 4) Postać monomeryczna z tagiem His. ) Białka fuzyjne z fragmentem Fc zarówno na N- jak i C-końcu. 6) Usunięcie miejsc przyłączenia na N-końcu. 7) Podstawienie aminokwasowe Gln za pomocą Asn. 8) Hybrydowe białka fuzyjne w oparciu o IL17RA i IL17RC [0400] Wszystkie warianty konstruktów ekspresyjnych rozpuszczalnego IL-17RC testowano pod kątem ekspresji białka w przejściowej transfekcji komórek HEK 293. Metodę Western blotting wykorzystano do detekcji białek wydzielanych do kondycjonowanego podłoża hodowlanego i do porównania ich ilości z ilością białek zatrzymanych w komórce i tym samym obecnych w lizacie. Większość konstruktów wyrażających białko kierowało to białko do kondycjonowanego podłoża hodowlanego w ilości bardzo słabo wykrywalnej metodą Western blotting. Ponadto sygnał otrzymywany z lizatu komórkowego był silniejszy niż sygnał z kondycjonowanego podłoża hodowlanego, co sugerowało, że białko nie było wydajnie wydzielane. Te konstrukty ekspresyjne, które w rezultacie dawały najwyższe sygnały w kondycjonowanym podłożu hodowlanym wykorzystano do stabilnej transfekcji komórek CHO. Miana białka mierzono w populacji 96

98 stabilnych transfektantów CHO i, jeśli było to możliwe, oczyszczone białko analizowano pod kątem wiązania IL-17A i IL-17F do komórek w teście kompetycyjnym. W poniższej tabeli przedstawiono wyniki ekspresji białka otrzymanej z wykorzystaniem najwydajniejszych konstruktów w populacji stabilnych transfektantów komórek CHO. Jeśli bezwzględne stężenie białka znajdowało się poniżej poziomu wykrywalności, miano białka oznaczano jako <0, mg/ml. [0401] Oznaczenia numeryczne konstruktów wyrażających białka IL-17RC i IL-17RC/RA, krótki opis egzonów, miano białka wyrażanego w populacji stabilnie transfekowanych komórek CHO i zdolność wiązania interleukin IL17A i IL17F. Nie wszystkie sekwencje wariantów zawartych w Tabeli 13 zostały poniżej uwzględnione. Tabela 13 Opis Miano białka (mg/l) Wiązanie x1 wariant splicingowy IL17RC egzony (wariant 12) x4 wariant splicingowy IL17RC egzony 1-6 3,0 Zdolność blokowania IL17A i IL17F i IL17F < 0, IL17RC egzony 1-6 < 0, Nieaktywny IL17RC egzony ,6 Nieaktywny Nie udało się uzyskać wystarczającej ilości próbki IL17RC egzony 7-16 < 0, Zdolność blokowania IL17A i IL17F i IL17F IL17RA egzony 1- IL17RC egzony 8-16 (Wariant 1407) IL17RA egzony 1-6 IL17RC egzony 8-16 IL17RA egzony 7- IL17RA egzony 1-3 IL17RC egzony 4-16 IL17RA egzony 1 IL17RC egzony 2-16 IL17RA egzony 1-6 IL17RC egzony 8-16 (wariant 144) 32, Zdolność blokowania IL17A i IL17F < 0, Nieaktywny < 0, < 0, Nie udało się uzyskać wystarczającej ilości próbki Nie udało się uzyskać wystarczającej ilości próbki 19 Zdolność blokowania IL17A i IL17F 1 20 LISTA SEKWENCJI [0402] <1> Levin, Steven D. Rixon, Mark W. Gao, Zeren Lewis, Katherine E. Bilsborough, Janine Taft, David W. <120> Antagoniści IL-17A i IL-17F oraz sposoby ich wykorzystania <130>

99 <140> Jeszcze nie przekazano 1 <141> <> 60/721,162 <11> <> 60/73,794 <11> <> 60/772,022 <11> <> 60/782,247 <11> <160> <170> FastSEQ dla Windows wersja 4.0 <2> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <221> CDS <222> (14)...(2229) <223> zoptymalizowany aktywator plazminogenu (otpa) pre-pro sekwencja sygnałowa i egzony 7- ludzkiego IL-17RC i Fc <400>

100 99

101 0

102 <2> 2 <211> 692 <212> PRT <213> Homo sapiens 1

103 <400> 2 2

104 <2> 3 <211> 432 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3 3

105 <2> 4 <211> 173 <212> DNA <213> Homo sapiens <221> CDS <222> (2)...(1726) <400> 4 4

106

107 <2> <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens 6

108 <400> 7

109 1 <2> 6 <211> 172 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> sekwencja zdegenerowana <221> misc feature <222> (1)...(172) <223> n = A,T,C lub G <400> 6 8

110 <2> 7 <211> 2076 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> sekwencja zdegenerowana 1 <221> misc_feature <222> (1)..(2076) <223> n = A,T,C lub G 20 <400> 7 9

111 <2> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Starter do reakcji PCR <400> 8 cggcgtggtg gtcttgctct t 21 <2> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> linker peptydowy <400> 9 <2> <211> 688 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Chimeryczne białko Zcytor14 1

112 <400> 111

113 <2> 11 <211> 70 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Chimeryczne białko Zcytor14 112

114 <400>

115 <2> 12 <211> 67 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Chimeryczne białko Zcytor14 <400>

116 11

117 <2> 13 <211> 1874 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 <2> 14 <211> 1 <212> PRT <213> Homo sapiens 116

118 <400> 14 <2> 1 <211> 923 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 <2> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>

119 <2> 17 <211> 1172 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 17 <2> 18 <211> 18 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 1 <2> 19 <211> 462 <212> DNA <213> Mus musculus <400> <2> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus 118

120 <400> 20 <2> 21 <211> 320 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 <2> 22 <211> 221 <212> PRT <213> Homo sapiens 119

121 <400> 22 <2> 23 <211> 2180 <212> DNA <213> Homo sapiens <400>

122 <2> 24 <211> 667 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>

123 <2> 2 <211> 2269 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 122

124 <2> 26 <211> 683 <212> PRT <213> Mus musculus <400>

125 <2> 27 <211> 449 <212> PRT <213> Mus musculus 124

126 <400> 27 <2> 28 <211> 222 <212> PRT <213> Mus musculus 12

127 <400> 28 <2> 29 <211> 2287 <212> DNA <213> Mus musculus <400>

128 <2> 30 <211> 689 <212> PRT <213> Mus musculus <400>

129 <2> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> 31 tcccgtcccc cgccccaggt c 21 <2> 32 <211> 2 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja 128

130 <223> starter oligonukleotydowy <400> 32 ctctccatcc ttatctttca tcaac 2 <2> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> 33 ctctctgctg gctaaacaaa acac 24 <2> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> 34 ctcatattgc tcaactgtgt gaaaaa 26 <2> 3 <211> 2 ' <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> 3 tagaagccac ctgaacacaa atctg 2 <2> 36 <211> 28 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> 36 atcttgcgtt gtatgttgaa aatcaatt 28 <2> 37 <211> 2 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> 37 ttctccacca ggtaaacaag tctac 2 <2> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> 38 ctctccaggc ccaagtcgtg ctct 24 <2> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> 39 ttgtcctggg ggcctcgtgt ctcc 24 <2> 40 <211>

131 1 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> 40 acgaagccca ggtaccagaa agag 24 <2> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> 41 aaaagcgccg cagccaagag tagg 24 <2> 42 <211> 1293 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> <2> 43 <211> 431 <212> PRT <213> Homo sapiens 130

132 <400> 43 <2> 44 <211> 699 <212> DNA <213> Homo sapiens 131

133 <400> 44 <2> 4 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 1 <2> 46 <211> 69 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> <2> 47 <211> 36 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> 47 tgtgggccct ctgggctcct tgtggatgta tttgtc

134 1 20 <2> 48 <211> 36 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> 48 gacaaataca tccacaagga gcccagaggg cccaca 36 <2> 49 <211> <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> 49 caaccccaga gctgttttaa ggcgcgcctc tagattattt acccggagtc cggga <2> 0 <211> 76 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> <2> 1 <211> <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> C-terminal his tag <400> 1 3 <2> 2 <211> <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> C-terminal FLAG tag <400> <2> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Glu-Glu tag <400> 3 0 <2> 4 <211> 8 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> 4 133

135 <2> <211> 8 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> <2> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> 6 acgaagccca ggtaccagaa agag 24 <2> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> 7 aaaagcgccg cagccaagag tagg 24 <2> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> 8 cgtaagcggt ggcggttttc 20 <2> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> 9 tgggcagggc acagtcacag 20 <2> 60 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> 60 acttgccatt ctgagggagg tagc 24 <2> 61 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> 61 cacaggtgca gccaactttt agga 24 <2> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy 134

136 1 <400> 62 gtgggccgct ctaggcacca 20 <2> 63 <211> 2 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> starter oligonukleotydowy <400> 63 cggttggcct tagggttcag ggggg 2 <2> 64 <211>.2127 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> <2> 6 <211> 708 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 13

137 136

138 <2> 66 <211> 1416 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> syntetyczny insert <400> 66 1 <2> 67 <211> 214 <212> DNA <213> homo sapiens <400>

139 <2> 68 <211> 718 <212> PRT <213> homo sapiens <400>

140 <2> 69 <211>

141 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 69 <2> 70 <211> 683 <212> PRT <213> homo sapiens 140

142 <400>

143 <2> 71 <211> 2130 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Mysi peptyd sygnałowy i egzony 1-6 mysiej IL-17RA, egzony 8-16 ludzkiego IL-17RC, linker i Fc <400>

144 <2> 72 <211> 7 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Mysi peptyd sygnałowy i egzony 1-6 mysiej IL-17RA, egzony 8-16 ludzkiego IL-17RC, linker i Fc <400>

145 <2> 73 <211> 1638 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> otpa (zoptymalizowany tkankowy aktywator plazminogenu) peptyd sygnałowy i egzony 8-16 ludzkiego IL-17RC, linker i Fc 144

146 <400> 73 <2> 74 <211> 46 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> otpa (zoptymalizowany tkankowy aktywator plazminogenu) peptyd sygnałowy i egzony 8-16 ludzkiego IL-17RC, linker i Fc <400> 74 14

147 <2> 7 <211> 622 <212> DNA <213> homo sapiens 146

148 <400> 7 <2> 76 <211> 207 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 76 <2> 77 <211> 1318 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony 1-7 ludzkiego IL-17RC i Fc 147

149 <400> 77 <2> 78 <211> 439 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony 1-7 ludzkiego IL-17RC i Fc <400>

150 <2> 79 <211> 762 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 79 <2> 80 <211> 24 <212> PRT <213> homo sapiens 149

151 <400> 80 <2> 81 <211> 148 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony 1-8 ludzkiego IL-17RC i Fc <400> 81 1 <2> 82 <211> 486 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja

152 <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony 1-8 ludzkiego IL-17RC i Fc <400> 82 <2> 83 <211> 822 <212> DNA <213> homo sapiens 11

153 <400> 83 <2> 84 <211> 274 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 84 1 <2> 8 <211> 118 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony 1-9 ludzkiego IL-17RC i Fc 12

154 <400> 8 <2> 86 <211> 06 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony 1-9 ludzkiego IL-17RC i Fc 13

155 <400> 86 <2> 87 <211> 873 <212> DNA <213> homo sapiens 14

156 <400> 87 <2> 88 <211> 291 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 88 1 <2> 89 <211> 169 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony 1- ludzkiego IL-17RC i Fc 1

157 <400> 89 <2> 90 <211> 23 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony 1- ludzkiego IL-17RC i Fc 16

158 <400> 90 <2> 91 <211> 9 <212> DNA <213> homo sapiens 17

159 <400> 91 <2> 92 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 92 18

160 <2> 93 <211> 17 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony 1-11 ludzkiego IL-17RC i Fc <400> 93 1 <2> 94 <211> 8 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony 1-11 ludzkiego IL-17RC i Fc <400> 94 19

161 <2> 9 <211> 303 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 9 <2> 96 <211> 1 <212> PRT <213> homo sapiens 160

162 <400> 96 <2> 97 <211> 999 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony ludzkiego IL-17RC i Fc <400> 97 1 <2> 98 <211> 333 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony ludzkiego IL-17RC i Fc 161

163 <400> 98 <2> 99 <211> 8 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 99 <2> 0 <211> 19 <212> PRT <213> homo sapiens 162

164 <400> 0 <2> 1 <211> 1281 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony ludzkiego IL-17RC i Fc <400> 1 1 <2> 2 <211> 427 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony ludzkiego IL-17RC i Fc 163

165 <400> 2 <2> 3 <211> 882 <212> DNA <213> homo sapiens 164

166 <400> 3 <2> 4 <211> 294 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 1 <2> <211> 178 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony 7-16 ludzkiego IL-17RC i Fc 16

167 <400> <2> 6 <211> 26 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony 7-16 ludzkiego IL-17RC i Fc 166

168 <400> 6 <2> 7 <211> 864 <212> DNA <213> homo sapiens 167

169 <400> 7 <2> 8 <211> 288 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 8 1 <2> 9 <211> 160 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony 1-7 i ludzkiego IL-17RC i Fc 168

170 <400> 9 <2> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony 1-7 i ludzkiego IL-17RC i Fc 169

171 <400> 1 <2> 111 <211>

172 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 111 <2> 112 <211> 382 <212> PRT <213> homo sapiens 171

173 <400> 112 <2> 113 <211> 1842 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony 1-7 oraz ludzkiego IL-17RC i Fc 172

174 <400> 113 <2> 114 <211> 614 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony 1-7 oraz ludzkiego IL-17RC i Fc <400>

175 <2> 11 <211> 124 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony 1-13 ludzkiego IL-17RC egzony 7-9 ludzkiego IL-17RA 174

176 <400> 11 <2> 116 <211> 08 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC, egzony 1-13 ludzkiego IL-17RC, egzony 7-9 ludzkiego IL-17RA <400>

177 <2> 117 <211> 2220 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC, egzony 1-13 ludzkiego IL-17RC, egzony 7-9 ludzkiego IL-17RA i Fc 176

178 <400> 117 <2> 118 <211> 740 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC, egzony 1-13 ludzkiego IL-17RC, egzony 7-9 ludzkiego IL-17RA i Fc <400>

179 178

180 <2> 119 <211> 0 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Mysi peptyd sygnałowy IL-17RA, egzony 1-6 mysiego IL-17RA, egzony 8-13 ludzkiego IL-17RC i egzony 7-9 mysiego IL-17RA <400> <2> 120 <211> 00 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja 179

181 <223> Mysi peptyd sygnałowy IL-17RA, egzony 1-6 mysiego IL-17RA, egzony 8-13 ludzkiego IL-17RC i egzony 7-9 mysiego IL-17RA <400> 120 <2> 121 <211>

182 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Mysi peptyd sygnałowy IL-17RA, egzony 1-6 mysiego IL-17RA, egzony 8-13 ludzkiego IL-17RC i egzony 7-9 mysiego IL-17RA <400> <2> 122 <211> 2196 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Mysi peptyd sygnałowy IL-17RA, egzony 1-6 mysiego IL-17RA, egzony 8-13 ludzkiego IL-17RC, egzony 7-9 mysiego IL-17RA i Fc 181

183 <400>

184 183

185 184

186 18

187 <2> 123 <211> 1272 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC, egzony 1-6 ludzkiego IL-17RC i Fc 186

188 <400> 123 <2> 124 <211> 424 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Sekwencja sygnałowa IL-17RC, egzony 1-6 ludzkiego IL-17RC i Fc <400>

189 <2> 12 <211> 1794 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC i egzony 1-6 oraz ludzkiego IL-17RC i Fc <400>

190 <2> 126 <211> 98 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC oraz egzony 1-6 i ludzkiego IL-17RC, oraz Fc <400>

191 <2> 127 <211> 11 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC oraz egzony 1-6 i ludzkiego IL-17RC, oraz Fc 190

192 <400> 127 <2> 128 <211> 0 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy IL-17RC oraz egzony 1-6 i ludzkiego IL-17RC, oraz Fc <400>

193 <2> 129 <211> 133 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Optymizowany tkankowy aktywator plazminogenu (otpa) pre-prosekwencja sygnałowa i egzony 8-13 ludzkiego IL17RC i Fc <400>

194 <2> 130 <211> 44 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Optymizowany tkankowy aktywator plazminogenu (otpa) pre-prosekwencja sygnałowa i egzony 8-13 ludzkiego IL17RC i Fc <400>

195 <2> 131 <211> 1299 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Optymizowany tkankowy aktywator plazminogenu (otpa) pre-prosekwencja sygnałowa i egzony 8-13 i ludzkiego IL17RC i Fc <400> <2> 132 <211> 433 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Optymizowany tkankowy aktywator plazminogenu (otpa) pre-prosekwencja sygnałowa oraz egzony 8- i ludzkiego IL-17RC, oraz Fc 194

196 <400> 132 <2> 133 <211> 6 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Optymizowany tkankowy aktywator plazminogenu (otpa) pre-prosekwencja sygnałowa oraz egzony 8- ludzkiego IL-17RC, oraz Fc 19

197 <400> 133 <2> 134 <211> 32 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Optymizowany tkankowy aktywator plazminogenu (otpa) pre-prosekwencja sygnałowa oraz egzony 8- ludzkiego IL-17RC, oraz Fc <400>

198 <2> 13 <211> 80 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Optymizowany tkankowy aktywator plazminogenu (otpa) pre-prosekwencja sygnałowa oraz egzony ludzkiego IL-17RC, oraz Fc <400>

199 <2> 136 <211> 360 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Optymizowany tkankowy aktywator plazminogenu (otpa) pre-prosekwencja sygnałowa oraz egzony ludzkiego IL-17RC, oraz Fc <400>

200 <2> 137 <211> 1164 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Optymizowany tkankowy aktywator plazminogenu (otpa) pre-prosekwencja sygnałowa oraz egzony 7- ludzkiego IL-17RC, oraz Fc <400> <2> 138 <211> 388 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Optymizowany tkankowy aktywator plazminogenu (otpa) pre-prosekwencja sygnałowa oraz egzony 7- ludzkiego IL-17RC, oraz Fc 199

201 <400> 138 <2> 139 <211> 2433 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Sekwencja peptydowa IL-17RA oraz egzony 1- IL-17RA i egzony 8-16 ludzkiego IL-17RC, oraz Fc 200

202 <400> 139 <2> 140 <211> 811 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Sekwencja sygnałowa IL-17RA oraz egzony 1- IL-17RA i egzony 8-16 ludzkiego IL-17RC, oraz Fc <400>

203 202

204 <2> 141 <211> 2190 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Sekwencja sygnałowa IL-17RA oraz egzony 1-6 IL-17RA i egzony 8-13 ludzkiego IL-17RC oraz egzony 7- IL-17RA, oraz Fc <400>

205 <2> 142 <211> 730 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Sekwencja sygnałowa IL-17RA oraz egzony 1-6 IL-17RA i egzony 8-13 ludzkiego IL-17RC oraz egzony 7- IL-17RA, oraz Fc <400>

206 20

207 <2> 143 <211> 2124 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Sekwencja sygnałowa IL-17RA oraz egzony 1-3 IL-17RA i egzony 4-16 ludzkiego IL-17RC oraz Fc <400> <2> 144 <211> 708 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Sekwencja sygnałowa IL-17RA oraz egzony 1-3 IL-17RA i egzony 4-16 ludzkiego IL-17RC oraz Fc 206

208 <400>

209 <2> 14 <211> 2127 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Sekwencja sygnałowa IL-17RA oraz egzon 1 IL-17RA i egzony 2-16 ludzkiego IL-17RC oraz Fc <400>

210 <2> 146 <211> 709 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Sekwencja sygnałowa IL-17RA oraz egzon 1 IL-17RA i egzony 2-16 ludzkiego IL-17RC oraz Fc <400>

211 2

212 <2> 147 <211> 2094 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Sekwencja sygnałowa IL-17RC oraz egzony 1-16 IL-17RCx4 z podstawieniami Cys194Ser i Cys202Ser oraz egzony 2-16 ludzkiego IL-17RC oraz Fc <400> <2> 148 <211> 698 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Sekwencja sygnałowa IL-17RC oraz egzony 1-16 IL-17RCx4 z podstawieniami Cys194Ser i Cys202Ser oraz egzony 2-16 ludzkiego IL-17RC oraz Fc 211

213 <400>

214 <2> 149 <211> 2061 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Sekwencja sygnałowa IL-17RC oraz egzony 1-6 i 8-16 IL-17RC z linkerem GlyGlyGlySer pomiędzy egzonami 6 i 8, oraz Fc 213

215 <400> 149 <2> <211> 687 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Sekwencja sygnałowa IL-17RC oraz egzony 1-6 i 8-16 IL-17RC z linkerem GlyGlyGlySer pomiędzy egzonami 6 i 8, oraz Fc <400> 214

216 21

217 <2> 11 <211> 2094 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> otpa pre-prosekwencja sygnałowa oraz egzony 1-6 i 8-16 IL-17RC z podstawieniem Leu21Ala, oraz Fc <400> 11 1 <2> 12 <211> 698 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> otpa pre-prosekwencja sygnałowa oraz egzony 1-6 and 8-16 IL-17RC z podstawieniem Leu21Ala, oraz Fc 216

218 <400>

219 <2> 13 <211> 2097 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Egzony 1-6 i 8-16 IL17RC z podstawieniami Ser21Thr i Ser228Thr 218

220 <400> 13 <2> 14 <211> 698 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Egzony 1-6 i 6-16 IL17RC z podstawieniami Ser21Thr i Ser228Thr oraz Fc <400>

221 220

222 <2> 1 <211> 2094 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Egzony 1-6 i 8-16 IL17RC z podstawieniami Ser na Thr w resztach 120, 21, 228, 374 i 408 oraz Fc <400> 1 1 <2> 16 <211> 698 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Egzony 1-6 i 8-16 IL17RC z podstawieniami Ser na Thr w resztach 120, 21, 228, 374 i 408 oraz Fc 221

223 <400>

224 <2> 17 <211> 2070 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Sekwencja sygnałowa IL-17RA oraz egzony 1-6 IL-17RA i egzony 8-16 IL-17RC oraz Fc <400>

225 <2> 18 <211> 690 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Sekwencja sygnałowa IL-17RA oraz egzony 1-6 IL-17RA i egzony 8-16 IL-17RC oraz Fc <400>

226 22

227 <2> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Domena 1 <400> 19 1 <2> 160 <211> 84 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Domena 1 <400> <2> 161 <211> 282 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Domena 2 <400> <2> 162 <211> 94 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Domena 2 <400> <2> 163 <211> 231 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja 226

228 <223> Domena 3 <400> 163 <2> 164 <211> 77 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Domena 3 <400> <2> 16 <211> 2124 <212> DNA <213> homo sapiens <400> <2> 166 <211> 707 <212> PRT <213> homo sapiens 227

229 <400>

230 <2> 167 <211> 3120 <212> DNA <213> homo sapiens <400>

231 <2> 168 <211> 78 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy ludzkiego hormonu wzrostu <221> CDS <222> (1)...(78) <400> <2> 169 <211> 26 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy ludzkiego hormonu wzrostu <400> <2> 170 <211> 7 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy regionu zmiennego łańcucha cięzkiego immunoglobuliny mysiej (VH 26-) 230

232 <221> CDS <222> (1)...(7) <400> 170 <2> 171 <211> 19 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy regionu zmiennego łańcucha cięzkiego immunoglobuliny mysiej (VH 26-) <400> <2> 172 <211> 48 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy ludzkiego CD33 <221> CDS <222> (1)...(48) <400> <2> 173 <211> 16 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Peptyd sygnałowy ludzkiego CD33 <400> <2> 174 <211> 696 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Region stały łańcucha cięzkiego immunogloguliny Fc <221> CDS <222> (0)...(696) 231

233 <400> 174 <2> 17 <211> 232 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Region stały łańcucha cięzkiego immunogloguliny 232

234 <400> 17 <2> 176 <211> 60 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> linker <221> CDS <222> (1)...(60) <400> <2> 177 <211> 20 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> linker <400> <2> 178 <211> 3 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja 233

235 <223> pre-prosekwencja sygnałowa z otpa <400> 178 <2> 179 <211> 696 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Region stały łańcucha cięzkiego immunogloguliny Fc <221> CDS <222> (1)...(696) <400>

236 <2> 180 <211> 232 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223> Region stały łańcucha cięzkiego immunogloguliny Fc <400> <2> 181 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja 23

237 <223> Peptyd sygnałowy mysigo IL-17RA <400> Zastrzeżenia patentowe 1. Izolowany rozpuszczalny polipeptyd zawierający egzony 8-16 IL-17RC (reszty aminokwasowe z SEKW. Nr ID: 2) i egzony 1-6 IL-17RA, przy czym rozpuszczalny polipeptyd swoiście wiąże się z IL-17A i IL-17F. 2. Izolowany rozpuszczalny polipeptyd według zastrz. 1, który zawiera reszty aminokwasowe 1-48 z SEKW. NR ID: Izolowany rozpuszczalny polipeptyd według zastrz. 2, który zawiera sekwencję SEKW. Nr ID: Izolowany rozpuszczalny polipeptyd według zastrz. 2, który składa się z reszt aminokwasowych 1-48 z SEKW. Nr ID: 18.. Izolowany rozpuszczalny polipeptyd według zastrz. 3, który składa się z sekwencji SEKW. Nr ID: Izolowany rozpuszczalny polipeptyd według zastrz. 1, który zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEKW. Nr ID: 72 i SEKW. Nr ID: Cząsteczka izolowanego kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd według dowolnego z zastrz Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 7, która zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEKW. NR ID: Wektor ekspresyjny zawierający następujące funkcjonalnie połączone elementy: a) promotor transkrypcji b) segment DNA kodujący polipeptyd według dowolnego z zastrz. 1-6; oraz c) terminator transkrypcji..izolowana komórka, do której wprowadzono wektor ekspresyjny według zastrz. 9, wyrażająca polipeptyd kodowany przez segment DNA. 11.Sposób wytwarzania polipeptydu obejmujący: a) hodowanie komórki, do której wprowadzono wektor ekspresyjny według zastrz. 9, przy czym wspomniana komórka wyraża polipeptyd kodowany przez segment DNA; oraz b) odzyskiwanie wyrażanego polipeptydu. 12.Sposób według zatrz. 11, w którym komórka jest komórką eukariotyczną, a wyrażany polipeptyd jest wydzielany przez wspomnianą komórkę. 13.Sposób według zastrz. 11 lub 12, w którym kodowany polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEKW. NR ID: 18 lub reszty 1-48 z SEKW Izolowany polipeptyd według dowolnego zastrz. 1-6, który jest dodatkowo pegylowany. 1.Rozpuszczalny polipeptyd według dowolnego zastrz. 1-6 do zmniejszania lub hamowania u ssaka zapalenia wywołanego albo przez IL-17A albo IL-17F. 16.Rozpuszczalny polipeptyd według dowolnego zastrz. 1-6 do zmniejszania u ssaka zapalenia wywołanego przez IL-17A i IL-17F. 17.Zastosowanie rozpuszczalnego polipeptydu według dowolnego zastrz. 1-6 do wytwarzania leku do leczenia ssaka dotkniętego chorobą o charakterze zapalnym, w której IL-17A i/lub IL-17F odgrywają rolę. 236

238 Zastosowanie według zastrz. 17, w którym choroba została wybrana z grupy składającej się z przewlekłej choroby zapalne, choroby zapalnej o ostrym przebiegu i choroby autoimmunologicznej oraz przewlekłej choroby zapalnej dróg oddechowych. 19.Zastosowanie według zastrz. 18, w którym choroba jest przewlekłą chorobą zapalną wybraną z grupy składającej się z nieswoistego zapalenia jelit, wrzodziejącego zapalenia okrężnicy, choroby Leśniowskiego-Crohna, zapalenia stawów i łuszczycy. 20.Zastosowanie według zastrz. 18, w którym choroba jest chorobą autoimmunologiczną wybraną z grupy składającej się ze stwardnienia rozsianego, reumatoidalnego zapalenia stawów i nieswoistego zapalenia jelit (IBD). 21.Zastosowanie według zastrz. 18, w którym choroba jest przewlekłą chorobą zapalną dróg oddechowych wybraną z grupy składającej się z astmy, przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) i mukowiscydozy. 22.Zastosowanie według zastrz. 17, w którym choroba została wybrana z grupy składającej się z łuszczycy, reumatoidalnego zapalenia stawów, zapalenia kości i stawów, wrzodziejącego zapalenia jelita grubego, choroby Leśniowskiego-Crohna, zespołu nadwrażliwości jelita (IBS), kontaktowego zapalenia skóry, stwardnienia rozsianego (SM), odrzucenia przeszczepu, astmy, przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP), mukowiscydozy i astmy alergicznej. 23.Zastosowanie dowolnego zastrz , w którym rozpuszczalny polipeptyd jest polipeptydem wytwarzanym sposobem według zastrz

239 Sekwencja sygnałowa Egzon 1 Egzon 2 Egzon 3 1 Egzon 4 Egzon Egzon 6 20 Egzon 7 (usuniety) Egzon 8 2 Egzon 9 30 Egzon 3 Egzon 11 Fig. 1A

240 Sekwencja sygnałowa Egzon 1 Egzon 2 Egzon 3 Egzon 4 Egzon Egzon 6 Egzon 7 Egzon 8 Egzon 9 Egzon Fig. 1B 239

241 Sekwencja sygnałowa Egzon 1 Egzon 2 Egzon 3 Egzon 4 Egzon Egzon 6 Egzon 7 Egzon 8 Egzon 9 Egzon Fig. 2A 240

242 Egzon 11 Egzon 12 Egzon 13 Egzon 14 Egzon 1 Egzon 16 Egzon 18 Egzon 17 Egzon 19 Fig. 2B 241

243 Sekwencja sygnałowa Egzon 1 Egzon 2 Egzon 3 Egzon 4 Egzon Egzon 6 Egzon 7 Egzon 8 Egzon 9 Egzon Fig

244 Sekwencja sygnałowa Egzon 1 Egzon 2 Egzon 3 Egzon 4 Egzon Egzon 6 Egzon 8 Egzon 9 Egzon Egzon 11 Fig. 4A 243

245 Egzon 12 Egzon 13 Egzon 14 Egzon 1 Egzon 16 Fig. 4B 244

246 Kompetycyjne wiązanie hil-17f do komórek BHK/hIL-17RCx4 odniesienie standardowe Procentowe wiązanie µg/ml rozpuszczalny receptor brak liganda Fig. 24

247 Odnośniki cytowane w opisie Poniższa lista cytowanych przez zgłaszającego odnośników ma na celu wyłącznie pomoc dla czytającego i nie stanowi części dokumentu patentu europejskiego. Mimo, że dołożono największej staranności przy jej tworzeniu, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń i EUP nie ponosi żadnej odpowiedzialności w tym względzie. Dokumenty patentowe cytowane w opisie Literatura niepatentowa cytowana w opisie 246

248 247

249 248

250 249

251 20