cynaryny, luteoliny w osoczu.

Transkrypt

1 PRACE ORYGINALNE Maksymilian KULZA 1 Katarzyna MALINOWSKA 1 Anna WOŹNIAK 1 Monika SEŃCZUK-PRZYBYŁOWSKA 1 Gerard NOWAK 2 Ewa FLOREK 1 Opracowanie i walidacja metody oznaczania cynaryny, luteoliny w osoczu. Development and validation of method for the determination of cynarin, luteolin in plasma 1 Laboratorium Badań Środowiskowych, Katedra i Zakład Toksykologii, im. Karola Marcinkowskiego, Poznań Kierownik Laboratorium: Prof. dr hab. Ewa Florek 2 Katedra i Zakład Naturalnych Surowców Leczniczych i Kosmetycznych im. Karola Marcinkowskiego, Poznań Kierownik: Prof. dr hab. Gerard Nowak Dodatkowe słowa kluczowe: cynaryna luteolina osocze wysokosprawna chromatografia cieczowa walidacja Additional key words: cynarin luteolin plasma high-performance liquid chromatography validation Adres do korespondencji: Adres do korespondencji: dr n. farm. Maksymilian Kulza Laboratorium Badań Środowiskowych, Katedra i Zakład Toksykologii, im. Karola Marcinkowskiego ul. Dojazd 30, Poznań Tel./faks: mkulza@ump.edu.pl Celem przedstawionej pracy było opracowanie i walidacja metody oznaczania cynaryny i luteoliny, głównych związków czynnych ekstraktu z liści karczocha (Cynara scolymus L.) w osoczu. Do oznaczenia związków czynnych z liści karczocha wykorzystano technikę wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detektorem z matrycą diodową (HPLC-DAD). Oznaczenie było poprzedzone ekstrakcją badanych związków z osocza przy pomocy octanu etylu. Rozdziału dokonano na kolumnie C 18, przy użyciu elucji w układzie gradientowym stosując rozpuszczalniki: 0,05% wodny roztwór kwasu trifluorooctowego oraz metanol. Detekcji dokonywano przy długości fali λ=330 nm. Walidacja metody oparta była o wyznaczenie liniowości, granicy wykrywalności i oznaczalności oraz powtarzalności wyników a także odzysku metody. W opracowanej metodzie uzyskano liniowość w zakresie stężeń 1, ,0 µg/cm 3 dla cynaryny (R2=0,9989) i 1, ,0 µg/cm 3 dla luteoliny (R2=0,998). Granice wykrywalności cynaryny i luteoliny wynosiły odpowiednio: 0,75 µg/cm 3 i 0,1 µg/cm 3, natomiast granice oznaczalności: 2,25 µg/cm 3 i 0,2 µg/cm 3. Współczynnik zmienności dla pomiarów w tym samym dniu oraz pomiędzy dniami określający powtarzalność nie przekraczał 10%. Odzysk metody dla cynaryny i luteoliny to kolejno: 67% i 96%. Sprawdzenia przydatności metody dokonano na próbkach osocza szczurów, którym podawano ekstrakt z liści karczocha doustnie i dootrzewnowo w dawce 3 g/kg lub czyste związki dootrzewnowo, luteolinę w dawce 1 mg/kg i cynarynę w dawce 0,5 mg/kg. Obecność oznaczanych substancji stwierdzono w próbkach jedynie po podaniu czystych związków. Opracowana metoda pozwala na jednoczesne oznaczenie cynaryny i luteoliny, po podaniu dootrzewnowym czystych substancji. The aim of this study was to develop and validate the method of cynarin and luteolin, the main constituents of artichoke (Cynara scolymus L.) leaf extract, determination in plasma. The compounds were separated using the high-performance liquid chromatography technique with diode array detection (HPLC-DAD). The analysis was preceded by liquid-liquid extraction using as the extracting agent ethyl acetate. The HPLC separation was performed on C18 column under gradient conditions using a mobile phase 0,05% trifluoroacetic acid in water and methanol. The detector was set at λ=330 nm. The validation was related to linearity, sensitivity (LOD and LOQ), accuracy and repeatability. In the validated method the linearity was achieved within concentration range 1, ,0 µg/cm 3 for the cynarin (R2=0,9989) and 1, ,0 µg/cm 3 for the luteolin (R2=0998). The limits of detection for cynarin and luteolin was: 0,75 µg/cm 3 and 0,1 µg/cm 3 and the limits of quatification: 2,25 µg/cm 3 and 0,2 µg/cm 3, respectively. Coefficient of variation for the inter-day and the intra-day analysis, which is a precision and accuracy parameter, do not exceed 10%. Recovery was 67% for the cynarin and 96% for the luteolin. The practical application of this method was proved by analysis of plasma samples from rats. The animals were administrated artichoke leaf extract orally and intraperitoneally at a dose of 3 g/kg body weight or pure substances intraperitoneally at a dose 1 mg/kg of luteolin and 0,5 mg/kg of cynarin. The presence of investigated compounds was proved only in samples after intraperitoneal administration of pure substances. The developed method is used to determine simultaneously cynarin and luteolin, after intraperitoneal administration of pure compounds. 987

2 Wstęp Po wielu latach marginalizowania znaczenia leku roślinnego i jego skuteczności na korzyść leków syntetycznych, obecnie obserwuje się coraz większe zainteresowanie zarówno badaczy, jak i lekarzy środkami pochodzenia naturalnego. Rozwój takich gałęzi nauki, jak fitochemia czy farmakognozja, umożliwia nam weryfikacje tradycyjnej wiedzy o ziołach oraz poszukiwanie nowych roślin, mogących mieć zastosowanie w lecznictwie. Mnogość związków chemicznych, spotykanych w świecie roślinnym, stanowi potencjalne źródło środków leczniczych na bardzo wiele różnych schorzeń. Jednym z od wieków znanych ze swoich korzystnych właściwości, surowców roślinnych jest karczoch zwyczajny (Cynara scolymus L.). Posiada on wielokierunkowe działanie prozdrowotne. Oprócz najszerzej znanych właściwości ułatwiających trawienie, stosowanych w różnego rodzaju zaburzeniach trawienia, przetwory z karczocha posiadają udowodnione działanie obniżające poziom cholesterolu, hepatoprotekcyjne, przeciwutleniające oraz hipoglikemizujące. Za wszystkie te korzystne profile działania odpowiedzialne są zawarte w roślinie związki czynne należące do dwóch głównych grup: kwasów dikawoilochinowych (cynaryna) i flawonoidów (luteolina). Celem pracy było opracowanie i walidacja metody oznaczania cynaryny i luteoliny, głównych związków czynnych ekstraktu z liści karczocha zwyczajnego (Cynara scolymus L.). Materiał i metody Zgodę na przeprowadzenie badań wydała Lokalna Komisja Etyczna do Spraw Doświadczeń na Zwierzętach w Poznaniu, Uchwała nr 18/2010 z dnia 22 stycznia 2010 roku. Przedmiot badań Do badań użyto sproszkowanego ekstraktu z liści karczocha wyprodukowanego przez Martin Bauer Group w Niemczech, w 2010 roku, o 2,5 % minimalnej zawartości kwasu kawoilochinowego. Materiałem biologicznym do badań (próbki rzeczywiste) była krew (osocze) pobrana od szczurów szczepu Wistar, pochodzących z Hodowli Zwierząt Laboratoryjnych Katedry i Zakładu Toksykologii Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu. Zwierzętom podano doustnie oraz dootrzewnowo ekstrakt z liści karczocha zwyczajnego w dawce 3 g/kg masy ciała oraz dootrzewnowo czyste związki (cynarynę i luteolinę) w dawkach 1 mg/kg luteoliny i 0,5 mg/kg cynaryny. Zwierzęta znieczulano (podanie domięśniowe) ketaminą z ksylazyną w dawce 40 mg/kg + 5 mg/kg. Próbki krwi z serca pobierane były po 10 minutach po podaniu doustnym i po 15 minutach w przypadku podania dootrzewnowego. Krew pobraną z serca umieszczono w probówkach heparynizowanych i mieszano. Następnie wirowano przez 10 minut, przy 3000 obrotach/minutę, po czym pobierano osocze i zamrażano w temperaturze - 80 C do momentu wykonania oznaczeń. Zasada metody Cynarynę i luteolinę w osoczu oznaczano metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detektorem z matrycą fotodiodową (HPLC-DAD). Analizę poprzedzono ekstrakcją badanych związków z osocza, wykorzystując technikę ciecz-ciecz. W badaniach wykorzystano Chromatograf Agilent Technologies 1200 SL z degazerem próżniowym, pompą czterodrożną, autosamplerem, termostatem i detektorem diodowym. Do rozdziału cynaryny i luteoliny zastosowano kolumnę C18 Allsphere ODS-2 o długości 250 mm zaopatrzoną w prekolumnę Eclipse XDB-C18 o długości 12,5 mm w celu ograniczenia napływu zanieczyszczeń na główną kolumnę. Zastosowano elucję w układzie gradientowym z liniową zmianą składu fazy ruchomej od 10% do 90% metanolu w ciagu 15 minut a następnie powrót do warunków wyjściowych w ciągu 5 minut i kondycjonowanie kolumny przez kolejne 6 minut. Warunki analizy chromatograficznej W trakcie pracy chromatografu ustalono ciśnienie maksymalne na 300 bar, przepływ fazy ruchomej był stały i wynosił 1 ml/min. Temperatura termostatu kolumny chromatograficznej wynosiła 20 C. Objętość próbki nastrzykiwana na kolumnę wynosiła 20 µl, szybkość pobierania próbki z fiolki wynosiła 300 µl/min, natomiast szybkość nastrzyku 500 µl/min. Długość fali λ=330 nm, przy której dokonywano pomiaru absorbancji ustalono na podstawie literatury Rycina 1 Widmo UV cynaryny. UV spectra of cinarine. Rycina 2 Widmo UV luteoliny. UV spectra of lutoline. [Hausler et al., 2002] oraz doświadczalnie na podstawie widm substancji wzorcowych wykreślonych w zakresie od λ=190 nm do λ=400 nm (Ryc.1-2). Ekstrakcja cynaryny i luteoliny z osocza Rozpuszczalnikiem zastosowanym do ekstrakcji badanych związków z osocza był octan etylu, środowisko ekstrakcji zostało ustalone na lekko kwaśne (ph=5-6), uzyskiwane za pomocą buforu octanowego o ph=4. Do 200 µl osocza badanego lub osocza obciążonego znaną ilością substancji badanych, dodawano 300 µl buforu octanowego, po wytrząsaniu na Micro-shakerze przez 10 sekund, dodawano 3 ml octanu etylu i ekstrahowano przez 15 minut. Próbki wirowano przez 10 minut stosując 5000 obrotów/min. Pobierano 2 ml fazy organicznej i odparowywano do sucha w strumieniu azotu, w temperaturze 40 C. Suchą pozostałość rozpuszczano w 100 µl metanolu i poddawano analizie chromatograficznej w wyżej wymienionych warunkach. Walidacja metody oznaczenia Liniowość metody Przeprowadzono trzy serie pomiarowe dla 6 różnych stężeń (1,56; 3,125; 6,25; 12,50; 25,00; 50,00 µg/cm 3 ) w przypadku cynaryny oraz 8 różnych stężeń (1,56; 3,125; 6,25; 12,50; 25,00; 50,00; 100,00; 988 M. Kulza i wsp.

3 200,00 µg/cm 3 ) dla luteoliny. Na podstawie wyników wykreślono krzywe kalibracyjne, jako zależność stężenia badanego związku od pola powierzchni piku chromatograficznego, dla cynaryny w zakresie stężeń 1, ,0 µg/cm 3, natomiast dla luteoliny w zakresie stężeń 1, ,0 µg/cm 3. Granica wykrywalności (LOD) i oznaczalności (LOQ) Wyznaczenia granicy wykrywalności dokonano na podstawie oznaczenia różnych stężeń cynaryny i luteoliny. Granice wykrywalności i oznaczalności określono doświadczalnie na podstawie stosunku sygnału do szumu (s/n = 3 dla LOD oraz s/n = 10 dla LOQ). Powtarzalność metody oznaczania Powtarzalność w ciągu dnia Powtarzalność badano dla dwóch różnych stężeń badanych związków. W przypadku cynaryny były to stężenia 40 µg/cm 3 i 10 µg/cm 3, dla luteoliny stężenia 100 µg/cm 3 i 10 µg/cm 3. Wykonano w ciągu jednego dnia 12 elementową serię pomiarową. Powtarzalność pomiędzy dniami Powtarzalność pomiędzy dniami dla cynaryny i luteoliny badano na takich samych stężeniach, jak powtarzalność w ciągu dnia. Wykonano 12 elementowe serie w odstępie dwóch dni. Odzysk metody Odzysk cynaryny i luteoliny badany był poprzez oznaczenie badanych związków w roztworze metanolowym, wprowadzonych na kolumnę z pominięciem ekstrakcji, dla stężeń 40 µg/cm 3 i 10 µg/cm 3 w przypadku cynaryny oraz 100 µg/cm 3 i 10 µg/ cm 3 dla luteoliny i porównanie z wynikami otrzymanymi dla tych samych stężeń ekstrahowanych z osocza. W obliczeniach uwzględniono stopień zagęszczenia prób w wyniku ekstrakcji. Wyniki Rozdział chromatograficzny cynaryny i luteoliny Pierwszym etapem badań było ustalenia optymalnych warunków rozdziału badanych substancji z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Badania przeprowadzono z zastosowaniem wzorców cynaryny i luteoliny rozpuszczonych w metanolu. Dla cynaryny otrzymano czas retencji 9,56 min., dla luteoliny 15,13 min. (Rycina 3). Wyniki wskazują na odpowiednie rozdzielenie badanych substancji w dobranych warunkach analizy. Następnie wykonano oznaczenie osocza szczurzego obciążonego substancjami badanymi (Rycina 4). Potwierdzono odpowiedni dobór warunków analizy chromatograficznej do pełnego rozdzielenia badanych związków chemicznych. Walidacja metody oznaczenia cynaryny i luteoliny Wykonanie krzywych kalibracyjnych dla oznaczanych związków Na podstawie trzech pomiarów każdego z punktów krzywej wzorcowej, dla cynaryny w zakresie stężeń 1, ,0 µg/cm 3, oraz luteoliny w zakresie stężeń 1, ,0 µg/cm 3, wykreślono krzywe kalibracyjne przedstawione na rycinach 5 i 6. Krzywą kalibracyjną dla cynaryny opisywało równanie: y = 0,6754x + 1,7242; R = 0,999; R2 = 0,999, dla luteoliny: y = 0,0472x + 0,9028; R = 0,999; R2 = 0,998. Granica wykrywalności (LOD) i oznaczalności (LOQ) Wyznaczone na podstawie stosunku sygnału do szumu granice wykrywalności i oznaczalności wynosiły odpowiednio 0,75 µg/cm 3 i 2,25 µg/cm 3 dla cynaryny i 0,1 µg/ cm 3 oraz 0,2 µg/cm 3 dla luteoliny Powtarzalność metody Powtarzalność w ciągu dnia W przypadkach obu związków współczynniki zmienności w ciągu dnia (CV%) prób w wysokich oraz w niskich stężeniach wynosiły odpowiednio 3,53% i 6,29% dla cynaryny oraz 9,00% i 6,52% dla luteoliny. Powtarzalność pomiędzy dniami W przypadkach obu związków współczynniki zmienności pomiędzy dniami (CV%) prób w wysokich oraz w niskich stężeniach wynosiły odpowiednio 4,82% i 7,44% dla cynaryny oraz 8,75% i 7,27% dla luteoliny. Odzysk metody Odzysk metody wynosił 67% dla cynaryny i 96% dla luteoliny Oznaczanie cynaryny i luteoliny w próbach rzeczywistych W celu weryfikacji przydatności opracowanej metody oznaczania cynaryny i luteoliny w materiale biologicznym przeprowadzono próby na osoczu szczurzym. Zwierzętom podano ekstrakt z liści karczocha dootrzewnowo i doustnie w dawce 3 g/kg oraz czyste substancje dootrzewnowo w dawkach: cynaryna 0,5 mg/kg i luteolina 1 mg/kg. Stwierdzono obecność badanych związków jedynie w osoczu szczura, któremu podawane były dootrzewnowo czyste substancje. Na rycinach przedstawiono chromatogramy czystego osocza (Ryc. 7) oraz osocza, w którym wykryto obecność Badanie prób rzeczywistych W badaniach własnych wykorzystano osocze zwierząt, którym podano dootrzewnowo ekstrakt z liści karczocha w dawce 3 g/kg masy ciała; dootrzewnowo czyste związki cynaryna, luteolina w dawkach: 1mg/kg luteoliny i 0,5 mg/kg cynaryny; doustnie ekstrakt z liści karczocha w dawce 3 g/kg masy ciała. Próbki osocza zostały poddane postępowaniu analitycznemu przedstawionemu powyżej. Rycina 3 Chromatogram roztworu cynaryny i luteoliny w metanolu. Chrmatogram of cinarine and luteolin standard solution. Rycina 4 Chromatogram osocza obciążonego cynaryną i luteoliną. Chromatogram of plasma with standard solution of cinarine and luteoline. 989

4 Rycina 5 Wykres krzywej kalibracyjnej dla cynaryny. Cinarine calibration curve. Rycina 6 Wykres krzywej kalibracyjnej dla luteoliny. Luteoline calibration curve. Rycina 7 Chromatogram czystego osocza. Chromatogram of blank plasma sample. Rycina 8 Chromatogram osocza po podaniu dootrzewnowym cynaryny i luteoliny. Chromatogram of plasma after intraperitoneally administration of cinarine and luteoline. cynaryny i luteoliny (Rycina 8). Średnia powierzchnia piku po podaniu dootrzewnowym wynosiła 14,3 dla cynaryny i 485,6 w przypadku luteoliny. Korzystając z równania krzywej kalibracyjnej obliczono stężenie badanych związków w osoczu, które wynosiło: cynaryna - 11,38 µg/cm 3, luteolina 23,82 µg/cm 3. Dyskusja Obserwuje się obecnie tendencję do powracania do naturalnych metod leczenia, z wykorzystaniem wiedzy ludowej na temat leku roślinnego oraz do poszukiwania nowych leków w świecie roślinnym. Wszystkie te procesy odbywają się w oparciu o wiedzę naukową i osiągnięcia współczesnej medycyny [7,11]. Intensywnie prowadzone badania nad lekiem roślinnym mają na celu udowodnienie ich działania, poprzez ustalenie mechanizmu, a także określenie interakcji i działań niepożądanych. Obecnie istnieje niewielka grupa leków roślinnych, których skuteczność i bezpieczeństwo stosowania zostały w pełni potwierdzone. Daje to ogromne pole do prowadzenia przyszłych badań [5]. Badania wykonywane w celu opisania modelu działania, parametrów farmakokinetycznych po podaniu leku roślinnego muszą być poprzedzone określeniem, które ze związków czynnych odpowiadają za dane działanie oraz opracowaniem czułej i precyzyjnej metody oznaczania tych związków w materiale biologicznym. Celem niniejszej pracy było opracowanie i walidacja metody oznaczania cynaryny i luteoliny, głównych związków czynnych ekstraktu z liści karczocha zwyczajnego (Cynara scolymus L.) w materiale biologicznym osoczu pobranym od zwierząt doświadczalnych, którym je podano. W tym celu posłużono się techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detektorem z matrycą diodową (HPLC- DAD). W opracowanej metodzie wykorzystano elucję w układzie gradientowym, z zastosowaniem dwóch rozpuszczalników: 0,05% wodnego roztworu kwasu trifluorooctowego i metanolu. Detekcja odbywała się przy długości fali λ=330 nm. Wielu badaczy stosowało odmienne rozpuszczalniki: wodę doprowadzoną do kwaśnego ph, przy pomocy kwasu mrówkowego i acetonitryl [8-10]. Dokonywano pomiaru absorbancji przy kilku różnych długościach fali, jednak najlepsze wyniki otrzymywano w zakresie λ= nm. Inną metodę ekstrakcji cynaryny z materiału biologicznego przedstawili Alonso i wsp. [1]. Autorzy wykorzystali technikę ekstrakcji do fazy stałej, przy użyciu tlenku glinu, stosując przy tym zasadowe środowisko (ph=8,75). Yang i współpracownicy opracowali metodę oznaczania flawonoidów m.in. luteoliny w osoczu kurczaków [13]. Izolacja polegała na mieszaniu próbki osocza z metanolem, odwirowaniu i poddaniu roztworu analizie chromatograficznej. W opracowanej metodzie uzyskano liniowość w zakresie stężeń 1, ,0 µg/cm 3 dla cynaryny (R2=0,9989) i 1, M. Kulza i wsp.

5 200,0 µg/cm 3 w przypadku luteoliny (R2= 0,998). Granice wykrywalności dla cynaryny i luteoliny to odpowiednio 0,75 µg/cm 3 i 0,1 µg/cm 3, natomiast granice oznaczalności 2,25 µg/cm 3 i 0,2 µg/cm 3. Metoda charakteryzowała się dobrą powtarzalnością, współczynnik zmienności (CV%) w przypadku oznaczeń wykonywanych tego samego dnia oraz w różnych dniach nie przekroczył wartości 10%. Odzysk metody kształtował się na poziomie 67% - cynaryna i 96% - luteolina. Hausler i wsp. opisują metodę oznaczania kwasów kawoilochinowych i flawonoidów z użyciem techniki HPLC-DAD [4]. Do analizy zastosowano również wodny roztwór kwasu trifluorooctowego jednak w stężeniu 0,03% oraz acetonitryl zamiast metanolu. Detekcji dokonano również przy długości fali λ=330 nm. Uzyskano w ten sposób liniowość w zakresie stężeń 1,2 1000,0 µg/ cm 3 w przypadku kwasów kawoilochinowych (R2=0,9995) oraz 1,2 100,0 µg/cm 3 dla luteoliny (R2=0,9995). Granica oznaczalności dla wszystkich badanych związków była na tym samym poziomie i wynosiła 0,4 µg/cm 3. Powtarzalność przedstawionej metody była na bardzo wysokim poziomie, CV% nie przekroczył w przypadku żadnego z oznaczanych związków 2%. Otrzymany przez autorów odzysk był bliski wartościom teoretycznym, różnice wynosiły mniej niż 4%. Li i Jiang opracowali metodę HPLC-UV w celu oznaczania luteoliny oraz innego flawonoidu: apigeniny w ludzkim moczu [6]. Uzyskana w tej metodzie liniowość dla luteoliny występowała w zakresie stężeń 0,0975-7,80 µg/cm 3 (R=0,9999). Odzysk metody na poziomie powyżej 85% świadczył o satysfakcjonującej dokładności. Precyzja oznaczeń była na bardzo wysokim poziomie, CV% poniżej 5%. Wyznaczona w pracy granica oznaczalności dla luteoliny wynosiła 39,2 ng/ml. Metodę oznaczania cynaryny w osoczu szczurów z wykorzystaniem techniki HPL- C-UV opracowali Alonso i wsp. [1]. Granicę wykrywalności ustalono na poziomie 0,02 µg/cm 3, natomiast granicę oznaczalności na poziomie 0,038 µg/cm 3. Współczynnik zmienności wykonanych oznaczeń nie przekraczał 5%. Liniowość uzyskano w zakresie stężeń 0,04 1,25 µg/cm 3 (R2=0,9961). Odzysk cynaryny w podanej metodzie wynosił około 70%. W badaniach Alonso i współautorów wykazano, że stężenie maksymalne, po podaniu dożylnym cynaryny rozpuszczonej w soli fizjologicznej w dawce 0,17 mg/kg masy ciała, u szczurów osiągane było po 5 minutach od podania [1]. Natomiast stężenie maksymalne luteoliny, po podaniu doustnym ekstraktu z Chrysanthemum morifolium Ramat. w dawce 102 mg/kg, u psów osiągnięte zostało po 1,5 godzinie [6]. W badaniach własnych w celu sprawdzenia i potwierdzenia przydatności metody na próbach rzeczywistych, wykorzystano osocze szczurów, którym podawano doustnie oraz dootrzewnowo ekstrakt z liści karczocha zwyczajnego w dawce 3 g/kg masy ciała oraz dootrzewnowo czyste związki (cynarynę i luteolinę) w dawkach 1 mg/kg luteoliny i 0,5 mg/kg cynaryny. Próbki krwi pobrano po 10 minutach od podania doustnego i 15 minutach od podania dootrzewnowego. Obecność oznaczanych substancji stwierdzono jedynie w osoczu szczura, któremu podano czyste związki. Alonso i wsp. dowiedli, iż cynaryna ma bardzo krótki biologiczny okres półtrwania i wysoki klirens. Dane te, otrzymane po podaniu dożylnym, wskazywać mogą na istotne mechanizmy metabolizmu wątrobowego. Autorzy sugerują również niską biodostępność badanego związku z możliwym efektem pierwszego przejścia [1]. Wittemer i Veit w eksperymencie podania doustnego ekstraktu z liści karczocha badali obecność w osoczu metabolitów cynaryny: kwasów ferulowego (FA), izoferulowego (IFA), dihydroferulowego (DHFA), kawowego (CA), dihydrokawowego (DHCA) i waniliowego (VA). Oznaczano również luteolinę [12]. Pracę na temat absorpcji i metabolizmu związków czynnych zawartych w karczochu przedstawili Azzini i wsp. [2]. W eksperymencie tym oznaczano u ochotników, po konsumpcji jadalnych części karczocha, takie związki jak: kwas chlorogenowy (CGA), kwas kawowy (CA), kwas dihydrokawowy (DHCA), kwas ferulowy (FA) i dihydroferulowy (DHFA) oraz luteolinę i apigeninę. Obecność CGA, CA i FA zaobserwowano już po 1 godzinie od przyjęcia pokarmu, z zaznaczeniem, że kwasu chlorogenowego nie wykazano w osoczu już po 2 godzinach. Sygnały pochodzące od DHCA i DHFA otrzymano dopiero w próbkach pobranych po kilku godzinach. Niskie stężenia CGA oraz kwasów dikawoilochinowych sugerują, że związki te przechodzą w organizmie biotransformacje. Kwas chlorogenowy i kwasy kawoilochinowe ulegają hydrolizie, stąd wniosek, że uwalnianie ich metabolitów może mieć początek już w jelicie cienkim. Obserwowane rosnące stężenia kwasu kawowego i kwasu ferulowego w osoczu mogą pochodzić właśnie z hydrolizy tych związków. Dodatkowo cząsteczki kwasu chlorogenowego, które w nienaruszonej formie dotrą do jelita grubego są hydrolizowane, przez obecne tam enzymy do różnych kwasów aromatycznych - kwasu kumarowego, pochodnych kwasów fenylopropionowego i benzoesowego [2]. Uwolniony w jelitach kwas kawowy po absorpcji i transporcie do wątroby może ulegać metylacji z wytworzeniem kwasu ferulowego. Przypuszcza się, że mikroflora jelitowa również jest zdolna do metylowania kwasu kawowego z powstaniem kwasu ferulowego i kwasu izoferulowego. Kwas kawowy może również przed absorpcją zostać metabolizowany do kwasu dihydrokawowego, który to po wchłonięciu może w wątrobie ulec metylacji do kwasu dihydroferulowego, a następnie dehydrogenacji z wytworzeniem kwasu ferulowego (te same reakcje mogą zachodzić również w jelicie grubym). Fakty te dowodzą, że jelita mogą być główną lokalizacją metabolizmu kwasów kawoilochinowych pochodzących z Cynara scolymus L. [2]. W cytowanej pracy nie wykazano obecności w osoczu luteoliny i apigeniny. Ich brak w ilościach, które można by poddać oznaczeniu wynika z ich niewielkiej zawartości w testowanym pożywieniu lub ich niskiej biodostępności [2]. Niska biodostępność luteoliny oraz sposób jej zwiększenia były obiektem badań wykonanych przez Chen a i wsp. [3]. Monitorowanie stężenia cynaryny i luteoliny po doustnym lub dootrzewnowym podaniu ekstraktu z liści karczocha zwyczajnego, wymaga dalszych modyfikacji w celu zwiększenia czułości lub wprowadzenia do oznaczenia substancji będących metabolitami kwasów kawoilochinowych ewentualnie zmiany czasu po którym pobierane są próby do badań. Jednak w świetle przedstawionych wyników metoda opracowana w niniejszej pracy nadaje się do zastosowania jej do oznaczania związków czynnych po podaniu dootrzewnowym. Wykorzystanie łatwo dostępnych odczynników, popularnej kolumny chromatograficznej a także krótki czas analizy, brak interferencji z fizjologicznymi składnikami osocza zwierząt czyni metodę łatwą do zastosowania w wielu badaniach naukowych lub klinicznych. Dodatkowo metoda może zostać w łatwy sposób zaadoptowana do oznaczeń związków czynnych w materiale roślinnym lub ekstrakcie z liści karczocha zwyczajnego. Piśmiennictwo 1. Alonso M.R., Garcia M.C., Bonelli C.G. et al.: Validated HPLC method for cynarin determination in biological samples. Acta Farm. Bonaerense 2006, 25, Azzini E., Bugianesi R., Romano F. et al.: Absorption and metabolism of bioactive molecules after oral consumption of cooked edible heads of Cynara scolymus L. (cultivar Violetto di Provenza) in human subjects: a pilot study. Br. J. Nutr. 2007, 97, Chen X., Liu L., Sun Z. et al.: Pharmacokinetics of luteolin and tetra-acetyl-luteolin assayed by HPLC in rats after oral administration. Biomed. Chromatogr. 2010, 24, Hausler M., Ganzera M., Abel G. et al.: Determination of caffeoylquinic acids and flavonoids in Cynara scolymus L. by high performance liquid chromatography. Chromatographia 2002, 56, Krauze-Baranowska M., Bet M.: Badania kliniczne leczniczych produktów roślinnych. Panacea 2010, 32, Li L., Jiang H., Wu H., Zeng S.: Simultaneous determination of luteolin and apigenin in dog plasma by RP-HPLC. J. Pharm. Biom. Anal. 2005, 37, Lutomski J.: Znaczenie ziół w terapii i dietetyce. Postępy Fitoterapii 2001, 2-3, Mulinacci N., Prucher D., Peruzzi M. et al.: Commercial and laboratory extracts from artichoke leaves: estimation of caffeoyl esters and flavonoidic compounds content. J. Pharm. Biom. Anal. 2004, 34, Pinelli P., Agostini F., Comino C. et al.: Simultaneous quantification of caffeoyl esters and flavonoids in wild and cultivated cardoon leaves. Food Chem. 2007, 105, Romani A., Pinelli P., Cantini C. et al.: Characterization of Violetto di Toscana, a typical Italian variety of artichoke (Cynara scolymus L.). Food Chem. 2006, 95, Strzelecka H.: Lek roślinny stan obecny i perspektywy rozwoju. Panacea 2002, 11-13, Wittemer S.M., Veit M.: Validated method for the determination of six metabolites derived from artichoke leaf extract in human plasma by high-performance liquid chromatography coulometric-array detection. J. Chromatogr. B. 2003, 793, Yang G.J., Liu P., Qu X.L. et al.: The simultaneous separation and determination of six flavonoids and troxerutin in rat urine and chicken plasma by reversed-phase high-performance liquid chromatography with ultraviolet-visible detection. J. Chromatogr. B. 2007, 856,