Prof. dr hab. inż. M. Kamiński 2006/7 Katedra Chemii Analitycznej Wydział Chemiczny PG. Ćwiczenie: LC / GC. Instrukcja ogólna

Transkrypt

1 Prof. dr hab. inż. M. Kamiński 2006/7 Katedra Chemii Analitycznej Wydział Chemiczny PG Przedmiot: Chemia analityczna Instrukcje ćwiczeń laboratoryjnych Ćwiczenie: LC / GC Instrukcja ogólna Uzupełniający dobór warunków rozdzielania, oznaczenie zawartości wskazanych analitów w próbkach mieszanin substancji organicznych z zastosowaniem kolumnowej chromatografii cieczowej / gazowej Cel ćwiczenia: Nabycie podstawowych umiejętności oraz doświadczenia w zakresie doboru optymalnych warunków wykorzystania w praktyce kolumnowej chromatografii gazowej (KGC) / wysokosprawnej kolumnowej chromatografii cieczowej (HPLC) do rozwiązania zadania analitycznego, tzn., do rozdzielania i oznaczania składników mieszanin związków chemicznych, z wykorzystaniem w przypadku GC - metodyki wzorca wewnętrznego / normalizacji ze współczynnikami korekcyjnymi, a w przypadku HPLC - metodyki krzywej kalibracyjnej / dodatku wzorca. Aparatura, wyposażenie, dane pomocnicze Każda 2-3 osobowa podgrupa otrzymuje do dyspozycji na czas ćwiczenia aparat chromatograficzny o podstawowej konfiguracji modułów składowych, zawierający co najmniej - moduł zasilania kolumny eluentem (gazem nośnym o określonej, regulowanej temperaturze / cieczą o określonym składzie), z możliwością regulacji prędkości przepływu eluentu w kolumnie, dozownik membranowy (aparaty GC i niektóre aparaty HPLC), dozownik zaworowy z pętlą o znanej pojemności (pozostałe aparaty HPLC), kolumnę, termostat kolumny / dozownika / detektora aparaty do GC, detektor / detektory (detektor płomieniowo jonizacyjny (FID), termo - konduktometryczny (TCD) chromatografy gazowe, albo w przepływowy detektor fotoabsorpcjometrycznym (fotometryczny) w zakresie nadfioletu z niskociśnieniową lampą rtęciową (UV-254) i niekiedy, różnicowy detektor refraktometryczny (RID) - aparaty do HPLC. Każdy aparat zawiera, albo rejestrator Y-t (pomiar napięciowego sygnału detektora), albo/i integrator mierzący powierzchnię / wysokość pików chromatograficznych. Każde stanowisko analityczne jest wyposażone w określony gaz nośny / eluent o znanym, niekoniecznie optymalnym, składzie. W strzykawkę do dozowania próbki, pipety i kolby miarowe do wykonywania rozcieńczeń oraz mieszaninę kalibracyjną matka o znanych stężeniach wszystkich komponentów oraz o podanym składzie rozpuszczalnika. Przebieg ćwiczenia 1. Treść zadania analitycznego, warunki rozdzielania, pokaz czynności podczas wprowadzania próbki, dozowania, dane konieczne do opisu warunków rozdzielania. 1

2 Każda podgrupa otrzymuje zadanie analityczne w postaci mieszaniny określonych substancji, o różnych, nieznanych studentom, stężeniach składników. Niektóre składniki mogą być nieobecne w próbkach poszczególnych zadań analitycznych. W przypadku HPLC - zadanie analityczne jest rozwiązywane z zastosowaniem układu faz odwróconych (RP-HPLC), albo układu faz normalnych (NP-HPLC). W warunkach RP-HPLC fazę stacjonarną stanowi n-oktadekan, związany wiązaniem siloksanowym z powierzchnią żelu krzemionkowego, a eluentem jest mieszanina wody i metanolu (MeOH H2O), albo wody i acetonitrylu (AcCN-H2O). W przypadku układu faz normalnych (NP-HPLC) studenci używają kolumn wypełnionych żelem krzemionkowym (SiO2), albo wypełnionych fazą stacjonarną chemicznie związaną z żelem krzemionkowym fazą stacjonarną typu Diol, CN, NH2, NO2 itp. Elentem jest wówczas mieszanina złożona z takich składników, jak n-heksan, albo n- heptan (bardzo niska siła elucyjna w układzie faz normalnych) i chlorek metylenu (MeCl2), eter metylowo tertbutylowy (MTBE), tetrahydrofuran (THF), dioksan (DX), izopropanol (IsoOH) o różnych zawartościach składnika / składników o wyższej sile elucyjnej. Jednocześnie eluent charakteryzuje się niską (śladową) zawartością wody. Skład fazy ruchomej został wcześniej dobrany przez opracowującego ćwiczenie w odniesieniu do rodzaju fazy stacjonarnej i rozdzielanych substancji, stanowiących zadanie analityczne, m.in. na takiej zasadzie, aby substancje stanowiące zadanie analityczne rozdzielały się w zadowalającym stopniu i w stosunkowo krótkim czasie kilku minut. Jednocześnie zastosowana faza ruchoma zapewnia korzystne warunki detekcji analizowanych substancji. W przypadku chromatografii cieczowej oznaczenie jest wykonywane z zastosowaniem metody krzywej kalibracyjnej, metody punktów ograniczających albo metody dodatku wzorca. W przypadku chromatografii gazowej, do obliczenia zawartości analitu powinna być wykorzystywana metoda wzorca wewnętrznego i metoda normalizacji ze współczynnikami korekcyjnymi. Każdy aparat jest przystosowany do pracy w warunkach izotermicznych i izokratycznych oraz zapewnia możliwość zmiany w szerokim zakresie temperatury kolumny (GC) oraz składu eluentu i natężenia przepływu eluentu (HPLC). Niektóre aparaty są dostosowane do pracy w warunkach elucji gradientowej (programowanie temperatury kolumny w przypadku GC / programowanie składu eluentu w przypadku HPLC), jednak, studenci nie wykorzystują tych możliwości doboru optymalnych warunków rozdzielania podczas ćwiczenia podstawowego. W zamian, do każdego aparatu (stanowiska) załączono chromatogramy, wykonane w różnych warunkach rozdzielania składników mieszaniny stanowiącej zadanie analityczne. Chromatogramy te zostały otrzymane w czasie przygotowania ćwiczenia i stanowią podstawę do określenia przez studentów optymalnego składu eluentu oraz optymalnego natężenia przepływu eluentu. Optymalizacja dotyczy kompromisu między wartością czasu rozdzielania i rozdzielczością pików. Rozdzielczość pików (R / Rs) na poziomie 0.9 przyjmuje się za wystarczającą, nie mającą wpływu na dokładność oznaczania. Na podstawie analizy tych danych podgrupa wybiera optymalne warunki rozdzielania i detekcji oznaczanych składników analitu, a prowadzący ćwiczenie te warunki akceptuje, albo odrzuca. W przypadku odrzucenia, prowadzący żąda dalszej analizy danych i nowej propozycji optymalnych warunków rozdzielania i oznaczania. W przypadku akceptacji laborant, albo prowadzący ustawia zaproponowane przez studentów warunki rozdzielania i detekcji oraz wykonuje pierwsze dozowanie przygotowanej przez studentów pierwszej próbki kalibracyjnej, albo próbki zadania analitycznego, demonstrując sposób pobierania próbki, 2

3 wprowadzania jej do strzykawki i dozownika, poprawny sposób operowania strzykawką, zasadę i sposób wyboru czułości detektora, sposobu oznaczania punktu startu, zwraca uwagę które dane, konieczne do jednoznacznego opisania warunków rozdzielania itp. czynności. 2. Analizy i oznaczenia wykonywane samodzielnie przez studentów Dobór optymalnych warunków rozdzielania i oznaczania na podstawie przebiegu pików na wcześniej uzyskanych chromatogramach oraz pokaz poprawnego sposobu wykonania dozowania i rozdzielania oraz opisu chromatogramu poprzedza badania wykonywane dalej samodzielnie przez każdą podgrupę studentów. Polegają one na samodzielnym wykonaniu kalibracji z zastosowaniem rozcieńczania roztworu matka, przy użyciu eluentu, określeniu granic oznaczalności badanych analitów oraz oznaczenia stężenia składników próbki stanowiącej zadanie analityczne. Kalibracja, określenie granicy oznaczalności i oznaczenie zawartości analitów w próbce stanowiącej zadanie analityczne jest wykonywane wspólnie przez dwu, trzy-osobową grupę studentów. Każda podgrupa przygotowuje zależności kalibracyjne, oddzielnie dla każdego z poszczególnych analitów oraz oddzielnie na podstawie wysokości oraz na podstawie obliczenia orientacyjnej powierzchni pików, tzn., z wykorzystaniem zależności typu: Ci = f ( ki, Si), albo/i Ci = f (Ki, Hi) (1) gdzie: Ci stężenie określonego analitu w próbce dozowanej do kolumny; Si powierzchnia piku analitu o stężeniu Ci, odniesiona do określonej czułości detekcji; Hi - wysokość piku analitu o stężeniu Ci, odniesiona do określonej czułości detekcji; ki, Ki odpowiednie współczynniki kalibracyjne / korekcyjne, odpowiednio: dla metody krzywej kalibracyjnej, wzorca wewnętrznego, normalizacji ze współczynnikami korekcyjnymi, albo metody dodatku wzorca patrz rozdział dotyczący metod obliczania zawartości składników w dowolnym podręczniku chromatografii, np. poz. [1]. Typ funkcji kalibracyjnej wielomian / funkcja liniowa, w zależności od charakteru przebiegu linii kalibracyjnej. W przypadku zmiany czułości detekcji należy nie zapomnieć o uwzględnieniu odpowiednich współczynników przeliczeniowych. Bardzo ważne jest dokładne wykonywanie rozcieńczeń najkorzystniej stosowanie tzw. rozcieńczania na wadze. Rozdzielanie jednej próbki trwa ok. 5 minut. Każda podgrupa może, więc, przygotować wielopunktową krzywą kalibracyjną. Jest to szczególnie zalecane w przypadku wykorzystywania wysokości piku do oznaczania stężeń analitów. Nie należy, jednak, przekraczać 5-ciu punktów kalibracyjnych, wliczając punkt 0/0. Podgrupa wyznacza także orientacyjne wartości granicy oznaczalności każdego analitu (LOQ), na zasadzie: LOQ = 5 x (Amplituda poziomu szumów detektora) (2) gdzie: Amplituda poziomu szumów detektora w: [jednostkach stężenia analitu dozowanego do kolumny] Należy co najmniej trzykrotnie oznaczyć zawartość każdego analitu w otrzymanej próbce zadaniu analitycznym, obliczając ją na podstawie kalibracji przygotowanej przez 3

4 podgrupę. Celowe jest przy tym sprawdzenie, z zastosowaniem testu Q-Dickson a, czy jeden z rezultatów nie powinien zostać odrzucony (na poziome ufności 0.95). W przypadku uzyskania tylko dwóch ważnych oznaczeń, należy podać wartość rozstępu między poszczególnymi rezultatami, traktowaną jako doświadczalna wartość powtarzalności oznaczania. W przypadku uzyskania co najmniej trzech ważnych oznaczeń badanej próbki, należy obliczyć powtarzalność laboratoryjną na podstawie zależności (3): r i = 1.98 Si (3) gdzie: r i powtarzalność laboratoryjna oznaczania analitu i Si odchylenie standardowe pojedynczego oznaczenia analitu i Raport analityczny przygotowują wspólnie wszyscy studenci stanowiący określoną podgrupę. Powinien on zawierać: - opis zasad rozumowania i postępowania dla doboru optymalnych warunków dozowania i rozdzielania składników otrzymanej próbki w zastosowanym układzie chromatograficznym (dobór składu i natężenia przepływu eluentu, rozpuszczalnika, stopnia rozcieńczenia objętości próbki wprowadzanej do pętli zaworu dozującego / kolumny, czułości detektora, szybkości posuwu papieru rejestratora / integratora itp.); - schemat ideowy i parametry techniczne modułów składowych stosowanego aparatu; - metodykę i rezultaty kalibracji, wraz z wartościami współczynników korelacji oraz wnioski dotyczące oceny liniowości przebiegów kalibracyjnych; - wyniki oznaczenia zawartości oznaczonych analitów w otrzymanej próbce; - powtarzalność oznaczania ( r ) i granice oznaczalności (LOQ); - wnioski i uwagi dotyczące przyczyn ewentualnych błędów oznaczania. Do raportu należy załączyć poprawnie opisane przykłady otrzymanych chromatogramów kalibracyjnych i chromatogramów badanej próbki. Raport analityczny powinien zostać przygotowany odręcznie w czasie trwania ćwiczenia. Niedopuszczalne jest stosowanie edytora tekstu. Studenci, którzy nie zdążą przygotować raportu w czasie ćwiczenia, mogą dostarczyć raport w ciągu tygodnia, jednak, przed rozpoczęciem kolejnego ćwiczenia. W przeciwnym razie nie będą mieli możliwości uczestniczyć w kolejnym ćwiczeniu. Warunkiem zaliczenia jest pozytywna ocena raportu podgrupy, dokładne oznaczenie stężenia poszczególnych analitów i poprawne określenie granicy oznaczalności. Dopuszczalny błąd względny oznaczenia wynosi +/- 10 % rzeczywistej zawartości analitu w próbce. W przypadku błędnych rezultatów / błędnego rezultatu, a także w przypadku niezadowalającej treści sprawozdania studenci otrzymują zwrot raportu, w celu sprawdzenia wykonanych obliczeń, albo / i poprawienia / uzupełnienia treści raportu. Ponowne przekroczenie dopuszczalnego błędu, albo dyskwalifikacja treści raportu powoduje konieczność powtórzenia ćwiczenia i wykonania nowego raportu. Literatura, materiały pomocnicze Dowolny podręcznik chromatografii, odpowiednio: gazowej (GC) i cieczowej (HPLC), wydany później, niż w roku 1990, w tym szczególnie: 4

5 - M. Kamiński (ed) Chromatografia Cieczowa, CEEM, Gdańsk, 2002 TLC i HPLC; - Z Witkiewicz, Podstawy chromatografii szczególnie GC, ale także TLC i HPLC. Uwaga! 1. Każdy aparat ma, albo w trakcie trwania ćwiczenia będzie miał uregulowane optymalne parametry pracy (temperatura rozdzielania, objętość dozowania, ciśnienie i prędkość przepływu eluentu, nastawy detektora. Student powinien te parametry pracy zamieścić w raporcie analitycznym - opisie przykładu chromatogramu uzyskanego dla badanej próbki. Powyższe parametry / nastawy można zmienić podczas wykonywania zadania analitycznego, tylko w uzgodnieniu z prowadzącym.!!! 2. W przypadku chromatografii cieczowej ma miejsce stosunkowo wysokie ciśnienie pompowania eluentu (do ok. 350 bar 35 MPa). Jednocześnie, składniki eluentu są cieczami szkodliwymi dla zdrowia, albo toksycznymi. - Obowiązkowe jest stosowanie fartucha, rękawic i okularów ochronnych!!! W przypadku chromatografii gazowej niektóre zewnętrzne moduły aparatu (dozownik, głowica detektora) posiadają wysoką temperaturę (do 350 C). 3. Rozcieńczenia należy wykonywać pod wyciągiem. 4.Podczas wszystkich czynności laboratoryjnych należy zachować szczególną ostrożność; 5