OD HPLC do UPLC. Prof. dr hab. inż. Agata Kot-Wasik. Katedra Chemii Analitycznej Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska

Transkrypt

1 OD HPLC do UPLC Katedra Chemii Analitycznej Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska 1

2 PREHISTORIA 1966 Chromatogram autorstwa L.R.Snyder Analiza chinolin LC-GC North America, 30(4), ,

3 PREHISTORIA

4 HISTORIA

5 HISTORIA

6 DZISIAJ 21 wiek 6

7 DZISIAJ 7

8 UPLC UPLC Utra-Performance Liquid Chromatography UHPLC Ultra-High Performance Liquid Chromatography UHPLC Ultra-High Pressure Liquid Chromatography UPLC Ultra-Price Liquid Chromatography ULTRASPRAWNA / ULTRASZYBKA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA 8

9 UPLC ULTRASPRAWNA / ULTRASZYBKA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA Zwyczajowa nazwa przyjęta dla chromatografii cieczowej z użyciem kolumn o średnicy ziarna wypełnienia < 2µm 9

10 Czas analizy chromatograficznej w warunkach izokratycznych jest określony przez czas retencji ostatniego piku chromatograficznego L HNreq tr = u (1+k) = u (1+k) L długość kolumny u liniowa prędkość przepływu fazy ruchomej H wysokość półki teoretycznej Nreq wymagana ilość półek teoretycznych 10

11 Czas analizy chromatograficznej w warunkach izokratycznych jest określony przez czas retencji ostatniego piku chromatograficznego L HNreq tr = u (1+k) = u (1+k) L długość kolumny u liniowa prędkość przepływu fazy ruchomej H wysokość półki teoretycznej Nreq wymagana ilość półek teoretycznych min 11

12 Czas retencji analitu L HNreq tr = u (1+k) = u (1+k) L długość kolumny u liniowa prędkość przepływu fazy ruchomej H wysokość półki teoretycznej Nreq wymagana ilość półek teoretycznych H h (~2.2) h = dp H = dp Nreq tr ~ 2.2 (1+k) u dp f(dp) f(u) 12

13 13

14 Zwiększenie rozdzielczości Przy zachowaniu długości kolumny chromatograficznej poprzez zmniejszenie średnicy ziarna zwiększa się rozdzielczość 14

15 Zwiększenie rozdzielczości Przy zachowaniu długości kolumny chromatograficznej poprzez zmniejszenie średnicy ziarna zwiększa się rozdzielczość 15

16 Sprawność (liczba półek teoretycznych) Długość kolumny [mm] 5µm 3µm 2µm

17 Nreq tr ~ 2.2 (1+k) u dp Prędkość przepływu fazy ruchomej [cm/sec] Zmniejszenie średnicy ziarna skraca czas analizy Zwiększenie prędkości przepływu fazy ruchomej skraca czas analizy 17

18 Skrócenie czasu analizy 18

19 Skrócenie czasu analizy Zmniejszenie średnicy ziarna wypełnienia Zwiększenie prędkości przepływu fazy ruchomej ciśnienie [ MPa ] p [ bar ] dp [ µm ] 19

20 Pomiędzy HPLC a UPLC Kolumny wypełnione materiałem osadzonym na rdzeniu 20

21 Skrócenie czasu analizy Dostosowanie sprzętu chromatograficznego odporność na wysokie ciśnienia szybkość zbierania danych sygnałów objętość pozakolumnowa 21

22 Dostosowanie sprzętu chromatograficznego Automatyczny podajnik próbek Powinien zapewniać małą objętość martwą Odporność na wysokie ciśnienia Skrócić cykl: pobieranie przemywanie igła w gnieździe podanie próbki overlapping Nastrzyk, 30sec nastrzyk analiza Nastrzyk, 10sec nastrzyk analiza Nastrzyk, 10sec plus overlapping nastrzyk analiza nastrzyk analiza nastrzyk nastrzyk analiza nastrzyk nastrzyk analiza nastrzyk analiza analiza 33 % 44 % analiza 22

23 Dostosowanie sprzętu chromatograficznego Detektor Objętość celi pomiarowej może wpływać na poszerzenie pików chromatograficznych Długa droga światła (10mm, 13µL) Mała transmisja światła duży szum Krótka droga światła (3mm, 2µL) Duża transmisja światła mały szum 23

24 Dostosowanie sprzętu chromatograficznego Wzrost czułości 24

25 Dostosowanie sprzętu chromatograficznego Przetwornik analogowo-cyfrowy Szybkość zbierania danych 25

26 UPLC wybór kolumny Kryterium: CZAS 50mm L Kryterium: ROZDZIELCZOŚĆ 100mm L Zawsze: 2.1mm ID, < 2µm Temperatura: zawsze podwyższona lepkość (ciśnienie) plus kinetyka (czas) 26

27 minut! 27

28 2011 < 4.5 minuty! 28

29 Analiza WWA Analiza białek 1. fluorene 2. phenanthrene 3. anthracene 4. fluoranthene 5. pyrene 6. chrysene 7. benzo(b)fluoranthene 8. benzo(k)fluoranthene 9. benzo(g,h,i)perylene Analiza flawonoidów 1.Myricetin 2. Quercetin 3. Apigenin 4. Kaempferol 5. Baicalein 6. Chrysin 7. Acacetin 29

30 ANALIZA WITAMIN 30

31 ANALIZA DIURETYKÓW acetazolamide, 2. hydrochlorothiazide, 3. hydroflumethiazide, 4. clopamide, 5. trichlormethiazide, 6. indapamide, 7. bendroflumethiazide, 8. spironolactone Warunki chromatograficzne: Kolumna: 30mmL x 2.1mm x1.7 μm ACQUITY UPLC C18; 35 C; Elucja: gradient 9 45% (H2O + 0.1% HCOOH ) / ACN; 0.86 ml/min Detekcja: UV 273nm 31

32 ANALIZA AMINOKWASÓW 32

33 ANALIZA PEPTYDÓW Kolumna C18: 5μm 70 pików Pojemność pików: 143 Kolumna C18: 1.8μm 168 pików Pojemność pików:

34 UPLC SZYBKOŚĆ CZUŁOŚĆ ROZDZIELCZOŚĆ 34

35 Od HPLC do UPLC Lata 70-te 2004r. 10µm, 5µm, 3,5µm 1,7µm 15-25cm L 2-10cm L mm ID 2.1mm ID do 400bar do 1200bar czas analizy 45minut czas analizy 5 minut 35

36 Waters '1964 Waters '

37 PRZYSZŁOŚĆ Sprawność [liczba półek teoretycznych / m] µm µm 1.7µm µm 5µm 10µm Ciśnienie w układzie chromatograficznym [bar] 37