BADANIA WŁAŚCIWOŚCI LIPOFILOWYCH ZWIĄZKÓW PRZECIWUTLENIAJĄCYCH

Transkrypt

1 BADANIA WŁAŚCIWOŚCI LIPOFILOWYCH ZWIĄZKÓW PRZECIWUTLENIAJĄCYCH Katedra Chemii Analitycznej, Wydział Chemiczny Tomasz Chmiel, Agata Kot-Wasik, Jacek Namieśnik Gdańsk

2 Lipofilowość definicja IUPAC* LIPOFILOWOŚĆ właściwość fizykochemiczna wyrażająca powinowactwo cząsteczki lub ugrupowania chemicznego do środowiska lipofilowego. Jest to miara zdolności cząsteczek związku chemicznego do rozpuszczania się w tłuszczach, olejach oraz rozpuszczalnikach niepolarnych. Powinowactwo jest to tendencja cząsteczki do wiązania się z inną Hydrofobowość to asocjacja niepolarnych grup lub cząsteczek w środowisku wodnym, która wynika z tendencji wody do wykluczania cząsteczek niepolarnych. To miara zdolności cząsteczek chemicznych do odpychania od siebie cząsteczek wody. * Wermuth C.G. et al. Glossary of terms used in medicinal chemistry (IUPAC Recommendations 1998), Pure & Appl. Chem. 70 (1998), 1129.

3 Jakie znaczenie ma lipofilowość i dlaczego jej pomiar jest istotny? Bariera krew-mózg Wydalanie z wątroby Wychwytywanie przez wątrobę Wchłanianie jelitowe Substancja czynna (przeciwutleniacz, składnik leku, witamina) Wydzielanie żółci Wydzielanie jelitowe Sekrecja przez nerki Resorpcja jedna z najważniejszych właściwości fizykochemicznych związków biologicznie czynnych wpływających na ich aktywność biologiczną, umożliwia przewidywanie profilu wchłaniania, dystrybucji, metabolizmu i wydalania (tzw. profil ADME), czyli zachowania się substancji w organizmie człowieka po jej podaniu, pozwala określić możliwości wiązania z odpowiednim receptorem, podział substancji między fazę wodą i organiczną może stanowić model podziału in vivo.

4 Lipofilowość jak ilościowo jest wyrażana Lipofilowość (zgodnie z definicją IUPAC) jest opisywana poprzez zjawisko podziału miedzy dwie niemieszające się fazy, zarówno w układzie ciecz-ciecz (np. octanol/woda) jak i ciało stałe/ciecz (metody chromatograficzne). Ilościowo lipofilowość jest wyrażana jako współczynnik podziału (P). Współczynnik podziału stosunek stężeń substancji w fazie niepolarnej (organicznej) i polarnej (głównie wodnej) w stanie równowagi. Wyrażany zazwyczaj w skali logarytmicznej (log P). [B oct ] stężenie w fazie niepolarnej, np. 1-oktanol [B water ] stężenie w fazie polarnej, np. bufor wodny (TRIS-HCl; ph 7,4) P współczynnik podziału substancji występującej wyłącznie w formie niezjonizowanej (obojętnej)

5 Lipofilowość jak ilościowo jest wyrażana Współczynnik dystrybucji (D) stosunek sumy stężeń wszystkich form danej substancji (zjonizowanych i niezjonizowanych) w każdej z dwóch niemieszających się faz, niepolarnej (organicznej) i polarnej (wodnej). Zależy od ph roztworu (głównie wodnego), a tym samym od stałej dysocjacji substancji (pk a ). Dla substancji nieulegających jonizacji log D = log P

6 Wpływ lipofilowości na biodostępność substancji Ogólnym warunkiem dla optymalnego wchłanianie substancji z przewodu pokarmowego na drodze dyfuzji pasywnej po doustnym podaniu jest umiarkowana wartość log P (zakres 0 3). Bardziej polarna, słabsza przenikalność przez dwuwarstwę lipidową Dobra równowaga między przenikalnością i rozpuszczalnością Bardziej niepolarna i słabiej rozpuszczalna w wodzie Kerns E.H. and Di L. Drug-like Properties: Concepts, Structure Design and Methods from ADME to Toxicity Optimization

7 Lipofilowość metody wyznaczania Metody doświadczalne: klasyczna metoda ekstrakcyjna w układzie oktanol-woda (tzw. metoda shake-flask), metoda elektrochemiczna, metoda RP-TLC, układzie faz, tj. chromatografia cienkowarstwowa w odwróconym metoda RP-HPLC, czyli wysokosprawna chromatografia cieczowej w odwróconym układzie faz. Badania tą metodą można prowadzić w układzie HPLC z: - elucją izokratyczną; - elucją gradientową (zastosowanie odpowiednich substancji wzorcowych). Metody teoretyczne (obliczeniowe): programy komputerowe wykorzystujące algorytmy oparte na różnych uwarunkowaniach (np. atomistycznych) struktury chemicznej związku (np. ALOGPS, ChemOffice, Dragon, ChemAxon).

8 Pomiar lipofilowości metodą RP-HPLC w metodzie tej substancje eluują w kolejności od najbardziej polarnych (ściśle najbardziej hydrofilowych) do niepolarnych lipofilowych), (najbardziej współczynnik retencji (k) substancji rozpuszczonej jest proporcjonalny do średniej liczby cząsteczek w fazie stacjonarnej podzielonej przez średnią liczbę cząsteczek w fazie ruchomej, retencję substancji rozpuszczonej reguluje dynamiczna stała równowagi podziału (K) związku między fazę ruchomą i stacjonarną.

9 Pomiar lipofilowości metodą RP-HPLC W metodzie HPLC jako faz stacjonarną wykorzystuje się najczęściej żel krzemionkowy zmodyfikowaną warstwą hydrofobową złożoną z podstawników C18 (tzw. kolumny typu C18) Możliwe jest również zastosowanie biomimetycznych faz stacjonarnych, np. kolumny z unieruchomioną sztuczną błoną biologiczną (tzw. kolumny IAM). fazę stacjonarną stanowi fosfatydylocholina (PC) związana z krzemionką, unieruchomione cząsteczki fosfolipidów naśladują środowisko lipidowe błony komórkowej co umożliwia przewidywanie (a) interakcji analitu z błoną biologiczną czy (b) wchłaniania przez błonę komórkową (np. w jelicie), współczynnik retencji (k) związku określony dla kolumny IAM jest proporcjonalny do jego powinowactwa (współ. podziału, K) do fosfolipidów zgodnie z równaniem: Niepolarny ogon Polarna głowa PC gdzie Model dwuwarstwy lipidowej w kolumnie IAM

10 GENISTEINA Wyznaczanie lipofilowości w układzie HPLC z elucją izokratyczną kolumna RP-C18 Procedura wyznaczania lipofilowości (parametry log k w i CHI) Faza stacjonarna kolumna Purospher STAR RP-C18e Faza ruchoma metanol/woda (zakres 40-60% MeOH) Nazwa związku MeOH [%] t R [min] log k log k w CHI ( 0 ) 40 15,015 1, ,085 0, ,715 0, ,652 0, ,587 0,119 2,874 62,45 Równanie Snydera-Soczewińskiego log k w chromatograficzny współczynnik podziału (przecięcie z osią y; odpowiada fazie zawierającej wyłącznie wodę); udział metanolu w fazie ruchomej; CHI ( 0 ) indeks hydrofobowości (gdy k = 1, czyli log k = 0); k współczynnik retencji; t R i t 0 odpowiednio czas retencji i czas martwy

11 Wyznaczanie lipofilowości w układzie HPLC z elucją gradientową kolumna IAM Procedura wyznaczania lipofilowości (parametry CHI i log P) Faza stacjonarna kolumna IAM.PC.DD2 (100 x 4,6 mm) Fazy ruchome (A) 50 mm octan amonu (ph 7,4) (B) Acetonitryl Program elucji gradientowej => Faza stacjonarna Indeks hydrofobowości (CHI) wyznaczony w warunkach izokratycznych (dla substancji wzorcowych) jest liniowo powiązany z czasem retencji tych substancji wyznaczonym w warunkach elucji gradientowej. Subst. wzorcowa t R [min] CHI IAM paracetamol acetanilide acetophenone propiophenone butyrophenone valerophenone hexanophenone heptanophenone octanophenone

12