Analiza sekwencji kodującej genów MSX1 oraz PAX9 u chorych z wrodzonym brakiem zawiązków zębów stałych*

Transkrypt

1 race oryginalne Dent. Med. robl. 202, 49, 2, ISSN X Copyright by Wroclaw Medical University and olish Dental Society Adrianna Mostowska, A, B, D, E, F, Barbara Biedziak 2, A, B, D, A, D, aweł. Jagodziński Analiza sekwencji kodującej genów MSX oraz AX9 u chorych z wrodzonym brakiem zawiązków zębów stałych* Analysis of the Coding Sequence of the MSX and AX9 Genes in atients with the Congenital Lack of ermanent Teeth Katedra Biochemii i Biologii Molekularnej Uniwersytetu Medycznego w oznaniu 2 raktyka prywatna A koncepcja i projekt badania; B gromadzenie i/lub zestawianie danych; C opracowanie statystyczne; D interpretacja danych; E przygotowanie tekstu; F zebranie piśmiennictwa Streszczenie Wprowadzenie. Wrodzony brak zawiązków zębów stałych jest jedną z najczęstszych nieprawidłowości rozwojowych uzębienia. Etiologia tej wady, w której rolę odgrywają zarówno czynniki genetyczne, jak i środowiskowe, jest złożona i nie została jeszcze w pełni wyjaśniona. Do najważniejszych genów, których mutacje są przyczyną agenezji zębów stałych należą MSX oraz AX9. Geny te kodują czynniki transkrypcyjne pełniące kluczową rolę podczas odontogenezy. Cel pracy. oszukiwanie mutacji w sekwencji kodującej genów MSX oraz AX9 u chorych z wrodzonym brakiem zawiązków zębów stałych. Materiał i metody. Do badań zakwalifikowano 0 niespokrewnionych pacjentów z oligodoncją, którym brakowało więcej niż 5 zębów stałych (oprócz trzecich zębów trzonowych). oszukiwanie mutacji przeprowadzono za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania DNA. Wyniki. Analiza otrzymanych wyników wykazała brak nowych etiologicznych mutacji w genach MSX oraz AX9, które mogą być przyczyną oligodoncji w analizowanej grupie chorych. Wszystkie zidentyfikowane warianty nukleotydowe tych genów były to znane polimorfizmy, które nie wykazują związku z wrodzonym brakiem zawiązków zębów stałych. Wnioski. Oligodoncja u badanych chorych nie jest wynikiem mutacji zlokalizowanych w sekwencji kodującej genów MSX oraz AX9. Czynnikiem etiologicznym tej wady rozwojowej mogą być mutacje rejonów regulatorowych badanych genów, mutacje lub polimorfizmy innych genów kandydackich lub też działanie czynników środowiskowych (Dent. Med. robl. 202, 49, 2, 57 65). Słowa kluczowe: hipodoncja,, MSX, AX9, mutacja. Abstract Background. The congenital lack of permanent teeth is one of the most common developmental dental anomalies. This malformation etiology, in which both genetic and environmental factors play a role, is complex and not yet fully elucidated. The main genes, which mutations can cause the lack of permanent teeth budt are MSX and AX9. They encode transcription factors that play a key role during odontogenesis. Objectives. The aim of the project was to search for mutations in the coding sequence of the MSX and AX9 genes in patients with the congenital lack of permanent teeth. Material and Methods. The study included ten unrelated patients with oligodontia, that is the lack of more than five permanent teeth (excluding third molars). Mutation screening was performed by direct sequencing of DNA. Results. The analysis of the received data has revealed no new etiological mutations in the MSX and AX9 genes, which could be the cause of oligodontia in the examined group of patients. All of the identified nucleotide variants * Badania były finansowane z grantu habilitacyjnego nr NN

2 58 A. Mostowska, B. Biedziak,.. Jagodziński Do badań zakwalifikowano 0 niespokrewnionych chorych z izolowaną oligodoncją, która została rozpoznana podczas badania klinicznego i potwierdzona badaniem radiologicznym. Z każdym pacjentem przeprowadzono także wywiad dotyczący występowania wrodzonych braków zawiązków zębów stałych oraz innych wad rozwojowych u najbliższych członków rodziny. Wszystkie osoby biorące udział w badaniu podpisały formularz świadomej zgoof tested genes were some known polymorphisms, which are not associated with the congenital lack of permanent teeth. Conclusions. Oligodontia in the studied patients is not the result of mutations located in the coding sequence of the MSX and AX9 genes. The etiological factor of this developmental anomaly may be mutations in the regulatory regions of these genes, mutations or polymorphisms in another candidate genes or the influence of the environmental factors (Dent. Med. robl. 202, 49, 2, 57 65). Key words: hypodontia, oligodontia, MSX, AX9, mutation. Wrodzony brak zawiązków zębów stałych (OMIM Online Mendelian Inheritance in Man: #06600) jest jedną z najczęstszych nieprawidłowości rozwojowych uzębienia. Częstość występowania tej wady zależy od populacji i wynosi,6 9,6% [, 2]. Dane te nie dotyczą trzecich zębów trzonowych, których brak stwierdza się u około 20 25% osób [3]. W zależności od liczby brakujących zawiązków zębowych wyróżnia się hipodoncję (brak do 4 zawiązków zębów, oprócz trzecich zębów trzonowych), oligodoncję (brak więcej niż 4 lub 5 zawiązków zębów, oprócz trzecich zębów trzonowych) oraz anodoncję, czyli brak wszystkich zawiązków zębów [4]. Wrodzone braki zawiązków zębów stałych mogą występować jako wada samodzielna (wada izolowana), albo być jednym z objawów złożonych wad rozwojowych [5]. ostać rodzinna agenezji zębowej jest dziedziczona przede wszystkim w sposób autosomalny dominujący, ale są również obserwowane przypadki dziedziczenia recesywnego lub też związanego z chromosomem X [3]. Etiologia wrodzonego braku zawiązków zębów stałych jest bardzo złożona i mimo badań prowadzonych przez wiele ośrodków naukowych na świecie wciąż nie jest w pełni wyjaśniona. Za jedną z głównych przyczyn tej wady, obok zaburzeń rozwojowych ektodermy lub też negatywnego wpływu czynników środowiskowych, takich jak zaburzenia odżywiania i choroby somatyczne matki podczas ciąży, urazy, chemioterapia oraz naświetlanie promieniami X, uważa się czynniki genetyczne [2]. Według najnowszych poglądów do genów, których mutacje powodują zatrzymanie rozwoju zawiązków zębów stałych należą: MSX, AX9, AXIN2 oraz EDA [6 9]. Zidentyfikowano ponadto geny, których warianty polimorficzne mogą wpływać na ryzyko występowania zarówno hipodoncji, jak i oligodoncji. Do genów tych należą: TGFα, IRF6, FGFR, WNT0 oraz gen CHDH, którego polimorfizmy ponad 2-krotnie zmniejszają ryzyko wystąpienia wrodzonego braku zawiązków zębów stałych w polskiej populacji [0 3]. Wykazano także, że interakcje epistatyczne między genami CHDH oraz LD2 kodującymi białka przemiany folianów oraz choliny mogą być czynnikiem etiologicznym tej wady uzębienia [3]. Większość mutacji opisanych jako genetyczna przyczyna agenezji zębów stałych została zidentyfikowana w genach MSX (OMIM *42983) oraz AX9 (OMIM *6746). Mutacje te zlokalizowano przede wszystkim w silnie konserwatywnych ewolucyjnie sekwencjach tych genów, homeobox i paired box, które kodują domeny białkowe biorące udział w oddziaływaniu z DNA oraz z innymi białkami. Analiza wzorów zębowych u chorych z mutacjami w genie MSX wykazała, że są one odpowiedzialne przede wszystkim za wrodzone braki drugich zębów przedtrzonowych i trzecich trzonowych, podczas gdy mutacje genu AX9 prowadzą do agenezji zębów trzonowych [4, 5]. rodukty białkowe genów MSX oraz AX9 pełnią funkcję czynników transkrypcyjnych, które odgrywają kluczową rolę w procesie odontogenezy [6, 7]. U myszy transgenicznych pozbawionych funkcjonalnej formy tych genów, Msx / lub też ax9 /, rozwój wszystkich zębów zostaje zatrzymany w stadium pączka. Zwierzęta te wykazują także liczne nieprawidłowości rozwojowe w morfologii twarzowej części czaszki, w tym rozszczepy podniebienia [8, 9]. Wykazano, że podstawową funkcją białek Msx oraz ax9 podczas rozwoju zawiązków zębów jest utrzymywanie i regulacja ekspresji Bmp4 w zębowej mezenchymie [20, 2]. Ścieżki sygnałowe z udziałem produktu białkowego tego genu prowadzą do wykształcenia węzła szkliwnego (enamel knot), który odgrywa istotną rolę w morfogenezie zębów, zwłaszcza wielokorzeniowych [22]. Celem pracy było poszukiwanie w sekwencji kodującej genów MSX oraz AX9 mutacji, które mogą być przyczyną wrodzonego braku zawiązków zębów stałych u chorych z występującą oligodoncją. Materiał i metody

3 Analiza sekwencji kodującej genów MSX oraz AX9 59 dy i zostały poinformowane o celu prowadzonych analiz. Do badań genetycznych posłużyła krew obwodowa, z której wyizolowano DNA za pomocą techniki wysalania. oszukiwanie mutacji w sekwencji kodującej genów MSX (2 eksony) oraz AX9 (4 eksony) przeprowadzono za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania DNA z wykorzystaniem zestawu ABI rismtm BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing kit oraz kapilarnego sekwenatora ABI rism 3730 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Sekwencje starterów, warunki amplifikacji oraz sekwencjonowania dostępne na życzenie. Otrzymane chromatogramy analizowano z użyciem programu FinchTV v..3.. W celu sprawdzenia czy zidentyfikowane warianty nukleotydowe są znanymi polimorfizmami genów MSX oraz AX9, czy też nowymi mutacjami, które mogą być przyczyną oligodoncji, uzyskane wyniki porównywano z danymi dostępnymi w bazach UCSC Genome Browser ( dbsn ( oraz The Human Gene Mutation Database ( org/). Na wszystkie badania genetyczne uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej przy Uniwersytecie Medycznym w oznaniu. Wyniki U chorych biorących udział w badaniu obserwowano braki 7 2 zawiązków zębów stałych (oprócz trzecich zębów trzonowych). Najczęściej brakującymi zębami były górne i dolne drugie zęby przedtrzonowe, górne boczne zęby sieczne oraz dolne przyśrodkowe zęby sieczne (tab. ). U cho- Tabela. Diagramy zębowe chorych z wrodzonym brakiem zawiązków zębów stałych Table. Dental diagrams of patients with the congenital lack of permanent teeth acjent liczba brakujących zębów stałych (atient number of missing permanent teeth) Kwadrant (Quadrant ) Kwadrant 2 (Quadrant 2) kwadrant 4 (quadrant 4) kwadrant 3 (quadrant 3) OD (2) * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * AK (20) * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * MK (6) * * * * * * * * * * * * * * * * MŻ (2) * * * * * * * * * * * * ŁT () * * * * * * * * * * * AM (0) * * * * * * * * * * DN (9) * * * * * * * * * AC (8) * * * * * * * * ACH (7) * * * * * * * S (7) * * * * * * * Gwiazdki wskazują braki zębów stałych. Liczba brakujących zębów stałych nie wliczając trzecich zębów trzonowych. Stars represent absent permanent teeth. Number of missing permanent teeth excluding third molars.

4 60 A. Mostowska, B. Biedziak,.. Jagodziński rych nie obserwowano innych zaburzeń rozwojowych twarzoczaszki oraz nieprawidłowości w budowie włosów, skóry i paznokci. Uzębienie mleczne równiez było prawidłowe. W wywiadzie rodzinnym stwierdzono, że u 4 chorych braki zawiązków zębów stałych występowały także u najbliższych członków rodziny. ozostałe przypadki oligodoncji były sporadyczne. Analiza sekwencyjna genów MSX oraz AX9 nie wykazała obecności nowych etiologicznych mutacji, które mogą być przyczyną oligodoncji w analizowanej grupie chorych. Wszystkie zidentyfikowane warianty nukleotydowe tych genów są to znane polimorfizmy opisane w dostępnych bazach danych. W genie MSX zidentyfikowano 8 polimorfizmów, z których 2 są zlokalizowane w sekwencji kodującej eksonu, 5 w sekwencji owej oraz w sekwencji kodującej 3 UTR (tab. 2). W genie AX9 zidentyfikowano 6 wariantów nukleotydowych, 4 zlokalizowane w sekwencjach owych oraz 2 w eksonie 3 (tab. 2). Większość z odkrytych polimorfizmów są to substytucje pojedynczych nukleotydów, które zidentyfikowano u badanych chorych zarówno w postaci heterozygotycznej, jak i homozygotycznej. W genie MSX odkryto także 2 polimorfizmy inercyjno-delecyjne zlokalizowane w ie (c.469+3delginst oraz c.470-5delt). Omówienie Do najważniejszych genów kandydackich dla agenezji zębów stałych, których mutacje opisano jako przyczynę hipodoncji oraz oligodoncji także w polskiej populacji, należą MSX oraz AX9 [23 26]. Celem tego projektu było poszukiwanie etiologicznych mutacji tych genów u 0 chorych z izolowanym brakiem więcej niż 7 zawiązków zębów stałych. Analiza przeprowadzona za pomocą bezpośredniego sekwencjowania DNA nie wykazała obecności zmian nukleotydowych, które można uznać za mutacje odpowiedzialne za powstawanie tej wady rozwojowej u badanych chorych. Analizą objęto sekwencje kodujące genów MSX oraz AX9 wraz z sekwencjami otaczającymi połączenia ekson, a także sekwencje kodujące 3 -regiony nieulegające translacji (3 UTR). Wszystkie wykryte warianty nukleotydowe (łącznie 4) były to znane polimorfizmy genów MSX oraz AX9, które nie wykazują związku z występowaniem wrodzonego braku zawiązków zębów stałych. Tabela 2. Warianty polimorficzne genów MSX oraz AX9 zidentyfikowane u badanych chorych z oligodoncją Table 2. olymorphic variants in the MSX and AX9 genes identified in the examined patients with oligodontia Gen MSX (MSX gene) Gen AX9 (AX9 gene) olimorfizm (olymorphism) rs rs rs rs rs rs rs rs8670 rs rs rs rs rs rs Umiejscowienie (Localisation) Efekt białkowy (rotein effect) acjent (atient) OD AK MK MŻ ŁT AM DN AC ACH S ekson Ala40- Gly ekson Gly6- Gly 3 UTR 2 His239- His CA CA CA c.469+3delginst; 2 c.470 5delT. sekwencja prawidłowa; heterozygota; Homo homozygota. normal sequence; heterozygote; Homo homozygote. Homo TT ekson 3 ekson 3 Ala240- ro GC

5 Analiza sekwencji kodującej genów MSX oraz AX9 6 Jeden ze zidentyfikowanych polimorfizmów genu AX9 (rs490420), który powoduje substytucję alaniny proliną w pozycji 240 kodowanego białka (Ala240ro), jest uznawany przez niektórych badaczy za wariant etiologiczny, który można uznać za przyczynę agenezji zębów [27, 28]. W badanej grupie chorych polimorfizm ten został wykryty w postaci homozygotycznej u chorego z brakiem 2 zawiązków zębów stałych oraz w postaci heterozygotycznej u chorego z brakiem 8 zawiązków zębów stałych (tab. 2). Wcześniejsze badania przeprowadzone w polskiej populacji wykazały jednak, że polimorfizm Ala240ro nie wykazuje związku z wadami rozwojowymi twarzy [29]. Częstość występowania tego wariantu nukleotydowego nie wykazywała różnic istotnych statystycznie, porównując grupę chorych z wrodzonym brakiem zawiązków zębów stałych, izolowanymi rozszczepami wargi i podniebienia oraz grupą kontrolną składającą się ze 44 zdrowych osób bez wad rozwojowych twarzoczaszki. Obecnie uważa się, że polimorfizm Ala240ro, który najprawdopodobniej zaburza strukturę i funkcję białka AX9, może być czynnikiem, który zwiększa ryzyko wystąpienia wrodzonego braku trzecich zębów trzonowych [29]. Braki zębów mądrości nie były rozpatrywane u chorych biorących udział w badaniu. Brak etiologicznych mutacji w MSX oraz AX9 u 0 chorych z oligodoncją nie wyklucza tych genów jako głównych genów kandydackich dla wrodzonego braku zawiązków zębów stałych. rzeprowadzone analizy dotyczyły jedynie sekwencji kodującej i krótkich fragmentów sekwencji owych, natomiast warianty nukleotydowe, które mogą być przyczyną agenezji zębów stałych mogą być zlokalizowane także w niekodujących sekwencjach regulatorowych badanych genów. Mendoza-Fandino et al. [30] opisali mutację w regionie regulatorowym 5 genu AX9 (g.-258g>a), która była przyczyną hipodoncji zębów trzonowych dziedziczonej w sposób autosomalny dominujący. Tranzycja ta, zlokalizowana w sekwencji silnie konserwatywnej ewolucyjnie, jest najprawdopodobniej odpowiedzialna za ograniczenie ekspresji genu AX9 [30]. Jak dotąd jest to jedyny przykład mutacji odpowiedzialnej za braki zębowe, która została odkryta w niekodującej sekwencji regulatorowej. Wszystkie pozostałe mutacje opisane w genach MSX oraz AX9 prowadzą do zmian w sekwencji kodowanego białka powodując substytucje aminokwasowe, przesunięcia ramki odczytu oraz przedwczesną terminację translacji (tab. 3). W dwóch rodzinach z występującą oligodoncją opisano także heterozygotyczne delecje całego locus zawierającego gen AX9, prowadzące do niedoboru prawidłowo funkcjonującego produktu białkowego (haploinsufficiency) [3, 32]. Mimo że MSX oraz AX9 są najważniejszymi genami kandydackimi dla agenezji zębów stałych, liczba mutacji zidentyfikowana w tych genach u chorych z wrodzonym brakiem zawiązków zębów stałych jest względnie niewielka (tab. 3). Liczba opisanych mutacji genu MSX wynosi 2, a w genie AX9 zidentyfikowano dotychczas 27 etiologicznych wariantów nukleotydowych. Większość z tych mutacji została opisana w pojedynczych, głównie wielopokoleniowych, rodzinach z hipodoncją oraz oligodoncją. Wyjątkiem są 4 mutacje genu AX9, które zostały zidentyfikowane u chorych ze sporadyczną postacią tej wady rozwojowej (Gly6Arg, Gly5Ser, Tyr60Stop oraz delacja całego locus obejmującego gen AX9) [23, 32 34]. Jedna z nich (Gly5Ser), zidentyfikowana w polskiej populacji, była pierwszą opisaną de novo mutacją tego genu [23]. Wszystkie mutacje genów MSX oraz AX9 zostały zidentyfikowane w postaci heterozygotycznej, wskazując, że ich rezultat feno typowy jest związany z niedoborem prawidłowo funkcjonujących czynników transkrypcyjnych kodowanych przez te geny. Jedynie mutacja genu MSX (Ala29Thr) opisana w pakistańskiej rodzinie, w której rodzice byli blisko ze sobą spokrewnieni, jest odpowiedzialna za występowanie oligodoncji, występując w postaci homozygotycznej [35]. Brak mutacji w MSX oraz AX9 u chorych z występującą oligodoncją może sugerować obecność etiologicznych wariantów nukleotydowych w innych genach kandydackich dla tej wady rozwojowej. Według danych literaturowych genami, których mutacje mogą być przyczyną wrodzonego braku zawiązków zębów stałych są także AXIN2 oraz EDA (tab. 4). Obecnie liczba mutacji zidentyfikowana w genie EDA, które są odpowiedzialne za izolowaną postać agenezji zębów stałych wynosi 2. Mutacje tego genu kodującego błonowe białko ekstodysplazynę-a są także główną przyczyną anhydrotycznej dysplazji ektodermalnej zaburzenia rozwojowego, które charakteryzuje się nieprawidłowościami w rozwoju przydatków skóry, w szczególności zębów, włosów oraz gruczołów potowych [36]. Dotychczasowe badania prowadzone w polskiej populacji nie wykazały związku genu EDA z wrodzonym brakiem zawiązków zębów stałych (nieopublikowane dane własne). Analizy sekwencji kodującej AXIN2 wykazały natomiast, że warianty polimorficzne tego genu są istotnym czynnikiem zwiększającym ryzyko występowania hipodoncji w naszej populacji [37]. Genami, których polimorfizmy wpływają na ryzyko wystąpienia agenezji zębów stałych są także geny: TGFα, IRF6, FGFR, WNT0 oraz CHDH [0 3]. Więk-

6 62 A. Mostowska, B. Biedziak,.. Jagodziński Tabela 3. Mutacje genów MSX oraz AX9 zidentyfikowane u chorych z wrodzonym brakiem zawiązków zębów stałych na podstawie danych literaturowych Table 3. Mutations in the MSX and AX9 genes identified in patients with the congenital lack of permanent teeth based on literature data Mutacja (Mutation) Gen MSX chr:4p6.2 62dupG 82T>A 34C>A 453G>T 526C>T 559C>T 58C>T 587G>C 644insA 655G>A 662C>A 67T>C Gen AX9 chr:4q3.3 g.-258g>a A>G 6G>A 62T>C 76C>T 83G>C 09insG 28G>A i 29C>A 39C>T 5G>A 52G>C 75C>T 76ins288pz 29insG 230_242del3pz 238A>G 259A>T 27A>G 32insG 340A>T 428A>G 433C>T 480C>G 69_62delATCins24pz 793incC delecja całego locus delecja całego locus Umiejscowienie (Localisation) ekson ekson ekson 5 UTR ekson ekson 4 Efekt białkowy (rotein effect) G22fs Met6Lys Ser04Stop Arg5Ser Arg76Trp Gln87Stop Ala94Val Arg96ro Gln26fs Ala29Thr Ala22Glu Leu224ro MetVal Gly6Arg Leu2ro Arg26Trp Arg28ro Ile37fs Ser43Lys Arg47Trp Gly5Ser Gly5Ala Arg59Stop Ala58fs Gly73fs Arg77_ro8delfs Thr80Ala Ile87he Lys9Glu Ala08fs Lys4Stop Tyr43Cys Gln45Stop Tyr60Stop Ile207fs Ala264fs brak produktu białkowego brak produktu białkowego Fenotyp (henotype) / C / CL hipodoncja hipodoncja hipodoncja c hipodoncja / hipodoncja / c hipodoncja / hipodoncja / hipodoncja/ /opóźnienie mowy c Lit. (Ref.) [46] [47] [48] [49] [5] [25] [6] [35] [52] [26] [30] [53] [33] [54] [55] [56] [57] [33] [57] [23] [58] [54] [7, 34] [59] [54] [60] [6] [62] [34] [24] [63, 64] [3] [32] a Sekwencja kodująca homoeodomenę białka MSX; b sekwencja kodująca paired domain białka AX9; c mutacja de novo. C rozszczep podniebienia; CL rozszczep wargi i podniebienia. a Sequence encoding the homeodomain of the MSX protein; b sequence encoding the paired domain of the AX9 protein; c de novo mutation. C cleft palate; CL cleft lip and palate. szość z nich to także geny kandydackie dla rozszczepów wargi i podniebienia wady rozwojowej twarzoczaszki, której często towarzyszą wrodzone braki zawiązków zębów stałych [38]. Badania przebiegu odontogenezy wykonane na embrionach mysich wykazały, że rozwój zębów, ich liczba, kształt oraz umiejscowienie, są precyzyjnie kontrolowane przez produkty białkowe ponad 300 genów, a każdy z nich jest potencjalnym genem kandydackim dla agenezji zębów stałych [39]. Na szczególną uwagę zasługują geny, których zablokowanie w modelach mysich (knock

7 Analiza sekwencji kodującej genów MSX oraz AX9 63 Tabela 4. Mutacje genów AXIN2 oraz EDA zidentyfikowane u chorych z wrodzonym brakiem zawiązków zębów stałych na podstawie danych literaturowych Table 4. Mutations in the AXIN2 and EDA genes identified in patients with the congenital lack of permanent teeth based on literature data Mutacja (Mutation) Lokalizacja (Localisation) Efekt białkowy (rotein effect) Fenotyp (henotype) Lit. (Ref.) Gen AXIN2 chr:7q insG 966C>T 205C>T 2272G>A ekson 0 Gly666fs Arg656Stop Ala684Val Ala758Thr a /rak jelita grubego [8, 50] [8] Gen EDA chr:xq3. 93C>G 200A>T IVS5 + G>A 776C>A 865C>T 947A>G 993G>C 00G>A 03C>T 072C>G 09T>C 336T>C ekson ekson 5 ekson 6 ekson 7 Arg65Gly Glu67Val zaburzony splicing Ala259Glu Arg289Cys Asp36Gly Gln33His Arg334His Thr338Met Gln358Glu Met364Thr Val365Ala hipodoncja/ hipodoncja/ hipodoncja hipodoncja/ hipodoncja/ hipodoncja hipodoncja/ [9] [65] [65] [66] [66] [67] [68] [66] [67, 69] [70] [7 73] [74] a Mutacja de novo. a de novo mutation. out mice) prowadzi do licznych zaburzeń w rozwoju zawiązków zębów stałych, tj. geny z rodziny DLX [40]. otencjalnymi genami, których mutacje mogą być przyczyną izolowanej postaci wrodzonego braku zawiązków zębów stałych są także geny odpowiedzialne za jej postacie syndromiczne [0, 4]. Dotychczas opisano ponad 60 zespołów chorobowych, w których jednym z objawów fenotypowych jest brak zawiązków zębów stałych. Analizą, która pozwoliłaby na identyfikację nowych genów/loci dla wad rozwojowych uzębienia byłoby także badanie asocjacyjne całego genomu (GWAS genome wide association study). Metoda ta pozwoliła na identyfikację m.in. 5 nowych genów, które odgrywają kluczową rolę w procesie rozwoju zębów mlecznych. Należą do nich geny: KCNJ2, EDA, MSRB3, IGFB oraz RAD5L [42]. Badania GWAS pozwoliły także na identyfikację nowych loci dla izolowanych rozszczepów wargi i podniebienia [43, 44]. Wykazano m.in. że polimorfizm umiejscowiony w miejscu będącym pustynią genową na chromosomie 8q24. jest wariantem, który znacząco wpływa na ryzyko tej wady rozwojowej w populacjach europejskich, w tym w polskiej populacji [43, 45]. odsumowując, analiza sekwencji kodującej genów MSX oraz AX9 u 0 chorych z występującą oligodoncją nie wykazała obecności mutacji, które mogą być przyczyną tej wady rozwojowej. Wynik ten może świadczyć o obecności innego etiologicznego czynnika, który jest odpowiedzialny za wrodzony brak zawiązków zębów stałych u badanych osób. Czynnikiem tym mogą być mutacje zlokalizowane w rejonach regulatorowych genów MSX oraz AX9, mutacje lub polimorfizmy innych genów kandydackich dla agenezji zębów stałych lub też działanie czynników środowiskowych. Należy wziąć także pod uwagę możliwość oddziaływań międzygenowych oraz interakcji genotyp środowis ko w etiologii oligodoncji. iśmiennictwo [] older B.J., Van t Hof M.A., Van der Linden F.., Kuijpers-Jagtman A.M.: A meta-analysis of the prevalence of dental agenesis of permanent teeth. Community Dent. Oral. Epidemiol. 2004, 32, [2] De Coster.J., Marks L.A., Martens L.C., Huysseune A.: Dental agenesis: genetic and clinical perspectives. J. Oral. athol. Med. 2009, 38, 7. [3] Vastardis H.: The genetics of human tooth agenesis: new discoveries for understanding dental anomalies. Am. J. Orthod. Dentofac. Orthop. 2000, 7,

8 64 A. Mostowska, B. Biedziak,.. Jagodziński [4] Schalk-Van Der Weide Y., Beemer F.A., Faber J.A., Bosman F.: Symptomatology of patients with oligodontia. J. Oral. Rehabil. 994, 2, [5] Bakri H., Rapp R., Hadeed G.: Clinical management of ectodermal dysplasia. J. Clin. ediatr. Dent. 995, 9, [6] Vastardis H., Karimbux N., Guthua S.W., Seidman J.G., Seidman C.E.: A human MSX homeodomain missense mutation causes selective tooth agenesis. Nat. Gen. 996, 3, [7] Stockton D.W., Das., Goldenberg M., D souza R.N., atel.i.: Mutation of AX9 is associated with oligodontia. Nat. Gen. 2000, 24, 8 9. [8] Lammi L., Arte S., Somer M., Jarvinen H., Lahermo., Thesleff I., irinen S., Nieminen.: Mutations in AXIN2 cause familial tooth agenesis and predispose to colorectal cancer. Am. J. Hum. Gen. 2004, 74, [9] Tao R., Jin B., Guo S.Z., Qing W., Feng G.Y., Brooks D.G., Liu L., Xu J., Li T., Yan Y., He L.: A novel missense mutation of the EDA gene in a Mongolian family with congenital hypodontia. J. Hum. Gen. 2006, 5, [0] Vieira A.R., Meira R., Modesto A., Murray J.C.: MSX, AX9, and TGFA contribute to tooth agenesis in humans. J. Dent. Res. 2004, 83, [] Vieira A.R., Modesto A., Meira R., Barbosa A.R., Lidral A.C., Murray J.C.: Interferon regulatory factor 6 (IRF6) and fibroblast growth factor receptor (FGFR) contribute to human tooth agenesis. Am. J. Med. Gen. A. 2007, 43, [2] Kantaputra., Sripathomsawat W.: WNT0A and isolated hypodontia. Am. J. Med. Gen. A. 20, 55A, [3] Mostowska A., Biedziak B., Dunin-Wilczynska I., Komorowska A., Jagodzinski..: olymorphisms in CHDH gene and the risk of tooth agenesis. Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 20, 9, [4] Matalova E., Fleischmannova J., Sharpe.T., Tucker A.S.: Tooth agenesis: from molecular genetics to molecular dentistry. J. Dent. Res. 2008, 87, [5] Kavitha B., riyadharshini V., Sivapathasundharam B., Saraswathi T.R.: Role of genes in oro-dental diseases. Indian J. Dent. Res. 200, 2, [6] Chen Y., Bei M., Woo I., Satokata I., Maas R.: Msx controls inductive signaling in mammalian tooth morphogenesis. Development 996, 22, [7] eters H., Neubüser A., Balling R.: ax genes and organogenesis: ax9 meets tooth development. Eur. J. Oral Sci. 998, 06, [8] Satokata I., Maas R.: Msx deficient mice exhibit cleft palate and abnormalities of craniofacial and tooth development. Nat. Gen. 994, 6, [9] eters H., Neubüser A., Kratochwil K., Balling R.: ax9-deficient mice lack pharyngeal pouch derivatives and teeth and exhibit craniofacial and limb abnormalities. Genes Dev. 998, 2, [20] Ogawa T., Kapadia H., Feng J.Q., Raghow R., eters H., D souza R.N.: Functional consequences of interactions between ax9 and Msx genes in normal and abnormal tooth development. J. Biol. Chem. 2006, 28, [2] Nakatomi M., Wang X.., Key D., Lund J.J., Turbe-Doan A., Kist R., Aw A., Chen Y., Maas R.L., eters H.: Genetic interactions between ax9 and Msx regulate lip development and several stages of tooth morphogenesis. Dev. Biol. 200, 340, [22] Thesleff I., Keränen S., Jernvall J.: Enamel knots as signaling centers linking tooth morphogenesis and odontoblast differentiation. Adv. Dent. Res. 200, 5, 4 8. [23] Mostowska A., Kobielak A., Biedziak B., Trzeciak W.H.: Novel mutation in the paired box sequence of AX9 gene in a sporadic form of oligodontia. Eur. J. Oral Sci. 2003,, [24] Mostowska A., Biedziak B., Trzeciak W.H.: A novel mutation in AX9 causes familial form of molar oligodontia. Eur. J. Hum. Gen. 2006, 4, [25] Mostowska A., Biedziak B., Trzeciak W.H.: A novel c.58c>t transition localized in a highly conserved homeobox sequence of MSX: is it responsible for oligodontia? J. Appl. Gen. 2006, 47, [26] Mostowska A., Biedziak B., Jagodzinski..: Novel MSX mutation in a family with autosomal-dominant hypodontia of second premolars and third molars. Arch. Oral. Biol. 202, [27] awlowska E., Janik-apis K., oplawski T., Blasiak J., Szczepanska J.: Mutations in the AX9 gene in sporadic oligodontia. Orthod. Craniofac. Res. 200, 3, [28] Wang J., Jian F., Chen J., Wang H., Lin Y., Yang Z., an X., Lai W.: Sequence analysis of AX9, MSX and AXIN2 genes in a Chinese oligodontia family. Arch. Oral Biol. 20, 56, [29] ereira T.V., Salzano F.M., Mostowska A., Trzeciak W.H., Ruiz-Linares A., Chies J.A., Saavedra C., Nagamachi C., Hurtado A.M., Hill K., Castro-de-Guerra D., Silva-Júnior W.A., Bortolini M.C.: Natural selection and molecular evolution in primate AX9 gene, a major determinant of tooth development. roc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 03, [30] Mendoza-Fandino G.A., Gee J.M., Ben-Dor S., Gonzalez-Quevedo C., Lee K., Kobayashi Y., Hartiala J., Myers R.M., Leal S.M., Allayee H., atel.i.: A novel g.-258g>a mutation in a conserved putative regulatory element of AX9 is associated with autosomal dominant molar hypodontia. Clin. Gen. 20, 80, [3] Das., Stockton D.W., Bauer C., Shaffer L.G., D souza R.N., Wright T., atel.i.: Haploinsufficiency of AX9 is associated with autosomal dominant hypodontia. Hum. Gen. 2002, 0, [32] Haldeman-Englert C.R., Biser A., Zackai E.H., Ming J.E.: A 223-kb de novo deletion of AX9 in a patient with oligodontia. J. Craniofac. Surg. 200, 2,

9 Analiza sekwencji kodującej genów MSX oraz AX9 65 [33] Wang Y., Wu H., Wu J., Zhao H., Zhang X., Mues G., D souza R.N., Feng H., Kapadia H.: Identification and functional analysis of two novel AX9 mutations. Cells Tissues Organs 2009, 89, [34] Zhu J., Yang X., Zhang C., Ge L., Zheng S.: A novel nonsense mutation in AX9 is associated with sporadic hypodontia. Mutagenesis 20, doi:0.093/mutage/ger080. [35] Chishti M.S., Muhammad D., Haider M., Ahmad W.: A novel missense mutation in MSX underlies autosomal recessive oligodontia with associated dental anomalies in akistani families. J. Hum. Gen. 2006, 5, [36] Mikkola M.L.: Molecular aspects of hypohidrotic ectodermal dysplasia. Am. J. Med. Gen. A. 2009, 49A, [37] Mostowska A., Biedziak B., Jagodzinski..: Axis inhibition protein 2 (AXIN2) polymorphisms may be a risk factor for selective tooth agenesis. J. Hum. Gen. 2006, 5, [38] Murthy J., Bhaskar L.: Current concepts in genetics of nonsyndromic clefts. Indian J. last. Surg. 2009, 42, [39] Galluccio G., Castellano M., La Monaca C.: Genetic basis of non-syndromic anomalies of human tooth number. Arch. Oral Biol. 202, [40] Qiu M., Bulfone A., Ghattas I., Meneses J.J., Christensen L., Sharpe.T., resley R., edersen R.A., Rubenstein J.L.: Role of the Dlx homeobox genes in proximodistal patterning of the branchial arches: mutations of Dlx-, Dlx-2, and Dlx- and -2 alter morphogenesis of proximal skeletal and soft tissue structures derived from the first and second arches. Dev. Biol. 997, 85, [4] Vieira A.R.: Oral clefts and syndromic forms of tooth agenesis as models for genetics of isolated tooth agenesis. J. Dent. Res. 2003, 82, [42] illas D., Hoggart C.J., Evans D.M., O reilly.f., Sipilä K., Lähdesmäki R., Millwood I.Y., Kaakinen M., Netuveli G., Blane D., Charoen., Sovio U., outa A., Freimer N., Hartikainen A.L., Laitinen J., Vaara S., Glaser B., Crawford., Timpson N.J., Ring S.M., Deng G., Zhang W., Mccarthy M.I., Deloukas., eltonen L., Elliott., Coin L.J., Smith G.D., Jarvelin M.R.: Genome-wide association study reveals multiple loci associated with primary tooth development during infancy. LoS Gen. 200, 6, e [43] Birnbaum S., Ludwig K.U., Reutter H., Herms S., Steffens M., Rubini M., Baluardo C., Ferrian M., Almeida De Assis N., Alblas M.A., Barth S., Freudenberg J., Lauster C., Schmidt G., Scheer M., Braumann B., Bergé S.J., Reich R.H., Schiefke F., Hemprich A., ötzsch S., Steegers-Theunissen R.., ötzsch B., Moebus S., Horsthemke B., Kramer F.J., Wienker T.F., Mossey.A., ropping., Cichon S., Hoffmann., Knapp M., Nöthen M.M., Mangold E.: Key susceptibility locus for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate on chromosome 8q24. Nat. Gen. 2009, 4, [44] Beaty T.H., Murray J.C., Marazita M.L., Munger R.G., Ruczinski I., manski J.B., Liang K.Y., Wu T., Murray T., Fallin M.D., Redett R.A., Raymond G., Schwender H., Jin S.C., Cooper M.E., Dunnwald M., Mansilla M.A., Leslie E., Bullard S., Lidral A.C., Moreno L.M., Menezes R., Vieira A.R., etrin A., Wilcox A.J., Lie R.T., Jabs E.W., Wu-Chou Y.H., Chen.K., Wang H., Ye X., Huang S., Yeow V., Chong S.S., Jee S.H., Shi B., Christensen K., Melbye M., Doheny K.F., ugh E.W., Ling H., Castilla E.E., Czeizel A.E., Ma L., Field L.L., Brody L., angilinan F., Mills J.L., Molloy A.M., Kirke.N., Scott J.M., Arcos-Burgos M., Scott A.F.: A genome-wide association study of cleft lip with and without cleft palate identifies risk variants near MAFB and ABCA4. Nat. Gen. 200, 42, [45] Mostowska A., Hozyasz K.K., Wojcicki., Biedziak B., aradowska., Jagodzinski..: Association between genetic variants of reported candidate genes or regions and risk of cleft lip with or without cleft palate in the olish population. Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 200, 88, Adres do korespondencji: Adrianna Mostowska Katedra Biochemii i Biologii Molekularnej UM ul. Święcickiego oznań tel.: , amostowska@wp.pl raca wpłynęła do Redakcji: r. o recenzji: r. Zaakceptowano do druku: r. Received: Revised: Accepted: