Mgr Agnieszka Kikulska

Wielkość: px

Rozpocząć pokaz od strony:

Download "Mgr Agnieszka Kikulska"

Patryk Przybysz
6 lat temu
Przeglądów:

1 Mgr Agnieszka Kikulska Dziedzina: nauki biologiczne Dyscyplina: biologia Wszczęcie: Temat: Zmiana poziomu ekspresji oraz polimorfizm genów Grainyhead-like (GRHL) u pacjentów z nieczerniakowatym rakiem skory Promotor: dr hab. Tomasz Wilanowski Recenzenci: prof. dr hab. Małgorzata Krajewska, dr hab. Anna Joanna Żaczek

2 STRESZCZENIE Geny Grainyhead-like (GRHL) kodują czynniki transkrypcyjne, które są niezbędne dla utrzymania prawidłowej struktury i funkcjonowania naskórka. Badania przeprowadzone na myszach z wyłączonymi genami z rodziny GRHL pozwoliły wykazać, że brak funkcjonalnych czynników transkrypcyjnych GRHL1 lub GRHL3 prowadzi do zaburzenia procesu powstawania wielowarstwowego naskórka oraz zwiększa ryzyko rozwoju raka kolczystokomórkowego skóry inicjowanego w warunkach laboratoryjnych za pomocą karcynogenów chemicznych. Na podstawie wyników tych badań została postawiona hipoteza, że w ludzkich nieczerniakowych rakach skóry (NMSC) dochodzi do uszkodzeń genów GRHL lub do zmian częstości występowania naturalnie występujących polimorfizmów, mających wpływ na poziom ekspresji genów GRHL lub funkcjonowanie białek GRHL. Przedmiotem niniejszej pracy była analiza sekwencji genów z rodziny GRHL w próbie populacji polskich pacjentów z nieczerniakowym rakiem skóry typu podstawnokomórkowego (BCC) i kolczystokomórkowego (SCC). Badania zostały przeprowadzone na próbkach tkanki rakowej oraz zdrowej tkanki, pochodzącej z marginesu wyciętej zmiany, pobranych od 33 pacjentów podczas zabiegów chirurgicznych, przeprowadzanych w Centrum Onkologii, Instytucie im. Marii Skłodowskiej-Curie w Warszawie (Klinika Tkanek Miękkich, Kości i Czerniaków). Do wzbogacenia puli DNA w wybrane fragmenty oraz przygotowania indeksowanych bibliotek dla 66 różnych próbek, została wykorzystana technika HaloPlex (Agilent). Głębokie ukierunkowane sekwencjonowanie następnej generacji w systemie MiSeq (Illumina) zostało przeprowadzone w jednostce usługowej Genomics Core Facility w Europejskim Laboratorium Biologii Molekularnej w Heidelbergu, Niemcy. Następnie, przeprowadzona została analiza bioinformatyczna, mająca na celu wyłonienie mutacji i polimorfizmów pojedynczych nukleotydów towarzyszących rozwojowi nieczerniakowego raka skóry. Badanie zmian poziomu ekspresji genów GRHL w próbkach raka w porównaniu do próbek zdrowej skóry przeprowadzono za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem sond TaqMan. Ponadto, wykonano analizę mającą na celu wytypowanie cząsteczek mikrorna, które potencjalnie mogą regulować poziom ekspresji genów GRHL. W toku dalszych badań przeprowadzone zostały eksperymenty, mające na celu potwierdzenie wpływu mikrorna mir-21-3p na poziom ekspresji genu GRHL1 w komórkach linii HaCaT.

3 Uzyskane wyniki badań pozwoliły stwierdzić, że geny GRHL nie ulegają uszkodzeniom de novo podczas powstawania i rozwoju nowotworów nie stwierdzono w nich mutacji, które występowałyby w próbce nowotworowej i nie były obecne w próbce zdrowej tkanki pobranej od tego samego pacjenta. Wykazano natomiast, że niektóre naturalnie występujące warianty genów GRHL pojawiają się w badanej populacji pacjentów statystycznie częściej niż w zdrowej populacji europejskiej. Jeden z takich wariantów - rs wpływa na zmianę sekwencji aminokwasowej białka GRHL3, co może rzutować na jego fosforylację i prawidłowe funkcjonowanie. Ponadto wykazano, że w badanych próbkach nieczerniakowych raków skóry poziom ekspresji dwóch genów GRHL1 i GRHL3 jest obniżony w stosunku do okalającej zdrowej tkanki. Uzyskany wynik sugeruje, że ekspresja obu tych genów może być regulowana w nieczerniakowych rakach skóry przez wspólny mechanizm, zależny od onkogennego mikrorna. Z danych literaturowych wynika, że ekspresja genu GRHL3 wyciszana jest przez mir-21-5p. W niniejszej pracy wstępnie wykazano, że poziom ekspresji genu GRHL1 w komórkach linii HaCaT zależy w warunkach in vitro od mir-21-3p. Opisane w niniejszej rozprawie badania zostały wykonane z wykorzystaniem zaawansowanych technik biologii molekularnej, w tym sekwencjonowania następnej generacji. Po raz pierwszy przeprowadzono równocześnie badania nad wszystkimi genami z rodziny GRHL w kontekście rozwoju różnych typów nieczerniakowego raka skóry i wskazano warianty genów GRHL, które występują w badanej grupie chorych ze zmienioną częstością, i w przyszłości mogą potencjalnie zostać wykorzystane do określania indywidualnych predyspozycji genetycznych do rozwoju nieczerniakowego raka skóry.

4 ABSTRACT The Grainyhead-like genes (GRHL) encode transcription factors that are essential for the maintenance of proper structure and function of the epidermis. Previous studies in Grhl knock-out mice have shown that the lack of functional transcription factor GRHL1 or GRHL3 increases susceptibility to squamous cell carcinoma development following chemical carcinogenesis of the skin. Based on these results, a hypothesis was proposed that there are genetic changes in GRHL genes associated with human non-melanoma skin cancers (NMSC), which may potentially affect GRHL gene expression or GRHL protein function. The main goal of the project was to analyze the sequence variability and expression profiles of all GRHL genes in the trial group of Polish patients with various types of nonmelanoma skin cancer squamous cell carcinoma (SCC) and basal cell carcinoma (BCC). The experiments were carried out on cancerous tissue as well as on control healthy tissue derived from the border of excision. In the study 33 patients surgically treated in the Maria Sklodowska-Curie Memorial Cancer Center and Institute of Oncology in Warsaw (Department of Soft Tissue/Bone Sarcoma and Melanoma) were enrolled. To examine genetic variation in the population of patients, targeted deep next-generation sequencing in MiSeq system (Illumina) was performed at the European Molecular Biology Laboratory, in Genomics Core Facility in Heidelberg, Germany. To enrich the pool of selected DNA fragments and prepare indexed DNA libraries, HaloPlex technique (Agilent) was used (n=66). Next, bioinformatic analysis of obtained data was performed. Examination of GRHL gene expression level changes in cancer tissue compared to healthy skin was performed with TaqMan Real-Time PCR technique. Furthermore, computational prediction of micrornas that potentially may regulate expression levels of GRHL genes in skin cancers was performed. Also, impact of mir-21-3p on GRHL1 expression was studied in vitro in HaCaT cell line. The results obtained in the study allowed to conclude that there are no de novo mutations in GRHL genes in non-melanoma skin cancer samples compared to healthy skin in the same patient. It has been shown, however, that some naturally occurring variants of GRHL genes appear in the examined population more or less frequently than in general European population with statistical significance. One of these variants - rs alters the amino acid sequence of GRHL3 protein, which may affect its posttranscriptional modification (phosphorylation) and proper protein functioning. It was further found that

5 the expression levels of two genes: GRHL1 and GRHL3 were reduced in skin cancer samples in a synchronized manner. Such pattern may suggest that the expression of both genes may be regulated by a common mechanism in non-melanoma skin cancers, for instance by oncogenic mir-21. It was previously shown that GRHL3 is regulated by mir-21-5p. In this work first evidence that mir-21-3p may regulates expression of GRHL1 was presented. Conducted research was performed with the use of highly advanced technique of molecular biology Next Generation Sequencing. For the first time all the GRHL genes were simultaneously analyzed in the context of non melanoma skin cancer development. Information about GRHL gene variants, which occur in the NMSC patients with an increased incidence, may be employed in the future to determine the individual s genetic predisposition to the development of non-melanoma skin cancer.

Podobne dokumenty

Katarzyna Durda STRESZCZENIE STĘŻENIE KWASU FOLIOWEGO ORAZ ZMIANY W OBRĘBIE GENÓW REGULUJĄCYCH JEGO METABOLIZM JAKO CZYNNIK RYZYKA RAKA W POLSCE

Pomorski Uniwersytet Medyczny Katarzyna Durda STRESZCZENIE STĘŻENIE KWASU FOLIOWEGO ORAZ ZMIANY W OBRĘBIE GENÓW REGULUJĄCYCH JEGO METABOLIZM JAKO CZYNNIK RYZYKA RAKA W POLSCE Promotor: dr hab. prof. nadzw.