Znaczenie współwystępowania polimorfizmów genów MTHFR, MTR, MTRR, TCII w hipotrofii płodu

Transkrypt

1 Perinatologia, Neonatologia i Ginekologia, tom 7, zeszyt 2, 72-80, 2014 Znaczenie współwystępowania polimorfizmów genów MTHFR, MTR, MTRR, TCII w hipotrofii płodu ANNA LORENC 1, GRAŻYNA KURZAWIŃSKA 1, 2, WITOLD KRAŚNIK 1, HUBERT WOLSKI 1, 3 AGNIESZKA SEREMAK-MROZIKIEWICZ 1, 2, KRZYSZTOF DREWS 1, 2 Streszczenie Cel pracy: Foliany pełnią kluczową rolę w syntezie i naprawie kwasów nukleinowych, reakcjach metylacji i metabolizmie homocysteiny (Hcy). Dlatego zmiany w związanym z folianami metabolizmie jednostek jednowęglowych mogą prowadzić do nieprawidłowego rozwoju płodu. Kluczowe reakcje w metabolizmie kwasu foliowego i Hcy katalizują reduktaza 5,10-metylenoterahydrofolianowa (MTHFR), syntaza metioninowa (MS), reduktaza syntazy metioniny (MTRR) i transkobalamina II (TCII). Badaliśmy związek genetycznych wariantów tych genów z wewnątrzmacicznym ograniczeniem wzrostu płodu. Materiał i metoda: Analizę genetyczną przeprowadzono używając metody PCR/RFLP. Badaliśmy sześć SNP w czterech genach związanych z metabolizmem folianów: MTHFR (rs , rs , rs ), MTR (rs ), MTRR (rs ), TCII (rs ) u 120 matek dzieci z hipotrofią (średnia waga urodzeniowa 1963,3 ± 601,0 g, 3,14 ± 2,83 percentyl) i u 120 zdrowych kobiet, które urodziły noworodka o prawidłowej masie (średnia waga urodzeniowa: 3490,3 ± 351,3 g, 52,2 ± 25,9 percentyl). Wyniki: Analizując warianty 1298A > C i 1793A > G MTHFR oraz 66A > G MTRR i 776C > G TCII nie uzyskano różnic statystycznie istotnych w częstości występowania genotypów i alleli. Dla polimorfizmu 677C > T MTHFR zaobserwowano przewagę częstości występowania genotypu 677TT w grupie z hipotrofią (677TT: 11,7 vs 6,7% w grupie kontrolnej, WR = 1,85, p = 0,13). Genotyp zmutowany 2756GG MTR występował dwukrotnie częściej w grupie badanej w porównaniu z grupą kontrolną (4,2 vs. 2,5%, WR = 1,70, p = 0,36). Ocena współwystępowania genotypów badanych polimorfizmów ujawniła wyższą frekwencję w grupie pacjentek z hipotrofią płodu kombinacji genotypów: 677TT MTHFR/ 776CG TCII (10,0 vs.2,5%, p = 0,01). Wnioski: Uzyskane wyniki dotyczące częstości występowania genotypów oraz alleli polimorfizmów 677C > T, 1298A > C, 1793G > A genu MTHFR, 2756A > G genu MTR, 66A > G genu MTRR oraz 776C > G genu TCII nie wskazują na ich bezpośredni związek z ryzykiem występowania hipotrofii płodu. Analiza współwystępowania badanych w pracy genotypów wskazała na możliwość ich interakcji wpływającej na wzrost ryzyka hipotrofii, a zwłaszcza łącznego wpływu wariantów: 677C > T, 1298A > C, 1793G > A genu MTHFR, 2756A > G genu MTR oraz 776C > G genu TCII. Słowa kluczowe: hipotrofia płodu, metabolizm folianów, polimorfizm, MTHFR, MTR, MTRR, TCII Wstęp Hipotrofia płodu, czyli ograniczenie wewnątrzmacicznego wzrastania płodu (IUGR, ang. intrauterine growth restriction), jest wieloczynnikowym powikłaniem ciąży, które w skrajnym przypadku prowadzi do zagrożenia życia płodu. Hipotrofię można rozpoznać, gdy dwukrotnie wykonane pomiary wykazują zbyt wolne tempo wzrastania płodu i/lub jego masa ciała jest mniejsza niż 2 odchylenia standardowe lub 10 percentyla w stosunku do wieku płodowego w danej populacji [1]. W około 40% przypadków hipotrofii nie udaje się znaleźć jednoznacznej przyczyny. W krajach rozwiniętych do najważniejszych czynników ryzyka zalicza się przede wszystkim palenie papierosów, zbyt mały przyrost masy ciała ciężarnej i małą masę ciała matki przed ciążą. Inne częste wymieniane czynniki ryzyka to rasa czarna, pierwsza ciąża, żeńska płeć noworodka, niski wzrost matki, wcześniejsze porody dzieci z małą masą urodzeniową, infekcje wewnątrzmaciczne oraz zaburzenia metaboliczne i genetyczne [2]. Udowodniono, że do prawidłowego rozwoju wewnątrzmacicznego płodu niezbędne jest utrzymanie 1 Klinika Perinatologii i Chorób Kobiecych, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu 2 Pracownia Biologii Molekularnej Kliniki Perinatologii i Chorób Kobiecych, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu 3 Oddział Ginekologii i Położnictwa, Podhalański Szpital Specjalistyczny im. Jana Pawła II w Nowym Targu

2 Znaczenie współwystępowania polimorfizmów genów MTHFR, MTR, MTRR, TCII w hipotrofii płodu 73 właściwego stężenia folianów w organizmie matki. Niedobór folianów u ciężarnej wywołuje negatywny wpływ na przebieg ciąży [3, 4]. Stąd wiele uwagi poświęca się zbilansowanej diecie ciężarnej z uwzględnieniem suplementacji folianami. Na świecie najwięcej dzieci z małą masą urodzeniową każdego roku przychodzi na świat w Indiach (około 40%), co przypisuje się diecie ubogiej w mięso i witaminę B12 [5]. Z drugiej strony zgodnie z hipotezą Barkera rozwojowego pochodzenia chorób wieku dorosłego (DOHaD, ang. Developmental Origin of Adult Diseases Hypothesis) nieprawidłowe żywienie w okresach intensywnego rozwoju organizmu: prenatalnym i wczesnym okresie postnatalnym, powoduje nieodwracalne adaptacyjne zmiany strukturalne, funkcjonalne i metaboliczne. Zwiększają one szansę płodu na przeżycie, ale poprzez zmiany epigenetyczne powodują wystąpienie chorób w późniejszym życiu [6]. Ponieważ właściwy rozwój wewnątrzmaciczny płodu zależny m.in. od dostępności folianów, dlatego szczególne zainteresowanie budzą badania związane z ich przemianami. Zaburzenia metabolizmu folianów, przez nadmiar homocysteiny mogą wpływać na implantację i embriogenezę oraz upośledzać tworzenie naczyń krwionośnych łożyska. Z kolei zahamowanie syntezy zasad potrzebnych do budowy DNA oraz upośledzenie metylacji DNA, może skutkować ograniczeniem proliferacji i różnicowania się komórek. Wszystkie te procesy mogą prowadzić do rozwoju powikłań w przebiegu ciąży, w tym do zaburzeń wzrastania płodu [7, 8]. Uwarunkowania hipotrofii wynikające z obecności polimorfizmów genetycznych enzymów uczestniczących w metabolizmie homocysteiny są częstym przedmiotem badań. Najlepiej poznanymi pod tym względem są warianty genetyczne enzymu reduktazy metylenotetrahydrofolianowej (MTHFR; EC ): 677C > T i 1298A > C [9, 10]. Natomiast wpływ polimorfizmu 1793G > A na występowanie hipotrofii opisuje tylko jedno doniesienie [11]. W metabolizmie folianów i jednostek jednowęglowych uczestniczy wiele enzymów wymagających licznych substratów i kofaktorów, które pełnią rolę w regulacji stężenia homocysteiny i folianów w osoczu oraz stężenia folianów w erytrocytach [12]. Kluczowym enzymem jest reduktaza MTHF katalizująca reakcję powstawania z 5,10-metylenotetrahydrofolianu metabolicznie czynnego 5-metylotetrahydroksyfolianu (5-metylo-THF), niezbędnego do regulowania stężenia metioniny i homocysteiny. Remetylacja homocysteiny katalizowana jest przez enzym syntazę metioniny (MTR; EC ) i zależy od dostępności donora grupy metylowej (5-metylo-THF) oraz kofaktora metylokobalaminy. Aktywność enzymu MTR wymaga obecności drugiego białka, reduktazy syntazy metioniny (MTRR; EC ), który utrzymuje grupę prostetyczną B12 w aktywnym zredukowanym stanie. Za transport witaminy B12 do komórki odpowiedzialna jest transkobalamina II (TCII). Polimorfizmy MTHFR 677C > T (A222V), 1298A > C (E429A), 1793G > A (R594Q), MTR 2756A > G (D919G), MTRR 66A > G (I22M) i TCII 776C > G (P259R) powodują zmianę sekwencji aminokwasowej i mogą wpływać na funkcję białka. Omawiane w pracy przemiany metabolizmu folianów, uczestniczących w nich białek z uwzględnieniem badanych w pracy polimorfizmów przedstawiono na rycinie 1. Ryc. 1. Schemat metabolizmu folianów z zaznaczeniem omawianych w pracy polimorfizmów Cel pracy Celem pracy była ocena częstości występowania genotypów i alleli oraz współwystępowania genotypów polimorfizmów wybranych genów metabolizmu folianów i zbadanie ich związku ze wzrostem ryzyka wystąpienia hipotrofii płodu. Materiał i metodyka Do badania zakwalifikowanych zostało 240 kobiet zamieszkujących region Wielkopolski, będących pacjentkami Ginekologiczno-Położniczego Szpitala Klinicznego nr 3 w Poznaniu. Grupę badaną stanowiło 120 matek dystroficznych noworodków, których masę urodzeniową oceniono poniżej lub na poziomie 10. percentyla, odpowiedniego do czasu trwania ciąży lub więcej niż dwa standardowe odchylenia poniżej średniej w stosunku do wieku ciąży (średnia masa

3 74 A. Lorenc, G. Kurzawińska, W. Kraśnik, H. Wolski, A. Seremak-Mrozikiewicz, K. Drews noworodka 1963,3 ± 601,2 g, 3,1 ± 2,8 centyl). Grupa kontrolna składała się ze 120 zdrowych ciężarnych, które urodziły noworodki z prawidłową masą ciała (średnia masa noworodka 3490,3 ± 351,3 g, 52,2 ± 25,9 centyl). Średnia wieku pacjentek w obydwu badanych grupach nie różniła się istotnie (29,3 ± 5,8 vs. 30,3 ± 4,6 lat, p = 0,14), natomiast średni czas zakończenia ciąży był istotnie statystycznie niższy w grupie badanej i wynosił 35,0 ± 3,2 tc. w porównaniu z grupą kontrolną: 39,2 ± 1,3 tc. (p < 0,0001). Z krwi obwodowej każdej pacjentki izolowano DNA (QIAamp DNA Blood Mini Kit, Niemcy), a następnie oznaczano polimorfizmy z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR, ang. polimerase chain reaction) i polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP, ang. restriction fragments length polymorphism). Metodykę zastosowaną w pracy przyjęto zgodnie z podawaną w następujących pozycjach literatury: rs [13], rs [14], rs [15], rs [16], rs [17] oraz rs [18]. Analiza statystyczna Analizę statystyczną uzyskanych w pracy wyników przeprowadzono z wykorzystaniem programu statystycznego SPSS 22.0 PL dla Windows. Do weryfikacji hipotezy o nieistotności różnicy badanego rozkładu zmiennej z rozkładem normalnym używano testu Kołmogorova-Smirnova z poprawką Lillieforsa, dla dwóch zmiennych niepowiązanych test t-studenta dla grup niezależnych. Do analizy statystycznej badań genetycznych wykorzystywano test chi kwadrat oraz test Fishera, obliczano współczynnik ryzyka (WR) przy uwzględnieniu odpowiednich przedziałów ufności (95%PU). Zgodność rozkładu genotypów z prawem Hardy ego-weinberga przeprowadzono za pomocą testu chi kwadrat. Za istotne statystycznie przyjęto te o wartościach p < 0,05. Wyniki Wyniki dotyczące częstości występowania poszczególnych genotypów oraz alleli wszystkich badanych w pracy polimorfizmów genu MTHFR przedstawiono w tabeli 1. Zaobserwowano niewielką różnicę w częstości występowania genotypu homozygotycznego 677TT pomiędzy badanymi grupami (677TT: 11,7 vs 6,7% w grupie kontrolnej, WR = 1,85, p = 0,13). Nie uzyskano również różnic w częstości występowania alleli tego polimorfizmu (677C: 69,6 vs. 68,7%, p = 0,46; 677T: 30,4 vs. 31,3%, p = 0,46). W zakresie polimorfizmu 1298A > C genu MTHFR analiza statystyczna nie ujawniła istotnych statystycznie różnic w częstości występowania genotypów: 1298AA: 45,0 vs. 48,3%, p = 0, AC: 47,5 vs. 46,7%, p = 0, CC: 7,5 vs. 5,0% p = 0,30, pomiędzy grupą badaną a kontrolną. Podczas analizy polimorfizmu 1793G > A zaobserwowano nieco większą częstość występowania heterozygot 1793GA (10,0 vs. 7,5%,WR = 1,37, p = 0,32) w grupie badanej oraz nieznaczną przewagę występowania zmutowanego allela 1793A w grupie badanej (5,0 vs. 3,8%, WR = 1,35, p = 0,33). W obu badanych grupach nie odnotowano obecności genotypu homozygotycznego zmutowanego 1793AA MTHFR. Uzyskane dane dotyczące częstości występowania poszczególnych genotypów oraz alleli polimorfizmów 2756A > G MTR, 66A > G MTRR oraz 776C > G TCII przedstawiono w tabeli 2. W zakresie polimorfizmu 2756A > G genu MTR zaobserwowano dwukrotnie częstsze występowanie genotypu zmutowanego 2756GG w grupie badanej w porównaniu z grupą kontrolną (4,2 vs. 2,5%), co jednak nie stanowiło istotnej statystycznie różnicy (WR = 1,70, p = 0,36). Częstość występowania alleli tego polimorfizmu nie różniła się pomiędzy grupą badaną i grupą kontrolną (2756A: 78,3 vs. 77,1%, p = 0,41; 2756G: 21,7 vs. 22,9%, p = 0,41). W badaniu nie stwierdzono również istotnych statystycznie różnic między grupą badaną i kontrolną pod względem częstości występowania genotypów polimorfizmu 66A > G MTRR oraz w zakresie częstości występowania alleli tego polimorfizmu (66A: 44,6 vs. 45,4%, WR = 0,97, p = 0,46; 66G: 55,4 vs. 54,6%, WR = 1,03, p = 0,46). W zakresie polimorfizmu 776C > G genu TCII zaobserwowano podobną częstość występowania genotypu zmutowanego 776GG w grupie badanej i grupie kontrolnej (776GG: 20,0 vs. 22,5%, WR = 0,86, p = 0,37). Również częstość występowania alleli 776C i 776G były zbliżone w grupie badanej i kontrolnej (766C: 53,8 vs. 54,2%, WR = 0,98, p = 0,50; 766G: 46,2% vs. 45,8%, WR = 1,02, p = 0,50). Współwystępowanie genotypów analizowanych polimorfizmów w badanych grupach Podczas analizy współwystępowania genotypów polimorfizmów 677C > T i 1298A > C oraz 1298A > C i 1793G > A genu MTHFR nie zaobserwowano żadnych różnic statystycznie istotnych między badanymi

4 Znaczenie współwystępowania polimorfizmów genów MTHFR, MTR, MTRR, TCII w hipotrofii płodu 75 Tabela 1. Częstość występowania genotypów i alleli polimorfizmów 677C > T, 1298A > C, 1793G > A genu MTHFR w grupie matek noworodków z hipotrofią płodu oraz w grupie kontrolnej MTHFR 677C > T MTHFR 1298A > C MTHFR 1793G > A MTHFR Hipotrofia płodu (n = 120) obserwowana n (%) oczekiwana (%) Grupa kontrolna (n = 120) obserwowana n (%) oczekiwana (%) WR 95%PU p CC 61 (50,8) 48,4 53 (44,1) 47,3 1,31 0,76-2,24 0,18 CT 45 (37,5) 42,3 59 (49,2) 42,9 0,62 0,36-1,07 0,045 TT 14 (11,7) 9,3 8 (6,7) 9,8 1,85 0,68-5,29 0,13 C 167 (69,6) 165 (68,7) 1,04 0,69-1,56 0,46 T 73 (30,4) 75 (31,3) 0,96 0,64-1,44 0,46 AA 54 (45,0) 47,3 58 (48,3) 51,4 1,02 0,59-1,72 0,52 AC 57 (47,5) 43,0 56 (46,7) 40,6 1,03 0,60-1,77 0,50 CC 9 (7,5) 9,8 6 (5,0) 8,0 1,54 0,47-5,43 0,30 A 165 (68,8) 172 (71,7) 0,87 0,57-1,31 0,27 C 75 (31,2) 68 (28,3) 1,15 0,76-1,73 0,27 GG 108 (90,0) 90,3 111 (92,5) 92,6 0,72 0,26-1,97 0,32 GA 12 (10,0) 9,5 9 (7,5) 7,2 1,37 0,51-3,84 0,32 AA 0 (0,0) 0,3 0 (0,0) 0,2 G 228 (95,0) 231 (96,2) 0,74 0,27-1,95 0,33 A 12 (5,0) 9 (3,8) 1,35 0,51-3,70 0,33 grupami kobiet zdrowych ciężarnych oraz matek dzieci z hipotrofią. Analiza współwystępowania genotypów polimorfizmów 677C > T i 1793G > A wykazała częstsze występowanie kombinacji genotypów 677TT/1793GG w grupie badanej z hipotrofią płodu (11,7 vs. 6,7%, WR = 1,85 PU 0,69-5,29, p = 0,13) oraz kombinacji genotypów 677CC/1793GA (6,6 vs. 3,3%, WR = 2,07, PU 0,53-9,64, p = 0,18). W przypadku polimorfizmów 677C > T genu MTHFR oraz 776C > G genu TCII zaobserwowano statystycznie istotnie częste współwystępowanie w grupie z hipotrofią genotypów 677TT/776CG (z dwoma zmutowanymi allelami polimorfizmu 677C > T MTHFR oraz jednym zmutowanym m polimorfizmu 776C > G TCII) (10,0 vs. 2,5%, WR = 4,33, PU 1,12-24,43, p = 0,01). Statystycznie istotną różnicę zaobserwowano także podczas analizy współwystępowania polimorfizmów 1298A > C genu MTHFR oraz 66A > G genu MTRR. Odnotowano częstsze współwystępowanie genotypów 1298CC/66AG w grupie z hipotrofią (z dwoma zmutowanymi allelami polimorfizmu 1298A > C MTHFR oraz jednym zmutowanym m polimorfizmu 66A > G MTRR) (5,8 vs. 0,8 w grupie kontrolnej, WR = 7,37, p = 0,03). Ze względu na małą liczbę pacjentek w badanych podgrupach obserwację tę należy jeszcze poddać kolejnej analizie. Dyskusja Foliany, witamina B6 oraz B12 są ważnymi czynnikami wpływającymi na metabolizm homocysteiny (Hcy). Hiperhomocysteinemia uważana jest za jeden

5 76 A. Lorenc, G. Kurzawińska, W. Kraśnik, H. Wolski, A. Seremak-Mrozikiewicz, K. Drews Tabela 2. Częstość występowania genotypów i alleli polimorfizmów 2756A > G genu MTR, 66A > G genu MTRR oraz 766C > G genu TCII w grupie matek noworodków z hipotrofią płodu oraz w grupie kontrolnej MTR, MTRR, TCII MTR 2756A > G MTRR 66A > G TCII 776C > G Hipotrofia płodu (n = 120) obserwowana n (%) oczekiwana (%) Grupa kontrolna (n = 120) obserwowana n (%) oczekiwana (%) WR 95%PU p AA 73 (60,8) 61,4 68 (56,7) 59,4 1,19 0,71-1,99 0,30 AG 42 (35,0) 33,9 49 (40,8) 35,3 0,78 0,46-1,32 0,21 GG 5 (4,2) 4,7 3 (2,5) 5,3 1,70 0,40-7,26 0,36 A 188 (78,3) 185 (77,1) 1,07 0,70-1,65 0,41 G 52 (21,7) 55 (22,9) 0,93 0,61-1,43 0,41 AA 23 (19,2) 19,9 23 (19,2) 20,6 1,00 0,53-1,90 0,57 AG 61 (50,8) 49,4 63 (52,5) 49,6 0,94 0,56-1,55 0,45 GG 36 (30,0) 30,7 34 (28,3) 29,8 1,08 0,62-1,89 0,44 A 107 (44,6) 109 (45,4) 0,97 0,67-1,39 0,46 G 133 (55,4) 131 (54,6) 1,03 0,72-1,48 0,46 CC 33 (27,5) 28,9 37 (30,8) 29,3 0,85 0,49-1,49 0,33 CG 63 (52,5) 49,7 56 (46,7) 49,7 1,26 0,76-2,10 0,22 GG 24 (20,0) 21,4 27 (22,5) 21,0 0,86 0,46-1,60 0,37 C 129 (53,8) 130 (54,2) 0,98 0,69-1,41 0,50 G 111 (46,2) 110 (45,8) 1,02 0,71-1,46 0,50 z istotnych czynników ryzyka chorób o podłożu naczyniowym [19, 20]. Liczne doniesienia wskazują także na jej możliwy udział w powstawaniu powikłań położniczych, m.in. nawracających poronień, wewnątrzmacicznego obumarcia płodu, przedwczesnego oddzielenia łożyska, a także ograniczenia wewnątrzmacicznego wzrastania płodu [21, 22]. Istnieją doniesienia o indukowaniu przez nadmiernie wysoki poziom homocysteiny apoptozy w komórkach trofoblastu i zmniejszeniu syntezy hcg in vitro, jak też o zależnym od stężenia Hcy wzroście kurczliwości myometrium izolowanego od ciężarnych, co razem może prowadzić do samoistnego poronienia [19, 23]. W metaanalizie Hogeveen i wsp. badano związek stężenia całkowitej homocysteiny (thcy) w surowicy matki z masą urodzeniową noworodka. Stwierdzono, że wyższe stężenia thcy nieznacznie są związane ze wzrostem ryzyka małej masy urodzeniowej [24]. Steegers-Theunissen i wsp. oceniali związek pomiędzy hiperhomocysteinemią a powikłaniami ciąży o możliwym pochodzeniu naczyniowym. Zaobserwowano związek podwyższonego poziomu homocysteiny na czczo (WR = 1,9) oraz po teście obciążenia metioniną (WR = 2,1) z występowaniem wewnątrzmacicznego ograniczenia wzrastania płodu. Podobną korelację potwierdzono dla nadciśnienia ciążowego [9]. W ostatnim czasie dużo uwagi poświęca się ocenie możliwego wpływu zaburzeń genetycznych w metabolizmie folianów oraz jego wpływu na rozwój powikłań położniczych, w tym hipotrofii płodu, z czego najwięcej dotyczy polimorfizmu 677C > T genu MTHFR. Kupferminc i wsp. zaobserwowali, że obec-

6 Znaczenie współwystępowania polimorfizmów genów MTHFR, MTR, MTRR, TCII w hipotrofii płodu 77 ność wariantu 677TT MTHFR była częstsza wśród 110 kobiet z powikłaniami położniczymi (22% vs. 8% w grupie kontrolnej, p = 0,005) [25]. Przewagę homozygotycznego genotypu 677TT wśród pacjentek z hipotrofią płodu w porównaniu z grupą kontrolną (27,3 vs. 8,2%, WR = 5,0) uzyskano również w pracy Alfirevic i wsp. (2002) [26]. Natomiast Murphy i wsp. badając wpływ polimorfizmu 677C>T genu MTHFR na rozwój powikłań położniczych, w tym IURG, nie zaobserwowali żadnego związku istotnego statystycznie (p = 0,7947) [27]. Do podobnych wniosków prowadzi badanie Vespryck i wsp., przeprowadzone na grupie matek noworodków z IUGR urodzonych we Francji. Częstość występowania homozygotycznego genotypu 677TT MTHFR nie różniła się istotnie statystycznie pomiędzy grupą badaną a kontrolną (11,3 vs. 15,5%, p = 0,52) [28]. Engel i wsp. zaobserwowali nieznaczne zwiększenie ryzyka urodzenia dziecka z hipotrofią u nosicielek allela 677T genu MTHFR rasy białej (WR = 1,2). Stwierdzono także u kobiet z genotypem zmutowanym 1298AA MTHFR zmniejszone ryzyko rozwoju hipotrofii w porównaniu z pacjentkami z genotypem 1298CC (WR = 0,6). Nie stwierdzono różnic we wpływie powyższych polimorfizmów w zależności od podaży folianów w diecie [10]. W badaniu kohortowym 5867 pacjentek przeprowadzonym w Norwegii (Hordalan Homocysteine Study), zaobserwowano nieznaczne zwiększanie ryzyka wystąpienia hipotrofii płodu wraz z ilością alleli 677T genu MTHFR (WR dla genotypu 677CC: 1,0, dla 677CT: 1,1, dla TT: 1,2, p = 0,04). Obecność genotypu 1298CC MTHFR wiązała się z nieco niższym ryzykiem rozwoju hipotrofii płodu (WR = 0,8, p = 0,06) [29]. Ueda i wsp. nie zaobserwowali współzależności pomiędzy stężeniem homocysteiny, folianów witaminy B12 w osoczu ciężarnych a polimorfizmem 677C > T genu MTHFR oraz występowaniem powikłań położniczych [30]. Niewątpliwie na wyniki prac duży wpływ ma wybór badanej populacji. Praca Klai i wsp. z Tunezji wskazuje na możliwą rolę polimorfizmu 1298A > C, ale nie 677C > T genu MTHFR w rozwoju IUGR. Uzyskano istotną statystyczną przewagę w częstości występowania zmutowanego genotypu 1298CC polimorfizmu 1298A > C MTHFR w grupie z hipotrofią (WR = 4,7, p = 0,001) [22]. W badaniu norweskiej grupy Fredriksen i wsp. (2007) analizowano u pacjentów związek parametrów biochemicznych (całkowitej homocysteiny (thcy), kwasu foliowego, witaminy B12, kwasu metylomalonowego (MMA), witamin B2 i B6 (PLP), choliny, betainy, dimetyloglicyny (DMG), cystationiny, cysteiny, metioniny i kreatyniny) z wariantami genetycznymi białek związanych z metabolizmem jednostek jednowęglowych. Analizowano 13 polimorfizmów m.in. badane również przez nas warianty MTHFR (677C > T, 1298A > C ), 2756A > G MTR, 66A > G MTRR i 766C > G TCII. Najsilniejszy związek zaobserwowano w przypadku polimorfizmu 677C > T MTHFR (wzrost thcy, natomiast stężenia kwasu foliowego, betainy, DMG i PLP malały wraz z ilością alleli 677T). Wpływ na stężenie thcy miały także polimorfizmy 1298A > C MTHFR i 2756A > G MTR. Statystycznie istotnego związku z żadnym z badanych parametrów biochemicznych nie stwierdzono dla polimorfizmu MTRR 66A > G. Transwersja 776C > G genu TCII miała niewielki wpływ na stężenie thcy, natomiast była związana ze wzrostem MMA, wskazując na ograniczenie dostępności wewnątrzkomórkowej kobalaminy [12]. Jedyną pracą badającą polimorfizm 1793G > A genu MTHFR w hipotrofii płodu jest praca z Meksyku, w której nie wykazano wpływu polimorfizmu 1793G > A, 677C > T oraz 1298A > C genu MTHRF na masę urodzeniową płodu, niezależnie od spożycia folianów oraz ekspozycji na ołów [11]. Obecnie prezentowane badanie nie ujawniło różnic istotnych statystycznie w zakresie częstości występowania genotypów i alleli wszystkich trzech badanych polimorfizmów genu MTHFR, co może wskazywać na brak bezpośredniego związku tych polimorfizmów z rozwojem hipotrofii płodu. Badając współwystępowania genotypów zaobserwowano natomiast mieszczącą się na granicy istotności statystycznej wyższą częstość występowania kombinacji 677CT/1793GG w grupie kontrolnej (45,0 vs. 34,1%, WR = 0,63, p = 0,05). Furness i wsp. zaobserwowali, że częstość występowania genotypów polimorfizmu 2756A > C nie różniła się istotnie w grupach z IUGR (n = 18) i w grupie kontrolnej (n = 42). Wyniki badania wskazały na możliwą rolę matczynego zmutowanego allela 2756G w rozwoju niewydolności maciczno-łożyskowej (obejmującej razem przypadki hipotrofii płodu i stanu przedrzucawkowego, p = 0,049), ale tylko u matek, które nie były suplementowane dużymi dawkami witamin z grupy B. Nie stwierdzono różnic istotnych statystycznie w częstości występowania genotypów polimorfizmu 66A > G genu MTRR pomiędzy bada-

7 78 A. Lorenc, G. Kurzawińska, W. Kraśnik, H. Wolski, A. Seremak-Mrozikiewicz, K. Drews nymi grupami oraz w stężeniu osoczowym folianów, witaminy B12, homocysteiny w zależności od genotypów 66A > G MTRR ciężarnej [31]. Cytowana już poprzednio praca Engel i wsp. oceniała także wpływ polimorfizmów 2756A > G genu MTR i 66A > G genu MTRR na występowanie mniejszej masy urodzeniowej płodu. Częstości występowania genotypów nie różniły się istotnie statystycznie dla obydwu wariantów pomiędzy grupą badaną i kontrolną zarówno dla rasy białej, jak i czarnej [10]. W prezentowanej pracy w badanych grupach uzyskano podobną częstość występowania alleli. Badanie współwystępowania polimorfizmów 677C > T genu MTHFR oraz 2756A > G genu MTR wykazało istotnie statystycznie większą częstość współwystępowania genotypów 677CT/2756AG w grupie kontrolnej (20,8 vs. 11,6% w grupie badanej, WR = 0,50, p = 0,04). W zakresie polimorfizmu 66A > G MTRR w naszym badaniu, podobnie jak w powyżej cytowanych pracach, nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic pomiędzy grupą badaną i kontrolną pod względem częstości występowania poszczególnych genotypów i alleli, co może wskazywać na brak jego bezpośredniego związku z rozwojem hipotrofii płodu i jest zgodne z wynikami badań Fredriksen i wsp. (2007) [12]. Uzyskane przez nas wyniki wskazują jednak na możliwy wpływ tego wariantu na rozwój hipotrofii w koincydencji z innymi polimorfizmami metabolizmu folianów. Wśród dostępnego piśmiennictwa nie odnaleziono prac badających związek pomiędzy hipotrofią płodu a polimorfizmem 766C > G genu transkobalaminy II. Obecna praca jest pierwszą próbą poruszenia tego zagadnienia. Zaobserwowano podobną częstość występowania alleli 766C (53,8 vs. 54,2%) oraz 776G (46,2% vs. 45,8%) w obydwu grupach. Ciekawą obserwacją była analiza współwystępowania genotypów: w przypadku polimorfizmów 776C > G genu TCII oraz polimorfizmu 677C > T genu MTHFR zaobserwowano częstsze współwystępowanie genotypów 677TT/776CG w grupie z hipotrofią (10,0 vs 2,5%, WR = 4,33, p = 0,01), co stanowiło istotną statystycznie różnicę. Współwystępowanie genotypów polimorfizmów 66A > G genu MTRR oraz 776C > G genu TCII ujawniło istotnie statystycznie większą częstość występowania kombinacji genotypów 66AA/776GG w grupie kontrolnej zdrowych kobiet ciężarnych (8,4 vs. 1,7% w grupie badanej, p = 0,02). Analiza badanych w pracy wariantów genetycznych nie wykazała bezpośredniego związku z występowaniem hipotrofii płodu, jednak współwystępowanie genotypów wskazuje na możliwy wpływ niektórych z nich na wzrost ryzyka hipotrofii. Badania polimorfizmów w genach kodujących białka związane z metabolizmem folianów mogą pomóc w zrozumieniu patomechanizmu powstawania hipotrofii płodu, a co się z tym wiąże również jego wczesne rozpoznanie i właściwy nadzór położniczy nad pacjentką. Wnioski 1) Uzyskane wyniki dotyczące częstości występowania genotypów oraz alleli polimorfizmów 677C > T, 1298A > C, 1793G > A genu MTHFR, 2756A > G genu MTR, 66A > G genu MTRR oraz 776C > G genu TCII nie wskazują na ich bezpośredni związek z ryzykiem występowania hipotrofii płodu. 2) Analiza współwystępowania badanych w pracy genotypów wskazała na możliwość interakcji badanych polimorfizmów wpływającej na wzrost ryzyka hipotrofii, a zwłaszcza łącznego wpływu wariantów: 677C > T, 1298A > C, 1793G > A genu MTHFR, 2756A > G genu MTR oraz 776C > G genu TCII. Piśmiennictwo [1] Haram K., Svendsen E., Myking O. (2007) Growth Restriction: Etiology, Maternal and Neonatal Outcome. A Review. Curr Women s Health Reviews. 3: [2] Valero De Bernabé J., Soriano T., Albaladejo R. i wsp. (2004) Risk factors for low birth weight: a review. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 116: [3] Forges T., Monnier-Barbarino P., Alberto J.M. i wsp. (2007) Impact of folate and homocysteine metabolism on human reproductive health. Hum. Reprod. Update 13: [4] Bergen N.E., Jaddoe V.W.V., Timmermans S. i wsp. (2012) Homocysteine and folate concentrations in early pregnancy and the risk of adverse pregnancy outcomes: the Generation R Study. BJOG. 119: [5] Yajnik C.S., Deshmukh U.S. (2012) Fetal programming: maternal nutrition and role of one-carbon metabolism. Rev. Endocr. Metab. Disord. 13: [6] Barker D.J. (2004) The developmental origins of adult disease. J. Am. Coll. Nutr. 23 (Suppl. 6): 588S-595S. [7] Di Simone N., Maggiano N., Caliandro D. i wsp. (2003) Homocysteine induces trophoblast cell death with apoptotic features. Biol. Reprod. 69:

8 Znaczenie współwystępowania polimorfizmów genów MTHFR, MTR, MTRR, TCII w hipotrofii płodu 79 [8] van Mil N.H., Oosterbaan A.M., Steegers-Theunissen R.P. (2010) Teratogenicity and underlying mechanisms of homocysteine on animal models: a review. Reprod Toxicol. 30: [9] Steegers-Theunissen R.P., Van Iersel C.A., Peer P.G. i wsp. (2004) Hyperhomocysteinemia, pregnancy complications, and the timing of investigation. Obstet. Gynecol. 104: [10] Engel S.M., Olshan A.F., Siega-Riz A.M. i wsp. (2006) Polymorphisms in folate metabolizing genes and risk for spontaneous preterm and small-for-gestational age birth. American Journal of Obstetrics and Gynecology 195: [11] Kordas K., Ettinger A.S., Lamadrid-Figueroa H. i wsp. (2009) Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T, A1298C and G1793A genotypes, and the relationship between maternal folate intake, tibia lead and infant size at birth. Br. J. Nutr. 102: [12] Fredriksen A., Meyer K., Ueland P.M. i wsp. (2007) Large-scale population-based metabolic phenotyping of thirteen genetic polymorphisms related to onecarbon metabolism. Hum. Mutat. 28: [13] Frosst P., Blom H., Milos R. i wsp. (1995) A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase. Nat. Genet. 10: [14] Hanson N.Q., Aras O., Yang F. i wsp. (2001) C677T and A1298C polymorphisms of the methylenetetrahydrofolate reductase gene: incidence and effect of combined genotypes on plasma fasting and post-methionine load homocysteine in vascular disease. Clin. Chem. 47: [15] Rady P.L., Szucs S., Grady J. i wsp. (2002) Genetic polymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and methionine synthase reductase (MTRR) in ethnic populations in Texas; a report of a novel MTHFR polymorphic site, G1793A. Am. J. Med. Genet. 107: [16] Harmon D.L., Shields D.C., Woodside J.V. i wsp. (1999) Methionine synthase D919G polymorphism is a significant but modest determinant of circulating homocysteine concentrations. Genet. Epidemiol. 17: [17] Wilson A., Platt R., Wu Q. i wsp. (1999) A common variant in methionine synthase reductase combined with low cobalamin (vitamin B12) increases risk for spina bifida. Mol. Genet. Metab. 67: [18] Miller J.W., Ramos M.I., Garrod M.G. i wsp. (2002) Transcobalamin II 775G > C polymorphism and indices of vitamin B12 status in healthy older adults. Blood. 100: [19] Ayar A., Celik H., Ozcelik O. i wsp. (2003) Homocysteine induced enhancement of spontaneous contractions of myometrium isolated from pregnant women. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 82: [20] Refsum H., Ueland P., Nygard O. i wsp. (1998) Homocysteine and cardiovascular disease. Ann. Rev. Med. 49: [21] Aubard Y., Darodes N., Cantaloube M. (2000) Hyperhomocysteinemia and pregnancy review of our present understanding and therapeutic implications. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 93: [22] Klai S., Fekih-Mrissa N., El Housaini S. i wsp. (2011) Association of MTHFR A1298C polymorphism (but not of MTHFR C677T) with elevated homocysteine levels and placental vasculopathies. Blood Coagulation & Fibrinolysis. 22: [23] Dudding T.E., Attia J. (2004) The association between adverse pregnancy outcomes and maternal factor V Leiden genotype: a meta-analysis. Thromb. Haemost. 91: [24] Hogeveen M., Blom H.J., den Heijer M. (2012) Maternal homocysteine and small-for-gestational-age offspring: systematic review and meta-analysis. Am. J. Clin. Nutr. 95: [25] Kupferminc M.J., Eldor A., Steinman N. i wsp. (1999) Increased frequency of genetic thrombophilia in women with complications of pregnancy. N. Engl. J. Med. 340: [26] Alfirevic Z., Roberts D., Martlew V. (2002) How strong is the association between maternal thrombophilia and adverse pregnancy outcome? A systematic review. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 101: [27] Murphy R.P., Donoghue C., Nallen R.J. i wsp. (2000) Prospective evaluation of the risk conferred by factor V Leiden and thermolabile methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms in pregnancy. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20: [28] Vespyck E., Le Cam-Duchez V., Goffinet F. et al. (2002) Thrombophilia and immunological disorders in pregnancies as risk factors for small for gestational age infants. Br. J. Obstet. Gynaecol. 109: [29] Nurk E., Tell G.S., Refsum H. i wsp. (2004) Associations between maternal methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms and adverse outcomes of pregnancy: the Hordaland Homocysteine Study. Am. J. Med. 117: [30] Ueda N., Reyes L., González-Medina A. i wsp. (2011) Physiologic changes in homocysteine metabolism in pregnancy: a longitudinal study in Spain. Nutrition. 27: [31] Furness D.L., Fenech M.F., Khong Y.T. i wsp. (2008) One-carbon metabolism enzyme polymorphisms and uteroplacental insufficiency. Am. J. Obstet. Gynecol. 199: J Grażyna Kurzawińska Pracownia Biologii Molekularnej Klinika Perinatologii i Chorób Kobiecych Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Poznań, ul. Polna 33 gene@gpsk.am.poznan.pl

9 80 A. Lorenc, G. Kurzawińska, W. Kraśnik, H. Wolski, A. Seremak-Mrozikiewicz, K. Drews Significance of coexistence of MTHFR, MTR, MTRR, TCII gene polymorphisms in fetal hypotrophy Objectives: Folate plays a key role in synthesis and repair of nucleic acids, methylation reactions and homocysteine (Hcy) metabolism. Therefore, alterations in the folate-mediated one-carbon metabolism may lead to abnormal fetal development. The 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR), methionine synthase (MS), methionine synthase reductase (MTRR) and transcobalamin II (TCII) regulate key reactions in the folate and Hcy metabolism. Therefore, we investigated whether the genetic variants of this genes are associated with intrauterine growth restriction. Material and methods: Genotyping was performed by PCR/RFLP method. We studied six SNPs in four folate metabolism genes: MTHFR (rs , rs , rs ), MTR (rs ), MTRR (rs ), TCII (rs ) in 120 mothers of children with fetal hypotrophy (mean birth weight 1963,3 ± 601,0 g, 3,14 ± 2,83 percentile) and in 120 healthy women, who delivered normal weight neonates (mean birth weight: 3490,3 ± 351,3 g, 52,2 ± 25,9 percentile). Results: No statistically significant differences were found in genotype and frequencies of the tested variants 1298 > C, 1793A > G MTHFR, and 66A > G MTRR, 776C > G TCII. For 677C > T polymorphism of MTHFR gene higher frequency of 677TT genotype observed in the IUGR group (677TT: 11,7 vs 6,7% in control group, WR = 1,85, p = 0,13). Mutated homozygous 2756GG genotype twice more frequent was observed in study group compared to control (4,2 vs. 2,5%, WR = 1,70, p = 0,36). Analysis of coexistence of genotypes revealed in study group the higher incidence of combination of genotypes: 677TT MTHFR/ 776CG TCII (10,0 vs. 2,5%, p = 0,01). Conclusons: The results on the prevalence of genotypes and s of SNPs 677C > T, 1298 > C, 1793G > A MTHFR, 2756 > G MTR, 66A > G MTRR and 776C > G gene TCII not indicate their direct relationship with the risk of IUGR. Analysis of co-occurrence of genotypes indicated the possibility of interactions affecting the increased risk of IUGR, especially the cumulative effect of variations: 677C > T, 1298 > C, 1793G > A MTHFR, 2756 > G MTR and 776C > G gene TCII.