Liposomy nośniki leków przeciwnowotworowych

Transkrypt

1 Liposomy nośniki leków przeciwnowotworowych mgr Patrycja Kozub Projektowanie, synteza i badanie nanonośników liposomowych do transferu leków (porfiryn, chloryn) do komórek nowotworowych (prof. dr hab. Alicja Ratuszna).

2 Wprowadzenie do technologii liposomowej Liposomy z gr. ciałka lipidowe. Są to struktury powstające samoistnie z fosfolipidów. Mają postać pęcherzyków zbudowanych z kilku lub kilkunastu przestrzeni wodnych oddzielonych od siebie zamkniętymi koncentrycznie dwuwarstwami fosfolipidowymi.

3 Budowa liposomu

4 Rodzaje fosfolipidów DSPC 18:0 - disterylofosfatydylocholina DPPG 16:0 - dipalmitylofosfatydyloglicerol DPPC 16:0 - dipalmitylofosfatydylocholina DSPG 18:0 - disterylofosfatydyloglicerol DSPE-PEG :0 disterylofosfatydyloetanoloamina -glikol polietylenowy DOTAP 18:1 - dioleoilometyloamoniopropan HSPC uwodorniona fosfatydylocholina

5 Mechanizm powstawania liposomów A. Kozubek, Wstęp do technologii liposomowej, Wrocław 2004

6 Podział liposomów 1. Wielowarstwowe pęcherzyki (MLV) o wielkości od 200 nm do kilku mikronów. 2. Duże jednowarstwowe pęcherzyki (LUV) o wielkości od 100 nm do 400 nm. 3. Małe jednowarstwowe pęcherzyki o wielkości od 25 nm do 100 nm. A. Sharma, U.S. Sharma, Int. J. Pharm., 1997, 154,

7 Inne podziały Ze względu na skład: konwencjonalne stabilne sferycznie modyfikowane Ze względu na ładunek: Jonowo obojętne kationowe anionowe K. Stebelska et al., Adv. Clin. Med. 2002, 11, 2,

8 Preparatyka liposomów 1. Metoda cienkiego filmu fosfolipidowego. A. Kozubek, Wstęp do technologii liposomowej, Wrocław 2004

9 2. Modyfikacje metody 1. a) Sonikacja A. Kozubek, Wstęp do technologii liposomowej, Wrocław 2004

10 b) Kalibracja przez filtry poliwęglanowe o ściśle określonej wielkości porów. A. Kozubek, Wstęp do technologii liposomowej, Wrocław 2004

11 c) Prasa Frencha 2. Wstrzykiwanie roztworu etanolowego A. Kozubek, Wstęp do technologii liposomowej, Wrocław 2004

12 Wykorzystanie liposomów jako nośników leków w terapii fotodynamicznej A.C. Kübler, Med Laser Appl, 2005, 20, 37-45

13 Leki zamknięte w formulacjach liposomowych Nazwa produktu Rok zatwierdzenia AmBisome 1990 Doxil 1995 ABELCET 1995 DaunoXome 1996 Substancja czynna Stosunek lipid:lek Amfoterycyna B 7:1 Doksyrubicyna 8:1 Amfoterycyna B 1:1 Daunorubicyna 15:1 Skład liposomów HSPC/Chol/DSPG -Alfa-tokoferol 4.26:1.04:1.68:0. 13 HSPC/Chol/DSPE -PEG :3.5:0.5 DMPC/DMPG 7:3 DSPC/Chol 2:1 Visudyne 2000 Werteporfiryna - Myocet 2001 Chlorowodorek doksorubicyna 19:1 EPC/Chol 2.5:1 DepoCyte 2002 cytarabina - Zastosowanie Poważne infekcje grzybicze Leczenie mięsaka Kaposiego u pacjentów z AIDS Poważne infekcje grzybicze Leczenie mięsaka Kaposiego u pacjentów z AIDS Zwyrodnienie plamki żółtej Leczenie kobiet z rakiem piersi z przerzutami Zapalenie opon mózgowych w wyniku przebiegu chłoniaka DepoDur 2004 Morfina - Ból po operacji

14 Chloryna D Materiał badawczy

15 Preparatyka liposomów metoda cienkiego filmu fosfolipidowego

16 Rodzaje badanych liposomów: 1. Obojętne: HSPC/Chol 7:3 HSPC/DSPE-PEG : Kationowe HSPC/DOTAP/Chol 6:1:3 HSPC/DOTAP/DSPE-PEG :1: Anionowe DPPC/DPPG 9:1 HSPC/DSPG/DSPE-PEG :1:0.5 Stężenie chloryny w 1 ml zawiesiny liposomów 100 μm.

17 Ocena stopnia miejsca zamykania się związku w liposomach Mikroskop fluorescencyjny Nikon Eclipsce 90i

18 Wykonanie zdjęć Seria 4 zdjęć: film lipidowy przed wzbudzenie film lipidowy po wzbudzeniu film lipidowy po podgrzaniu film lipidowy po podgrzaniu i wzbudzeniu Do wzbudzenia oraz obserwacji fluorescencji używano filtru TRITC (wzbudzenie światło zielone, emisja światło czerwone).

19 HSPC/DOTAP/DSPE-PEG 2000 z chloryną D 100 µm Film lipidowy po wzbudzeniem Film lipidowy przed wzbudzeniem 100 µm

20 HSPC/DOTAP/Chol z chloryną D 100 µm Film lipidowy po podgrzaniu i wzbudzeniu Film lipidowy po podgrzaniu 100 µm

21 HSPC/DOTAP/DSPE-PEG 2000 z chloryną D 100 µm Film lipidowy po podgrzaniu i wzbudzeniu Film lipidowy po podgrzaniu 100 µm

22 Analizator wielkości cząstek Zetasizer Nano ZS firmy Malver określenie wielkości pęcherzyków, ich stabilności oraz ocena polidyspersyjności.

23 Wykonanie pomiarów Kuweta polistyrenowa, cztery ścianki czynne optycznie. Źródło światła oświetlającego laser 633 nm. Detekcja światła wstecznie rozproszonego pod kątem 173 o. Pomiar wykonywany w temperaturze 25 o C. Wyniki uśredniano z 5 pomiarów.

24 Pomiar średnicy pęcherzyków HSPC/DOTAP/Chol Średnica: 217±6.21 PDI:0.21±0.02 HSPC/DOTAP/DSPE- PEG 2000 Średnica: 121.8±2.58 PDI:0.12±0.01

25 d [nm] PDI d [nm] PDI HSPC/DOTAP/Chol z chl D Stabilność 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 HSPC/DOTAP/Chol z chl D 24 h 48 h 72 h Po 3 miesiącach 24 h 48 h 72 h Po 3 miesiącach HSPC/DOTAP/DSPE-PEG 2000 z chl D 24 h 48 h 72 h Po 3 miesiącach 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 HSPC/DOTAP/DSPE-PEG 2000 z chl D 24 h 48 h 72 h Po 3 miesiącach

26 Test MTS ocena przeżywalności komórek Płytka kontrolna 1uM 1uM 1uM Płytka naświetlana 1uM 1uM 1uM k k k 2uM 2uM 2uM k k k 2uM 2uM 2uM 2.5 um 2.5 um 2.5 um 2.5 um 2.5 um 2.5 um 5uM 5uM 5uM 5uM 5uM 5uM Oświetlacz halogenowy wyposażony w 4 żarówki o mocach 250 W oraz filrt odcinający długości fali poniżej 630 nm.

27 Wykonanie eksperymentu

28 Frakcja przeżywająca [%] 120 HSPC/DOTAP/CHOL z chloryną D J/cm 2 12 J/cm 2 Kontrola 20 J/cm 2 4 J/cm 2 12 J/cm 2 20 J/cm 2 4 J/cm 2 12 J/cm 2 20 J/cm 2 4 J/cm 2 12 J/cm 2 20 J/cm 2 4 J/cm 2 12 J/cm 2 1 μm 1.5 μm 2 μm 5 μm 20 J/cm 2 10 μm

29 2 μm Frakcja przeżywająca [%] 140 HSPC/DOTAP/DSPE-PEG 2000 z chloryną D J/cm 2 Kontrola 20 J/cm 2 4 J/cm 2 12 J/cm 2 20 J/cm 2 4 J/cm 2 12 J/cm 2 20 J/cm 2 4 J/cm 2 12 J/cm 2 20 J/cm 2 4 J/cm 2 12 J/cm 2 1 μm 1.5 μm 2 μm 5 μm 20 J/cm 2 10 μm

30 Podsumowanie Mikroskop fluorescencyjny związek zamyka się w dwuwarstwie fosfolipidowej. Średnica badanych typów liposomów jest w okolicy 100 nm za wyjątkiem liposomów kationowych z cholesterolem. Pod kątem zmian średnicy cząsteczek w czasie liposomy są stabilne, jednakże występują zmiany wartości współczynnika polidyspersyjności (PDI < 0.3). Efekt PDT około 20% komórek nowotworowych przeżywa terapię. Cytotoksyczność ciemna występuje w przypadku podania związku zamkniętego w liposomach, ale dopiero powyżej stężenia 2µM.

31 Dziękuję za uwagę.