DETEKCJA W MIKRO- I NANOOBJĘTOŚCIACH. Ćwiczenie nr 3 Detektor optyczny do pomiarów fluorescencyjnych

Wielkość: px

Rozpocząć pokaz od strony:

Download "DETEKCJA W MIKRO- I NANOOBJĘTOŚCIACH. Ćwiczenie nr 3 Detektor optyczny do pomiarów fluorescencyjnych"

Helena Kalinowska
8 lat temu
Przeglądów:

1 DETEKCJA W MIKRO- I NANOOBJĘTOŚCIACH Ćwiczenie nr 3 Detektor optyczny do pomiarów fluorescencyjnych Cel ćwiczenia: Celem ćwiczenia jest zaznajomienie się z zasadą działania i zastosowaniami detektora optycznego do pomiarów fluorescencyjnych. W ramach ćwiczenia badana będzie charakterystyka czułościowa detektora dla róŝnych stęŝeń roztworu biologicznego. Opis stanowiska: 1. Źródło światła: laser 632 nm, moc 5 mw 2. Chip krzemowo-szklany 3. Kamera CCD z filtrem optycznym górnoprzepustowym FEL650 nm 4. Zasilacz do kamery (12 V) oraz lasera (3V) 5. Komputer z oprogramowaniem Kamera CCD Filtr Chip Stolik pozycjonujący LASER Przebieg ćwiczenia: Rysunek 1. Schemat układu pomiarowego do pomiaru fluorescencji Przygotowanie stanowiska: 1. Włączyć zasilanie lasera i kamery CCD 2. Włączyć komputer. 3. Uruchomić program do nagrywania filmów AmCap (skrót na Pulpicie). Przygotowanie roztworów pomiarowych: Dostępne roztwory na stanowisku pomiarowym: 1. Tris HCl 2. roztwór DNA o stęŝeniu 500 ng/µl 3. roztwór z barwnikiem fluorescencyjnym TO-PRO-3 Procedura przygotowania roztworów DNA w małych próbówkach o następujących stęŝeniach: 250 ng/µl, 50 ng/µl, 25 ng/µl, 5 ng/µl: a) roztwór o stęŝeniu DNA 250 ng/µl naleŝy wymieszać 20 µl roztworu DNA o stęŝeniu 500 ng/µl z 20 µl Tris HCl

Źródło światła: laser 632 nm, moc 5 mw 2. Chip krzemowo-szklany 3. Kamera CCD z filtrem optycznym górnoprzepustowym FEL650 nm 4. Zasilacz do kamery (12 V) oraz lasera (3V) 5.

2 b) roztwór o stęŝeniu DNA 50 ng/µl - naleŝy wymieszać 10 µl roztworu DNA o stęŝeniu 500 ng/µl z 90 µl Tris HCl c) roztwór o stęŝeniu DNA 25 ng/µl - naleŝy wymieszać 10 µl roztworu DNA o stęŝeniu 250 ng/µl z 90 µl Tris HCl d) roztwór o stęŝeniu DNA 5 ng/µl - naleŝy wymieszać 10 µl roztworu DNA o stęŝeniu 50 ng/µl z 90 µl Tris HCl Procedura przygotowania roztworów DNA z barwnikiem o stęŝeniach: 250 ng/µl, 125 ng/µl, 25 ng/µl, 12,5 ng/µl, 2,5 ng/µl: a) roztwór o stęŝeniu DNA 250 ng/µl - naleŝy wymieszać 10 µl roztwór DNA o stęŝeniu 500 ng/µl z 10 µl roztworu barwnika TO-PRO-3 b) roztwór o stęŝeniu DNA 125 ng/µl naleŝy wymieszać 10 µl roztwór DNA o stęŝeniu 250 ng/µl z 10 µl roztworu barwnika TO-PRO-3 c) roztwór o stęŝeniu DNA 25 ng/µl naleŝy wymieszać 10 µl roztwór DNA o stęŝeniu 50 ng/µl z 10 µl roztworu barwnika TO-PRO-3 d) roztwór o stęŝeniu DNA 12,5 ng/µl naleŝy wymieszać 10 µl roztwór DNA o stęŝeniu 25 ng/µl z 10 µl roztworu barwnika TO-PRO-3 e) roztwór o stęŝeniu DNA 2,5 ng/µl naleŝy wymieszać 10 µl roztwór DNA o stęŝeniu 5 ng/µl z 10 µl roztworu barwnika TO-PRO-3 Pomiary są wykonywane na próbkach o róŝnych stęŝeniach DNA z barwnikiem fluorescencyjnym. Pomiary sygnału fluorescencyjnego: 1. Sprawdzić, czy są podłączone laser oraz kamera CCD do zasilaczy 2. Umieścić chip krzemowo-szklany na stoliku pozycjonującym 3. Spozycjonować wiązkę lasera ze szklaną ścianą chipa za pomocą śrub mikrometrycznych w taki sposób, aby światło lasera wchodziło do środka celi pomiarowej (Rys. 2) Cela pomiarowa Wiązka światła Rys. 2 Schemat chipa 4. Walć 5 µl roztworu DNA z barwnikiem fluorescencyjnym do celi pomiarowej (rozpocząć pomiary od najmniejszego stęŝenia DNA) 5. Umieścić kamerę CCD dokładnie nad celą pomiarową 6. Sprawdzić, czy jest widoczna na ekranie komputera w programie AmCap wiązka światła w celi pomiarowej. W przypadku braku sygnału naleŝy ponownie justować wiązkę lasera ze szklaną ścianą chipa 7. W programie AmCap określić ścieŝkę zapisu filmu ( Capture Setup Capture to unallocated files Browse)

250 ng/µl, 125 ng/µl, 25 ng/µl, 12,5 ng/µl, 2,5 ng/µl: a) roztwór o stęŝeniu DNA 250 ng/µl - naleŝy wymieszać 10 µl roztwór DNA o stęŝeniu 500 ng/µl z 10 µl roztworu barwnika TO-PRO-3 b) roztwór o

3 8. W programie AmCap rozpocząć proces nagrywania filmu (Capture Start Capture) 9. Film powinien trwać ok. 4s. 10. Wyłączyć nagrywanie filmu poprzez wybranie Capture Stop Capture 11. Po wykonaniu pomiaru naleŝy opłukać chipa w wodzie dejonizowanej i rozpocząć procedurę pomiarową od nowa dla kolejnego stęŝenia DNA z barwnikiem Analiza danych pomiarowych: 1. Uruchomić program OPTOLABCARD software 2. Wybrać ścieŝkę zapisu wygenerowanego po analizie pliku xls oraz zdjęcia (Change dir) 3. Wczytać wybrany film do analizy (Select movie) 4. Po wczytaniu pliku w oknie po prawej stronie pojawi się obraz do analizy (Rys. 3) Analizowany obraz 5. W celu dokładnego zaznaczenia analizowanych punktów naleŝy powiększyć analizowany obszar poprzez naciśnięcie Enlarge area i zakreślenie tylko obszaru celi pomiarowej. 6. NaleŜy wybrać obszary, które będą poddane analizie. W tym celu naleŝy wybrać 2 pola do analizy (1 i 2). Jedno z nich powinno znajdować się w obszarze świecenia wiązki laserowej (sygnał fluorescencji) a drugie poza nią (sygnał tła), ale w obszarze celi pomiarowej. Pola do analizy nie powinny przekraczać wymiarów 3x3. W celu dokładnego narysowania pola do analizy moŝna się posługiwać precyzyjnymi strzałkami (Rys. 4).

Uruchomić program OPTOLABCARD software 2. Wybrać ścieŝkę zapisu wygenerowanego po analizie pliku xls oraz zdjęcia (Change dir) 3. Wczytać wybrany film do analizy (Select movie) 4.

Rozmiar pól analizowanych Pola analizowane Precyzyjne strzałki 7. W celu dokonania analizy zaznaczonych pól naleŝy wcisnąć przycisk Measure.

Krzywe pomiarowe 8. PowyŜsze czynności naleŝy wykonać dla wszystkich stęŝeń DNA z barwnikiem Opracowanie wyników: 1.

4 Rozmiar pól analizowanych Pola analizowane Precyzyjne strzałki 7. W celu dokonania analizy zaznaczonych pól naleŝy wcisnąć przycisk Measure. Spowoduje to pojawienie się krzywych pomiarowych w lewej części programu (Rys. 5) oraz automatycznie zostaną wygenerowane pliki xls oraz bmp do katalogu, który był wskazany na początku. Krzywe pomiarowe 8. PowyŜsze czynności naleŝy wykonać dla wszystkich stęŝeń DNA z barwnikiem Opracowanie wyników: 1. Dla danego stęŝenia DNA z barwnikiem naleŝy odjąć sygnał tła od sygnału fluorescencji w programie Excel lub Origine. Z uzyskanej róŝnicy naleŝy wybrać jeden punkt pomiarowy. 2. Czynności te naleŝy powtórzyć dla kaŝdego z mierzonych stęŝeń DNA z barwnikiem 3. Końcowym wynikiem analizy danych pomiarowych jest wykres intensywności fluorescencji w zaleŝności od stęŝenia DNA z barwnikiem. Przykład takiego wykresy jest przedstawiony na rys. 6

Podobne dokumenty

ZASTOSOWANIE MIKROSYSTEMÓW W MEDYCYNIE LABORATORIUM. Ćwiczenie nr 4 MIKROCYTOMETR DO BADANIA KOMÓREK BIOLOGICZNYCH

ZASTOSOWANIE MIKROSYSTEMÓW W MEDYCYNIE LABORATORIUM Ćwiczenie nr 4 MIKROCYTOMETR DO BADANIA KOMÓREK BIOLOGICZNYCH Cel ćwiczenia: Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z budową i warunkami działania mikrocytometru