(12) OPIS PATENTOWY (19)PL

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19)PL (2 1) N um er zgłoszenia: (2 2 ) D ata zgłoszenia: (86) D ata i num er zgłoszenia m iędzynarodow ego: , PCT/EP98/00817 (87) Data i num er publikacji zgłoszenia m iędzynarodow ego: , W098/36736, PCT Gazette nr 34/98 (11) (13) B1 (51 ) IntCl7 A61K 9/127 A61K 38/13 A61K 31/41 (54)Liofilizowana kompozycja zawierająca trehalozę i lipidowe liposomy i sposób liofilizacji kompozycji zawierającej trehalozę i lipidowe liposomy (30) Pierwszeństwo: ,IT,MI97A (73) Uprawniony z patentu: AZIENDE CHIMICHE RIUNITE ANGELINI FRANCESCO A.C.R.A.F. S.P.A., Rzym, IT (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 08/00 (72) Twórcy wynalazku: Giovanni Cavallo, Ostia, IT Leonardo Marchitto, Cupra Marittima, IT (45) o udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 12/05 (74) Pełnomocnik: Zofia Szczepańska, PATPOL Sp. z o.o. PL B1 (57) 1. Liofilizowana kompozycja zawierająca trehalozę i lipidowe liposomy, w których y zamknięta jest biologicznie aktywna substancja, znamienna tym, że rozpuszczalność w wodzie biologicznie czynnej substancji jest równa lub niższa niż 0,01% (w/v), stosunek wagowy trehaloza/lipid jest < 1,5, a cała trehaloza została dodana do zewnętrznej strony liposomów, uformowanych już przed liofilizacją. 8. Sposób liofilizacji kompozycji zawierającej trehalozę i lipidowe liposomy, do których została wprowadzona biologicznie aktywna substancja, znamienny tym, że: a) od 0,2 do 1,5 części wagowych trehalozy dodaje się do każdej części wagowej lipidów wodnej kompozycji liposomowej, w której średnia wielkość liposomów mieści się w zakresie pomiędzy 50 i 250 nm, które to liposomy zawierają biologicznie aktywną substancję, której rozpuszczalność w wodzie jest równa lub niższa niż 0,01% (w/v); b) powyższą kompozycję chłodzi się przy pomocy płyty chłodzącej liofilizera do temperatury pomiędzy -5 C a -70 C z szybkością chłodzenia pomiędzy 0,5 C a 2 C/min; c) po osiągnięciu założonej temperatury zamrażania powyższą kompozycję utrzymuje się w tej temperaturze w ciągu okresu pomiędzy 2 i 5 godzin; d) stosuje się próżnię pomiędzy 50 i 8 Pa, pozostawiając temperaturę płyty chłodzącej określoną w punkcie b) w okresie pomiędzy 2 a 5 godzin; e) temperaturę płyty chłodzącej podnosi się do -15 C i utrzymuje się do całkowitego usunięcia wody.

2 Liofilizowana kompozycja zawierająca trehalozę i lipidowe liposomy i sposób liofilizacji kompozycji zawierającej trehalozę i lipidowe liposomy Zastrzeżenia patentowe 1. Liofilizowana kompozycja zawierająca trehalozę i lipidowe liposomy, w których zamknięta jest biologicznie aktywna substancja, znamienna tym, że rozpuszczalność w wodzie biologicznie czynnej substancji jest równa lub niższa niż 0,01% (w/v), stosunek wagowy trehaloza/lipid jest < 1,5, a cała trehaloza została dodana do zewnętrznej strony liposomów, uformowanych już przed liofilizacją. 2. Liofilizowana kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że biologicznie aktywna substancja, która jest wysoce nierozpuszczalna w wodzie, jest wybrana z grupy składającej się z lonidaminy, melatoniny, cyklosporyny-a i bindanitu. 3. Liofilizowana kompozycja według zastrz. 1 lub 2, znamienna tym, że lipidy są wybrane z grupy składającej się z fosfoglicerydów, glicerydów, diglicerydów, triglicerydów, fosfolipidów, lipidów galaktozylowych i glikozylowych, cholesterolu i jego pochodnych, sfingolipidów i ich mieszanin. 4. Liofilizowana kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że lipidami są fosfolipidy. 5. Liofilizowana kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że stosunek wagowy trehaloza/lipid mieści się pomiędzy 1:2 i 1:1. 6. Liofilizowana kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że średnia wielkość liposomów mieści się pomiędzy 50 i 250 nm. 7. Liofilizowana kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że średnia wielkość liposomów mieści się pomiędzy 50 a 100 nm. 8. Sposób liofilizacji kompozycji zawierającej trehalozę i lipidowe liposomy, do których została wprowadzona biologicznie aktywna substancja, znamienny tym, że: a) od 0,2 do 1,5 części wagowych trehalozy dodaje się do każdej części wagowej lipidów wodnej kompozycji liposomowej, w której średnia wielkość liposomów mieści się w zakresie pomiędzy 50 i 250 nm, które to liposomy zawierają biologicznie aktywną substancję, której rozpuszczalność w wodzie jest równa lub niższa niż 0,01% (w/v); b) powyższą kompozycję chłodzi się przy pomocy płyty chłodzącej liofilizera do temperatury pomiędzy -5 C a -70 C z szybkością chłodzenia pomiędzy 0,5 C a 2 C/min; c) po osiągnięciu założonej temperatury zamrażania powyższą kompozycję utrzymuje się w tej temperaturze w ciągu okresu pomiędzy 2 i 5 godzin; d) stosuje się próżnię pomiędzy 50 i 8 Pa, pozostawiając temperaturę płyty chłodzącej określoną w punkcie b) w okresie pomiędzy 2 a 5 godzin; e) temperaturę płyty chłodzącej podnosi się do -15 C i utrzymuje się do całkowitego usunięcia wody. 9. Sposób liofilizacji według zastrz. 8, znamienny tym, że w fazie b) temperatura zamrażania mieści się pomiędzy -20 C a -30 C. 10. Sposób liofilizacji według zastrz. 8 lub 9, znamienny tym, że w fazie b) szybkość chłodzenia wynosi 0,77 C/min. 11. Sposób liofilizacji według zastrz. 8, znamienny tym, że w fazie c) czas wynosi 3 godziny. 12. Sposób liofilizacji według zastrz. 8, znamienny tym, że w fazie d) próżnia wynosi 6 Pa. * * * Przedmiotem wynalazku jest liofilizowana kompozycja zawierająca trehalozę i lipidowe liposomy i sposób liofilizacji kompozycji zawierającej trehalozę i lipidowe liposomy. Kompozycja ta stanowi preparat farmaceutyczny, zawierający liofilizowane liposomy otaczające biologicznie aktywną substancję, która jest wysoce nierozpuszczalna w wodzie.

3 Preparat farmaceutyczny, zawierający liofilizowane liposomy otaczające biologicznie aktywną substancję, która jest wysoce nierozpuszczalna w wodzie, jest stabilny w czasie. W opisie i zastrzeżeniach patentowych przedmiotowego wynalazku określenie wysoce nierozpuszczalna w wodzie stosuje się do takich substancji, które mają rozpuszczalność w wodzie 0,01% (w/v). Wiadomo, że stosowanie liposomów w praktyce medycznej zapobiegało trudnościom występującym przy otrzymywaniu preparatów farmaceutycznych, które są wystarczająco stabilne zarówno podczas liofilizacji, jak i w czasie. Powyższe trudności polegają przede wszystkim na wytwarzaniu liposomów, które nie rozstępują się ani nie zbijają się razem. Innymi słowy liposomy powinny pozostać całe i oddzielone od siebie. Strukturalna integralność liposomów jest szczególnie ważna w przypadku, gdy aktywna substancja jest wysoce nierozpuszczalna w wodzie. Ze względu na fakt, że rozerwanie liposomów podczas liofilizacji i/lub podczas przechowywania nie zapobiega przed przechodzeniem do roztworu rozpuszczalnych w wodzie aktywnych substancji podczas gdy wodny roztwór liposomów rekonstytuuje się przed podaniem pacjentowi przez dodanie roztworu fizjologicznego. Z drugiej strony w przypadku rozerwania liposomów zawierających aktywne substancje, które są wysoce nierozpuszczalne w wodzie, rekonstytuowanie się liofilizatu daje roztwór, zawierający mniej aktywnej substancji niż to jest wymagane. Im więcej jest rozerwanych liposomów, tym większa jest różnica pomiędzy teoretyczną i aktualną ilością aktywnej substancji w roztworze. Metodę liofilizacji rozpuszczalnych w wodzie biologicznie aktywnej substancji, zawierającej liposomy ujawniono w opisie patentowym US-A Dokument ten opisuje liofilizację liposomów o średniej wielkości około nm, z dodatkiem jako środka konserwującego, disacharydu jedynie po wewnętrznej stronie (z zawartością zamkniętą przez liposomy), lub jedynie po zewnętrznej stronie, albo po obu stronach, wewnętrznej i zewnętrznej. Stosunek wagowy disacharyd/lipid mieści się w zakresie 0,1:1 i 4:1. Korzystną disacharoząjest trehaloza. Fazę zamrażania prowadzi się w temperaturze ciekłego azotu (-195,8 C). W powyższym dokumencie charakterystyki stabilności podczas liofilizacji określano drogą pomiaru pozostałości zamkniętej aktywnej substancji w liposomach po rekonstytucji liofilizatu przez rehydrację. Tabela 2 w wyżej wspomnianym opisie patentowym pokazuje, że pozostałość jest wysoka (99-100%) jedynie wtedy, gdy stosunek trehaloza/lipid jest wyższy niż 1,76, a trehaloza obecna jest zarówno po wewnętrznej, jak i po zewnętrznej stronie liposomów. Jeśli ten stosunek jest równy 0,11 i 0,19, pozostałość wynosi odpowiednio 22% i 49%, nawet, gdy trehaloza obecna jest zarówno po wewnętrznej jak i po zewnętrznej stronie liposomów. W przeciwieństwie do tego, jeśli trehaloza obecna jest tylko po wewnętrznej stronie, ilość zatrzymanej aktywnej substancji jest drastycznie zmniejszona, nawet przy bardzo dużych ilościach trehalozy. Nawet przy stosunku trehaloza/lipid 3,9, ilość zatrzymana wynosi tylko 26%. Nie mniej powyższe wyniki nie są powtarzalne, jeśli biologicznie aktywna substancja jest wysoce nierozpuszczalna w wodzie. Faktycznie, jeśli dodaje się trehalozę podczas wytwarzania liposomów w celu zamknięcia jej w pęcherzykach lipidu, otrzymuje się niejednorodną, nie dającą się wytłaczać zawiesinę (preparaty porównawcze 1 i 2). Nieoczekiwanie stwierdzono, że liposomy zawierające biologicznie aktywne substancje, które są wysoce nierozpuszczalne w wodzie, pozostają w zasadzie całe podczas liofilizacji, jeśli trehalozę dodaje się w małych ilościach do liposomów jedynie przed liofilizacją, samą liofilizację osiąga się prowadząc fazę zamrażania w temperaturze pomiędzy -5 C i -70 C. Liofilizowana kompozycja zawierająca trehalozę i lipidowe liposomy, w których zamknięta jest biologicznie aktywna substancja, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że rozpuszczalność w wodzie biologicznie czynnej substancji jest równa lub niższa niż 0,01% (w/v), stosunek wagowy trehaloza/lipid jest 1,5, a cała trehaloza została dodana do zewnętrznej strony liposomów, uformowanych już przed liofilizacją. Korzystnie, kompozycja zawiera biologicznie aktywną substancję, która jest wysoce nierozpuszczalna w wodzie, wybraną z grupy składającej się z lonidaminy, melatoniny, cyklosporyny-a i bindanitu.

4 Korzystnie, kompozycja zawiera lipidy wybrane z grupy składającej się z fosfoglicerydów, glicerydów, diglicerydów, triglicerydów, fosfolipidów, lipidów galaktozylowych i glikozylowych, cholesterolu i jego pochodnych, sfingolipidów i ich mieszanin. Korzystniej, kompozycja jako lipidy zawiera fosfolipidy. Korzystnie, w kompozycji stosunek wagowy trehaloza/lipid mieści się pomiędzy 1:2 i 1:1. Korzystnie, w kompozycji średnia wielkość liposomów mieści się pomiędzy 50 i 250 nm. Bardziej korzystnie, w kompozycji średnia wielkość liposomów mieści się pomiędzy 50 a 100 nm. Sposób liofilizacji kompozycji zawierającej trehalozę i lipidowe liposomy, do których została wprowadzona biologicznie aktywna substancja, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że: a) od 0,2 do 1,5 części wagowych trehalozy dodaje się do każdej części wagowej lipidów wodnej kompozycji liposomowej, w której średnia wielkość liposomów mieści się w zakresie pomiędzy 50 i 250 nm, które to liposomy zawierają biologicznie aktywną substancję, której rozpuszczalność w wodzie jest równa lub niższa niż 0,01% (w/v); b) powyższą kompozycję chłodzi się przy pomocy płyty chłodzącej liofilizera do temperatury pomiędzy -5 C a -70 C z szybkością chłodzenia pomiędzy 0,5 C a 2 C/min; c) po osiągnięciu założonej temperatury zamrażania powyższą kompozycję utrzymuje się w tej temperaturze w ciągu okresu pomiędzy 2 i 5 godzin. d) stosuje się próżnię pomiędzy 50 i 8 Pa, pozostawiając temperaturę płyty chłodzącej określoną w punkcie b) w okresie pomiędzy 2 a 5 godzin. e) temperaturę płyty chłodzącej podnosi się do -15 C i utrzymuje się do całkowitego usunięcia wody. Korzystnie, w fazie b) sposobu temperatura zamrażania mieści się pomiędzy -20 C a -30 C. Korzystnie, w fazie b) sposobu szybkość chłodzenia wynosi 0,77 C/min. Korzystnie, w fazie c) sposobu czas wynosi 3 godziny. Korzystnie, w fazie d) sposobu próżnia wynosi 6 Pa. Po rekonstytucji przez hydratację kompozycja zatrzymuje w roztworze więcej niż 95% biologicznie aktywnej substancji, która jest wysoce nierozpuszczalna w wodzie (przykłady 1,2 i 3). Typowe przykłady biologicznie aktywnych substancji, które są wysoce nierozpuszczalne w wodzie stanowią lonidamina, melatonina, cyklosporyna-a i bindaryt. Lipidy kompozycji liposomowej, która ma być poddana procesowi liofilizacji według wynalazku korzystnie wybrane są z grupy składającej się z fosfoglicerydów, glicerydów, diglicerydów, triglicerydów, fosfolipidów, lipidów galaktozylowych i glikozylowych, cholesterolu i jego pochodnych, sfingolipidów i ich mieszanin. Korzystnymi lipidami są fosfolipidy. Stosunek wagowy trehaloza/lipid z kolei korzystnie mieści się pomiędzy 1:2 i 1:1. Średnia wielkość liposomów może wynosić pomiędzy 50 i 250 nm. Korzystna wielkość mieści się pomiędzy 50 i 100 nm. Korzystne warunki pracy w sposobie liofilizacji są następujące: Faza 2: temperatura zamrażania -20 C do -30 C, szybkość chłodzenia: 0,77 C/min; Faza 3: czas: 3 godziny; Faza 4: próżnia: 6 Pa; Faza 5: a) jeśli temperatura zamrażania (faza 2) jest niższa niż -15 C, temperaturę płyty chłodzącej obniża się do -15 C z szybkością pomiędzy 0,5 C a 2 C, a liofilizacja trwa 20 godzin, po czym temperaturę płyty chłodzącej podnosi się do -10 C, a po godzinie do +5 C, a liofilizacja następuje po 16 godzinach, b) jeśli temperatura zamrażania (faza 2) jest wyższa lub równa -15 C, liofilizację kontynuuje się w ciągu 20 godzin, po których temperaturę płyty chłodzącej utrzymuje się +5 C, a liofilizacja następuje w ciągu 16 godzin. Szczególnie korzystna kompozycja liposomowa według wynalazku zawiera: Składnik % (wagowych) Fosfatydylocholina 94 Lizofosfatydykocholina 3 N-acylo-etanoloamina 1

5 Fosfatydylo-etanoloamina 0,1 Triglicerydy 1 Wolne kwasy tłuszczowe 0,75 DL-α-tokoferol 0,15 Zazwyczaj wodną kompozycję liposomową według wynalazku wytwarza się przez: a) dyspergowanie biologicznie aktywnej substancji, która jest wysoce nierozpuszczalna w wodzie w lipidach w temperaturze pomiędzy 20 C a 30 C; b) zawieszanie tej dyspersji w fazie wodnej; c) pozostawienie tej zawiesiny w temperaturze otoczenia na okres pomiędzy 0 a 48 godzin; d) ogrzewanie do temperatury pomiędzy 30 C a 75 C wciągu minut; e) zamrażanie do temperatury pomiędzy -150 C a -200 C; f) powtórzenie faz d) i e) co najmniej dwukrotnie i nie więcej niż 8 razy; g) filtrowanie przez membranę filtracyjną o średnicy porów nm; h) wytłaczanie przez membranę o średnicy porów nm; i jednocześnie; i) eliminowanie nie zamkniętej aktywnej substancji. Czas trwania fazy c) zależy od ilości aktywnej substancji wysoce nierozpuszczalnej w wodzie, która jest przeznaczona do zamknięcia przez liposomy. Fachowiec w tej dziedzinie nie będzie miał trudności w określeniu odpowiedniego czasu drogą kilku prostych rutynowych eksperymentów z każdym z typów kompozycji aktywnych substancji i liposomów. Korzystnie fazę wodną stanowi 0,05%-0,9% (w/v) wodny roztwór chlorku sodu. Typowo ilość użytych lipidów wynosi 0,01-0,4 części na każdą część wodnego roztworu. Z kolei ilość aktywnej substancji generalnie wynosi pomiędzy 0,01 i 0,3 części wagowych na każdą część wagową lipidów. Generalnie wytłaczanie przeprowadza się stosując jako gaz wytłaczający sprężone powietrze lub neutralny gaz wybrany z grupy składającej się z azotu, helu i argonu. Korzystnym neutralnym gazem jest hel. Ciśnienie w fazie wytłaczania korzystnie wynosi pomiędzy 500 a 5500 kpa, a temperatura mieści się pomiędzy 20 C a 75 C, a nawet bardziej korzystnie pomiędzy 40 C a 65 C. Typowe przykłady typów odpowiednich urządzeń do wytłaczania stanowią Lipex Biomembranes TTiermobarrel Extruder lub Emulsiflex CC Avestin z poliwęglanową membraną Costar o średnicy porów pomiędzy 50 i 600 nm. Postępując w opisany wyżej sposób, otrzymuje się wodne kompozycje, zawierające około 8 mg/ml melatoniny, 3,8 mg/ml lonidaminy, 1 mg/ml cyklosporyny-a i 4 mg/ml bindarytu, przy rozpuszczalności w wodzie 3x10-3 mg/ml (lonidaminy), 1x l0-1 mg/ml (bindarytu) i praktycznie absolutnej nierozpuszczalności melatoniny (G. S. Shida i in. J. Pineal Res. 1994, 16, ) i cyklosporyny-a [ nierozpuszczalna w wodzie, monografia o cyklosporynie-a w Analitical Profiles o f Drug Substances, 16, 163, (1987)]. Poniższe przykłady powinny służyć jako ilustracja przedstawionego wynalazku, bez jakiegokolwiek jego ograniczenia. Preparat I W sposób opisany niżej wytworzono kompozycję liposomową, zawierającą wysoce nierozpuszczalną biologicznie aktywną substancję. 100 mg melatoniny dyspergowano w 1 g fosfolipidów w temperaturze 30 C w ciągu 10 minut przy pomocy homogenizatora typu Ultraturrax. Bezpośrednio po tym powyższą dyspersję zawieszono w 10 ml 0,9% (w/v) wodnego roztworu chlorku sodu przy pomocy tego samego homogenizatora, po czym ogrzano na łaźni wodnej o temperaturze 55 C w ciągu 20 minut. Tak otrzymaną zawiesinę poddano następującemu cyklowi chłodzenia i ogrzewania: - chłodzenie w ciekłym azocie w ciągu 1 minuty, - ogrzewanie w temperaturze 55 C do całkowitego upłynnienia fosfolipidów. Powyższy cykl powtórzono 6 razy. Zawiesinę przepuszczono dwukrotnie przez filtr 0,6 (μ.m stosując urządzenie Lipex Biomembranes. Tak otrzymaną zawiesinę Multilamellar Large Vesicle (MLV) poddano 6 cyklom ciągłego wytłaczania, stosując 10 ml urządzenie do wytłaczania typu Lipex Biomembranes Thermobarrel z 0,1 μm poliwęglanowym filtrem Costar w temperaturze 55 C, stosując hel jako gaz wytłaczający pod ciśnieniem pomiędzy 1000 i 4800 kpa.

6 Preparat II Postępowaliśmy tak jak opisano w preparacie I, stosując 2 g fosfolipidów i 50 mg lonidaminy zamiast 1 g fosfolipidów i 100 mg melatoniny. Preparat III Postępowaliśmy jak opisano w preparacie I, stosując 2 g fosfolipidów i 200 mg melatoniny zamiast 1 g fosfolipidów i 100 mg melatoniny. Preparat IV Postępowaliśmy jak opisano w preparacie II, z tą różnicą, że wytłaczanie prowadzono przez 0,2 μm poliwęglanową membranę zamiast przez 0,1 μm. Preparat V 30 mg cyklosporyny-a dyspergowano w 2 g fosfolipidów w temperaturze 30 C w ciągu 10 minut przy pomocy homogenizatora typu Ultraurrax. Bezpośrednio po tym powyższą dyspersję zawieszono w 0,9% (w/v) wodnym roztworze chlorku sodu przy pomocy tego samego homogenizatora i pozostawiono na 24 godziny w temperaturze otoczenia. Następnie otrzymaną zawiesinę ogrzewano na łaźni wodnej o temperaturze 65 C w ciągu 20 minut. Tak otrzymaną zawiesinę poddano następującemu cyklowi chłodzenia i ogrzewania: - chłodzenie w ciekłym azocie w ciągu 1 minuty, - ogrzewanie w temperaturze 65 C do całkowitego upłynnienia fosfolipidów. Powyższy cykl powtórzono 6 razy. Zawiesinę przepuszczono dwukrotnie przez filtr 0,6 μm, stosując urządzenie Lipex Biomembranes. Otrzymano w ten sposób zawiesinę Multilamellar Large Vesicle (MLV) i poddano ją 6 krotnemu cyklowi ciągłego wytłaczania w 10 ml urządzeniu do wytłaczania typu Lipex Biomembranes Thermobarrel w temperaturze 65 C z 0,1 μ m poliwęglanowym filtrem Costar, stosując hel jako gaz wytłaczający pod ciśnieniem pomiędzy 1000 i 4800 kpa. Preparat VI Postępowaliśmy tak jak opisano w preparacie I, stosując 2 g fosfolipidów i 50 mg bindarytu zamiast 1 g fosfolipidów i 100 mg melatoniny. Preparaty porównawcze 1 Preparat 1A 100 mg melatoniny i 1 g trehalozy dyspergowano w 1 g fosfolipidów w temperaturze 30 C w ciągu 10 minut przy pomocy homogenizatora typu Ultraturrax. Bezpośrednio po tym powyższą dyspersję zawieszono w 10 ml 0,9% (w/v) wodnego roztworu chlorku sodu, stosując ten sam homogenizator, po czym ogrzewano na łaźni wodnej o temperaturze 55 C w ciągu 20 minut. Tak otrzymaną zawiesinę poddano następującemu cyklowi chłodzenia i ogrzewania: - chłodzenie w ciekłym azocie w ciągu 1 minuty, - ogrzewanie w temperaturze 55 C do czasu całkowitego upłynnienia fosfolipidów. Powyższy cykl powtórzono 6 razy. Zawiesinę przepuszczono dwukrotnie przez 0,6 (im filtr, stosując urządzenie Lipex Biomembranes. W ten sposób otrzymano bardzo gęstą masę. Próba wytłaczania przy pomocy 10 ml urządzenia do wytłaczania typu Lipex Biomembranes Thermobarrel z 0,1 μm filtrami poliwę glanowymi Costar w temperaturze 55 C z użyciem helu jako gazu wytłaczającego pod ciśnieniem pomiędzy 1000 i 4800 kpa, była niezadowalająca. Preparat 1B Postępowaliśmy jak opisano w postępowaniu z preparatem 1 A, z tą różnicą że wyłączono melatoninę. Otrzymano zawiesinę Multilamellar Large Vesicle (MLV), która dała się doskonale wytłaczać przy pomocy 10 ml urządzenia do wytłaczania typu Lipex Biomembranes Thermobarrel z poliwęglanowymi 0,1 μm filtrami Costar w temperaturze 55 C z użyciem helu jako gazu wytłaczającego pod ciśnieniem pomiędzy 1000 i 4800 kpa. Preparaty porównawcze 2 Preparat 2A Postępowaliśmy tak jak opisano w preparacie porównawczym 1A z tą różnicą że użyto 2 g fosfolipidów zamiast 1 g. W tym przypadku otrzymano również, niedającą się wytłaczać, bardzo gęstą masę.

7 Preparat 2B Postępowaliśmy tak jak w przypadku preparatu porównawczego 1B z tą różnicą, że użyto 2 g fosfolipidów zamiast 1. W tym przypadku otrzymano również dającą się doskonale wytłaczać zawiesinę MLV. Przykład 1 Preparat II podzielono na 1 ml próbki i do każdej dodano trehalozę w stosunku wagowym trehaloza/lipid, podanym w tabeli 1/1. Liofilizację przeprowadzono na płycie liofilizera następująco: 1) chłodzenie do -25 C z szybkością 0,77 C/min; 2) utrzymanie w tej temperaturze (-25 C) w ciągu 3 godzin; 3) zastosowanie próżni (6 x 10-2 milibara) i utrzymanie w tej temperaturze (-25 C) w ciągu 2 godzin; 4) ogrzewanie do -15 C w ciągu 20 godzin pod próżnią 6 x 10-2 milibara; 5) ogrzewanie do -10 C w ciągu 2 godzin pod ciśnieniem 6 x 10-2 milibara; 6) ogrzewanie do +5 C w ciągu 20 godzin pod próżnią 6 x 10-2 milibara; 7) zwolnienie próżni; 8) wprowadzenie powietrza. Liofilizat (1 ml) nawodniono ponownie 1 ml destylowanej wody i pozostawiono w temperaturze otoczenia na 30 minut dla umożliwienia rekonstrukcji liposomów. 0,5 ml powyższego roztworu rozcieńczono następnie 10 ml roztworu fizjologicznego w celu pomiaru średniej wielkości liposomów w urządzeniu NICOMP 370. Tabela 1/1 przedstawia otrzymane wyniki. Tabela 1/1 Średnia w ielkość liposom ów przed i po liofilizacji Szarża T rehaloza/lipidy (w/w) Przed Po LM/ ,7 1 : ,9 1 : ,7 2 : ,9 LM/ ,2 911,7 1 :2 99,2 98,7 1 : 1 99,2 109,8 2 : 1 99,2 291,3 LM/ ,6 911,8 1 : 2 98,6 94,9 1 : 1 98,6 105,8 2 : 1 98,6 794 Z tabeli 1/1 widać, że nieobecność trehalozy pociąga za sobą w pewnym stopniu łączenie się liposomów, wyrażające się wzrostem ich średniej wielkości. Nieoczekiwanie wzrost trehalozy (trehaloza/lipidy 2:1) powoduje również pewien stopień łączenia się, a w konsekwencji wzrost średniej wielkości. Podobne wyniki otrzymano z preparatem IV. Średnią wielkość liposomów i ilości lonidaminy określono z pewnej liczby próbek, świeżo wytworzonych jak opisano wyżej. Następnie próbki umieszczono w lodówce w temperaturze 5 C i dzielono na próbki w określonych przedziałach czasu, nawodniano ponownie

8 w celu określenia ilości aktywnej substancji i średniej wielkości liposomów. Tak otrzymane wyniki podano w tabeli 1/2. Tabela 1/2 Stosunek trehaloza/lipid (w agow o) 1:2 Szarza Czas (miesiące) Ilość H PLC (mg/ml) Średnia wielkość (nm) LM/328 to 3, , , ,1 127,2 LM/329 to 3,2 103,3 1 3, ,2 110,5 6 3,1 115 LM/330 to 3,3 99,2 1 3,4 99,5 3 3,2 100,5 6 3,1 113,6 Przykład 2 Preparat III liofilizowano jak opisano wyżej w przykładzie 1 i określono średnią wielkość liposomów przed i po liofilizacji (tabela 2/1), jak również średnią wielkość liposomów i ilość melatoniny w świeżych preparatach przetrzymywanych w temperaturze 5 C, jak opisano w poprzednim przykładzie (tabela 2/2). Tabela 2/1 Ś rednia wielkość liposomów przed i po liofilizacji Szarża T rehaloza/l ipidy (w/w) Przed Po LM/ : : ,5 2 : ,7 LM/337 1 : ,3 1 : ,8 2 : ,8 LM/338 1 : ,7 1 : ,7 2 :

9 Podobne wyniki otrzymano również z preparatem I Tabela 2/2 Stosunek trehaloza/lipid (wagowo) 1:1 Szarża Czas (m iesiące) Ilość H PLC (mg/ml) Średnia w ielkość (nm) LM/359 t ,2 3 5,8 109,5 LM/360 t0 6,5 107,2 1 6,5 106,3 3 6,7 13,6 LM/361 t0 6,2 98,4 1 6, ,5 Przykład 3 Preparat IV liofilizowano jak opisano wyżej w przykładzie 1 i określono średnią wielkość liposomów przed i po liofilizacji (tabela 3/1), jak również średnią wielkość liposomów i ilość bindarytu w świeżych preparatach przetrzymywanych w temperaturze 5 C, jak opisano w poprzednim przykładzie (tabela 3/2). Tabela 3/1 Średnia w ielkość liposom ów przed i po liofilizacji Szarża Trehaloza/lipidy (w/w) Przed Po LM/ ,7 7524,1 1 : 2 102, : 1 102, : 1 102,7 140 LM/343 1 :2 102,7 546,6 1 : 1 102,7 112,3 2 : 1 102,7 1559,2 LM/344 1 : 2 102,7 194,9 1 : 1 102,7 112,2 2 : 1 102,7 4722

10 Tabela 3/2 Stosunek trehaloza/lipid (wagowo) 1:1 Szarża Czas (miesiące) Ilość H PLC (mg/ml) Średnia wielkość (nm) LM/356 t0 3,2 135,4 1 3, ,2 131,3 LM /357 t0 3, , ,2 126,2 LM/358 to 3, ,1 122,8 3 2,9 121,8 P r z y k ł a d p o r ó w n a w c z y 1 Preparat II podzielono na 1 ml próbki i dodano do każdej trehalozę w stosunku trehaloza/lipid podanym w tabeli porównawczej 1. Preparat następnie zamrożono w temperaturze ciekłego azotu (-195,8 C) i liofilizowano w ciągu 20 godzin bez zewnętrznej kontroli temperatury. Liofilizat (1 ml) nawodniono ponownie 1 ml wody destylowanej i utrzymywano w temperaturze otoczenia w ciągu 2 godzin. 0,5 ml powyższego roztworu rozcieńczono następnie 10 ml roztworu fizjologicznego w celu pomiaru średniej wielkości liposomów w urządzeniu NICOMP 370. Otrzymane wyniki przedstawiono niżej w tabeli porównawczej 1. Tabela porównawczal Średnia w ielkość liposomów przed i po liofilizacji Szarża Trehaloza/lipidy (w/w) Przed Po LM / ,8 1 : ,8 1 : ,3 2 : ,7 LM/ ,2 911,8 1 :2 99,2 349,9 1 : 1 99,2 180,4 2 : 1 99,2 717,2 LM/ ,6 911,8 1 : 2 98,6 722,5 1 : 1 98,6 161,1 2 : 1 98,6 150

11 Z tabeli porównawczej 1 widać, że jeśli liofilizację prowadzi się w temperaturze ciekłego azotu, zarówno pod nieobecność trehalozy jak i w obecności trehalozy, w stosunkach podanych w powyższej tabeli, ma miejsce pewien stopień łączenia się liposomów, wyrażający się wzrostem ich średniej wielkości. Poza tym powyższe dane pokazują, że jeśli liofilizację prowadzi się w temperaturze ciekłego azotu, sam przebieg liofilizacji (przy wytwarzaniu takiej samej kompozycji) nie zawsze reprodukuje takie same wyniki.

12 Departam ent W ydawnictw UP RP. N akład 50 egz. Cena 4,00 zł.