Badanie mechanizmów działania fotouczulaczy - pomiary tlenu singletowego i wolnych rodników

Transkrypt

1 Badanie mechanizmów działania fotouczulaczy - pomiary tlenu singletowego i wolnych rodników Marta Kempa Badanie aktywności fotouczulaczy stosowanych w terapii PDT metodami fizykochemicznymi (prof. dr hab. A. Ratuszna)

2 1 Terapia fotodynamiczna - Fotouczulacz Terapia fotodynamiczna lek (fotouczulacz) + tlen + światło Mechanizm działania fotouczulaczy: 0 I typ fotoreakcji (przeniesienie elektronu lub wodoru) II typ fotoreakcji (transfer energii) F h F * 1 ISC F * 3 Type-I reaction 3 F * RH FH 3 F * RH F R RH FH F O O H O 3 1 O F0 HO 3 1 O F0 O O O H O Me O n n 1 Me Me O O H SOD O OH (Haber Weiss reaction) OH n 1 n OH OH (Fenton reaction) Me Oxidation of Substraces and Cellular Damage Type-II reaction 3 F * O O F0 Rysunek 1. Fizyczne i chemiczne mechanizmy zachodzące podczas PDT.

3 Badane fotouczulacze - przykładowe struktury badanych związków Chl C 41 H 53 N 5 O 5 M=695,89m/mol Chl b C 53 H 79 N 7 O 13 M = 10,3 g/mol Chl d C 47 H 6 N 6 O 14 M=935,03 g/mol Rysunek. Przykładowe struktury fotouczulaczy z grupy chloryn.

4 Spektrofotometria Pomiary widm absorpcyjnych w różnych środowiskach: hydrofilowym, hydrofobowym oraz aprotycznym (położenie ostatniego pasma absorpcji, kontrola nad formą występowania badanych związków w różnych środowiskach) 0,9 5µM Chl Abs (a.u.) 0,6 0,3 chl PBS chl PBS + 0.% Triton X100 chl DMSO 0, wavelength (nm) Wykres 1. Widmo absorpcji chloryny.

5 Spektroskopia laserowa - detekcja fosforescencji fotogenerowanego tlenu singletowego 1 O Rejestracja emisji przy długości fali 170nm. W celu weryfikacji obserwowanego sygnału do badanych próbek dodawany jest azydek sodu (fizyczny wygaszacz tlenu singletowego) oraz wykorzystywane są dodatkowe filtry 1195nm i 1355nm. Związki wzbudzane są światłem laserowym o dł. 355nm. Pomiary wykonywane są dla związków rozpuszczonych w różnych środowiskach. Stężenie badanych związków 10μM. Filtry 170, 1195 i 1355nm Maksimum fosforescencji tlenu singletowego położone jest przy długości fali 170nm. Przy długościach fali 1195nm i 1355nm nie powinien być rejestrowany sygnał pochodzący od wzbudzonego tlenu. Jeżeli sygnał jest rejestrowany, może to oznaczać, że nie pochodzi on od 1 O.

6 Spektroskopia Laserowa A Signal intensity (au.) chl PBS (170nm) chl PBS (1195nm) chl PBS (1355nm) chl PBS + 5mM NAN3 (170nm) B Signal intensity (a.u.) chl PBS + 0.% Triton X100 (170nm) chl PBS + 0.% Triton X100 (1195nm) chl PBS + 0.% Triton X100 (1355nm) chl PBS + 0.% Triton X mM NaN3(170nm) 0 C Signal intensity (a.u.) Time (ns) chl PBS DMSO (170nm) chl PBS DMSO (1195nm) chl PBS DMSO (1355nm) chl PBS DMSO + 5mM NaN3(170nm) Time (ns) Time (ns) Wykres. Pomiar emisji luminescencji przy różnych długościach fali w A - środowisku wodnym (PBS), B -hydrofobowym (Triton x 100) oraz C- aprotycznym.

7 Spektroskopia EPR, Fotokonsumpcja tlenu przy użyciu sondy spinowej mhctpo. Rejestracja sygnału sondy spinowej w czasie naświetlania badanej próbki. Naświetlanie z zakresu 54-74nm. Obserwowany zanik tlenu będzie sugerował możliwość produkcji rodników w badanym układzie. Pomiary wykonywane są dla związków rozpuszczonych w różnych środowiskach. Dodatkowo metodą tą można pośrednio sprawdzić, czy w układzie generowany jest 1 O (zamiana środowiska z H O na D O, dodanie Histydyny, NaN 3 ). Rysunek 3. Struktura chemiczna sondy spinowej mhctpo. Rysunek 4. Sygnał sondy spinowej mhctpo. A wysoka koncentracja tlenu; B - niska koncentracja tlenu. Wyznaczany parametr R jest proporcjonalny do koncentracji tlenu w badanym układzie.

8 Fotokonsumpcja tlenu A 0,30 chl PBS chl PBS+ 0.5mM NADH chl PBS+ 0.5mM NADH + 5mM NaN3 chl PBS+ 1mM His chl DO+ 1mM His B 0,30 chl PBS+ 0.5% triton X100 chl PBS+ 0.5% triton X mM NADH chl PBS+ 0.5% triton X mM NADH + 5mM NaN3 chl PBS+ 0.5% tritonx100+1mm His chl DO+ 0.5% tritonx100+1mm His Oxygen concentration (a.u.) 0,5 0,0 0,15 0,10 0,05 0,00 Oxygen concentration (a.u.) 0,5 0,0 0,15 0,10 0,05 0, Irradiation time (min) Irradiation time (min) Wykres 3. Zmiany stężenia tlenu w trakcie naświetlania chl. Pomiary dla próbki w środowisku A - wodnym oraz B - hydrofobowym.

9 Spektroskopia EPR, Pułapkowanie spinowe w celu identyfikacji i porównania kinetyki fotogenerowanych rodników tlenowych w różnych układach modelowych. Badanie zmian amplitudy sygnału powstałych adduktów w trakcie naświetlania próbki. Naświetlanie w zakresie 54-74nm. Pomiary wykonywane dla związków rozpuszczonych w różnych środowiskach. R + ST ST- R Popularne pułapki: 1) -metylo--nitrozopropan, MNP ) α-fenylo-n-t-butylonitron, PBN 3) 5,5-dimetylo-1-pyrolino-N-tlenek, DMPO 4),,6,6-Tetrametyl-1-piperidinyloxy, TEMPO schemat reakcji pułapkowania spinowego Powstały addukt wykazuje charakterystyczne widmo EPR. Identyfikaca spułapkowanego rodnika oparta jest na stałych rozszczepienia nadsubtelnego występujące w widmach EPR próbki.

10 Pułapkowanie spinowe a N =14,3 G a H β=11,3 G a H I=1,4 G a N =14,9 G a H β=14,9 G Rysunek 5. A- Diagram pułapkowanego spinowo adduktu DMPO po interakcji z anionorodnikiem ponadtlenkowym oraz rodnikiem hydroksylowym, B- spektrum adduktu DMPO-OOH, C- spektrum adduktu DMPO-OH Hitoshi Togashi et al. Analysis of hepatic oxidative stress status by electron spin resonance spectroscopy and imaging, Free Radical Biology and Medicine, 000,

11 Signal intensity [a.u.] Signal intensity [a.u.] Pułapkowanie spinowe A,00E+05 1,50E+05 1,00E+05 5,00E+04 0,00E+00 + * + * * * B 1,50E+06 1,00E+06 5,00E+05 0,00E+00 * * * * -5,00E+04-5,00E+05-1,00E+05-1,50E+05 -,00E Magentic Field [G] -1,00E+06-1,50E Magnetic Field [G] Rysunek 6. Spektrum EPR adduktu DMPO-OH (*) oraz DMPO-CH(CH 3 )OH (+) powstałego podczas naświetlania roztworu A - chl w PBS, B - chl w PBS+0.5% Triton X100 OH+CH 3 CH OH CH(CH 3 )OH DMPO DMPO-CH(CH 3 )OH (a N =15,8 G, a H β=,8g)

12 Pułapkowanie spinowe Signal amplitude DMPO-OH (a.u.) Irradiation time (min) chl PBS chl PBS + 0,5mM NADH chl PBS + 5mM NaN3 chl PBS + 0,5% Triton X 100 Signal amplitude DMPO-OH (a.u.) chl PBS chl PBS + 0,5mM NADH chl PBS + SOD 50ug/ml chl PBS+0.5mM NADH+50u/ml SOD chl PBS+10% EOH chl PBS+0.5mM NADH+10% EOH Irradiation time (min) Wykres 4. Zmiany amplitudy rejestrowanego sygnału DMPO-OH w trakcie naświetlania chl.

13 Signal intensity [a.u.] A Spektroskopia EPR, Wykrywanie obecności anionorodnika ponadtlenkowego O przy użyciu sondy Tiron. Badanie generowania anionorodnika ponadtlenkowego przez badane związki w trakcie ich naświetlania. Naświetlanie w zakresie 54-74nm. Rejestracja sygnału semichinionu. Pomiary wykonywane dla związków rozpuszczonych w różnych 1,0E+06 8,0E+05 6,0E+05 4,0E+05,0E+05 0,0E+00 -,0E+05-4,0E+05-6,0E+05-8,0E+05-1,0E+06 środowiskach. -1,E Magnetic field [G] Rysunek 7. A - Przykładowy zarejestrowany sygnał semichinionu, B struktura chemiczna sondy spinowej Tiron. B Signal amplitude(a.u.) chl PBS chl PBS+50u/ml SOD chl PBS+0,5% tritonx100 (siatka) chl PBS+0,5% tritonx100+0,5mm NADH (siatka) Irradiation time (min) Wykres 5. Zmiany amplitudy rejestrowanego sygnału semichinionu w trakcie naświetlania chl.

14 Podsumowanie Stopień monomeryzacji chloryn w badanych środowiskach determinuje fotosensybilizującą efektywność, wpływa również na rodzaj mechanizmu działania jaki dominuje w danym układzie. Prowadzone badania potwierdziły wytwarzanie przez badane związki reaktywnych form tlenu. W środowisku wodnym przeważa mechanizm typu I, w którym kluczowa rolę odgrywają wolne rodniki takie jak anionorodnik ponadtlenkowy i rodnik hydroksylowy. W środowisku micelarnym dużą rolę będzie odgrywał Typ II fotosensybilizowanego utleniania. Jednakże Typ I zdaje się wciąż być bardzo znaczący, a nawet bardziej niż w środowisku hydrofilowym.

15 Dziękuję za uwagę