PRACOWNIA CHEMII. Wygaszanie fluorescencji (Fiz4)

Transkrypt

1 PRACOWNIA CHEMII Ćwiczenia laboratoryjne dla studentów II roku kierunku Zastosowania fizyki w biologii i medycynie Biofizyka molekularna Projektowanie molekularne i bioinformatyka Wygaszanie fluorescencji (Fiz4) Osoby prowadzące: mgr Dominika Ziółkowska dr ElŜbieta Bojarska

2 1. Wprowadzenie 1.1. Przejścia elektronowe w cząsteczkach wieloatomowych Absorpcja promieniowania elektromagnetycznego przez cząsteczki powoduje ich wzbudzenie do wyŝszych poziomów energetycznych. Przejścia elektronowe w cząsteczkach wieloatomowych opisuje się przy pomocy orbitali molekularnych zajmowanych przez elektrony walencyjne. Są to orbitale wiąŝące (σ, π), antywiąŝące (σ*, π*) oraz niewiąŝące n. MoŜliwe przejścia elektronowe układają się w szereg o malejącej energii przejścia σ σ* > n σ* > π π > n π* Przejścia σ σ* obserwuje się tylko w dalekim nadfiolecie (poniŝej 200 nm), natomiast przejścia π π* przewaŝnie w bliskim nadfiolecie ( nm). Przejścia n σ* występują zarówno dalekim jak i bliskim nadfiolecie, a przejścia n π* na granicy bliskiego nadfioletu oraz w z zakresie widzialnym Diagram Jabłońskiego Fotofizyczne procesy absorpcji i emisji promieniowania przez cząsteczkę przedstawia schematycznie diagram Jabłońskiego.

3 W wyniku absorpcji promieniowania cząsteczka znajdująca się w singletowym stanie podstawowym S 0 zostaje wzbudzona do jednego z wyŝszych singletowych stanów elektronowych S 1, S 2. Dezaktywacja stanu wzbudzonego moŝe zachodzić w wyniku procesów promienistych lub bezpromienistych. Przejścia bezpromieniste między stanami o jednakowej krotności (S 2 S 1 ) noszą nazwę konwersji wewnętrznej (IC), natomiast przejścia bezpromieniste między stanami o róŝnej krotności (S 1 T 1 ) nazywają się konwersją intercombinacyjną (ISC). W stanie wzbudzonym trypletowym (T 1 ) moŝe równieŝ następować transfer energii na inną cząsteczkę (O 2 ) Przejścia, którym towarzyszy emisja kwantu promieniowania nazywa się fluorescencją lub fosforescencją. Fluorescencja jest związana z przejściem między stanami o jednakowej krotności (S 1 S 0 ). Warunkiem zajścia fosforescencji jest bezpromieniste przejście między stanami o róŝnej krotności (S 1 T 1 ) Wygaszanie fluorescencji Wygaszanie fluorescencji polega na dezaktywacji stanów wzbudzonych cząsteczek fluoryzujących na drodze bezpromienistego przekazywania energii cząsteczkom innej substancji, tzw. wygaszacza. Przy ciągłym naświetlaniu próbki ustala się stan stacjonarny o stałym natęŝeniu cząsteczek fluoryzujących [S]. W rozworach rozcieńczonych o określonym stęŝeniu wygaszacza [Q] ustala się równowaga między szybkością powstawania cząsteczek wzbudzonych a szybkością ich dezaktywacji w procesach promienistych i bezpromienistych: V = I szybkość powstawania cząsteczek wzbudzonych zaleŝna od natęŝenia promieniowania V f = k f [S] szybkość dezaktywacji stanu wzbudzonego w procesie fluorescencji V IC = k IC [S] szybkość dezaktywacji stanu wzbudzonego w procesie konwersji wewnętrznej V ISC = k ISC [S] szybkość zaniku stanu wzbudzonego w procesie konwersji interkombinacyjnej V q = k q [S] szybkość dezaktywacji stanu wzbudzonego w procesie wygaszania Stan równowagi między szybkością powstawania cząsteczek wzbudzonych a ich dezaktywacją moŝna opisać równaniem gdzie I jest natęŝeniem absorbowanego promieniowania, [Q] stęŝeniem wygaszacza, [S] stęŝeniem cząsteczek w stanie wzbudzonym, a odpowiednie k i są stałymi szybkości w

4 procesach dezaktywacji fluorescencji (f), konwersji wewnętrznej (IC), konwersji interkombinacyjnej (ISC) oraz wygaszania (q). Korzystając z definicji wydajności kwantowej fluorescencji φ f jako stosunku ilości fotonów wyemitowanych k f [S] do ilości fotonów zaabsorbowanych w jednostce czasu I i podstawiając wyraŝenie na I otrzymujemy zaleŝność W nieobecności wygaszacza Q równanie to przyjmuje postać Po podzieleniu stronami otrzymuje się równanie Sterna-Volmera JeŜeli znany jest czas Ŝycia fluorescencji cząsteczki w stanie wzbudzonym określony równaniem to z stałą wygaszania fluorescencji k q moŝna wyznaczyć z równania Sterna-Volmera Iloraz φ f 0 /φ f moŝna przedstawić jako stosunek natęŝenia fluorescencji w nieobecności wygaszacza I f 0 do natęŝenia fluorescencji w obecności wygaszacza If q, a równanie Sterna- Volmera w postaci Równanie to opisuje wygaszanie dynamiczne zachodzące w wyniku zderzeń między cząsteczką fluoryzującą a cząsteczką wygaszacza.

5 2. Cel ćwiczenia Badanie procesu wygaszania fluorescencji kwasu 9-antracenokarboksylowego przy pomocy jonów jodkowych. HO O kwas 9-antracenokarboksylowy 3. Zagadnienia do przygotowania Przejścia elektronowe w cząsteczkach wieloatomowych Mechanizmy dezaktywacji stanów wzbudzonych Dezaktywacja promienista Wygaszanie fluorescencji, dynamiczne i statyczne (metody rozróŝniania) Równanie Sterna-Volmera 4. Materiały Roztwór wodny kwasu 9-antracenokarboksylowego Roztwór wodny KJ o stęŝeniu 2 mol/dm 3 5. Aparatura i sprzęt spektrofotometr absorpcyjny dwuwiązkowy spektrofotometr emisyjny (spektrofluorymetr) kuwety absorpcyjne i emisyjne (kwarcowe) probówki (15 ml) zestaw pipet automatycznych zestaw końcówek do pipet

6 6. Wykonanie ćwiczenia Uruchomić spektrofotometr, wybrać funkcję pomiaru widma. Zarejestrować widmo absorpcyjne kwasu antracenokarboksylowego w zakresie nm. Na podstawie widma naleŝy ustalić warunki do pomiarów fluorescencyjnych (stęŝenie, długość fali wzbudzenia). Uruchomić spektrofluorymetr. Zarejestrować widmo fluorescencji roztworu ANCA bez wygaszacza, ustalić parametry do pomiarów z wygaszaczem. Przygotować 8 roztworów ANCA zawierających jednakowe stęŝenie ANCA, ale róŝne stęŝenia jonów jodkowych (w zakresie 0,02-1 mol/dm 3 ). Zarejestrować widma fluorescencji przygotowanych roztworów 7. Opracowanie wyników Na podstawie widm fluorescencji sporządzić wykres zaleŝności I 0 /I q od stęŝenia jonów jodkowych Wyznaczyć stałą wygaszania Wykonać analizę niepewności pomiarowych 8. Literatura K. Pigoń, Z. Ruziewicz, Chemia fizyczna, Wydawnictwo Naukowe PWN