(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2012/19 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C12N 9/64 ( ) C07K 16/40 ( ) A61K 38/43 ( ) C12N 15/62 ( ) C12N 5/10 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Proteza do kondycjonowania ran i pielęgnacji skóry (30) Pierwszeństwo: EP (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2010/44 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2012/10 (73) Uprawniony z patentu: B.R.A.I.N. Biotechnology Research And Information Network AG, Zwingenberg, DE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 FRANK NIEHAUS, Heppenheim, DE JÜRGEN ECK, Bensheim, DE RENATE SCHULZE, Bensheim, DE MICHAEL KROHN, Lorsch, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Rafał Witek WTS RZECZNICY PATENTOWI WITEK, ŚNIEŻKO I PARTNERZY ul. R. Weigla Wrocław Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 2 Opis [0001] Wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznych i kosmetycznych, jak również wyrobów medycznych zawierających proteazę, nazywaną debrylazą, z Lucilia sericata do zastosowania w kondycjonowaniu ran i pielęgnacji skóry. Debrylazę zidentyfikowano z zastosowaniem larwalnego transkryptomu, tj. preparatów mrna i przekształcenia w cdna, i przygotowano z wykorzystaniem technik rekombinacyjnych oraz dalszej ekspresji w odpowiednich komórkach gospodarzach. Proteaza według wynalazku posiada aktywność fibrynolityczną, kazeinolityczną i aktywującą PAR-2 (receptor aktywowany proteazą 2). W jednej realizacji, dostarcza się kompozycji zawierających debrylazę do oczyszczania wolno lub niegojących się ran z komórek martwiczych, tkanki i złogów fibryny, znanego jako oczyszczanie rany. W innej realizacji proponuje się zastosowania kosmetyczne debrylazy w dziedzinie pielęgnacji i wygładzania skóry. [0002] Wynalazek ponadto dotyczy cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego proteazę serynową o zdolności do rozcinania fibryny i kazeiny, będącej cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą proteazę serynową zawierającą lub składającą się z sekwencji aminokwasów o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 4, jak również cząsteczek kwasów nukleinowych kodujących prekursory lub fragmenty wymienionej proteazy serynowej. Ponadto, dotyczy on cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej lub składającej się z sekwencji nukleotydów o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 3 oraz cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasów proteazy serynowej, która jest identyczna w co najmniej 80%, korzystniej w co najmniej 85%, a najkorzystniej w co najmniej 90% z sekwencją nukleotydów o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 3. Każdy z powyższych kwasów nukleinowych, w których T zastąpiona jest przez U, objęty jest zakresem wynalazku. [0003] Gojenie się rany składa się z trzech odrębnych faz: (1) stanu zapalnego; (2) migracji i proliferacji komórek; i (3) przebudowy. W fazie stanu zapalnego proteazy uwalniane są przez komórki układu odpornościowego. Różne limfokiny wydzielane z neutrofili i makrofagów modulują następną fazę gojenia się rany. Druga faza nazywana jest fazą proliferacji i obejmuje migrację fibroblastów, proliferację i syntezę nowych cząsteczek macierzy pozakomórkowej. Wydaje się, że zdarzenia te zachodzą w określonym porządku, przy czym cząsteczki macierzy pozakomórkowej w tym fibronektyna, kolagen i proteoglikany wydzielane są do warstwy ziarniny. Faza stanu zapalnego osiąga swój szczyt po 3 dniach. Druga faza gojenia się rany normalnie osiąga swój szczyt około jednego do dwóch tygodni po urazie, po czym następuje znacznie dłuższa faza przebudowy tkanki, która rozpoczyna się w ciągu tygodni i może trwać

3 3 kilka miesięcy. W fazie przebudowy, substancja międzykomórkowa tkanki łącznej dojrzewa wraz z wymianą bezładnych włókien kolagenowych na grubsze, bardziej uporządkowane cząsteczki kolagenu. Ta przebudowa tkanki ewentualnie prowadzi do zwiększenia wytrzymałości rany na rozciąganie i czasami towarzyszy jej bliznowacenie. [0004] Uszkodzenie skóry praktycznie zawsze związane jest z uszkodzeniem naczyń krwionośnych. Z tego też względu gojenie się rany obejmuje proces krzepnięcia - złożony proces, w którym krew tworzy skrzepy. Jest to ważna część hemostazy, w której uszkodzona ściana naczynia krwionośnego pokrywa się skrzepem zawierającym płytki krwi i fibrynę, w celu zatamowania krwawienia i rozpoczęcia naprawy uszkodzonego naczynia. Zaburzenia krzepnięcia prowadzić mogą do zwiększonego ryzyka krwotoku i/lub zakrzepicy. Krzepnięcie inicjowane jest prawie natychmiast po tym jak uszkodzenie naczynia krwionośnego spowodowało uszkodzenie śródbłonka. Płytki krwi niezwłocznie formują w miejscu uszkodzenia czop hemostatyczny (hemostaza pierwotna). W tym samym czasie zachodzi hemostaza wtórna, kiedy to czynniki krzepnięcia w osoczu krwi reagują w postaci złożonej kaskady, prowadząc do powstania pasm fibryny wzmacniających czop z płytek krwi. W skład kaskady krzepnięcia krwi w przypadku wtórnej hemostazy wchodzą dwa szlaki, szlak zależny od czynnika kontaktu (znany wcześniej jako szlak wewnątrzpochodny) oraz szlak zależny od czynnika tkankowego (znany wcześniej jako szlak zewnątrzpochodny) oba prowadzące do powstania fibryny. Obecnie wiadomo, że głównym szlakiem inicjującym krzepnięcie krwi jest szlak zależny od czynnika tkankowego. Szlaki to szereg reakcji, w których zymogen (nieaktywny prekursor enzymu) proteazy serynowej i jego kofaktor glikoproteinowy aktywowane są do elementów aktywnych, które następnie katalizują następną reakcję w kaskadzie, co prowadzi ostatecznie do usieciowanej fibryny. Czynnikami krzepnięcia są ogólnie proteazy serynowe, z wyjątkiem FVIII i FV, które są glikoproteinami i czynnika XIII będącego transglutaminazą. Kaskada krzepnięcia krwi typowo dzieli na trzy szlaki. Zarówno szlak zależny od czynnika tkankowego, jak i szlak zależny od czynnika kontaktu, aktywują wspólną drogę końcową czynnika X, trombiny i fibryny. [0005] Fibryna jest białkiem zaangażowanym w krzepnięcie krwi. Jest to białko włókienkowate polimeryzowane do postaci czopa hemostatycznego lub skrzepu w połączeniu z płytkami krwi w miejscu rany. Fibryna wytwarzana jest ze jej zymogenu fibrynogenu, rozpuszczalnej glikoproteiny osoczowej syntetyzowanej przez wątrobę. W kaskadzie krzepnięcia krwi zymogen, protrombina, aktywowany jest do proteazy serynowej, trombiny, która jest odpowiedzialna za przekształcenie fibrynogenu w fibrynę. Fibryna jest następnie sieciowana przez czynnik XIII, tworząc skrzep.

4 4 [0006] Plazmina rozcina proteolitycznie fibrynę na produkty rozkładu fibryny, które hamują nadmierne wytwarzanie fibryny. Plazmina wytwarzana jest na drodze proteolitycznego rozcięcia plazminogenu, białka osocza syntetyzowanego w wątrobie. Rozcięcie to katalizowane jest przez tkankowy aktywator plazminogenu (t-pa), który jest syntetyzowany i wydzielany przez śródbłonek. Plazminogen jest zablokowany podczas powstawania skrzepu i jest aktywowany powoli, gdy rana przestała krwawić a skrzep jest rozkładany. [0007] Rozpad skrzepu podczas gojenia się rany jest ważnym etapem umożliwiającym powstanie i przebudowę substancji międzykomórkowej, jak opisano powyżej. Uważa się, że jedną potencjalną przyczyną powolnego gojenia się ran lub rany przewlekłych jest brak fibrynolizy. Tak zwane złogi fibryny, składające się z fibryny, lamininy, fibronektyny, tenascyny, kolagenu i leukocytów upośledzają wymianę substancji odżywczych, czynników wzrostu i gazu, prowadząc do niedotlenienia tkanek, powstania wrzodu i zapobieżenia angiogenezie. Proteolityczne rozpuszczenie tych złogów fibryny przyspiesza neowaskularyzację, naciekanie leukocytów, migrację fibroblastów, tworzenie nowego nabłonka i indukuje proliferację i migrację komórek. Ponadto, gojenie się ran spowalniane jest przez obecność ropy, resztek tkankowych, bakterii i wysięków, które mogą zostać usunięte przez środki oczyszczające. [0008] Oczyszczanie rany definiowane jest jako usunięcie z rany zbędnej tkanki. W przypadku ran przewlekłych, oczyszczanie rany oznacza usunięcie martwicy jak również opatrunków ran, ciał obcych i innych zbędnych substancji. Dostateczne oczyszczenie rany stanowi jeden podstawowy warunek wstępny nieopóźnionego procesu gojenia się rany. Oprócz leczenia przyczyn opóźnionego gojenia się rany, oczyszczanie rany powinno być pierwszym etapem w odpowiednim, dostosowanym do fazy, przygotowaniem łożyska rany dla ran przewlekłych. Opisano różne metody oczyszczania ran przewlekłych, takie jak oczyszczanie chirurgiczne, terapia czerwiami, oczyszczanie laserowe, ultradźwiękowe, hydroterapia, zastosowanie plastrów osuszających, autoliza, wykorzystanie enzymów proteolitycznych, oczyszczanie osmotyczne lub chemiczne. [0009] Środki oczyszczające rany szybko trawią tkankę nekrotyczną, nie uszkadzając żywych komórek, przyspieszając przez to procesy gojenia. Poszukiwanie takich środków oczyszczających rany objęło zastosowanie wielu różnych materiałów pochodzenia roślinnego i zwierzęcego, takich jak czerwie lub larwy muchy mięsnej, lecz również enzymów pochodzenia roślinnego takich jak papaina, bromelaina i ananaina (np. opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr US , europejski opis patentowy nr EP B1, opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr US ), proteaz pochodzenia bakteryjnego (np. proteaza z Vibrio sp., opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr US ; termolizyna z Bacillus sp., międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 03/ A1, zgłoszenie patentowe St. Zjedn. Ameryki nr US

5 5 2003/ A1) i zwierzęcego (np. trypsyna i chymotrypsyna z ryb, opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr US ). Niektóre enzymy oczyszczające rany funkcjonują jako inhibitory proteaz w kaskadzie krzepnięcia krwi (inhibitory trombiny neksyna-1 (PN-1), opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr US ) lub w reakcji ostrej fazy (alfa1-antytrypsyna, opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr US ). Głównym celem enzymów oczyszczających rany jest oczyszczenie rany ze wszystkich różnych elementów tkanki nekrotycznej i rozcieńczenie lepkich wydzielin wysiękowych. Odpowiednio naniesione enzymy proteolityczne oczyszczają zainfekowane powierzchnie z wysięku zapalnego bez uszkodzenia żywych tkanek. Ułatwiają one drenaż obszarów umiejscowionych ropnych, krwistych i włóknistych skupisk, sprzyjają uwolnieniu ukrytych bakterii co sprawia, że stają się one dostępne dla obronnego układu odpornościowego. [0010] Działanie enzymatyczne enzymów oczyszczających rany można wykorzystać w przypadku niegojących się ran (np. Lobmann i in., Proteases and the diabetic foot syndrome: Mechanisms and therapeutic Implications. Diabetes Care 28 (2005), ), lecz mogą być one korzystne w leczeniu chorób zapalnych skóry, takich jak łuszczyca i wypryski itp., i mniej poważnych stanów skórnych, takich jak zmarszczki, trądzik i sucha skóra, jak ujawniono na przykład w opisach patentowych St. Zjedn. Ameryki nr US 4,524,136; US 5,439,935; US 5,441,740; US 5,554,366; US 5,853,705 i US 6,780,444. Dostępne są również produkty handlowe zawierające takie enzymy, np. Accuzyme (papaina) i Granulex (trypsyna), których zastosowanie ograniczone jest do oczyszczania ran. [0011] Nie ustają wysiłki w kierunku znalezienia lepszych enzymów do oczyszczania ran. Niektóre kryteria bardzo pożądanego enzymu do oczyszczania ran to co najmniej jedno, a korzystnie więcej spośród wszystkich takich jak: zdolność do szybkiego strawienia fibryny, zdenaturowanego kolagenu, elastyny i wysięku; oszczędzanie zdrowo wyglądających tkanek skóry człowieka; nietoksyczność i brak działania drażniącego względem ran; łatwość przygotowania, stabilność i nadawanie się do bezpośredniego zastosowania. Przykładowo, stabilne stężone kompozycje enzymatyczne odpowiednie do przechowywania w warunkach otoczenia z zachowaniem aktywności enzymatycznej oraz zestawy zawierające kompozycje enzymatyczne opisano w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr WO 2007/ A2. [0012] Kilka podejść dotyczących postępowania z ranami przewlekłymi obejmuje zastosowanie opatrunków utrzymujących ranę w wilgoci, która sprzyja żywotności komórek układu odpornościowego naciekających ranę. [0013] Do postępowania z ranami zaproponowano zastosowanie proteaz, tj. egzo- i endopeptydaz, jak również zastosowanie inhibitorów proteaz.

6 6 [0014] Urządzenie na bazie silikonu do kontrolowanego uwalniania enzymów do proteolitycznego oczyszczania ran z wykorzystaniem proteazy z rodziny subtylizyn opisali Bott i in. (A silicone-based controlled-release device for accelerated proteolytic debridement of wounds, Wound Repair Regen. (2007) 15: ). Podobnie opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr US przedstawia opatrunek o przedłużonym uwalnianiu enzymów oczyszczających rany składający się z warstwy materiału chłonnego i ulegającej degradacji substancji polimerowej. [0015] Od wieków wiadomo było, że czerwie miały korzystny wpływ na rany. Metoda oczyszczania raz z zastosowaniem czerwi (MDT) została zaadaptowana i rutynowo stosowana w Stanach Zjednoczonych w latach 30. i na początku lat 40. XX w., lecz MDT została wyparta przez wprowadzenie penicyliny i nowoczesne techniki chirurgiczne (Child FS, Roberts EF. The treatment of chronic osteomyelitis with live maggots. New York State J Med 1931; 31: ; Teich S, Myers RAM. Maggot therapy for severe skin infections. South Med J 1986; 79: ; Church JCT. Larvae therapy in modern wound care: A review. Primary Intention 1999; maj: 63-8; Sherman RA, Hall MJR, Thomas S. Medicinal maggots: An ancient remedy for some contemporary afflictions. Ann Rev Entomol 45 (2000): 55-81, Courtenay, M. i in., Larva therapy in wound management, J. R. Soc. Med. 93 (2000): 72-74). [0016] Nałożenie czerwi na ranę jest często odczuwane przez pacjenta jako nieprzyjemne, a nawet bolesne. Tak czy inaczej, larwy różnych gatunków owadów wykorzystywane są do oczyszczania i gojenia ran nieodpowiadających na leczenie konwencjonalnymi metodami. Czerwie pewnych gatunków much żerują na tkance nekrotycznej, a przez to ich oczyszczające rany działanie przyspiesza gojenie się przewlekłych ran tkanki miękkiej, takich jak odleżyny i owrzodzenia żylakowe, infekcje stopy cukrzycowej i rany pooperacyjne, opornych interwencję chirurgiczną lub antybiotykową (Sherman RA. 1998, Maggot debridement in modern medicine. Infect Med 15: 651-6, Sherman RA, Hall MJR, Thomas S., 2000, Medicinal maggots: An ancient remedy for some contemporary afflictions. Ann Rev Entomol 45: 55-81). [0017] Czerwie do celów leczniczych pełnią trzy główne funkcje: 1) oczyszczają rany, rozpuszczając martwą (nekrotyczną), zainfekowaną tkankę; 2) zabijając bakterie dezynfekują ranę, i 3) stymulują gojenie się rany. [0018] Horobin i in. (2006) opisują MDT z użyciem larw Lucilia sericata, inaczej czerwi lucilia skórnicy, nakładanych na rany przewlekłe w celu przyspieszenia gojenia poprzez wywołanie migracji fibroblastów i przebudowy substancji międzykomórkowej (Horobin i in., Promotion of human dermal fibroblast migration, matrix remodelling and modification of fibroblast morphology within a novel 3D model by Lucilia sericata larval secretions, J Invest Dermatol. 126: ). Wcześniej scharakteryzowali oni pewne aktywności enzymatyczne

7 7 występujące w wydalinach/wydzielinach czerwi (ES) (Horobin i in. 2003, Maggots and wound healing: an investigation of the effects of secretions from Lucilia sericata larvae upon interactions between human dermal fibroblasts and extracellular matrix components, Br. J. Dermatol. 148: ). [0019] Bakteriobójczą aktywność wydzielin czerwi Lucilia sericata w stosunku do typowych drobnoustrojów kolonizujących rany, takich jak Micrococcus luteus i Staphylococcus aureus, wykazano, posługując się larwami trzeciego stadium (Daeschlein, G. i in., 2007, In vitro antibacterial activity of Lucilia sericata maggot secretions, Skin Pharmacol. Physiol. 20: ). [0020] Interakcje między fibroblastami a otaczającą macierzą pozakomórkową odgrywają kluczową rolę w formowaniu tkanki, oddziałując na proliferację fibroblastów, migrację oraz przebudowę tkanki. Postulowane mechanizmy, na drodze których czerwie nasilają formowanie się tkanki w obrębie rany, mogą zachodzić poprzez sprzyjanie ruchliwości fibroblastów, przyspieszenie przebudowy macierzy pozakomórkowej i koordynację odpowiedzi komórkowych, zapewniając szersze rozprzestrzenienie żywotnych fibroblastów. Wykazano, że produkty wydalania i wydzielania L. sericata sprzyjały migracji fibroblastów po powierzchni pokrytej fibronektyną i że jest to związane z degradacją fibronektyny przez proteazy serynowe znajdujące się w wydalinie/wydzielinie czerwi (Chambers i in. 2000, Degradation of extracellular matrix components by defined proteinases from the greenbottle larva Lucilia sericata used for the clinical debridement of non-healing wounds, Brit J Dermatol. 148: 14-23). [0021] Dużą i zróżnicowaną rodzinę genów proteaz serynowych zidentyfikowano w cdna pierwszego stadium larwalnego lucilii australijskiej, Lucilia cuprina (Elvin i in. 1994, An estimate of the number of serine protease genes expressed in sheep blowfly larvae (Lucilia cuprina) Insect Molecular Biol 3: ). Dwie proteazy podobne do chymotrypsyny oczyszczono z produktów wydalania i wydzielania larw pierwszego stadium Lucilia cuprina (Casu i in. 1994, Excretory/secretory chymotrypsin from Lucilia cuprina: purification, enzymatic specificity and amino acid sequence deduced from mrna, Insect Molecular Biol 3: ). Różne inhibitory proteazy o aktywności skierowanej przeciwko proteazom serynowym, zarówno podobnym do trypsyny, jak i podobnym do chymotrypsyny, zastosowano do scharakteryzowania proteaz jelitowych Lucilia cuprina, wykorzystując do tego celu testy żerowania w warunkach in vitro (Casu i in. 1994, Isolation of a trypsin-like serine protease gene family from the sheep blowfly Lucilia cuprina, Insect Molecular Biol 3: ). Znaczące zahamowanie wzrostu larw zaobserwowano karmiąc larwy pierwszego stadium inhibitorami trypsyny, a zwłaszcza sojowym inhibitorem trypsyny. Karmienie chymostatyną, swoistym inhibitorem chymotrypsyny, nie spowodowało istotnego zahamowania wzrostu. Informacje te sugerują, że proteazy serynowe

8 8 podobne do trypsyny są prawdopodobnie głównymi jelitowymi enzymami trawiennymi. Ponadto, Borovsky i in. (1996) Eur. J. Biochem. 237: zidentyfikowali i zsekwencjonowali pełnej długości cdna kodujący trypsynę muchy Neobellieria bullata. [0022] Chambers i in. (2003, Degradation of extracellular matrix components by defined proteinases from greenbottle larva Lucilia sericata used for the clinical debridement of nonhealing wounds, British J. Dermatol 148: 14-23) opisują proteazy o aktywnościach przeciwko fibrynie i składnikom macierzy pozakomórkowej w stadiach od pierwszego do trzeciego larw lucilii skórnicy Lucilia sericata. Stwierdzili oni największą swoistą aktywność w wydalinach wczesnych stadiów larwalnych (stadium pierwsze i drugie). Proteazy o aktywności podobnej do chymotrypsyny i podobnej do trypsyny zawarte w larwalnych produktach wydalniczych/wydzielniczych (ES) uważa się za przyczyniające się do oczyszczenia ran poprzez usunięcie tkanki nekrotycznej. Stosując kazeinę znakowaną izotiocyjanianem fluoresceiny jako modelowy substrat w wydzielinach wykryto trzy klasy enzymów proteolitycznych: proteinazy serynowe (optymalne wartości ph 8-9) dwóch różnych podklas (podobne do trypsyny i podobne do chymotrypsyny), preoteinazę aspartylową (optymalna wartość ph 5) i metalopreoteinazę (optymalna wartość ph 9) o właściwościach egzopeptydazy. Przy zastosowaniu jako substratów właściwych dla skóry składników ECM produkty wydalania i wydzielania L. sericata rozpuszczały skrzepy fibrynowe i degradowały fibronektynę, lamininę i rozpuszczony kwasem kolagen typu I i III. [0023] Mimo tych wyników, do chwili obecnej naukowcy i lekarze szukają substancji czynnej wśród ogromnej ilości białek o aktywności proteolitycznej u larw. Wiadomo jest, że wydzieliny larwalne są zdolne do degradacji macierzy pozakomórkowej (ECM)/składników rany, fibronektyny, lamininy i kolagenów I, III, IV i V. Makrocząsteczki te znajdują się w wilgotnej tkance martwiczej oddzielającej się od zdrowej w ranach przewlekłych i budują również złogi fibryny, które przeważają we wrzodach przewlekłych. Degradacja lamininy i fibronektyny przez wydzieliny larwalne hamowana jest przez PMSF, ale nie jest hamowana istotnie przez APMSF ani przez inhibitor metalopreoteinazy 1,10-fenantrolinę. Aktywność wydzielin larwalnych wykazuje optimum przy ph 8,0-8,5 (Chambers i in. 2000, Degradation of extracellular matrix components by defined proteinases from the green bottle larva Lucilia sericata used for the clinical debridement of non-healing wounds, Brit J Dermatol. 148: 14-23), co nie odpowiada szerokiemu zakresowi ph, od kwasowego do zasadowego, panującego w ranach przewlekłych. Z tego też względu, występuje zapotrzebowanie na enzymy oczyszczające rany o aktywności w znacznie szerszym zakresie ph opisywanym dla wydzielin larwalnych. [0024] W opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr US B1 spekuluje się, że główną proteolityczną aktywnością w wydzielinach larwalnych jest aktywność proteinazy serynowej i że

9 9 występują dwa typy aktywności preoteinazy serynowej; jedna pochodząca od enzymu chymotrypsynowego i jedna pochodząca od enzymu trypsynowego. Opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr US 2008/ A1 podaje dowód na to, że degradacja macierzy pozakomórkowej jest ważnym etapem w procesie gojenia się rany z udziałem proteazy z Lucilia sericata. W wymienionym zgłoszeniu postuluje się proteazę serynową i metaloproteazę wyizolowane z produktów wydalniczych/wydzielniczych Lucilia sericata, które degradują odpowiednio składnik macierzy pozakomórkowej fibronektynę lub zwiększają migrację komórkową. Najwyraźniej, powstałe biologicznie czynne produkty degradacji fibronektyny sprzyjają gojeniu się rany. W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr WO 2007/ A3 ujawnia się chymotrypsynę z larw Lucilia sericata do zastosowania w leczeniu ran. Później w produktach wydzieliny larw Lucilia sericata zidentyfikowano białka, które są widocznie zaangażowane w gojenie się ran, takie jak nukleaza (międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 2007/ A2) i ligand receptora toll-like (TLR) (opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr US 2005/ A1). [0025] Mimo uzyskanych w ostatnich latach postępów w opracowywaniu kompozycji do oczyszczania ran, nadal byłoby pożądane uzyskanie jasno zdefiniowanych związków do oczyszczania ran lub kompozycji zawierających zdefiniowane składniki o co najmniej podobnych, jeśli nie ulepszonych, właściwościach w porównaniu z omówionymi powyżej substancjami ze stanu techniki. Cel ten można osiągnąć np. identyfikując wytwarzaną przez czerwie substancję czynną odpowiedzialną za przyspieszone gojenie się ran. Takie związki byłyby również przydatne w zastosowaniach kosmetycznych. [0026] Odpowiednio, w pierwszej realizacji wynalazek dotyczy cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego (i) proteazę serynową o zdolności do rozcinania fibryny i kazeiny, będącej (a) cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą proteazę serynową zawierającą lub składającą się z sekwencji aminokwasów o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 4; (b) cząsteczką kwasu nukleinowego zawierającą lub składającą się z sekwencji nukleotydów o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 3; (c) cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą sekwencję aminokwasów proteazy serynowej, która jest w co najmniej 80% identyczna z sekwencją aminokwasów (a); korzystnie identycznej w co najmniej 85%, korzystniej identycznej w co najmniej 90%, a najkorzystniej identycznej w co najmniej 95%; (d) cząsteczką kwasu nukleinowego zawierającą lub składającą się z sekwencji nukleotydów w co najmniej 80% identycznej z sekwencją nukleotydów (b), korzystnie identycznej w co najmniej 85%, korzystniej identycznej w co najmniej 90%, a najkorzystniej identycznej w co najmniej 95%; (e) cząsteczką kwasu nukleinowego zdegenerowaną z stosunku do cząsteczki kwasu nukleinowego (d); lub (f)

10 10 cząsteczką kwasu nukleinowego odpowiadającą cząsteczce kwasu nukleinowego którejkolwiek spośród (a) do (d), w której T zastąpiona jest przez U; (ii) fragment proteazy serynowej (i) o tej samej aktywności proteazy serynowej co (i); (iii) propeptyd proteazy serynowej (i) rozcinany do jego formy aktywnej, korzystnie tuż przed lub w trakcie leczenia rany, przy czym propeptyd kodowany jest przez cząsteczkę kwasu nukleinowego wybraną spośród (a) cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego propeptyd proteazy serynowej zawierającej lub składającej się z sekwencji aminokwasów o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 6; (b) cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej lub składającej się z sekwencji nukleotydów o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 5; (c) cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego propeptyd proteazy serynowej o sekwencji aminokwasów w co najmniej 80% identycznej z sekwencją aminokwasów (a); korzystnie identycznej w co najmniej 85%, korzystniej identycznej w co najmniej 90%, a najkorzystniej identycznej w co najmniej 95%; (d) cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej lub składającej się z sekwencji nukleotydów w co najmniej 80% identycznej z sekwencją nukleotydów (b), korzystnie identycznej w co najmniej 85%, korzystniej identycznej w co najmniej 90%, a najkorzystniej identycznej w co najmniej 95%; (e) cząsteczki kwasu nukleinowego zdegenerowanej w stosunku do cząsteczki kwasu nukleinowego (d); lub (f) cząsteczki kwasu nukleinowego odpowiadającej cząsteczce kwasu nukleinowego którejkolwiek spośród (a) do (d), w której T zastąpiona jest przez U; lub (iv) prepropeptyd proteazy serynowej (i), przy czym prepropeptyd kodowany jest przez kwas nukleinowy wybrany spośród (a) cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego prepropeptyd proteazy serynowej zawierającej lub składającej się z sekwencji aminokwasów o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 2; (b) cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej lub składającej się z sekwencji nukleotydów o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 1; (c) cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego prepropeptyd proteazy serynowej, którego sekwencja aminokwasów jest co najmniej w 80% identyczna z sekwencją aminokwasów (a); korzystnie identycznej co najmniej 85%, korzystniej identycznej co najmniej 90%, a najkorzystniej identycznej co najmniej 95%; (d) cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej lub składającej się z sekwencji nukleotydów w co najmniej 80% identycznej z sekwencją nukleotydów (b), korzystnie identycznej w co najmniej 85%, korzystniej identycznej w co najmniej 90%, a najkorzystniej identycznej w co najmniej 95%; (e) cząsteczki kwasu nukleinowego zdegenerowanej w stosunku do cząsteczki kwasu nukleinowego (d); lub (f) cząsteczki kwasu nukleinowego odpowiadającej cząsteczce kwasu nukleinowego dowolnej spośród (a) do (d), w której T zastąpiona jest przez U.

11 11 [0027] Termin cząsteczka kwasu nukleinowego zgodnie z niniejszym wynalazkiem obejmuje DNA, taki jak cdna lub genomowy DNA oraz RNA. Dalej obejmuje on znane w dziedzinie cząsteczki naśladujące kwas nukleinowy, takie jak syntetyczne lub półsyntetyczne pochodne DNA lub RNA i polimery mieszane. Takie cząsteczki naśladujące kwas nukleinowy lub pochodne kwasów nukleinowych według wynalazku obejmują fosforotionian kwasu nukleinowego, fosforoamidan kwasu nukleinowego, kwas 2 -O-metoksyetylorybonukleinowy, kwas morfolinonukleinowy, kwas heksytolonukleinowy (HNA), kwas peptydonukleinowy (PNA) i zablokowany kwas nukleinowy (LNA) (patrz Braasch i Corey, Chem Biol 2001, 8: 1). LNA jest pochodną RNA, w której pierścień rybozy jest ograniczony przez wiązanie metylenowe między atomem węgla w pozycji 2 i atomem węgla w pozycji 4. [0028] Termin proteaza serynowa charakteryzuje białka o aktywności proteolitycznej jako należące do podgrupy, której elementy w swoim centrum aktywnym zawierają serynę, która razem z histydyną i asparaginianem tworzy triadę katalityczną wspólną większości proteaz serynowych (Rawlings, N.D., Barrett, A.J. (1994). Families of serine peptidases. Meth. Enzymol. 244:19-61). Proteazy serynowe są sklasyfikowane jako hydrolazy i należą do podgrupy EC w numerycznym schemacie klasyfikacji. Białka kodowane przez cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku mogą same wykazywać aktywność proteolityczną proteazy serynowej (np. NUMER IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 4) lub po dalszej obróbce lub aktywacji (np. NUMER IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 2 lub 6), np. wskutek obróbki proteolitycznej; patrz również opis propeptydu według wynalazku, poniżej. Obróbka proteolityczna może obejmować odcięcie peptydu sygnałowego od prepropeptydu (np. prepropeptydu o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 2) i dalszą obróbkę proteolityczną propeptydu (np. propeptydu o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 6) przez rozcięcie proteolityczne. [0029] Stosowany tu termin peptyd sygnałowy określa krótką sekwencję aminokwasów (korzystnie długości 3-60 aminokwasów) kierującą transportem białka do konkretnego przedziału komórki i korzystnie do retikulum endoplazmatycznego. [0030] Stosowany tu termin propeptyd opisuje liniowy łańcuch cząsteczkowy aminokwasów, który jest prekursorem białka i rozcinany podczas dojrzewania lub aktywacji białka (np. sekwencja aminokwasów o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 6 lub sekwencja aminokwasów kodowana przez sekwencję nukleotydów o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 5). Stosowany tu termin prepropeptyd oznacza prekursor propeptydu i dalej zawiera peptyd sygnałowy (np. sekwencja aminokwasów o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 2 lub sekwencja aminokwasów kodowana przez sekwencję nukleotydów o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 1). Jest głównym produktem translacji.

12 12 Również jeśli prepropeptyd nanoszony jest na ranę, wówczas jest on rozcinany do formy aktywnej, korzystnie tuż przed lub w czasie leczenia wymienionej rany. [0031] Termin o zdolności do rozcinania fibryny i kazeiny korzystnie odnosi się jedynie do aktywności dojrzałego białka, lecz obejmować może również przyszłą aktywność (uzyskiwaną po wspomnianym przecięciu (wspomnianych przecięciach)) prepropeptydu i propeptydu będących prekursorami dojrzałego białka. [0032] Termin białko stosowany tu wymiennie z terminem polipeptyd lub peptyd opisuje liniowe łańcuchy cząsteczkowe aminokwasów, w tym białka jednołańcuchowe lub ich fragmenty, korzystnie zawierające ponad 30 aminokwasów. Odcinek aminokwasowy o długości 30 aminokwasów i krótszy niż 30 aminokwasów byłby normalnie nazywany jedynie peptydem lecz nie polipeptydem. Zależnie od okoliczności, tutaj termin białko lub polipeptyd może oznaczać dojrzałe białko (np. sekwencję aminokwasów o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 4 lub sekwencję aminokwasów kodowaną przez sekwencję nukleotydów o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 3), propeptyd (np. sekwencję aminokwasów o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 6 lub sekwencję aminokwasów kodowaną przez sekwencję nukleotydów o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 5) lub prepropeptyd (np. sekwencję aminokwasów o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 2 lub sekwencję aminokwasów kodowaną przez sekwencję nukleotydów o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 1). Polipeptydy mogą później tworzyć oligomery składające się z co najmniej dwóch identycznych lub różnych cząsteczek. Odpowiednie struktury wyższego rzędu, takie jak multimery, nazywane są odpowiednio, homo- lub heterodimerami, homo- lub heterotrimerami itd. Ponadto, peptydomimetyki takich białek/polipeptydów, w których aminokwas (aminokwasy) i/lub wiązanie (wiązania) peptydowe zostało (zostały) zastąpione analogami funkcjonalnymi są również objęte wynalazkiem. Takie analogi funkcjonalne obejmują wszystkie znane aminokwasy inne niż 20 kodowanych w genach aminokwasów, takie jak selenocysteina. Terminy polipeptyd, białko i peptyd mogą odnosić się do naturalnie zmodyfikowanych polipeptydów/białek i peptydów, w których modyfikacja jest skutkiem np. glikozylacji, acetylacji, fosforylacji i podobnych modyfikacji, które wszystkie są dobrze znane w dziedzinie. [0033] W kontekście fragmentów według niniejszego wynalazku, termin taka sama aktywność odnosi się do wymienionych tu aktywności biologicznych obecnych we fragmentach proteazy serynowej, debrylazy, według wynalazku. Fragmenty, zgodnie z tą realizacją według niniejszego wynalazku, mogą być polipeptydami lub peptydami o długości równej lub mniejszej niż 30 aminokwasów, zależnie od ich długości.

13 13 [0034] Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, termin procent (%) identyczności sekwencji opisuje liczbę dopasowań ( trafień ) identycznych nukleotydów/aminokwasów dwóch lub więcej przyrównanych kwasów nukleinowych lub sekwencji aminokwasowych porównanych z liczbą nukleotydów lub reszt aminokwasowych budujących całą długość matrycowego kwasu nukleinowego lub matrycowej sekwencji aminokwasów. Innymi słowy, stosując przyrównanie, można określić w dwóch lub więcej sekwencjach lub subsekwencjach udział procentowy takich samych reszt aminokwasowych lub nukleotydów (np. 80%, 85%, 90% lub 95% identyczności), gdy (sub)sekwencje są porównywane i przyrównywane pod kątem maksymalnej zgodności w okienku porównań, lub w wyznaczonym regionie, jak zmierzono z zastosowaniem algorytmu porównywania sekwencji znanego w dziedzinie, lub przy przyrównywaniu manualnym i ocenie wzrokowej. Definicja ta ma zastosowanie również do sekwencji komplementarnej do sekwencji badanej. [0035] Analizę i przyrównanie sekwencji aminokwasów w kontekście niniejszego wynalazku przeprowadzono, stosując algorytm NCBI BLAST (Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, i David J. Lipman (1997), Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res. 25: ). Specjalista w dziedzinie wie również o istnieniu odpowiednich programów do przyrównywania sekwencji kwasów nukleinowych. [0036] Korzystnie, substytucje w sekwencji aminokwasów proteazy serynowej według niniejszego wynalazku porównane z sekwencjami o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 2, 4 lub 6 są konserwatywne. Oznacza to, że korzystnie substytucje zachodzą w obrębie jednej klasy aminokwasów. Na przykład, aminokwas o ładunku dodatnim jest korzystnie mutowany do innego aminokwasu o ładunku dodatnim. To samo tyczy się klas aminokwasów zasadowych, aromatycznych lub alifatycznych. [0037] Termin zdegenerowany zgodnie z niniejszym wynalazkiem dotyczy degeneracji kodu genetycznego. Degeneracja spowodowana jest tym, że kod tripletowy opisuje 20 aminokwasów i kodon stop. Ponieważ występują cztery zasady, które wykorzystywane są do kodowania informacji genetycznej, kodony, triplety, wymagane są do wytworzenia co najmniej 21 różnych kodów. Możliwych 4 3 kombinacji dla zasad w tripletach daje 64 możliwych kodonów, co oznacza, że musi występować pewna degeneracja. W rezultacie, niektóre aminokwasy są kodowane przez ponad jeden triplet, tj. do sześciu. Degeneracja wynika głównie ze zmian w pozycji trzeciej w triplecie. Oznacza to, że cząsteczki kwasu nukleinowego o sekwencji innej niż wymieniono powyżej, lecz nadal kodujące ten sam polipeptyd, mieszczą się w zakresie niniejszego wynalazku.

14 14 [0038] Często spotykanym problemem, gdy rany nie goją się we właściwym czasie, jest usunięcie złogów fibryny i tkanki nekrotycznej w celu umożliwienia naciekania fibroblastów, a przez to rozpoczęcia procesu gojenia się ran. Autorzy niniejszego wynalazku niespodziewanie stwierdzili, że proteaza serynowa kodowana przez kwas nukleinowy według niniejszego wynalazek ma wspaniałe właściwości przygotowywania ran do naturalnego gojenia poprzez rozpuszczenie tych złogów fibryny. Jest to aktywna biologicznie proteaza serynowa, która, jak się uważa, jest główną substancją czynną aktywności gojenia rany z Lucilia sericata. Enzym jest również nazwany tutaj debrylazą, co stanowi tu odniesienie do jego sugerowanego zastosowania do oczyszczania ran. [0039] Larwy Lucilia sericata są ogólnie wykorzystywane w praktyce klinicznej jako organizmy żywe do leczenia ran opornych na leczenie konwencjonalne. Ponieważ terapia czerwiami jest raczej nieprzyjemna dla wielu pacjentów, a wydzieliny owadów dalekie są od określenia jako kompozycja farmaceutyczna, autorzy niniejszego wynalazku postanowili, z zastosowaniem podejścia molekularnego, zidentyfikować co najmniej jedną substancję czynną oczyszczającą rany. [0040] Przygotowanie biblioteki cdna z mrna (transkryptomu) larw drugiego stadium hodowanych na agarze z krwią doprowadziło do zidentyfikowania kwasu nukleinowego kodującego proteazę podobną do trypsyny i odpowiedniej sekwencji aminokwasowej eksprymowanej w dużej ilości, będącej prawdopodobnie główną proteazą zaangażowaną w oczyszczanie rany przez larwy Lucilia sericata. Enzymu nie znaleziono w bibliotekach cdna uzyskanych z mrna wyizolowanego z 5-dniowych larw (stadium trzecie). Odpowiada to spadkowi aktywności oczyszczającej rany wraz z kolejnymi stadiami larwalnymi (Chambers i in. 2003). [0041] Badanie przesiewowe wymienionych bibliotek pod kątem aktywności proteolitycznej względem kazeiny dało kilka sekwencji cdna kodujących proteazy w transkryptomie larw drugiego stadium indukowanym przez substrat w postaci krwi. Analiza sekwencji cdna w bibliotece indukowanych larw drugiego stadium doprowadziła do identyfikacji proteaz występujących wyłącznie w bibliotece cdna uzyskanej z larw drugiego stadium, lecz nie w transkryptomie larw w późniejszym stadium (stadium trzecie). Niektóre występujące proteazy wykazywały podobieństwo sekwencji kwasu nukleinowego odpowiednio do fosfochymotrypsyny, trypsyny lub chymotrypsyny. Nie znaleziono proteaz typu metaloproteazy, proteazy treoninowej, proteazy cysteinowej, proteazy asparaginowej lub proteazy glutaminianowej. [0042] W pierwszym badaniu przesiewowym na płytce agarowej z mlekiem odtłuszczonym znaleziono kilka klonów cdna wydzielających enzymy o aktywności kazeinolitycznej, lecz tylko jeden wykazał aktywność również w podłożu zawierającym fibrynę. Enzym ten

15 15 scharakteryzowano szczegółowo techniką rekombinowanej ekspresji i oceny jego właściwości biochemicznych w różnych testach. [0043] Analiza sekwencji kwasu nukleinowego ujawniła, występujące w dużej liczebności wśród mrna indukowanych larw, trzy proteazy typu serynowego i dwie proteazy typu trypsynowego. Proteazy typu trypsynowego ujawniły aktywność fibrynolityczną i kazeinolityczną. Analiza, z zastosowaniem algorytmu NCBI BLAST, sekwencji aminokwasów jednej z proteaz fibrynolitycznych, która odpowiada debrylazie reprezentowanej przez sekwencję aminokwasów o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI 4 i kodowanej przez sekwencję kwasu nukleinowego o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI: 2 wykazała identyczność sekwencji białka wynoszącą 76,1% względem proteazy podobnej do trypsyny z Sarcophaga sp. co stanowi najbliższe podobieństwo do znanych enzymów (Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, i David J. Lipman (1997), Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res. 25: ). Stwierdzono, że debrylaza eksprymowana jest w dużej ilości, a zatem prawdopodobne jest, że jest to główna proteaza zaangażowana w oczyszczanie ran przez larwy Lucilia sericata. Debrylaza ulega ekspresji i translacji w formie prepropeptydu zawierającego peptyd sygnałowy i aminokwasy propeptydowe (Figura 5A). Do aktywacji aktywności enzymatycznej dochodzi w wyniku odcięcia peptydu sygnałowego oraz dalszego cięcia propeptydu, które prowadzi do uzyskania dojrzałego białka (NUMER IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI 4) debrylazy, przy czym propeptyd jest widocznie dalej rozcinany na drodze autoproteolizy. Dojrzałe białko jest korzystnie kodowane przez cząsteczkę kwasu nukleinowego składającą się z sekwencji o NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM SEKWENCJI 3. Dojrzała debrylaza ma zdolność do rozcinania fibryny i kazeiny. Jej aktywność może całkowicie zahamować PMSF (fluorek fenylometanosulfonylu) i APMSF (fluorek 4- amidynofenylometanosulfonylu). Stosując inhibitory proteaz typu metaloproteaz, proteaz treoninowych, proteaz cysteinowych lub proteaz asparaginowych nie wykryto hamowania. Wskazuje to na to, że białko jest proteazą serynową i ma aktywność podobną do trypsyny. [0044] Wiadomo jest, że warunki panujące w ranach przewlekłych obejmują szeroki zakres ph (Greener B i in Proteases and ph in chronic wounds. J Wound Care; 14(2)). W innym szczegółowym badaniu, przez okres 12 miesięcy analizowano 247 wartości ph u 39 pacjentów z ranami przewlekłymi różnego pochodzenia, stwierdzając wartości od 5,45 do 8,65 (Dissemond, J. i in., 2003, ph-wert des Milieus chronischer Wunden, Untersuchungen im Rahmen einer modernen Wundtherapie, Der Hautarzt 54, No. 12, ). Debrylaza jest bardzo stabilna i aktywna w zakresie ph 5-10, co sprawia, że jest ona odpowiednia do zastosowania na ranach przewlekłych wykazujących szeroki zakres ph, jak opisano powyżej.

16 16 [0045] Ponadto, w teście aktywacji receptorów komórkowych stwierdzono, że debrylaza ma zdolność do aktywacji receptora aktywowanego proteazą 2 (PAR 2). PAR 2 jest elementem dużej rodziny 7-transbłonowych receptorów, które łączą się z białkami G. PAR 2 jest również elementem rodziny receptorów aktywowanych proteazą. Jest on aktywowany przez trypsynę, ale nie przez trombinę. Trypsyna przeprowadza proteolityczne odcięcie pozakomórkowego końca aminowego receptora, a nowy koniec aminowy funkcjonuje jako przyłączony ligand i aktywuje receptor. PAR 2 odgrywa ważną rolę w stanie zapalnym i bólu, w proliferacji fibroblastów (Asano-Kato i in., Tryptase increases proliferative activity of human conjunctival fibroblasts through protease-activated receptor-2, Invest Ophthalmol Vis Sci., (12):4622-6) i w formowaniu się tkanki łącznej, przyczyniając się do gojenia rany (Borensztajn K. i in., 2008, Factor Xa stimulates proinflammatory and profibrotic responses in fibroblasts via protease-activated receptor-2 activation, 1: Am J Pathol. 172(2):309-20). Zatem, podobny do trypsyny enzym według wynalazku tnąc przyłączony ligand aktywuje receptor, który następnie zapoczątkowuje procesy biochemiczne zaangażowane w pobudzanie gojenia się rany. Na przykład, przewiduje się, że debrylazę można stosować korzystnie w celu rozpuszczania złogów fibryny, które często obserwuje się w niegojących się ranach, do usuwania tkanki nekrotycznej i do uruchamiania z udziałem receptora kaskady odpowiedzi immunologicznych i komórkowych. [0046] Jest to zarówno pierwszy opis, jak i charakteryzacja na poziomie molekularnym po ekspresji rekombinacyjnej proteazy z Lucilia sericata o aktywności fibrynolitycznej, kazeinolitycznej i aktywującej PAR 2 i aktywności enzymatycznej w szerokim zakresie ph. Przewiduje się, że debrylaza i jej fragmenty o aktywności debrylazy mają zdolność do przygotowywania i wstępnego leczenia wolno gojących się lub przewlekłych ran tak, że stają się one podatne na naturalne procesy gojenia i/lub konwencjonalne leczenie, poprzez oczyszczenie rany, tj. usunięcie martwej tkanki i rozpuszczenie złogów fibryny. Ponadto, przewiduje się zastosowania kosmetyczne obejmujące zabiegi na skórze celem poprawienia wyglądu lub utkania skóry. Nałożenie propeptydu na ranę doprowadzi do jego przekształcenia w dojrzałe białko na drodze przecięcia enzymatycznego. [0047] Niniejszy wynalazek dotyczy również wektora zawierającego cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku, tj. cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą dojrzałe białko, propeptyd lub prepropeptyd, jak przedstawiono w opisie. Dodatkowo, wektor może zawierać cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą fragment, jak opisano powyżej. [0048] Wektor według tego wynalazku jest w stanie kierować replikacją, i/lub ekspresją cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku i/lub ekspresją kodowanego przez niego polipeptydu.

17 17 [0049] Korzystnie, wektorem jest plazmid, kosmid, wirus, bakteriofag lub inny wektor stosowany typowo np. w inżynierii genetycznej. [0050] Przykładowe plazmidy i wektory zostały przedstawione, na przykład, w pracy Studiera i współpracowników (Studier, W.F.; Rosenberg A.H.; Dunn J.J.; Dubendroff J.W., 1990, Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185, 61-89) lub broszurach dostarczanych przez firmy Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech i Gibco BRL. Informacje o innych korzystnych plazmidach i wektorach można znaleźć w: Glover, D.M., 1985, DNA cloning: a practical approach, tom I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. i Denhardt, D.T. (red.), 1988, Vectors: as survey _ of molecular cloning vectors and their uses, , Butterworth, Stoneham; Goedeel, D.V., 1990, Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7; Sambrook, J.; Russell, D. W., 2001, Molecular cloning: a laboratory manual, wyd. 3., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. [0051] Nieograniczające przykłady odpowiednich wektorów obejmują wektory w postaci plazmidów prokariotycznych, takie jak seria puc, pblue-script (Stratagene), seria wektorów ekspresyjnych pet (Novagen) lub pcrtopo (Invitrogen), lambda gt11, pjoe, seria pbbr1- MCS, pjb861, pbsmul, pbc2, pucpks, ptact1 i wektory zgodne z układem ekspresyjnym komórek ssaczych itp. prep (Invitrogen), pcep4 (Invitrogen), pmc1neo (Stratagene), pxt1 (Stratagene), psg5 (Stratagene), EBO-pSV2neo, pbpv-1, pdbpvmmtneo, prsvgpt, prsvneo, psv2-dhfr, plzd35, wektor ekspresyjny cdna pcdv1 Okayama-Berg (Pharmacia), prc/cmv, pcdna1, pcdna3 (Invitrogene), psport1 (GIBCO BRL), pgemhe (Promega), plxin, psir (Clontech), pires-egfp (Clontech), peak-10 (Edge Biosystems) ptriex-hygro (Novagen) i pcineo (Promega). Przykłady wektorów plazmidowych odpowiednich dla Pichia pastoris obejmują np. plazmidy pao815, ppic9k i ppic3.5k (wszystkie z firmy Invitrogen). [0052] Cząsteczkę kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, o której wspomniano powyżej, można również wprowadzić do wektorów w taki sposób, że uzyskuje się fuzję translacyjną z inną cząsteczką kwasu nukleinowego. Powstałe w ten sposób produkty nazywane są białkami fuzyjnymi i zostaną opisane dalej poniżej. Inne cząsteczki kwasu nukleinowego mogą kodować białko, które może np. zwiększać rozpuszczalność i/lub ułatwiać oczyszczanie białka kodowanego przez cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku. Nieograniczające przykłady obejmują pet32, pet41, pet43. Wektory mogą również zawierać dodatkowy, ulegający ekspresji kwas nukleinowy kodujący jedno lub więcej białek opiekuńczych ułatwiających prawidłowe składanie białka. Odpowiedni bakteryjni gospodarze ekspresyjni obejmują np. szczepy pochodzące od BL21 (takie jak BL21(DE3), BL21(DE3)PlysS, BL21 (DE3)RIL, BL21 (DE3)PRARE) lub Rosetta.

18 18 [0053] Szczególnie korzystne plazmidy, które można stosować w celu wprowadzenia kwasu nukleinowego kodującego proteazę serynową według wynalazku do komórki gospodarza to: puc18/19 (Roche Biochemicals), pkk-177-3h (Roche Biochemicals), pbtac2 (Roche Biochemicals), pkk223-3 (Amersham Pharmacia Biotech), pkk (Stratagene) i pet (Novagen). Kolejne odpowiednie plazmidy wymieniono w PCT/EP03/ Szczególnie korzystny jest układ ekspresyjny oparty na plazmidach należących do serii pet. [0054] Techniki modyfikacji wektorów patrz: Sambrook i Russel, Ogólnie, wektory mogą zawierać jedno lub więcej miejsc inicjacji replikacji (ori) i układy dziedziczenia do klonowania lub ekspresji, jeden lub więcej markerów do selekcji w gospodarzu, np., oporność na antybiotyki, i jedną lub więcej kaset ekspresyjnych. Odpowiednie miejsca inicjacji replikacji obejmują, na przykład, miejsca replikacji Col E1, wirusowy SV40 i M 13. Sekwencje kodujące wprowadzone do wektora mogą np. być zsyntetyzowane typowymi metodami, lub wyizolowane ze źródeł naturalnych. Ligację sekwencji kodujących z elementami regulującymi transkrypcję i/lub innymi sekwencjami kodującymi aminokwasy można przeprowadzić, stosując uznane metody. Elementy regulujące transkrypcję (części kasety ekspresyjnej) zapewniające ekspresję w komórkach prokariotycznych lub eukariotycznych są dobrze znane specjalistom w dziedzinie. Elementy te obejmują sekwencje regulatorowe zapewniające inicjację transkrypcji (np., kodon inicjacji translacji, promotory, sekwencje wzmacniające, i/lub izolujące), wewnętrzne miejsca wiązania rybosomu (IRES) (Owens i in., 2001) i ewentualnie sygnały poli-a zapewniające zakończenie transkrypcji i stabilizację transkryptu. Dodatkowe elementy regulatorowe mogą obejmować sekwencje wzmacniające transkrypcję jak również sekwencje wzmacniające translację, i/lub naturalnie związane lub heterologiczne regiony promotorowe. Korzystnie, cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku jest połączona w sposób umożliwiający działanie z takimi sekwencjami kontrolującymi ekspresję, co umożliwia ekspresję w komórkach prokariotycznych lub eukariotycznych. Wektor może ponadto zawierać sekwencje nukleotydów kodujące sygnały sekrecyjne, jako kolejne elementy regulatorowe. Takie sekwencje są dobrze znane specjaliście w dziedzinie. Ponadto, zależnie od użytego układu ekspresyjnego, do sekwencji kodującej cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku można dodać sekwencje liderowe zdolne do kierowania eksprymowanego polipeptydu do przedziału komórkowego. Takie sekwencje liderowe są dobrze znane w dziedzinie. Specjalnie skonstruowane wektory umożliwiają przesuwanie DNA między różnymi gospodarzami, tak jak między bakteriami a komórkami grzybowymi lub między bakteriami a komórkami zwierzęcymi. [0055] Cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku, jak to tu opisano powyżej, mogą zostać skonstruowane do wprowadzenia bezpośredniego lub wprowadzenia przez liposomy, wektory fagowe lub wektory wirusowe (np. adenowirusowe, retrowirusowe) do komórki.

19 19 Dodatkowo, jako wektor w eukariotycznym układzie ekspresyjnym dla cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku można zastosować układy bakulowirusowe lub układy na bazie wirusa krowianki lub wirusa Semliki Forest. Wektory ekspresyjne pochodzące od wirusów takich jak retrowirusy, wirus krowianki, wirus zależny od adenowirusów, wirusy opryszczki lub wirus brodawczakowatości bydła, mogą być stosowane do dostarczania kwasów nukleinowych lub wektora do docelowej populacji komórek. Sposoby, które są dobrze znane przez specjalistów w dziedzinie można zastosować do skonstruowania rekombinowanych wektorów wirusowych; patrz, na przykład, techniki opisane przez Sambrooka, 2001 i Ausubela, [0056] Promotory, które są szczególnie korzystne do wdrożenia wynalazku i które zostaną zastosowane, w szczególności, w E. coli, są znane specjaliście (Sambrook, J.; Fritsch, E.F. i Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Dalszymi odpowiednimi promotorami są te wybrane spośród promotorów T7, lac, tac, trp, ara lub indukowane przez ramnozę. Inne promotory wspomniano w pracy (Cantrell, SA (2003) Vectors for the expression of recombinant proteins in E. coli. Methods in Molecular biology 235: ; Sawers, G; Jarsch, M (1996) Alternative principles for the production of recombinant proteins in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology 46(1): 1-9). Bardzo korzystne jest zastosowanie promotora T7 w wektorze według wynalazku (Studier, W.F.; Rosenberg A.H.; Dunn J.J.; Dubendroff J.W.; (1990), Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185, 61-89; lub broszury dostarczone przez firmy Novagen lub Promega). [0057] Przykładowymi elementami regulatorowymi umożliwiającymi ekspresję w komórkach gospodarza eukariotycznego są promotory AOX1 lub GAL1 w drożdżach lub promotor CMV (cytomegalowirus), promotor SV40, promotor RSV (wirus mięsaka Rousa), promotor betaaktyny kurczaka, promotor CAG (połączenie promotora beta-aktyny kurczaka i sekwencji wzmacniającej genu odpowiedzi natychmiastowej z cytomegalowirusa), promotor gai10, promotor ludzkiego czynnika elongacji 1α, sekwencja wzmacniająca CMV, promotor kinazy CaM, promotor polh wirusa poliedrozy jądrowej Autographa californica (AcMNPV) lub intron globiny w komórkach ssaczych i innych komórkach zwierzęcych. Oprócz elementów odpowiedzialnych za inicjację transkrypcji takie elementy regulatorowe mogą również obejmować sygnały końca transkrypcji, takie jak miejsce SV40-poli-A lub miejsce tk-poli-a lub SV40, lacz i sygnały poliadenylacji polyh AcMNPV, w dół kwasu nukleinowego. [0058] Kotransfekcja dającym się selekcjonować markerem, takim jak geny oporności na kanamycynę lub ampicylinę do hodowli w E. coli i innych bakteriach umożliwia identyfikację i wyizolowanie transfekowanych komórek.

20 20 [0059] Dającymi się selekcjonować markerami dla hodowli komórek ssaczych są geny dhfr, gpt, oporności na neomycynę i oporności na higromycynę. Transfekowany kwas nukleinowy można również zamplifikować w celu ekspresji dużych ilości kodowanego (poli)peptydu. Marker DHFR (reduktaza dihydrofolianowa) jest przydatny do uzyskania linii komórkowych niosących kilka setek a nawet kilka tysięcy kopii genu będącego przedmiotem zainteresowania. Innym przydatnym markerem selekcyjnym jest enzym syntaza glutaminowa (GS) (Murphy i in. 1991; Bebbington i in. 1992). [0060] Stosując takie markery, komórki hoduje się w podłożu selekcyjnym i wyselekcjonowuje się komórki o największej oporności. [0061] W kolejnej realizacji, niniejszy wynalazek dotyczy transformowanej komórki gospodarza, transdukowanej lub transfekowanej wektorem według wynalazku. [0062] Komórki gospodarze, do których można wklonować wektory zawierające cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku stosowane są do replikowania i izolowania wystarczającej ilości rekombinowanego enzymu. Metody stosowane do tego celu są dobrze znane specjaliście (Sambrook, J.; Fritsch, E.F. i Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, wyd. 2., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). [0063] Odpowiednie komórki gospodarza prokariotycznego obejmują np. bakterie z gatunku Escherichia, takie jak szczepy pochodzące od E. coli BL21 (np. BL21(DE3), BL21(DE3)PlysS, BL21(DE3)RIL, BL21(DE3)PRARE, kodon plus BL21, kodon plus BL21 (DE3)), Rosetta, XL1 Blue, NM522, JM101, JM109, JM105, RR1, DH5α, TOP 10, HB101 lub MM294. Kolejnymi odpowiednimi komórkami gospodarza bakteryjnego są Streptomyces, Salmonella lub Bacillus takie jak Bacillus subtilis. Korzystnymi komórkami gospodarza prokariotycznego w połączeniu z niniejszym wynalazkiem są szczepy E. coli. [0064] Odpowiednimi komórkami gospodarza eukariotycznego są np. drożdże, takie jak Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha lub Pichia sp., takie jak P. pastoris, komórki owadzie, takie jak komórki Drosophila S2 lub Spodoptera Sf9, lub komórki roślinne. [0065] Szczególnie korzystny jest układ ekspresyjny występujący w E. coli BL21 jako gospodarz prokariotyczny i Pichia pastoris jako gospodarz eukariotyczny. [0066] Komórki gospodarza ssaka, które można zastosować obejmują ludzkie komórki Hela, komórki HEK293, H9 i Jurkat, mysie komórki NIH3T3 i C127, COS 1, COS 7 i CV1, komórki przepiórki QC1-3, mysie komórki L, komórki czerniaka Bowes i komórki jajnika chomika chińskiego (CHO). [0067] Niniejszy wynalazek ponadto dotyczy sposobu wytwarzania proteazy serynowej, jej fragmentu, propeptydu lub prepropeptydu, jak opisano powyżej, obejmującego hodowanie