Sekwencjonowanie RNA po kolei

Transkrypt

1 ALEKSANDRA ŚWIERCZ

2 Sekwencjonowanie RNA po kolei RNA-seq Module, 2013, A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 2

3 Różnice między eksperymentem mikromacierzowym a RNA-seq Przy użyciu mikromacierzy można badać poziom ekspresji znanych genów, natomiast wykorzystując RNA-seq można także wykryć nowe izoformy genów A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 3

4 Mikromacierze vs RNA seq Porównanie eksperymentów mikromacierzowych i RNA-seq pokazało, że: Jest duża zgodność w wynikach pomiędzy platformami, w szczególności pomiędzy wykrywaniem różnicowej ekspresji genów Platforma sekwencjonowania jest bardziej wrażliwa na wykrycie zmian, jest bardziej odporna na tło i różnice w powtórzeniach technicznych Zaletą RNA-seq jest porównanie poziomu ekspresji różnych genów między sobą (dla mikromacierzy można porównać ten sam gen między różnymi warunkami) Ograniczeniem RNA-seq jest natomiast wykrzywienie GC oraz niejednoznaczność w mapowaniu Większa jest moc statystyczna w wykrywaniu zmian, gdy odczyty występują w większej liczności A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 4

5 Dlaczego RNA-seq zamiast DNA-seq? Badanie funkcjonalności Genom jest taki sam, ale warunki eksperymentalne mogą mieć wpływ na różną ekspresję genów (np. traktowanie komórek lekarstwem, vs niczym nietraktowane, lub mysz dzika vs zmieniona genetycznie) Niektóre zmiany mogą być widoczne dopiero na poziome RNA Alternatywne izoformy Fuzja transkryptów (trans-splicing, transcription-induced chimerism) Edytowanie RNA - zmiana informacji w transkrypcie RNA przez reakcję chemiczną powodującą zmianę jednej zasady azotowej w inną (C->U, A->I, Inozyna interpretowana jako G). Przewidywanie sekwencji transkryptów z sekwencji genomu jest trudne: Alternatywny transkrypt Edytowanie RNA A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 5

6 Dlaczego RNA-seq zamiast DNA-seq? Interpretacja, czy poszczególne mutacje mają wpływ na sekwencje białkową Mutacje regulujące które wpływają na to czy izoformy mrna ulegają ekspresji i jak dużej Czy mutacje wpływają na promotory, eksonowe/intronowe motywy, miejsca splicingowe? Wpływ na białka kodujące mutacje somatyczne (często heterozygotyczne) Jeśli gen nie ulega ekspresji, mutacja w takim genie będzie mniej interesująca Jeśli gen ulega ekspresji tylko z alleli dzikiego typu, może to sugerować na utratę funkcjonalności (haploinsufficiency) Jeśli allel mutanta ulega ekspresji, może to oznaczać kandydata na target dla leku A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 6

7 RNA-seq razem z Ion Torent A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 7

8 Alamancos GP, Agirre E, Eyras E. (2014) Methods to study splicing from high-throughput RNA sequencing data. Methods Mol Biol 1126: A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 8

9 Trzy podejścia do mapowania RNA-seq A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 9

10 Trudności przy mapowaniu RNA Geny w genomach eukariotycznych zawierają introny, a sewkencje mrna są już ich pozbawione. Programy mapujące odczyty z eksperymentów RNA-seq muszą być w stanie dopasować sekwencje z przerwami Introny w genomach ssaków mają długość od 50 bp - 100,000 bp. Średnia długość transkryptu mrna u człowieka to 2227 bp Średnia długość eksonu to 235 bp Średnio w jednym genie jest 9 eksonów Około 20% odczytów które mapują się na łączeniach eksonów mapują się tylko na < 10 nukleotydach na drugim eksonie A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 10

11 Trudności przy mapowaniu RNA (2) Część sekwencji pochodzi z przetworzonych pseudogenów, z których niektóre lub wszystkie introny zostały usunięte (może to spowodować nieprawidłowe mapowanie odczytów) Genom ludzki posiada 14tys pseudogenów Pseudogeny mają sekwencję bardzo podobną do funkcjonalnych genów zawierających introny. W większości przypadków nie ulegają transkrypcji Problem w mapowaniu wynika stąd że odczyty, które mapują się na łączeniu eksonów, będą się mapowały w całości dokładnie lub z niewielkim błędem do pseudogenów, które nie zawierają intronów. Jeśli metoda mapująca mapuje najpierw odczyty w całości, a resztę próbuje dopasować z podziałem na eksony, to pominie odczyty które w całości zmapowane zostały do pseudogenów A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 11

12 D. Kim, G. Pertea, C. Trapnell, H. Pimentel, R. Kelley, S.L. Salzberg TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions Genome Biology 2013, 14:R36 A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 12

13 Trudności przy mapowaniu RNA (3) Transkrypt badanego genomu może się różnić od genomu referencyjnego Różnice mogą być małe, typu SNP, insercje, delecje, niedopasowania Zmiany mogą być większe, rearanżacje chromosomowe przeniesienia dłuższych fragmentów, wiele kopii Małe zmiany nie wpływają znacznie na mapowanie trzeba dopuścić możliwość błędów w niedopasowaniu (może to niestety spowodować wiele miejsc mapowania) Większe zmiany: duże usunięcia, inwersje w obrębie tego samego chromosomu, oraz translokacje między-chromosomowe powodują że trudno znaleźć kolejne eksony genu fragment chrom. 2 fragment chrom. 5 W genomie badanym w stosunku do genomu referencyjnego część genu uległa translokacji oraz inwersji A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 13

14 TopHat2 pipeline Znane sygnały podziału eksonów GT-AG, GC-AG, AT-AC A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 14

15 A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 15

16 A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 16

17 Jak wyrażana jest ekspresja genu? RPKM Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads FPKM Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads W RNA-Seq poziom ekspresji transkryptu jest proporcjonalny do liczby fragmentów cdna z którego pochodzi. Chociaż: Liczba fragmentów jest przechylona w kierunku większych genów Całkowita liczba fragmentów jest uzależniona od głębokości sekwencjonowania RPKM (FPKM) = (10 9 * C) / (N * L) C liczba zmapowanych odczytów (fragmentów) do genu/transkryptu/eksonu N całkowita liczba zmapowanych odczytów (fragmentów) w bibliotece L liczba nukleotydów w genie/transkrypcie/eksonie A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 17

18 Alternatywne do FPKM/RPKM Raw counts liczba odczytów/fragmentów przypadająca na gen/transkrypt Htseq-count zlicza liczbę odczytów przypadających na gen/ekson A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 18

19 Różne strategie przypisania odczytu do eksonu htseq-count A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 19

20 Alternatywny splicing W procesie splicingu łączone są ze sobą różne eksony z pre-mrna na różne sposoby, czasami z pominięciem niektórych eksonów, lub z zachowaniem niektórych intronów Jeśli warianty splicingowe dotyczą sekwencji kodującej, powstałe białka różnią się sekwencją aminokwasową, co może powodować np. zróżnicowanie funkcji. Jeśli warianty splicingowe dotyczą obszarów niekodujących może to wpływać np. na wzmocnienie translacji lub stabilność mrna. Rekordem w liczbie różnych wariantów splicingowych jest gen Dscam D. melanogaster, który ma ponad 38 tys. różnych wariantów (więcej niż liczba wszystkich genów) * * C. Ghigna, C. Valacca, G. Biamonti Alternative Splicing and Tumor Progression, Curr Genomics. Dec 2008; 9(8): A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 20

21 Różne warianty splicingowe A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 21

22 A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 22

23 Różne warianty splicingowe Mutually exclusive exons A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 23

24 Jak Cufflinks radzi sobie z wykrywaniem alternatywnego splicingu? C. Trapnell, BA Williams, G Pertea, A Mortazavi, G Kwan, MJ van Baren, SL Salzberg, BJ Wold, L Pachter, Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation, Nature Biotechnology 28(5) 2010, p C Trapnell, DG Hendrickson, M Sauvageau, L Goff, JL Rinn, L Pachter, Differential analysis of gene regulation at transcript resolution with RNA-seq, Nature Biotechnology 31(1), 2013, p A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 24

25 Mapowanie odczytów sparowanych za pomocą TopHat-a. Każda para odczytów traktowana jest jako jedno dopasowanie. Odczyty mogą być zmapowane w całości, lub z podziałem pomiędzy eksonami A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 25

26 Cufflinks W pierwszym kroku wyszukiwane są pary niekompatybilnych fragmentów, które muszą pochodzić z innych izoform mrna (zaznaczone na żółto, niebiesko i czerwono). Fragmenty (sparowane odczyty), są wierzchołkami w grafie. Wierzchołki są łączone pomiędzy parami kompatybilnych fragmentów. Szarym kolorem zaznaczone są fragmenty, które mogą pochodzić z dowolnych transkryptów. Ścieżki w grafie odpowiadają wzajemnie wykluczającym się fragmentom, które mogą być połączone w izoformy. Graf może być pokryty minimalnie przez 3 ścieżki oznaczone 3 kolorami, co w efekcie daje 3 odrębne izoformy A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 26

27 Cufflinks Fragmenty są znakowane (tutaj kolorem) w zależności od tego z której izoformy pochodzą. Fioletowy fragment może pochodzić z niebieskiego lub czerwonego. Szare fragmenty mogą pochodzić z dowolnej izoformy. Cufflinks estymuje liczność transkryptu używając modelu statystycznego, w którym prawdopodobieństwo obserwowania każdego fragmentu jest liniową funkcją liczności transkryptów, z których mogą pochodzić. Ponieważ długość sekwencjonowanych fragmentów nie jest znana (sparowane odczyty są końcami fragmentów), a przypisanie fragmentu do różnych izoform powoduje że różna jest jego długość Cufflinks wyznacza rozkład długości odczytów. Rozkład ten jest następnie wykorzystywany do przypisania fragmentów do różnych izoform (fioletowy fragment byłby zbyt długi, gdyby został przypisany do czerwonego transkryptu). W ostatnim kroku program maksymalizuje prawdopodobieństwo liczności każdej z izoform i przydziela im odpowiednio numeryczne wartości (γ 1, γ 2, γ 3 ) A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 27

28 Cufflinks W powyższym przykładzie analizowany był tylko fragment jednego genu. Wszystkie fragmenty genu należy potem skleić całość. Podobnie analizowane są kolejne geny A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 28

29 A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 29

30 Do czego jest potrzebny cuffmerge? Pozwala na łączenie wyników z działania cufflinks a dla różnych próbek Jest to potrzebne ponieważ dla każdej próbki cufflinks może wykryć inną liczbę oraz inną strukturę transkryptów Odfiltrowywane są transkrypty, które są najprawdopodobniej artefaktami (transfrags) Opcjonalnie może także podać plik GTF w odniesieniu do genomu referencyjnego, w którym połączone będą dotychczas znane oraz nowe izoformy wraz z maksymalizacją jakości zasemblowanych transkryptów A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 30

31 Alamancos GP, Agirre E, Eyras E. (2014) Methods to study splicing from high-throughput RNA sequencing data. Methods Mol Biol 1126: A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 31

32 Normalizacja Celem normalizacji jest usunięcie systematycznych błędów (czyli wynikających z niedoskonałości technologii) przy zachowaniu informacji biologicznej i wygenerowanie wartości, które będą mogły być porównane pomiędzy eksperymentami, w szczególności jeśli były wygenerowane w innym czasie, miejscu, na innym sekwenatorze.

33 Różnicowa ekspresja genów

34 Szukamy odpowiedzi na pytania Przeprowadzony został eksperyment (2 lub kilka różnych warunków, kilka powtórzeń każdy) Zbadaliśmy, że eksperymenty są dobrej jakości Histogram, imageplot, Usunięte zostały błędy systematyczne Korekcja tła, normalizacja plotma, boxplot Które geny (na mikromacierzy/ wykryte przez RNA seq) uległy zróżnicowanej ekspresji? Czy wystarczy posortować po log ratio?

35 3 różne zbiory danych zbiór A Pobrano próbki od 20 pacjentów chorych na raka piersi przed i po 16- tygodniowym leczeniu chemioterapią. Zbadano je przy użyciu mikromacierzy. Chcemy zidentyfikować geny, które uległy podwyższonej i obniżonej ekspresji związanej z leczeniem Data are from the paper of Perou et al. (2000) and are available from the Stanford Microarray Database.

36 W każdym z zestawów szukamy genów o zróżnicowanej ekspresji W zestawie A mamy dane sparowane. Mamy 2 pomiary dla każdego pacjenta: przed i po chemii. Dane są ze sobą powiązane to co nas interesuje to różnica pomiędzy dwoma pomiarami (log ratio), aby wykryć geny z podwyższoną i obniżoną ekspresją (up- downregulated) Pomiary dla każdego pacjenta są odjęte. Sprawdzamy czy mediana lub średnia są różne od 0

37 3 różne zbiory danych zbiór B Pobrany został szpik kostny od 27 pacjentów cierpiących na białaczkę ALL (acute lymphoblastic leukemia) i od 11 pacjetów cierpiących na białaczkę typu AML (acute myleoid leukemia). Zanalizowano próbki używając mikromacierzy Affymetrixowych Chcemy zidentyfikować geny, które uległy podwyższonej i obniżonej ekspresji w ALL w porównaniu do AML Data are from the paper of Golub et al. (1999) and are available from the Stanford Microarray Database

38 W zestawie B mamy dane niesparowane. Mamy 2 grupy pacjentów i chcemy zaobserwować jaki jest związek pomiędzy pacjentami w jednej grupie a pacjentami w drugiej grupie. Mamy pomiary dla każdego pacjenta z obu grup. Sprawdzamy czy mediana lub średnia dla obu grup są różne.

39 3 różne zbiory danych zbiór C Badano 4 typy nowotworów złośliwych drobnookrągłoniebiesko-komórkowych (small round blue cell tumors): Neuroblastoma (nerwiak płodowy) NB, non-hodgkin lymphoma (chłonniak nieziarniczny) NHL, rhabdomyosarcoma (mięśniakomięsak prążkowanokomórkowy) RMS, Ewing tumors (mięsak Ewinga) EWS 63 próbki z tych nowotworów (12, 8, 20, 23 z każdej z grup) Chcemy zidentyfikować geny, które uległy zróżnicowanej ekspresji w jednej z tych 4 grup The data are from the paper of Khan et al. (2001) and are available from the Stanford Microarray Database.

40 Dane sparowane (zestaw A) i niesparowane (zestaw B) wymagają odmiennej analizy (sparowany i niesparowany test istotności t) Zestaw danych C składa się z 4 grup i wymaga bardziej skomplikowanej analizy, jak np. analizy wariancji (ANOVA)

41 Cała populacja vs wybrane osobniki Nie możemy zbadać całej populacji (np. chorych na raka) Wybieramy reprezentację kilku (dziesięciu) osobników Uogólniamy wyniki na całą populację (np. pacjentów chorych na raka)

42 Przeprowadzamy wnioskowanie statystyczne aby stwierdzić czy różnica w ekspresji genu pomiędzy jedną, a drugą grupą badanych osobników wynika z szumu w danych, z różnorodności pomiędzy osobnikami, czy rzeczywiście ze zróżnicowanej ekspresji Dlatego potrzebujemy POWTÓRZEŃ eksperymentów Grupa A Grupa B Im większa liczba powtórzeń, tym pewniejszy wynik

43 Hipoteza zerowa H 0 zakłada że gen nie uległ zróżnicowanej ekspresji H 1 różnica w ekspresji genu jest znacząca Zbiór A gen nie uległ zróżnicowanej ekspresji po chemii Zbiór B gen nie uległ zróżnicowanej ekspresji dla pacjentów z białaczką typu ALL i AML Jeśli hipoteza H 0 jest prawdziwa, to znaczy że nie została stwierdzona istotna statystycznie zmiana w ekspresji. Jeśli prawdopodobieństwo zaistnienia hipotezy H 0 jest poniżej pewnego progu, to możemy odrzucić hipotezę zerową, a przyjąć alternatywną.

44 Testy statystyczne Każdy test hipotezy zerowej tworzy model, który wyznacza prawdopodobieństwo obserwowanej statystyki, np. średnie zróżnicowanie ekspresji genów. To prawdopodobieństwo to p-value. Im mniejsze tym mniej prawdopodobne, że obserwowane dane pojawiły się przypadkowo i tym bardziej pewne wyniki. Zakładamy że zróżnicowana ekspresja obserwowana dla genów z niską wartością p- value z małym prawdopodobieństwem pojawiła się przypadkowo, a zatem jest skutkiem biologicznego efektu, który testujemy. p-value = 0.01 oznacza że jest 1% szansy na obserwowanie zróżnicowanej ekspresji przez przypadek

45 Testy parametryczne (dla danych z rozkładem normalnym) test t sparowany test t niesparowany Testy nieparametryczne Test Wilcoxona dla par obserwacji (Wilcoxon sign-rank test) Test Manna-Whitneya = test sumy rang Wilcoxona (Wilcoxon rank-sum test) Bootstrap pozwala ominąć założenie o rozkładzie normalnym danych (mulitifactor) Anova gdy mamy więcej niż 2 warunki (2 rodzaje próbek) do porównania ebayes gdy jest zbyt mało powtórzeń i nie można wyznaczyć wariancji model liniowy oraz złagodzona statystyka t

46 Jaki można popełnić błąd? Odrzucenie hipotezy zerowej Nie-odrzucenie hipotezy zerowej Hipoteza zerowa (H 0 ) jest prawdziwa False positive Błąd I typu True positive poprawne Hipoteza zerowa (H 0 ) jest fałszywa True negative poprawne False negative Błąd II typu Swoistość - specificity Moc testu - sensitivity

47 Błąd typu I (false positive) Odrzucona została hipoteza zerowa, która mówi że geny nie uległy zróżnicowanej ekspresji Uznajemy zatem że geny uległy zróżnicowanej ekspresji, chociaż faktycznie tak nie było Współczynnik błędów I typu jest nazywany rozmiarem testu i oznaczany przez α. Poziom istotności testu (significance) (1- α) swoistość (specificity)

48 Błąd II typu (false negative) Nie udało się odrzucić hipotezy zerowej, chociaż faktycznie nie była spełniona Nie udało nam się wykryć genów, które uległy zróżnicowanej ekspresji Oszacowanie prawdopodobieństwa popełnienia błędu II typu oznaczamy przez β. (1- β) nazywamy mocą testu lub czułością (sensitivity)

49 Wielokrotne testowanie - problem Z definicji p-value, każdy gen ma 1% szansy posiadania wartości p<0.01, czyli będzie znaczący przy poziomie istotności 1% Dla genów, oczekujemy że o 100 genów przejdzie próg p<0.01 o 10 genów przejdzie próg p<0.001 o 1 gen przejdzie próg p< Dla zestawu A mamy 9216 genów. Jeśli chemioterapia nie miałaby żadnego wpływu na zmianę ekspresji genów to i tak oczekiwalibyśmy, że dla 92 genów p<0.01 Czy gen naprawdę uległ zróżnicowanej ekspresji, czy jest to wynik błędu I typu (false positive)?

50 Kontrolowanie false positives Family-wise error rate (FWER) - Prawdopodobieństwo co najmniej jednego błędu I typu pomiędzy genami wybranymi jako znaczące FWER = Pr(FP > 0) Bonferroni False discovery rate (FDR) - Oczekiwana proporcja błędów I typu spośród odrzuconych FDR = E Q, gdzie Q = FP, jeśli R > 0 R 0, jeśli R = 0 Benjamini Hochberg R to suma False Positive i True Negative (czyli wszystkich z odrzuconą hipotezą)

51 Korekcja p-value Bonferroni Załóżmy że przeprowadziliśmy testowanie hipotezy dla każdego z n genów, wyznaczyliśmy: statystykę t i dla i-tego genu wartość p i dla i-tego genu Korekcja Bonferroni: p i = min(n pi, 1) Wybierając geny p i α kontrolujemy FWER na poziomie Pr(FP>0) α α- poziom istotności

52 Korekcja Bonferroni - wada Przy dużej liczbie genów korekcja może spowodować, że dla żadnego genu nie będziemy mogli odrzucić hipotezy zerowej

53 Korekcja Benjamini Hochberg Kontrolowanie FDR = E(FP/R) na poziomie α 1. Sortowanie wartości p: p r1 p r2 prn 2. Wyznaczenie: j' = max{j: p rj (j/n)* α} 3. Odrzucenie hipotezy H rj dla j=1,, j

54 Limma Liniowy model początkowo używany do analizy danych pochodzących z eksperymentów mikromacierzowych, następnie przystosowany do analizy danych RNA-seq Umożliwia na bardzo rozbudowany model porównania, poprzez zdefiniowanie design matrix oraz contrast matrix. > design <- model.matrix(~ 0+factor(c(1,1,1,2,2,3,3,3))) > colnames(design) <- c("group1", "group2", "group3") > contrast.matrix <- makecontrasts(group2-group1, group3- group2, group3-group1, levels=design) Umożliwia analizę trendów Control vs treated 1d 2d 4d 8d 12d Time points A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 55

55 DESeq Utworzony dla danych RNA-seq. Wymaga tabeli z wyznaczoną liczbą odczytów przypadających na dany gen. Normalizacja względem liczby wszystkich odczytów przypadających na próbkę > cds = estimatesizefactors( cds ) Estymacja wariancji wyznaczenie jak bardzo geny różnią się w ekspresji pomiędzy różnymi próbkami > cds = estimatedispersions( cds ) Wyznaczenie różnicowej ekspresji > res = nbinomtest( cds, "untreated", "treated" ) A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 56

56 Jak działa cuffdiff? Modelowanie zmienności w liczbie fragmentów dla każdego genu dla różnych powtórzeń estymacja wariacji Liczba fragmentów dla każdej izoformy jest estymowana dla każdego powtórzenia (jak poprzednio) razem z miarą niepewności pochodzącą od niejednoznacznie zmapowanych odczytów Transkrypty, z większą liczbą współdzielonych eksonów, a niewielką liczbą jednoznacznie przypisanych fragmentów będą miały mniejszą niepewność Algorytm łączy estymowaną niepewność razem ze zmiennością pomiędzy powtórzeniami poprzez model ujemnego rozkładu dwumianowego dla liczby fragmentów, w celu estymowania liczby niezgodności dla każdego transkryptu w każdej bibliotece Te estymowane niezgodności używane podczas testowania statystycznego pozwalają na znalezienie znaczących statystycznie genów i transkryptów, które uległy zróżnicowanej ekspresji A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 57

57 Różne programy porównanie wyników A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 58

58 Wizualizacja, np. cummerbund Automatycznie generuje zestaw wykresów do porównania ekspresji dla różnych (zadanych) próbek Wykresy z rozkładem wartości Wykresy z korelacją Wykresy MA Wykresy volcano Wykresy klastrowania, PCA, MDS w celu ogólnej oceny związku pomiędzy warunkami Heatmapy wykresy gęstości Wykresy z poziomu genów lub transkryptów pokazujące strukturę transkryptów i poziom ekspresji A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 59

59 A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 60

60 ` A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 61

61 Dwa sposoby patrzenia na dane Patrzymy na związek między genami wykorzystując ekspresję każdej próbki jako pomiar genu Patrzymy na związek między próbkami używając ekspresji każdego genu jako miarę dla każdej próbki z naukowego punktu widzenia jest to odrębna analiza z punktu widzenia metod to jest to samo

62 Klasyfikacja i klastrowanie Analiza dyskryminacyjna: KLASY ZNANE Klastrowanie: KLASY NIEZNANE

63 Metody eksploracji danych klastrowanie grupowanie ze sobą genów lub/i próbek w celu znalezienia podobieństw (np. hierachiczne, k-średnich, PAM partitioning around medoids, SOM self-organizing maps) projekcję wizualizacja próbek w przestrzeni dwuwymiarowej (principal component analysis analiza głównych składowych - PCA, skalowanie wielowymiarowe - MDS) Analiza dyskryminacyjna (klasyfikacja) dla każdej badanej klasy chcemy znaleźć wzorce z podzbioru genów, za pomocą których będziemy przydzielać nowe próbki do zadanych klas (k-nearest neigbors, centroid classification, liniowa analiza dyskryminacyjna LDA, SVM suport vector machines).

64 PCA - przykład

65 PCA - przykład

66 Hierarchiczne klastrowanie Heatmap i dendrogram

67 Analiza klastrowa/ Analiza skupień Cel analizy klastrowej Grupowanie kolekcji obiektów w grupy klastrów, takich że obiekty wewnątrz klastra będą do siebie bardziej podobne niż obiekty powiązane do innych klastrów. Dwa składniki potrzebne do tworzenia grup obiektów: Miara odległości W jaki sposób ocenić czy obiekty są do siebie podobne czy też nie? Algorytm do klastrowania Procedura do minimalizacji odległości pomiędzy obiektami w klastrze/grupie lub/i maksymalizacji odległości pomiędzy grupami

68 Analiza klastrowa Macierz ekspresji genów próbki Klastrowanie kolumn: grupowanie podobnych próbek geny Klastrowanie wierszy: grupowanie genów z podobną trajektorią Bi-klastrowanie: grupy genów mają podobną trajektorię dla podzbioru próbek

69 Analiza dyskryminacyjna