Transkrypt

1 POSTÊPY BIOLOGII KOMÓRKI ZARODKOWE KOMÓRKI MACIERZYSTE TOM NR 2 ( ) ZARODKOWE KOMÓRKI MACIERZYSTE W POSZUKIWANIU PLURIPOTENCJI* EMBRYONIC STEM CELLS SEARCHING FOR THE PLURIPOTENCY Maria A. CIEMERYCH Zak³ad Cytologii, Instytut Zoologii, Wydzia³ Biologii, Uniwersytet Warszawski Streszczenie: W 2007 roku Nagroda Nobla w dziedzinie Fizjologii i Medycyny przyznana zosta³a Martinowi Evansowi, Mario Cappecchiemu oraz Olivierowi Smithiesowi. Martin Evans zosta³ uhonorowany za izolowanie pluripotentnych mysich zarodkowych komórek macierzystych (komórek ES), dwaj pozostali badacze za opracowanie metod genetycznej modyfikacji tych komórek.tutaj przedstawiono historiê uzyskania zarodkowych komórek macierzystych, metody wywo³ywania ich ukierunkowanego ró nicowania in vivo oraz in vitro, a tak e wybrane problemy zwi¹zane z potencjalnym zastosowaniem tych komórek w terapii. Omówione zosta³y tak e techniki wykorzystywane do modyfikacji genetycznej komórek ES oraz najnowsze osi¹gniêcia naukowe, dziêki którym mo liwe jest uzyskiwanie pluripotentnych komórek nie tylko z zarodków na wczesnych etapach rozwoju, ale tak e z komórek somatycznych. S³owa kluczowe: zarodkowe komórki macierzyste, pluripotencja, myszy knock-out, ró nicowanie, potworniak. Summary: In 2007 Martin Evans, Mario Cappecchi and Olivier Smithies were granted Nobel Prize in Physiology in Medicine. Martin Evans was the first who isolated mouse pluripotent embryonic stem cells (ES cells). Cappecchi and Smithies received the prize for the discovery of the methods allowing efficient genetic modification of ES cells. The current review briefly summarizes the history of ES cells, methods of their in vivo and in vitro differentiation and selected issues of their potential application in the therapy. It also focuses on the techniques of genetic modification of ES cells and studies devoted to the derivation of pluripotent stem cells form other then embryonic sources. Key words: embryonic stem cells, pluripotency, knock-out mice, differentiation, teratoma. WSTÊP W 2007 roku Nagroda Nobla w dziedzinie Fizjologii i Medycyny zosta³a przyznana trzem badaczom. Martin Evans otrzyma³ j¹ za uzyskanie linii zarodkowych komórek macierzystych komórek ES (ang. Embryonic Stem). Mario Capecchi i Olivier Smithies *Wyk³ad wyg³oszony 13 grudnia 2007 roku podczas sesji Towarzystwa Naukowego Warszawskiego poœwiêconej Nagrodzie Nobla w dziedzinie Fizjologii i Medycyny przyznanej w 2007 roku. Artyku³ powsta³ podczas realizacji projektu badawczego finansowanego ze œrodków na naukê MNiSW nr N N

2 184 M. A. CIEMERYCH zostali uhonorowani za opracowanie techniki, która umo liwi³a modyfikacje genetyczne komórek ES [37]. Uzyskane przez Evansa zarodkowe komórki macierzyste s¹ powszechnie uwa ane za komórki, z których mo na uzyskaæ wszystkie tkanki buduj¹ce organizm. Gdyby tak by³o, komórki te mog³yby nosiæ miano komórek totipotentnych. Istniej¹ jednak w¹tpliwoœci, czy komórki te mog¹ ró nicowaæ w tkanki pozazarodkowe, takie jak b³ony p³odowe czy ³o ysko. W¹tpliwoœci te sprawiaj¹, e zarodkowe komórki macierzyste okreœla siê raczej mianem komórek pluripotentnych [57]. Jak dosz³o do uzyskania tych komórek? Zacznijmy wiêc ab ovo, czyli od jaja, a dok³adniej od oocytu. 1. OD OOCYTU DO POTWORNIAKA Oocyt ssaka ulega owulacji z jajnika do jajowodu, tam mo e zostaæ zap³odniony przez plemnik i przekszta³ciæ siê w jednokomórkowy zarodek zygotê. Z zygoty, w wyniku nastêpuj¹cych po sobie podzia³ów bruzdkowania, powstaje wielokomórkowa morula (16 32 komórek), a nastêpnie zdolna do zagnie d enia siê w b³onie œluzowej macicy (implantacji) blastocysta (ryc. 1). Blastomery, czyli komórki buduj¹ce zarodek w pocz¹tkowych stadiach rozwoju s¹ totipotentne, zatem mog¹ z nich powstaæ wszystkie tkanki i narz¹dy rozwijaj¹cego siê zarodka, ³¹cznie z tkankami pozazarodkowymi. Ró nicowanie blastomerów, jak i towarzysz¹ce temu procesowi ograniczanie potencji rozwojowych niektórych z nich zachodzi po raz pierwszy w stadium moruli, w okresie poprzedzaj¹cym powstanie blastocysty. Jednak dopiero w stadium blastocysty efekty ró nicowania s¹ wyraÿnie widoczne zarodek zbudowany jest wtedy z dwóch rodzajów komórek, które mo na odró niæ na podstawie ich morfologii. Zewnêtrzna warstwa p³askich komórek otaczaj¹cych ca³y zarodek to nab³onek trofektodermalny (trofektoderma lub trofoblast) z niego powstan¹ tkanki pozazarodkowe czêœæ b³on p³odowych i zarodkowa czêœæ ³o yska. Natomiast grudka komórek zlokalizowanych wewn¹trz blastocysty, na jednym z jej biegunów to wêze³ zarodkowy. I w³aœnie te komórki s¹ pluripotentne. W wyniku ich ró nicowania, podczas kolejnych etapów rozwoju, powstan¹ pierwsze tkanki multipotentne listki zarodkowe: ektoderma, endoderma i mezoderma oraz pierwotne komórki p³ciowe. Nastêpnie listki zarodkowe dadz¹ pocz¹tek swoistym tkankowo komórkom macierzystym, a te z kolei komórkom prekursorowym tkanek i narz¹dów. Procesowi ró nicowania towarzyszy wiêc utrata totipotencji, a jedynie wêze³ zarodkowy blastocysty zawiera komórki pluripotentne (ryc. 1). Z tych pluripotentnych komórek uzyskano pierwsze linie zarodkowych komórek macierzystych. Historia badañ, które doprowadzi³y do uzyskania komórek ES, rozpoczê³a siê w latach piêædziesi¹tych XX wieku. W 1954 roku, Stevens i Little opisali guzy rozwijaj¹ce siê w j¹drach samców myszy szczepu 129, zwane potworniakami lub teratomami (od gr. teratos potwór), które zbudowane by³y z wielu rodzajów tkanek m.in. nab³onków, miêœni czy chrz¹stki. W 1974 roku Stevens i Varnum po raz pierwszy opisali rozwój potworniaków jajnikowych u samic szczepu myszy LT/Sv. Analiza histologiczna tych guzów wykaza³a obecnoœæ wielu zró nicowanych typów komórek. Badania pocz¹tkowych stadiów rozwoju potworniaków udowodni³y, e powstaj¹ one z komórek

3 ZARODKOWE KOMÓRKI MACIERZYSTE 185 RYCINA 1. Rozwój przedimplantacyjny zarodka myszy. Oocyt zablokowany w stadium metafazy II podzia³u mejotycznego owulowany jest do jajowodu, gdzie po zap³odnieniu zachodz¹ pierwsze etapy rozwoju zarodka. Zarówno jednokomórkowy zarodek (zygota), jak i komórki (blastomery) zarodków dwu- i czterokomórkowych s¹ totipotentne. A do stadium moruli blastomery nie ró ni¹ siê od siebie morfologi¹. W blastocyscie mo na ju wyró niæ dwa typy komórek pluripotentne komórki wêz³a zarodkowego, z których powstan¹ trzy listki zarodkowe: ekto-, endo- i mezoderma oraz komórki trofektodermy (trofoblastu), z których powstan¹ tkanki pozazarodkowe (j¹dra komórkowe czerwone, mikrotubule zielone) rozrodczych. Cech¹ charakterystyczn¹ myszy szczepu LT/Sv s¹ zaburzenia oogenezy, które przejawiaj¹ siê miêdzy innymi du ym odsetkiem oocytów nieulegaj¹cych owulacji z jajnika do jajowodu. Pozostaj¹ce w jajniku oocyty ulegaj¹ natomiast spontanicznej aktywacji, a pocz¹tkowe stadia rozwoju powsta³ych w ten sposób zarodków partenogenetycznych przebiegaj¹ podobnie jak rozwój zarodków powsta³ych w wyniku zap³odnienia oocytów owulowanych. Stevens i Varnum, analizuj¹c preparaty histologiczne uzyskane z jajników myszy LT/Sv, zaobserwowali w nich zarodki dwu- i czterokomórkowe. Wykazali tak e, e zarodki te mog³y osi¹gaæ stadium blastocysty, jednak kolejne etapy rozwoju przebiega³y nieprawid³owo i prowadzi³y do rozwoju potworniaków. Potworniaki powstawa³y wiêc z komórek o bardzo du ej potencji rozwojowej komórek rozrodczych (spermatogonia myszy szczepu 129) lub bruzdkuj¹cych zarodków partnenogenetycznych (aktywowane oocyty myszy szczepu LT/Sv). Równoczeœnie prowadzono badania, które wykaza³y, e do powstania potworniaków prowadzi³o równie przeszczepienie w miejsca pozamaciczne (np. pod torebkê nerkow¹ lub j¹dro) bruzdkuj¹cych lub nawet gastruluj¹cych normalnych zarodków myszy, a tak e zawi¹zków gonad [62]. Zatem mo na by³o stwierdziæ, e ró nego rodzaju tkanki mog¹ powstawaæ w miejscach pozamacicznych w wyniku podzia³ów komórek toti- lub pluripotentnych. Obserwacje te zosta³y wykorzystane przez Gail Martin i Martina Evansa. W 1974 opublikowali oni wyniki doœwiadczeñ, w których z bêd¹cych w pocz¹tkowych stadiach formowania siê potworniaków otrzymali kilka linii komórek okreœlonych jako komórki raka zarodkowego ECC (ang. Embryonic Carcinoma Cells). Chocia poszczególne linie ECC ró ni³y siê od siebie morfologi¹, to

4 186 M. A. CIEMERYCH jednak wszystkie badane komórki by³y w stanie intensywnie i nieprzerwanie proliferowaæ. Co niezwykle istotne, by³y one w stanie ró nicowaæ w wiele rodzajów tkanek. Ich zdecydowanie negatywn¹ cech¹ by³ natomiast niestabilny kariotyp. Uzyskanie linii komórek z potworniaków stanowi³o istotny etap badañ, które doprowadzi³y do uzyskania zarodkowych komórek macierzystych. 2. POCZ TKI ZARODKOWYCH KOMÓREK MACIERZYSTYCH W 1975 roku Michael Sherman opublikowa³ w Cell pracê podsumowuj¹c¹ ówczesn¹ wiedzê na temat warunków hodowli in vitro zarodków ró nych gatunków ssaków oraz próby uzyskiwania z nich linii komórkowych. Jednak adna z opisanych przez niego prób nie doprowadzi³a do opracowania metody gwarantuj¹cej rutynowe uzyskiwanie linii komórek zarodkowych, charakteryzuj¹cych siê takimi cechami, jak zdolnoœæ do nieograniczonych podzia³ów czy ró nicowania. Dopiero w 1981 roku Martin Evans i Matthew Kaufman oraz niezale nie od nich Gail Martin opublikowali prace opisuj¹ce uzyskanie linii mysich pluripotentnych komórek zarodkowych [16, 38]. Sukces Evansa i Kaufmana mo liwy by³ dziêki spe³nieniu trzech warunków: i) zarodki, z których wyprowadzano liniê komórek znajdowa³y siê w odpowiednim stadium rozwoju obecne w nich by³y komórki pluripotentne; ii) uzyskano odpowiednio du ¹ liczbê komórek z jednego zarodka; iii) œrodowisko, w którym prowadzono hodowlê sprzyja³o podzia³om komórkowym, a hamowa³o ró nicowanie. Doboru stadium rozwojowego optymalnego dla uzyskania komórek ES dokonano porównuj¹c wzór syntezy bia³ek zachodz¹cej w komórkach raka zarodkowego oraz zarodkach myszy na ró nych stadiach rozwoju oko³oimplantacyjnego. Takie porównanie wykaza³o, e ECC i gastruluj¹ce zarodki myszy charakteryzowa³ podobny wzór syntezy bia³ek. Poniewa zarodki we wczesnych etapach gastrulacji by³y stosunkowo trudne do wyizolowania, zdecydowano siê na uzyskanie blastocyst, a nastêpnie ich kilkudniow¹ hodowlê in vitro, co zapewnia³o uzyskanie wiêkszej liczby komórek. Zabieg ten mia³ tak e zapewniæ osi¹gniêcie przez hodowane zarodki stadium rozwoju odpowiadaj¹ce okresowi gastrulacji. Podczas hodowli in vitro wêz³y zarodkowe blastocyst rozrasta³y siê, ale ich komórki zachowywa³y niezró nicowany charakter. Enzymatyczna dezagregacja takich wêz³ów, a nastêpnie kilkukrotne pasa owanie otrzymanych komórek doprowadzi³y do uzyskania linii komórek, które w odpowiednich warunkach pozostawa³y niezró nicowane. Komórki te charakteryzowa³ równie stabilny kariotyp, ekspresja markerów komórek zarodkowych oraz zdolnoœæ do ró nicowania w wiele tkanek. Gail Martin, prowadz¹ca badania niezale nie od Evansa, zastosowa³a po ywkê, w której uprzednio hodowane by³y komórki raka zarodkowego. W ten sposób zapewnione zosta³o œrodowisko stymuluj¹ce podzia³y komórkowe, a jednoczeœnie blokuj¹ce ró nicowanie. Ponadto Martin hodowa³a wêz³y zarodkowe blastocyst na warstwie od ywczej inaktywowanych fibroblastów. Zastosowana przez ni¹ technika inaktywacji fibroblastów nie odbiega³a od tej stosowanej wspó³czeœnie komórki poddawane by³y dzia³aniu mitomycyny C, która powoduje uszkodzenia DNA komórek, co uniemo liwia ich

5 ZARODKOWE KOMÓRKI MACIERZYSTE 187 proliferacjê. Takie niedziel¹ce siê fibroblasty stanowi¹ bardzo dobre pod³o e dla hodowli zarodkowych komórek macierzystych [7, 43]. W ci¹gu ostatnich kilku lat wykazano, e mo liwe jest uzyskanie linii komórek ES nie tylko z wêz³ów zarodkowych blastocysty, ale tak e z pojedynczych blastomerów izolowanych z zarodków we wczeœniejszych stadiach rozwojowych (np. morula), czy nawet z zarodków jednokomórkowych [12, 29, 30, 75]. W 1998 roku opublikowano dwa pierwsze doniesienia opisuj¹ce otrzymanie ludzkich zarodkowych komórek macierzystych. Komórki te otrzymano dwoma ró nymi sposobami. Thomson i wspó³pracownicy uzyskali je z blastocyst, czyli w sposób podobny do zastosowanego w przypadku mysich linii komórkowych [70]. Natomiast Shamblott i wspó³pracownicy opisali izolacjê i hodowlê in vitro ludzkich pierwotnych komórek p³ciowych, z których nastêpnie wyprowadzano liniê komórek ES [67]. Pierwotne komórki p³ciowe izolowano z zawi¹zków gonad 5 9-tygodniowych p³odów poddanych aborcji z przyczyn medycz-nych. Obecnie ludzkie komórki ES mo na uzyskaæ z pojedynczego blastomeru, a jego mikromanipulacyjne pobranie nie prowadzi do zniszczenia zarodka [11]. Bez wzglêdu na sposób uzyskania, ludzkie zarodkowe komórki macierzyste mia³y normalny kariotyp, nieulegaj¹cy zmianom podczas wielokrotnego pasa owania i hodowli in vitro [61, 70]. Syntetyzowa³y one tak e telomerazê oraz markery charakterystyczne dla komórek pluripotentnych, miêdzy innymi nale ¹ce do rodziny bia³ek powierzchniowych SSEA (ang. Stage Specific Embryonic Antigen). Podobnie jak mysie, tak e i ludzkie komórki ES charakteryzowa³a wysoka aktywnoœæ fosfatazy zasadowej enzymu, który jest równie markerem pierwotnych komórek p³ciowych [3, 20]. Do dnia dzisiejszego otrzymano oko³o 100 linii ludzkich komórek macierzystych. W 2007 roku, w amerykañskim Narodowym Instytucie Zdrowia (NIH) zarejestrowanych by³o 78 takich linii. Jednak dostêpnych do badañ jest jedynie 21 linii komórek ES, o których wiadomo, e w d³ugotrwa³ej, prowadzonej w odpowiednich warunkach hodowli in vitro zachowuj¹ stabilny kariotyp, zdolnoœæ do samoodnawiania oraz niezró nicowany charakter. 3. JAK PRZETESTOWAÆ PLURIPOTENCJÊ KOMÓREK ES? Z zarodków w ró nych stadiach rozwojowych mo na uzyskaæ wiele typów linii komórkowych. Jednak nie wszystkie spe³niaj¹ warunki niezbêdne do uznania ich za zarodkowe komórki macierzyste. G³ównym kryterium jest zdolnoœæ tworzenia wszystkich tkanek organizmu, a wiêc pluripotencja. Aby wykazaæ, czy dana linia komórkowa rzeczywiœcie ma takie zdolnoœci, nale y przeprowadziæ odpowiednie testy Chimery Najpe³niejszy test, jakiemu mog¹ zostaæ poddane komórki ES, polega na stwierdzeniu, czy mog¹ one ró nicowaæ we wszystkie tkanki i budowaæ wszystkie narz¹dy organizmu. Najlepsz¹ metod¹, która umo liwia zweryfikowanie pluripotencji komórek ES, jest uzyskanie i analiza zwierz¹t chimerowych, czyli takich, w których funkcjonuj¹ komórki pochodz¹ce od dwóch ró nych osobników.

6 188 M. A. CIEMERYCH Pierwsze mysie chimery by³y dzie³em Andrzeja K. Tarkowskiego i powsta³y 20 lat przed uzyskaniem mysich zarodkowych komórek macierzystych. Przeprowadzone przez Tarkowskiego doœwiadczenia polega³y na agregacji dwóch, kilkukomórkowych zarodków myszy [68, 69]. Komórki tych zarodków ulega³y przemieszaniu i w efekcie powstawa³ jeden chimerowy organizm. Obecnie zwierzêta chimerowe uzyskuje siê zazwyczaj w inny sposób nie poprzez agregacjê, ale poprzez mikromanipulacyjne wprowadzanie komórek ES do jamy blastocysty [67]. Doœwiadczenie planowane jest w taki sposób, aby ESy oraz blastocysty biorczynie pochodzi³y od zwierz¹t ró ni¹cych siê genami warunkuj¹cymi pigmentacjê. ESy wprowadzone do jamy blastocysty zasiedlaj¹ wêze³ zarodkowy, a nastêpnie, je eli s¹ one pluripotentne, bior¹ udzia³ w tworzeniu wszystkich tkanek. Oczywiœcie rozwój chimerowego zarodka mo e byæ kontynuowany jedynie wtedy, gdy zostanie on przeniesiony do dróg rodnych samicy biorczyni, tam ulegnie implantacji i przejdzie wszystkie etapy embriogenezy. Je eli sierœæ urodzonej myszy jest ³aciata lub te dominuje kolor sierœci myszy, z której zarodków uzyskano testowane komórki, mo na podejrzewaæ, e komórki te wesz³y w sk³ad tak e innych tkanek i narz¹dów. Stosuj¹c tê technikê wykazano niezbicie, e mysie zarodkowe komórki macierzyste s¹ pluripotentne. Uzyskiwanie zwierz¹t chimerowych stanowi istotny etap w badaniach, w których uzyskiwane s¹ myszy zmodyfikowane genetycznie knock-out (w polskim argonie naukowym zwane myszami nokautowymi), czyli pozbawione wybranych przez naukowców funkcjonalnych genów. W ten sposób mo na te otrzymywaæ np. myszy typu knock-in, czyli takie, w których genomach wybrany gen zast¹piony zosta³ przez zmodyfikowan¹ kopiê tego samego genu czy te nawet przez inny gen. Technika uzyskiwania zwierz¹t chimerowych zosta³a tak zmodyfikowana, e gwarantuje powstanie myszy zbudowanej wy³¹cznie z komórek ES. Mo liwe jest to dziêki eksperymentalnemu otrzymywaniu zarodków tetraploidalnych (4N). Stosunkowo prosta metoda elektrofuzji komórek, wykorzystywana do dziœ podczas tetraploidyzacji zarodków myszy, opracowana zosta³a w 1985 roku przez Kubiaka i Tarkowskiego [32]. Badacze ci przeprowadzili elektrofuzjê blastomerów dwukomórkowego zarodka myszy. W efekcie uzyskali jednokomórkowy, tetraploidalny zarodek, który by³ w stanie przechodziæ kolejne etapy bruzdkowania i osi¹gn¹æ stadium blastocysty. W takiej blastocyœcie mo na wyró niæ zarówno trofektodermê, jak i wêze³ zarodkowy. Jednak tetraploidalne komórki wêz³a zarodkowego nie s¹ w stanie normalnie proliferowaæ. Zosta³o to udowodnione w 1991 roku, gdy Andras Nagy i jego wspó³pracownicy, stosuj¹c opisan¹ powy ej technikê, wykazali, e komórki tetraploidalne wchodz¹ jedynie w sk³ad tkanek pozazarodkowych (b³on p³odowych, ³o yska) oraz e s¹ one skutecznie eliminowane z cia³a zarodka. A zatem jeœli komórki ES wprowadzimy do jamy tetraploidalnej blastocysty, to cia³o rozwijaj¹cego siê zarodka bêdzie zbudowane jedynie z komórek wywodz¹cych siê z ESów [14,15, 60]. Metoda ta jest wprawdzie mniej wydajna ni klasyczny sposób tworzenia chimer, ale jest ona niezast¹piona, gdy na przyk³ad uzyskane zarodki nokautowe umieraj¹ in utero z powodu nieprawid³owego funkcjonowania tkanek pozazarodkowych. W takiej sytuacji analiza fenotypu zmodyfikowanego genetycznie zwierzêcia mo liwa by³aby jedynie wtedy, gdy tkanki pozazarodkowe funkcjonowa³yby bez zarzutu. Wprowadzenie komórek ES pozbawionych obu alleli danego genu do

7 ZARODKOWE KOMÓRKI MACIERZYSTE 189 jamy blastocyty uzyskanej w wyniku tetraploidyzacji normalnych zarodków gwarantuje, e nie dojdzie do utworzenia zarodka chimerowego. Powstanie wtedy zarodek zbudowany wy³¹cznie z komórek ES, natomiast tkanki pozazarodkowe zbudowane bêd¹ z normalnie funkcjonuj¹cych komórek tetraploidalnych. Stosuj¹c tê tzw. tetraploidaln¹ komplementacjê wykazano miêdzy innymi, e zarodki pozbawione genu supresorowego nowotworu retinoblastoma [78] czy te cyklin E1 i E2 [18] umieraj¹ in utero z powodu dysfunkcji ³o yska. Wymiana nieprawid³owo funkcjonuj¹cego, nokautowego ³o yska na ³o ysko tetraploidalne umo liwi³a bardziej zaawansowany rozwój tych myszy. Opisana technika mo e byæ tak e u ywana do przyspieszonego uzyskiwania myszy zmodyfikowanych genetycznie [60] Potworniaki Uzyskiwanie zwierz¹t chimerowych to jedyny test daj¹cy gwarancjê stwierdzenia, czy badane komórki s¹ w stanie ró nicowaæ i tworzyæ wszystkie rodzaje tkanek. Jednak mikromanipulacyjne wprowadzenie komórek do jamy blastocysty wymaga specjalistycznego i kosztownego sprzêtu, doœwiadczenia w manipulowaniu zarodkami oraz dostêpu do hodowli myszy. Ponadto test ten, z oczywistych wzglêdów, stosowany jest jedynie do okreœlania pluripotencji komórek zwierzêcych. Mo liwoœæ badania zdolnoœci do ró nicowania komórek zarówno zwierzêcych, jak i ludzkich zapewnia inny rodzaj testu in vivo polegaj¹cy na stwierdzeniu, czy badane komórki mog¹ tworzyæ potworniaki. Je eli tak, to po wprowadzeniu tych komórek pod skórê myszy charakteryzuj¹cych siê os³abion¹ odpowiedzi¹ immunologiczn¹, np. SCID (ang. Severe Combined ImmunoDeficient) bêd¹ one tworzyæ guz zbudowany z wielu rodzajów tkanek [19]. Zarówno mysie, jak i ludzkie komórki macierzyste z powodzeniem przechodz¹ tego rodzaju weryfikacjê, co udowadnia, e s¹ one pluripotentne Kule zarodkowe i ró nicowanie in vitro Rozwój technik uzyskiwania i hodowli komórek i tkanek sprawi³, e przebieg ró nicowania komórek ES mo na œledziæ in vitro. Testy in vitro maj¹ wielk¹ zaletê, gdy mog¹ byæ stosowane zarówno w badaniach nad mysimi, jak i ludzkimi komórkami. Je eli zapewnione zostan¹ odpowiednie warunki hodowli, to komórki ES zachowuj¹ pluripotencjê i zdolnoœæ do samoodnawiania. W przypadku mysich komórek niezbêdna jest obecnoœæ czynnika przeciwbia³aczkowego LIF (ang. Leukemia Inhibitory Factor) (ryc. 2). ESy stymulowane przez LIF przechodz¹ intensywne podzia³y i zachowuj¹ niezró nicowany charakter. Usuniêcie LIF ze œrodowiska lub wprowadzenie innych, subtelnych modyfikacji warunków hodowli powoduje, e komórki macierzyste zaczynaj¹ tworzyæ agregaty, tzw. kule zarodkowe (ang. embryoid bodies) [33]. Kolejnoœæ ró nicowania komórek w kulach zarodkowych stanowi odzwierciedlenie procesów zachodz¹cych w zarodku rozwijaj¹cym siê in vivo. U myszy po implantacji blastocysty, rozrastaj¹cy siê wêze³ zarodkowy tworzy tzw. cylinder zarodkowy, który pocz¹tkowo zbudowany jest z ektodermy zarodkowej oraz znajduj¹cej siê na jej powierzchni endodermy pierwotnej. Podczas gastrulacji na tylnym biegunie zarodka dochodzi do powstania mezodermy, która wrasta pomiêdzy ekto- i endodermê. Analiza morfologii

8 190 M. A. CIEMERYCH RYCINA 2. G³ówne szlaki przekazywania sygna³ów warunkuj¹ce samoodnawianie siê oraz zachowanie pluripotencji przez zarodkowe komórki macierzyste (ES) (schemat adaptowany za zgod¹ Macmillan Publishers Ltd: Nature Rev Cell Biol [4], copyright 2005) nab³onków oraz ekspresji markerów charakterystycznych dla okreœlonych listków zarodkowych wykaza³a, e tak e w kulach zarodkowych znajduj¹ca siê na zewn¹trz endoderma pierwotna odseparowana jest warstw¹ komórek mezodermy od po³o onego wewn¹trz nab³onka ektodermalnego. Degraduj¹c enzymatycznie kule zarodkowe, a nastêpnie hoduj¹c uzyskane z nich komórki mo na doprowadziæ do ich dalszego ró nicowania. Warunkiem jest obecnoœæ czynników, które podczas rozwoju zarodkowego kontroluj¹ powstawanie okreœlonych tkanek [31, 34, 72]. Przyk³adowo, zastosowanie czynnika Noggin doprowadza do powstania komórek neuroektodermy, które syntetyzuj¹ bia³ka charakterystyczne dla tej tkanki, takie jak np. N-CAM (ang. Neural Cell Adhesion Molecule) czy nestyna [21, 64]. Obecnoœæ czynnika BMP-4 (ang. Bone Morphogenetic Protein-4) powoduje ró nicowanie mezodermy, której komórki syntetyzuj¹ takie czynniki, jak Brachyury czy Nodal [13, 77]. Dodanie do hodowli czynnika VEGF (ang. Vascular Endotelial Growth Factor) doprowadza do powstania komórek hematopoetycznych [50], a po ywka bez surowicy wzbogacona w FGF2 (ang. Fibroblast Growth Factor 2) i inhibitory kinazy fosfatydyloinozytolowej 3 powoduje powstanie komórek produkuj¹cych insulinê [13, 36, 77]. Mo liwoœæ ró nicowania komórek ES in vitro ma szczególne znaczenie dla analizy mechanizmów molekularnych towarzysz¹cych ró nicowaniu komórek w czasie organogenezy u cz³owieka. W przeciwieñstwie do procesów zachodz¹cych w trakcie rozwoju zarodka myszy, ró nicowanie tkanek ludzkich nie jest dostatecznie dobrze poznane. Pomimo e mysz stanowi bardzo dobry model wykorzystywany w badaniach rozwoju ssaków, to jednak istniej¹ dowody, e nie wszystkie procesy towarzysz¹ce ró nicowaniu s¹ identycznie regulowane podczas embriogenezy myszy i cz³owieka.

9 ZARODKOWE KOMÓRKI MACIERZYSTE JAK ZACHOWAÆ PLURIPOTENCJÊ? G³ówne cechy zarodkowych komórek macierzystych to zdolnoœæ do samoodnawiania oraz utrzymania niezró nicowanego charakteru. Hoduj¹c komórki ES mo na zapewniæ warunki, które gwarantuj¹ zachowanie obu tych cech. Podczas rozwoju zarodkowego komórki wêz³a zarodkowego, z których potencjalnie mo na uzyskaæ liniê komórek ES, zachowuj¹ zdolnoœci przypisane komórkom macierzystym jedynie przez bardzo krótki okres. Poniewa jeszcze przed implantacj¹ dochodzi do ekspresji genów warunkuj¹cych ró nicowanie tych komórek w endodermê pierwotn¹ (np. genu GATA 4/6), a nastêpnie tu po implantacji dochodzi do indukcji mezodermy (synteza np. czynnika Brachury) zarówno stan toti-, jak i pluripotencji komórek jest stanem przejœciowym. Jedynie w komórkach buduj¹cych ektodermê zarodkow¹ jeszcze w trakcie gastrulacji obserwowana jest synteza bia³ek charakterystycznych dla totipotentnych komórek wêz³a zarodkowego, takich jak np. Oct-4. W kolejnych stadiach rozwoju synteza Oct-4 zostaje jednak ograniczona do pierwotnych komórek p³ciowych [47, 52]. Zachowanie pluripotencji wymaga warunków sprzyjaj¹cych syntezie czynników umo liwiaj¹cych samoodnawianie komórek oraz gwarantuj¹cych zachowanie ich pluripotentnego charakteru. Konieczne jest tak e zahamowanie ekspresji genów odpowiedzialnych za ró nicowanie. Dotychczas scharakteryzowano wiele szlaków przekazywania sygna³ów, których aktywacja zapewnia takie w³aœnie warunki. Wiadomo równie, e istniej¹ ró nice w regulacji tych procesów miêdzy mysimi i ludzkimi zarodkowymi komórkami macierzystymi [3, 20]. W przeciwieñstwie do komórek ludzkich, aby mysie zarodkowe komórki macierzyste zachowa³y swój niezró nicowany charakter, wymagana jest obecnoœæ czynnika LIF. Jego zwi¹zanie z receptorem LIF (LIFR) prowadzi do powstania heterodimeru, w którego sk³ad wchodzi, poza LIFR, równie bia³ko gp130 [39, 45] (ryc. 2). Oddzia³ywanie LIF z jego receptorem prowadzi do aktywacji czynnika transkrypcyjnego STAT3, który stymuluje procesy samoodnawiania komórek macierzystych oraz indukuje ró nico-wanie w trofektodermê. Jednoczeœnie STAT3 hamuje powstawanie endodermy pierwot-nej. Kolejnym czynnikiem kluczowym dla utrzymania pluripotencji i dla samoodnawiania komórek macierzystych jest Nanog (w jêzyku celtyckim s³owo to oznacza krainê wiecznej m³odoœci). Nanog blokuje ró nicowanie komórek ES w trofektodermê [9, 10, 42]. Inne szlaki przekazywania sygna³u, np. zale ne od obecnoœci czynników BMP-4 (ang. bone morphogenetic protein 4) czy WNT, oddzia³uj¹c za poœrednictwem czynników Id (ang. Inhibitor of differentiation) czy SMAD, indukuj¹ syntezê czynnika transkrypcyjnego Oct-4 [34, 58, 79]. Oct-4 jest nie tylko klasycznym markerem komórek pluripotentnych, ale tak e indukuje powstawanie endodermy pierwotnej [51, 52] (ryc. 2). Utrzymanie pluripotencji zale y wobec tego od subtelnej równowagi miêdzy wieloma ró nymi szlakami przekazywania sygna³ów [9, 27, 28, 34, 55]. Zak³ócenia aktywnoœci tych szlaków, zwi¹zane na przyk³ad z brakiem LIF lub innych niezbêdnych czynników wzrostu, prowadzi do ró nicowania zarodkowych komórek macierzystych.

10 192 M. A. CIEMERYCH 5. JAK WYKORZYSTAÆ ZARODKOWE KOMÓRKI MACIERZYSTE? Wyj¹tkowe w³aœciwoœci zarodkowych komórek macierzystych sprawiaj¹, e s¹ one niezwykle cennym materia³em zarówno do badañ funkcji wybranych genów np. w zachowaniu pluripotencji, czy ró nicowaniu, jak i doœwiadczeñ maj¹cych na celu opracowanie metod leczenia chorób wynikaj¹cych z zaburzeñ funkcjonowania okreœlonych tkanek Modyfikacje genetyczne komórek macierzystych badanie funkcji genów Badania prowadzone przez Cappecchiego, które doprowadzi³y do opracowania metod modyfikacji genetycznej komórek ES, by³y rozwiniêciem prac Axela. W 1977 roku wykaza³ on, e ssacze komórki nieprodukuj¹ce kinazy tymidynowej mog¹ wykorzystywaæ wprowadzon¹ do nich kinazê wirusa Herpes. W 1980 roku Cappecchi odkry³, e wydajnoœæ przeniesienia tego genu zwiêksza³a siê drastycznie, gdy zosta³ on wstrzykniêty mikropipet¹ do j¹dra komórki somatycznej. Jednak wprowadzane tak¹ metod¹ DNA integruje siê w genomie biorcy w sposób przypadkowy. Osi¹gniêciem Cappecchiego i jego wspó³pracowników, opublikowanym w 1986 roku, by³o opracowanie techniki gwarantuj¹cej precyzyjn¹ wymianê wybranego genu. Badania prowadzone przez Olivera Smithiesa równie koncentrowa³y siê na wymianie zmutowanych genów na ich prawid³owo funkcjonuj¹ce odpowiedniki. Wyniki przeprowadzonych przez niego doœwiadczeñ, w których locus koduj¹cy beta-globinê zosta³ zmodyfikowany w wyniku homologicznej rekombinacji z udzia³em odpowiednio skonstruowanego plazmidu, zosta³y opublikowane w 1985 roku w Nature. Zastosowanie technik opracowanych przez Cappecchiego i Smithiesa do modyfikacji zarodkowych komórek macierzystych uzyskanych przez Martina Evansa umo liwi³o uzyskiwanie myszy o precyzyjnie modyfikowanych okreœlonych fragmentach genomu. Aby uzyskaæ mysz pozbawion¹ danego genu, potrzebne s¹ mysie komórki ES oraz odcinek DNA zawieraj¹cy gen wraz z otaczaj¹cymi go sekwencjami DNA. Taki fragment DNA, nazywany konstruktem (ang. targeting construct), w³¹czony zostaje do DNA odpowiedniego plazmidu bakteryjnego. Zabieg ten umo liwia uzyskiwanie odpowiedniej liczby kopii plazmidu koduj¹cego dany gen. Obecnoœæ wystarczaj¹co d³ugich sekwencji otaczaj¹cych gen, identycznych z sekwencjami genomowymi zlokalizowanymi wokó³ tego w³aœnie locus, zwiêksza szansê, e po wprowadzeniu konstruktu do komórek ES, dojdzie do parowania i homologicznej rekombinacji we w³aœciwym rejonie genomu. Niezwykle istotny jest fakt, e dziêki temu mo liwa jest wymiana znajduj¹cej siê tam kopii genu na jego zmodyfikowan¹ kopiê. Sam sposób modyfikacji genu zale y od intencji eksperymentatora. Niezale nie od typu modyfikacji, konieczne jest wprowadzenie do genomu sekwencji warunkuj¹cej opornoœæ na okreœlony zwi¹zek chemiczny (antybiotyk). Umo liwia to selekcjê zmodyfikowanych komórek obecnoœæ tego zwi¹zku w œrodowisku hodowlanym powinna prowadziæ do œmierci komórek, które nie w³¹czy³y do swojego DNA zmodyfikowanego fragmentu. Dziêki temu, stosuj¹c antybiotyki (np. neomycynê), eksperymentator mo e wyizolowaæ interesuj¹ce go komórki.

11 ZARODKOWE KOMÓRKI MACIERZYSTE 193 RYCINA 3. Uzyskiwanie zmodyfikowanych genetycznie komórek ES (objaœnienia w tekœcie) Dodatkowo konstrukt mo e zawieraæ sekwencjê koduj¹c¹ kinazê tymidynow¹ wirusa Herpes simplex (HSV-TK, tzw. suicide gene, gen samobójczy ). Sekwencja ta powinna znajdowaæ siê w tej czêœci konstruktu, która po prawid³owej rekombinacji homologicznej nie powinna zostaæ w³¹czona do DNA komórek ES. Komórki, w których rekombinacja zasz³a w sposób nieprawid³owy (w przypadkowym, a nie docelowym miejscu genomu) i które w³¹czy³y do swojego genomu HSV-TK, staj¹ siê wra liwe na analog nukleozydu gancyklowir. Zwi¹zek ten po ufosforylowaniu przez kinazê tymidynow¹ i inkorporacji do DNA blokuje replikacjê i prowadzi do œmierci komórek ES (ryc. 3). Przygotowany konstrukt wprowadzany jest do komórek ES, które s¹ w tym celu poddane elektroporacji. Nastêpnie prowadzona jest selekcja wykorzystuj¹ca odpowiedni antybiotyk oraz je eli konstrukt zawiera³ HSV-TK, tak e gancyklowir. Jedynie te komórki, w których dosz³o do prawid³owej integracji, bêd¹ oporne zarówno na antybiotyk, jak i na gancyklowir (ryc. 3). Odpowiednio przeprowadzona selekcja zwiêksza prawdopodobieñstwo uzyskania klonów komórek ES z poprawnie wbudowanym zmodyfikowanym fragmentem DNA. Wyselekcjonowane komórki musz¹ byæ poddane dok³adnej analizie, która powinna potwierdziæ, e zmodyfikowana sekwencja DNA znajduje siê we w³aœciwym

12 194 M. A. CIEMERYCH RYCINA 4. Uzyskiwanie myszy nokautowych. Kolonie komórek ES zostaj¹ zdezagregowane, a nastêpnie poddane elektroporacji w obecnoœci plazmidu koduj¹cego fragment DNA, zmodyfikowany w taki sposób, e np. sekwencja koduj¹ca genu zast¹piona zosta³a przez gen warunkuj¹cy opornoœæ na neomycynê (Neo). W wyniku rekombinacji homologicznej zmodyfikowany fragment DNA zostaje w³¹czony do genomu komórek ES. Selekcja w obecnoœci neomycyny prowadzi do eliminacji komórek, w których nie dosz³o do w³¹czenia zmodyfikowanego DNA koduj¹cego Neo. Odpowiednio wyselekcjonowane i przetestowane komórki ES, w których jeden z alleli koduj¹cych dany gen zosta³ usuniêty i zast¹piony przez fragment koduj¹cy neomycynê (komórki heterozygotyczne) wprowadzane s¹ do jamy blastocysty. Uzyskane myszy chimerowe krzy owane s¹ z myszami innego szczepu. Je eli z komórek ES powsta³y gamety, potomstwo bêdzie heterozygotyczne (+/-). Skrzy owanie dwóch myszy heterozygotycznych mo e prowadziæ do urodzenia myszy homozygotycznej, której komórki pozbawione s¹ obu kopii danego genu (-/-) miejscu. Równie wa ne jest wykazanie, e do genomu zosta³a wprowadzona tylko jedna kopia zmodyfikowanego genu. Otrzymane w ten sposób komórki s¹ heterozygotyczne, wymianie ulega bowiem tylko jeden allel danego genu. Odpowiednio przetestowane komórki ES mog¹ zostaæ wykorzystane do uzyskania myszy chimerowych (ryc. 4). Je eli w chimerze pierwotne komórki p³ciowe, a nastêpnie gamety powstan¹ z komórek ES, to wprowadzona modyfikacja genetyczna bêdzie dziedziczona z pokolenia na pokolenie. W wyniku krzy owania takich chimer z myszami wybranego szczepu uzyskiwane s¹ myszy heterozygotyczne zawieraj¹ce tylko jeden zmodyfikowany allel. Krzy uj¹c ze sob¹ heterozygoty mo na doprowadziæ do powstania organizmów homozygotycznych, w których oba allele danego genu zosta³y zast¹pione przez ich zmodyfikowane wersje. Uzyskanie hetero- i homozygot otwiera przed badaczami niezwykle wa ny i czêsto d³ugotrwa³y etap analizê fenotypu uzyskanej myszy. Przeprowadzenie takich badañ mo e doprowadziæ do precyzyjnego okreœlenia roli danego

13 ZARODKOWE KOMÓRKI MACIERZYSTE 195 genu w rozwoju organizmu oraz w funkcjonowaniu okreœlonych tkanek czy narz¹dów. Analiza fenotypu mo e jednak nastrêczaæ wiele problemów. Szczególnie, je eli uzyskany efekt odbiega od efektu za³o onego. Pomocna w tego typu badaniach mo e byæ opublikowana w 2005 roku instrukta owa ksi¹ ka Virginii Papaioannou i Richarda Behringera Mouse phenotypes. A handbook of mutation analysis, której mottem s¹ s³owa Ann Mclaren A mouse with no phenotype is non-existing [48]. Niemal ka dy gen mo na zamieniæ na jego zmodyfikowan¹ kopiê. Wprowadzane modyfikacje genomu mog¹ polegaæ na usuniêciu ca³ego genu lub te takiego jego fragmentu, który jest niezbêdny dla inicjacji transkrypcji. W efekcie w komórkach myszy nokautowej nie bêdzie syntetyzowane dane bia³ko. Gen mo e zostaæ równie zmody-fikowany w taki sposób, e kodowane przez niego bia³ko nie bêdzie w pe³ni funkcjonalne. Mo e ono straciæ np. swoj¹ aktywnoœæ enzymatyczn¹ czy te zdolnoœæ do tworzenia kompleksów z innym bia³kiem. Usuniête mog¹ zostaæ sekwencje koduj¹ce domeny odpowiedzialne za degradacjê bia³ka, czy te reszty aminokwasowe podlegaj¹ce modyfikacjom posttranslacyjnym mog¹ zostaæ zast¹pione przez aminokwasy niemodyfikowalne. W ten sposób uzyskujemy zwierzêta okreœlane mianem knock-in. Ich analiza umo liwia badanie okreœlonych funkcji danego bia³ka. Innym przyk³adem modyfikacji typu knock-in jest wymiana okreœlonego genu na gen koduj¹cy inne bia³ko. Analiza uzyskanych w ten sposób zwierz¹t pozwala okreœliæ, czy funkcja danego genu mo e byæ pe³niona przez inny gen. Przyk³ad takich badañ stanowi uzyskanie myszy, w których zast¹piono gen koduj¹cy cyklinê D1 genem cykliny D2 [8] lub te gen cykliny D1 genem koduj¹cym ludzk¹ cyklinê E [17]. W latach dziewiêædziesi¹tych XX wieku wprowadzono istotn¹ modyfikacjê techniki uzyskiwania zwierz¹t nokautowych, pozwalaj¹c¹ na usuniêcie danego genu w okreœlonym czasie (wybrany etap rozwoju) i/lub miejscu (wybrany typ komórek). Technika ta okaza³a siê istotna w badaniach, których celem by³a analiza funkcji danego genu w konkretnej tkance czy narz¹dzie. Uzyskiwanie myszy nokautowej w klasyczny sposób mog³o prowadziæ do sytuacji, kiedy brak syntezy okreœlonego czynnika przez ca³y czas i we wszystkich komórkach uniemo liwia³ prawid³owy rozwój zarodka i powodowa³ jego œmieræ in utero. Tym samym niemo liwe by³o stawianie pytañ o znaczenie danego genu i kodowanego przez niego bia³ka dla prawid³owego funkcjonowania okreœlonej tkanki lub narz¹du w doros³ym organizmie. To istotne ograniczenie zosta³o usuniête, kiedy opracowano techniki uzyskiwania tzw. nokautów warunkowych (ang. conditional knock-out). Modyfikacja klasycznej metody polega³a na umieszczeniu wokó³ genu (lub jego fragmentu), który chcemy usun¹æ, specyficznych sekwencji rozpoznawanych przez enzymy bakteryjne rekombinazê cre (sekwencje LoxP), rekombinazê flip (sekwencje FRT) lub enzym kodowany przez faga FC31 (sekwencje att) [2, 6]. Tak otoczony gen móg³ zostaæ usuniêty z komórek tylko wtedy, gdy obecny by³ enzym rozpoznaj¹cy wprowadzone sekwencje. Technika ta umo liwia uzyskanie myszy, w których komórkach funkcja genu zachowana jest tak d³ugo, jak d³ugo nie zostanie wprowadzona do nich rekombinaza cre czy flip. Z tak zmodyfikowanych myszy mo liwe jest uzyskanie i hodowla in vitro wybranych komórek, do których mo liwe jest wprowadzanie wektorów koduj¹cych odpowiednie rekombinazy. Obecnie dostêpne s¹ tak e myszy transgeniczne, których genomy zmodyfikowane zosta³y w taki sposób,

14 196 M. A. CIEMERYCH e rekombinaza cre syntetyzowana jest jedynie w komórkach okreœlonej tkanki czy narz¹du. Krzy uj¹c ze sob¹ myszy, w których badany gen zosta³ otoczony sekwencjami LoxP, z odpowiednio dobranymi myszami cre mo na uzyskaæ potomstwo, w którym tylko wybrane tkanki pozbawione bêd¹ funkcjonalnego genu. Mo liwe jest równie wykorzystanie takich myszy cre, w których komórkach ekspresja rekombinazy jest indukowana podaniem odpowiedniego zwi¹zku chemicznego. Dziêki temu badany gen, otoczony sekwencjami LoxP, mo e zostaæ usuniêty w okreœlonych tkankach i w okreœlonym czasie. Technika ta otworzy³a zupe³nie nowy rozdzia³ w badaniach funkcji genów obecnie badacz mo e decydowaæ, kiedy i w jakich tkankach wy³¹czyæ okreœlony gen [41, 73, 74] Terapie komórkowe Uzyskanie ludzkich komórek ES rozbudzi³o wielkie nadzieje na ich zastosowanie w terapiach komórkowych u ludzi. Od wielu lat opracowywane s¹ techniki ró nicowania zarodkowych komórek macierzystych w okreœlone typy komórek, w nadziei, e bêdzie je mo na wykorzystaæ dla poprawy regeneracji uszkodzonych tkanek lub te zast¹pienia tkanek funkcjonuj¹cych nieprawid³owo. Naukowcy, którzy staraj¹ siê opracowaæ skuteczne terapie komórkowe, musz¹ jednak rozwi¹zaæ wiele problemów. Po pierwsze, d³ugotrwa³a hodowla in vitro mo e prowadziæ do mutacji w genomie komórek ES. Wiadomo, e na pewno prowadzi to do zmian w modyfikacjach epigenetycznych. Wykaza³ to w 2001 roku zespó³ Rudolfa Jaenischa. Opublikowano wtedy wyniki doœwiadczeñ, w których z jednej macierzystej linii komórek ES wyprowadzono kilka linii potomnych. Komórki tych linii poddano ró nicowaniu, a nastêpnie wykazano, e badane linie komórkowe znacz¹co ró ni³y siê od siebie poziomem metylacji wybranych genów (gen H19) [24]. Zmiany w metylacji DNA okreœlonych sekwencji, czy te w metylacji i acetylacji oddzia³uj¹cego z DNA histonu H3, w znacz¹cy sposób wp³ywaj¹ na ekspresjê genów, a co za tym idzie, mog¹ modyfikowaæ np. ró nicowanie komórek ES. Po drugie, wykorzystuj¹c komórki ES w terapiach nale y braæ po uwagê to, e wprowadzenie do organizmu komórek niezró nicowanych, o charakterze zarodkowym mo e zaindukowaæ powstawanie potworniaków. Dlatego obecnie szuka siê takich metod ró nicowania i selekcji komórek, które pozwol¹ wyeliminowaæ komórki niezró - nicowane, a zatem ci¹gle pluripotentne (zobacz np. [80]). Trzeci, istotny problem zwi¹zany z wykorzystaniem ludzkich zarodkowych komórek macierzystych w terapii wi¹ e siê z dostêpnoœci¹ niewielu linii ludzkich komórek ES. Planuj¹c przeszczep takich komórek nale y braæ pod uwagê mo liwoœæ ich odrzucenia przez biorcê. Problem ten móg³by zostaæ wyeliminowany, gdyby dostêpnych by³o tak wiele linii komórek ES, e mo liwe by³oby ich dopasowanie pod wzglêdem antygenów zgodnoœci tkankowej do ka dego niemal biorcy. Obliczono, e dysponowanie oko³o 200 liniami ESów pozwoli³oby na takie ich dobranie do biorców, e u pacjentów, którym przeszczepiono obce komórki, mo liwe by³oby ograniczenie stosowania immunosupresji. Obecnie jednak tego typu przedsiêwziêcie wydaje siê niemo liwe, g³ównie ze wzglêdu na regulacje prawne obowi¹zuj¹ce w krajach prowadz¹cych badania z wykorzystaniem

15 ZARODKOWE KOMÓRKI MACIERZYSTE 197 komórek ES. Brana by³a równie pod uwagê mo liwoœæ uzyskania komórek macierzystych pozbawionych kluczowych antygenów zgodnoœci tkankowej. W obliczu tych trudnoœci du e nadzieje pok³ada siê w klonowaniu terapeutycznym Klonowanie terapeutyczne Prototyp metody uzyskiwania skrojonych na miarê zarodkowych komórek macierzystych, czyli komórek o genotypie identycznym z genotypem danego zwierzêcia czy cz³owieka, zosta³ opracowany w latach dziewiêædziesi¹tych zesz³ego stulecia. Pierwszym sklonowanym zwierzêciem by³a owca Dolly. Podobna technika zastosowana zosta³a podczas klonowania równie innych gatunków zwierz¹t. Wykorzystano j¹ tak e w badaniach, w których najpierw sklonowano zarodek myszy, a nastêpnie uzyskano z niego komórki ES. W pierwszym etapie tych doœwiadczeñ przeprowadzono mikromanipulacyjne usuniêcie DNA z owulowanego oocytu myszy (chromosomy u³o one w p³ytce metafazy II podzia³u mejotycznego). Nastêpnie na jego miejsce wprowadzono j¹dro komórki somatycznej dawcy i taki oocyt pobudzono do rozwoju partenogenetycznego. Stworzony w ten sposób zarodek przeszed³ kolejne podzia³y bruzdkowania, a ka da z jego komórek funkcjonowa³a pod kontrol¹ j¹dra wywodz¹cego siê od j¹dra komórki dawcy czyli komórki somatycznej. Po osi¹gniêciu przez zarodek stadium blastocysty uzyskano z niej zarodkowe komórki macierzyste identyczne pod wzglêdem RYCINA 5. Klonowanie somatyczne uzyskiwanie komórek ntes. Z owulowanego oocytu myszy usuwane jest wrzeciono oraz chromosomy metafazy II podzia³u mejotycznego. Nastêpnie pod os³onkê otaczaj¹c¹ oocyt wprowadzana jest komórka somatyczna dawcy. Umieszczenie oocytu w polu elektrycznym indukuje fuzjê obu komórek j¹dro komórki somatycznej trafia do cytoplazmy oocytu. Alternatywnie, j¹dro komórki somatycznej mo e zostaæ wstrzykniête mikropipet¹ wprost do wnêtrza oocytu. Aktywowany partenogentycznie oocyt (impulsem aktywuj¹cym mo e byæ umieszczenie w polu elektrycznym, w roztworze zawieraj¹cym jony strontu lub w niskoprocentowym roztworze alkoholu etylowego) przechodzi podzia³y bruzdkowania i osi¹ga stadium blastocysty. Z wêz³a zarodkowego blastocysty uzyskuje siê komórki ntes

16 198 M. A. CIEMERYCH genetycznym z komórkami dawcy (ryc. 5). Komórki te okreœlono mianem ntes (ang. nuclear transfer ES). W dotychczas przeprowadzonych badaniach do oocytów wprowadzano ju j¹dra tak ró nych komórek, jak fibroblasty czy limfocyty B [23]. Wykazano tak e, e uzyskane komórki ntes mo na ró nicowaæ w okreœlone tkanki i potencjalnie wykorzystywaæ w terapiach komórkowych. Komórki ntes, podobnie jak klasyczne komórki ES, mo na tak e poddawaæ manipulacjom genetycznym maj¹cym na celu np. usuniêcie istniej¹cej mutacji. Stosuj¹c tê technikê wyleczono mysz, która pozbawiona by³a genu Rag2 koduj¹cego enzym niezbêdny do powstawania limfocytów T i B. Fibroblasty pobrane z ogona takiej nokautowej myszy zosta³y dawcami j¹der komórkowych wprowadzanych do oocytów. Po aktywacji partenogenetycznej oocyty utworzy³y zarodki, z których po osi¹gniêciu stadium blastocysty wyprowadzono liniê komórek ntes. Do komórek tych w drodze elektroporacji wprowadzono plazmid zawieraj¹cy odpowiednio przygotowany konstrukt koduj¹cy gen Rag2, a nastêpnie poddano selekcji w celu uzyskania klonu, w którym dosz³o do rekombinacji homologicznej oraz wstêpnemu ró nicowaniu w kierunku RYCINA 6. Klonowanie terapeutyczne. Z ogona myszy, której komórki pozbawione by³y obu alleli genu koduj¹cego enzym Rag2, (Rag2-/-) pobrano fibroblasty. J¹dro fibroblastu pos³u y³o do sklonowania zarodka, z którego, gdy osi¹gn¹³ stadium blastocysty, uzyskano komórki ntes. Do komórek tych elektroporowano wektor zawieraj¹cy gen Rag2 wraz z otaczaj¹cymi go sekwencjami homologicznymi do sekwencji genomowych zlokalizowanych wokó³ genu, który ma zostaæ zast¹piony. Po wyselekcjonowaniu klonów komórek (konstrukt kodowa³ równie gen warunkuj¹cy opornoœæ na antybiotyk), które zintegrowa³y gen w prawid³owy sposób, komórki poddano ró nicowaniu in vitro. Po umieszczeniu ich w po ywce pozbawionej LIF utworzy³y one kule zarodkowe, z których, stosuj¹c odpowiednie czynniki wzrostu, uzyskano komórki hematopoetyczne. Komórki te wprowadzono do krwioobiegu myszy Rag2-/-, gdzie ró nicowa³y w limfocyty T i B (schemat adaptowany za zgod¹ wydawnictwa Elsevier: Cell [54] copyright 2002)

17 ZARODKOWE KOMÓRKI MACIERZYSTE 199 komórek hematopoetycznych. Takie komórki wprowadzono do krwioobiegu myszy pozbawionej genu koduj¹cego Rag2 i w ten sposób doprowadzono do usuniêcia defektu we krwi leczonego zwierzêcia pojawi³y siê limfocyty [54] (ryc. 6). Istnieje ju zatem technika, która teoretycznie mog³aby byæ zastosowana w terapii cz³owieka. Na przeszkodzie próbom jej wykorzystania staj¹ jednak istotne ograniczenia, przede wszystkim bardzo ma³a dostêpnoœæ oocytów ludzkich, które by³yby biorcami j¹der komórek somatycznych. Doniesienia o uzyskaniu ludzkich komórek ntes oraz wykorzystaniu ich do terapii okaza³y siê sfa³szowane [25, 26, 59]. Byæ mo e do opracowania dogodnej metody klonowania terapeutycznego doprowadz¹ badania, których wykonywanie zosta³o ostatnio dopuszczone w Wielkiej Brytanii, a w których biorcami j¹der ludzkich komórek somatycznych mia³yby byæ oocyty innego gatunku ssaka. W doœwiadczeniach takich nie by³yby wiêc wykorzystywane ludzkie oocyty. Tymczasem jednak lata 2006 i 2007 przynios³y nadziejê na nowy, niebudz¹cy zastrze eñ etycznych, sposób uzyskiwania komórek ES. 6. KOMÓRKI ips CZYLI OD FIBROBLASTU DO KOMÓRKI MACIERZYSTEJ Latem 2006 roku pojawi³o siê pierwsze doniesienie wykazuj¹ce, e mysie pluripotentne komórki mo na uzyskaæ z fibroblastów. Takahashi i Yamanaka opublikowali wyniki doœwiadczeñ udowadniaj¹cych, e jednoczesna ekspresja genów Oct-4, Sox2, Klf4 i c-myc mo e doprowadziæ do przekszta³cenia fibroblastów w komórki pluripotentne, okreœlane przez badaczy jako komórki ips (ang. induced Pluripotent Stem) [66]. Podobne próby zosta³y z powodzeniem przeprowadzone tak e przez inne grupy badawcze [40, 53, 76]. Wskazanie odpowiedniego zestawu genów nie by³o proste. Japoñscy badacze wytypowali najpierw 24 geny, o których wiadomo by³o, e odgrywaj¹ kluczow¹ rolê w utrzymywaniu pluripotencji przez komórki ES lub te, e zaanga owane s¹ w regulacjê proliferacji komórek. Testowano aktywne formy takich genów, jak: beta-katenina, Stat3, Nanog, Oct-4, ale tak e onkogenu c-myc oraz nieaktywne formy genów, które nie sprzyjaj¹ utrzymaniu pluripotencji, jak np. Grb2. Fibroblasty by³y kolejno transfekowane wirusami, koduj¹cymi oddzielnie ka dy z testowanych czynników. Nie doprowadzi³o to jednak do zmiany cech tych komórek. Natomiast nadekspresja wszystkich 24 genów spowodowa³a przekszta³cenie fibroblastów w komórki, które mia³y cechy komórek ES. Kolejne doœwiadczenia, maj¹ce na celu znalezienie czynników krytycznych, pozwoli³y ustaliæ, e po³¹czenie czterech z nich jest wystarczaj¹ce do transformacji fibroblastów w komórki ips. Oct-4 i Sox2 s¹ to bia³ka, o których wiadomo by³o, e s¹ kluczowe dla zachowania pluripotencji przez komórki ES, Klf4 jest czynnikiem odpowiedzialnym za represjê p53, bia³ka, które bierze udzia³ miêdzy innymi w zahamowaniu syntezy innego kluczowego dla pluripotencji czynnika Nanog. c-myc jest bia³kiem stymuluj¹cym podzia³y komórkowe oraz zaanga owanym w indukcjê apoptozy ten efekt uboczny znoszony jest jednak przez aktywnoœæ Klf4. Komórki ips, które uzyskano po nadekspresji tych genów w fibro-

18 200 M. A. CIEMERYCH blastach charakteryzowa³a ekspresja genów typowych dla zarodkowych komórek macierzystych [5, 56, 66]. By³y one w stanie ró nicowaæ in vivo tworzy³y potworniaki, a wprowadzone do jamy blastocysty bra³y udzia³ w powstawaniu wszystkich tkanek rozwijaj¹cego siê chimerowego zarodka. Mog³y z nich równie powstawaæ gamety uzyskane myszy chimerowe by³y p³odne, a ich m³ode zawiera³y w swoich genomach markery wprowadzone do fibroblastów podczas uzyskiwania komórek ips [46]. Niestety, ekspresja onkogenu c-myc nie zawsze pozostawa³a bez negatywnych konsekwencji. U znacz¹cego odsetka myszy badanych przez zespó³ Yamanaki rozwinê³y siê nowotwory [46]. Próba wyeliminowania tego zagro enia zosta³a podjêta przez Jaenischa i jego wspó³pracowników, którzy w swoich kolejnych doœwiadczeniach wykorzystywali konstrukt koduj¹cy gen c-myc otoczony sekwencjami LoxP. Po uzyskaniu komórek ips usuwano c-myc wprowadzaj¹c do tych komórek rekombinazê cre [22]. Przeprowadzono równie badania, w których komórki ips uzyskiwane by³y z pominiêciem nadekspresji c-myc [44]. Dodatkowe analizy wykaza³y, e komórki ips mo na identyfikowaæ wy³¹cznie na podstawie ich morfologii i dziêki temu wyeliminowaæ stosowany w oryginalnych pracach skomplikowany system selekcji [53]. Komórki ips uzyskano nie tylko z fibroblastów, ale tak e z mysich hepatocytów oraz komórek nab³onkowych o³¹dka [1]. Badania analizuj¹ce mechanizmy odpowiedzialne za przeprogramowanie zró nicowanej mysiej komórki somatycznej (fibroblastu) w komórkê pluripotentn¹ wykaza³y, e pierwszym etapem transformacji by³o wyciszenie ekspresji genów charakterystycznych dla komórki somatycznej [63]. Nastêpnie komórki rozpoczyna³y syntezê czynników typowych dla komórek zarodkowych i komórek ES (np. bia³ko powierzchniowe SSEA-1). Kolejnym etapem by³a aktywacja genów odpowiedzialnych za zachowanie pluripotencji. Zaskakuj¹ce okaza³o siê odkrycie, e geny koduj¹ce markery pluripotencji Nanog czy Oct-4 nie by³y aktywowane jako pierwsze, lecz dopiero po reaktywacji innego markera komórek pluripotentnych, genu Fbx15. Dotychczas uwa ano, e ekspresja tego genu regulowana jest w³aœnie przez Oct-4 [71]. Ponadto, w komórkach ips wznawiana by³a synteza telomerazy [63]. Równoczeœnie z doniesieniami na temat uzyskania mysich komórek ips pojawi³y siê prace, w których opisywano podobny sposób otrzymywania ludzkich komórek ips. Ludzkie fibroblasty, do których wprowadzono ten sam zestaw genów, równie przekszta³ca³y siê w komórki pluripotentne charakteryzuj¹ce siê wysok¹ ekspresj¹ telomerazy i syntez¹ czynników charakterystycznych dla komórek ES oraz ró nicuj¹ce in vitro i tworz¹ce teratomy [35, 49, 65]. Równolegle z opracowywaniem optymalnych technik uzyskiwania komórek ips prowadzono badania maj¹ce na celu wykorzystanie tych komórek w terapii. Pierwszym obiektem takich doœwiadczeñ by³y myszy pozbawione genu beta-globiny stanowi¹ce zwierzêcy model ludzkiej anemii sierpowatej [22]. Uzyskane z fibroblastów tych myszy komórki ips zosta³y poddane elektroporacji w obecnoœci plazmidu koduj¹cego gen beta-globiny. Zabieg ten doprowadzi³ do uzyskania komórek, w których dosz³o do rekombinacji homologicznej i wprowadzenia funkcjonalnego genu w prawid³owe miejsce genomu myszy. Tak nareperowane komórki ips poddano ró nicowaniu w komórki hematopoetyczne, a nastêpnie wprowadzono je do krwioobiegu myszy z objawami anemii sierpowatej. W efekcie we krwi myszy obok erytrocytów sierpowatych

19 ZARODKOWE KOMÓRKI MACIERZYSTE 201 wykrywano normalne krwinki i zaobserwowano tak e czêœciowe ust¹pienie objawów anemii u tych zwierz¹t [22]. Pojawi³a siê wiêc nadzieja na opracowanie techniki podobnej do klonowania terapeutycznego, która mog³aby byæ stosowana w leczeniu ludzkich chorób. Autorzy tej pracy podkreœlaj¹ jednak, e zanim to nast¹pi, konieczne jest opracowanie modyfikacji pozwalaj¹cych na ca³kowite pominiêcie ekspresji onkogenu c-myc oraz zaniechanie wykorzystywania retrowirusów, jako noœników genów wprowadzanych do fibroblastów. Jak ju wspomnia³am, opracowywane s¹ techniki, które nie wymagaj¹ wprowadzania do komórek onkogenu c-myc [44]. Ponadto, szczególnie wa ne jest kontynuowanie doœwiadczeñ, które zapewni³yby opracowanie skutecznych metod ró nicowania komórek ips [22]. PODSUMOWANIE Uzyskanie zarodkowych komórek macierzystych oraz opracowanie technik ich modyfikacji genetycznej stworzy³o szansê na prowadzenie wielu bardzo istotnych badañ. Pozwoli³y one na zrozumienie funkcji wielu genów, a tak e mechanizmów ró nicowania komórek. Mo liwe by³o tak e opracowanie nowatorskich metod badawczych i zainicjowanie badañ, których nadrzêdnym celem by³o opracowanie skutecznych metod naprawy uszkodzonych lub nieprawid³owo funkcjonuj¹cych tkanek. Poznanie mechanizmów warunkuj¹cych pluripotencjê oraz samoodnawianie komórek macierzystych okaza³o siê kluczowe dla opracowania techniki przekszta³cania komórek somatycznych w komórki maj¹ce cechy komórek macierzystych. Historia odkrycia i poznawania cech tych komórek pokazuje, w jak œcis³ej zale noœci pozostaj¹ biologiczne badania podstawowe i te prowadzone przez nauki medyczne PODZIÊKOWANIA Pragnê podziêkowaæ Towarzystwu Naukowemu Warszawskiemu za zaproszenie mnie do wyg³oszenia wyk³adu, który sta³ siê podstaw¹ powy szego artyku³u. Dziêkujê równie Katarzynie Koziak, Iwonie Grabowskiej, Grzegorzowi Litwinienko, Jackowi Kubiakowi oraz Markowi Maleszewskiemu za cenne uwagi dotycz¹ce tekstu. SPIS LITERATURY [1] AOI T, YAE K, NAKAGAWA M, ICHISAKA T, OKITA K, TAKAHASHI K, CHIBA T, YAMANAKA S. Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells. Science 2008; / science [2] BABINET C, COHEN-TANNOUDJI M. Genome engineering via homologous recombination in mouse embryonic stem (ES) cells: an amazingly versatile tool for the study of mammalian biology. An Acad Bras Cienc 2001; 73: [3] BHATTACHARYA B, MIURA T, BRANDENBERGER R, MEJIDO J, LUO Y, YANG AX, JOSHI BH, GINIS I, THIES RS, AMIT M, LYONS I, CONDIE BG, ITSKOVITZ-ELDOR J, RAO MS, PURI??? RK. Gene expression in human embryonic stem cell lines: unique molecular signature. Blood 2004; 103:

20 202 M. A. CIEMERYCH [4] BOIANI M, SCHOLER HR. Regulatory networks in embryo-derived pluripotent stem cells. Nat Rev Mol Cell Biol 2005; 6: [5] BRAMBRINK T, FOREMAN R, WELSTEAD GG, LENGNER C, WERNIG M, SUH H, JAENISCH R. Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells. Cell Stem Cell 2008; 2: [6] BRANDA CS, DYMECKI SM. Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice. Dev Cell 2004; 6: [7] BRYJA V, BONILLA S, ARENAS E. Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat Protoc 2006; 1: [8] CARTHON BC, NEUMANN CA, DAS M, PAWLYK B, LI T, GENG Y, SICINSKI P. Genetic replacement of cyclin D1 function in mouse development by cyclin D2. Mol Cell Biol 2005; 25: [9] CAVALERI F, SCHOLER HR. Nanog: a new recruit to the embryonic stem cell orchestra. Cell 2003; 113: [10] CHAMBERS I, COLBY D, ROBERTSON M, NICHOLS J, LEE S, TWEEDIE S, SMITH A. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell 2003; 113: [11] CHUNG Y, KLIMANSKAYA I, BECKER S, LI T, MASERATI M, LU SJ, ZDRAVKOVIC T, ILIC D, GENBACEV O, FISHER S, KRTOLICA A, LANZA R. Human embryonic stem cell lines generated without embryo destruction. Cell Stem Cell 2008; 2: [12] CHUNG Y, KLIMANSKAYA I, BECKER S, MARH J, LU SJ, JOHNSON J, MEISNER L, LANZA R. Embryonic and extraembryonic stem cell lines derived from single mouse blastomeres. Nature 2006; 439: [13] CZYZ J, WOBUS A. Embryonic stem cell differentiation: the role of extracellular factors. Differentiation 2001; 68: [14] DUNCAN SA. Generation of embryos directly from embryonic stem cells by tetraploid embryo complementation reveals a role for GATA factors in organogenesis. Biochem Soc Trans 2005; 33: [15] EGGAN K, RODE A, JENTSCH I, SAMUEL C, HENNEK T, TINTRUP H, ZEVNIK B, ERWIN J, LORING J, JACKSON-GRUSBY L, SPEICHER MR, KUEHN R, JAENISCH R. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol 2002; 20: [16] EVANS MJ, KAUFMAN MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 1981; 292: [17] GENG Y, WHORISKEY W, PARK MY, BRONSON RT, MEDEMA RH, LI T, WEINBERG RA, SICINSKI P. Rescue of cyclin D1 deficiency by knockin cyclin E. Cell 1999; 97: p [18] GENG Y, YU Q, SICINSKA E, DAS M, SCHNEIDER JE, BHATTACHARYA S, RIDEOUT WM, BRON- SON RT, GARDNER H, SICINSKI P. Cyclin E ablation in the mouse. Cell 2003; 114: [19] GERTOW K, WOLBANK S, ROZELL B, SUGARS R, ANDANG M, PARISH CL, IMREH MP, WENDEL M, AHRLUND-RICHTER L. Organized development from human embryonic stem cells after injection into immunodeficient mice. Stem Cells Dev 2004; 13: [20] GINIS I, LUO Y, MIURA T, THIES S, BRANDENBERGER R, GERECHT-NIR S, AMIT M, HOKE A, CARPENTER MK, ITSKOVITZ-ELDOR J, RAO MS. Differences between human and mouse embryonic stem cells. Dev Biol 2004; 269: [21] GRATSCH TE, O'SHEA KS. Noggin and chordin have distinct activities in promoting lineage commitment of mouse embryonic stem (ES) cells. Dev Biol 2002; 245: [22] HANNA J, WERNIG M, MARKOULAKI S, SUN CW, MEISSNER A, CASSADY JP, BEARD C, BRAM- BRINK T, WU LC, TOWNES TM, JAENISCH R. Treatment of sickle cell anemia mouse model with ips cells generated from autologous skin. Science 2007; 318: [23] HOCHEDLINGER K, JAENISCH R. Monoclonal mice generated by nuclear transfer from mature B and T donor cells. Nature 2002; 415: [24] HUMPHERYS D, EGGAN K, AKUTSU H, HOCHEDLINGER K, RIDEOUT WM, 3RD, BINISZKIE- WICZ D, YANAGIMACHI R, JAENISCH R. Epigenetic instability in ES cells and cloned mice. Science 2001; 293: [25] HWANG WS, ROH SI, LEE BC, KANG SK, KWON DK, KIM S, KIM SJ, PARK SW, KWON HS, LEE CK, LEE JB, KIM JM, AHN C, PAEK SH, CHANG SS, KOO JJ, YOON HS, HWANG JH, HWANG YY, PARK YS, OH SK, KIM HS, PARK JH, MOON SY, SCHATTEN G. Patient-specific embryonic stem cells derived from human SCNT blastocysts. Science 2005; 308: