Pierwsze decyzje rozwojowe różnicowanie komórek w przedimplantacyjnym zarodku myszy

Transkrypt

1 Pierwsze decyzje rozwojowe różnicowanie komórek w przedimplantacyjnym zarodku myszy STRESZCZENIE To, w jaki sposób z jednej, totipotencjalnej komórki, zygoty, powstaje wielokomórkowy płód, budzi nieustającą ciekawość badaczy. W trakcie embriogenezy komórki stopniowo tracą totipotencję, zaczynają się specjalizować i formować w tkanki. Znaczenie najwcześniejszego, przedimplantacyjnego okresu rozwoju zarodkowego ssaków, w tym myszy, polega przede wszystkim na oddzieleniu linii pluripotencjalnych komórek zarodkowych, które będą budować ciało płodu (i większość błon płodowych), od linii komórek pozazarodkowych, koniecznych dla zagnieżdżenia się zarodka w tkankach macicy. Kamieniem milowym w badaniach nad wczesnymi etapami embriogenezy ssaków było wyizolowanie i utrzymanie w hodowli in vitro komórek macierzystych reprezentujących i odzwierciedlających cechy pierwszych linii komórkowych w zarodku. Dzięki nim dużo łatwiejsze stało się zgłębianie mechanizmów odpowiedzialnych za podejmowanie tych pierwszych, ważnych decyzji w zarodku. WPROWADZENIE Zygota jest komórką matką, z której powstają wszystkie komórki budujące organizmy zwierząt rozmnażających się płciowo. U ssaków są to zarówno komórki zarodkowe, które różnicując się w tkanki, a potem narządy, budują ciało płodu, jak i komórki dające początek błonom płodowym i łożysku. Tkanki pozazarodkowe warunkują przeżycie i zapewniają prawidłowy wzrost i rozwój zarodka. Dzięki nim możliwe jest jego zagnieżdżenie się w macicy, czyli implantacja oraz wymiana substancji między rozwijającym się płodem a matką. Te pierwsze ważne decyzje o kierunku różnicowania się komórek, czyli wyodrębnianiu pierwotnych linii komórkowych, są podejmowane bardzo wcześnie w rozwoju, w fazie, która trwa kilka dni i rozciąga się od momentu zapłodnienia oocytu do implantacji. Zarodek, w którym można już wyróżnić pierwsze linie komórkowe i który jest zdolny do zagnieżdżenia się w macicy nosi u ssaków nazwę blastocysty. Jedyna linia komórek stricte zarodkowych w blastocyście, epiblast, przekształca się we wszystkie tkanki budujące płód, a potem organizm myszy. Z dwóch linii pozazarodkowych: trofektodermy i pierwotnej endodermy powstają podtrzymujące rozwój struktury pozazarodkowe. Te linie komórkowe charakteryzują się określoną lokalizacją w blastocyście, odmiennymi potencjami rozwojowymi i ekspresją specyficznych tylko dla nich markerów komórkowych. Z każdej z tych linii można uzyskać in vitro, w ściśle zdefiniowanych warunkach hodowli, komórki macierzyste, które zachowują tożsamość danej linii komórkowej i odzwierciedlają jej cechy. Niniejszy artykuł ma na celu przybliżenie zjawisk towarzyszących najwcześniejszemu okresowi embriogenezy myszy: proliferacji komórek, ich różnicowania i formowania się w tkanki. Zebrano tu również informacje o tym, jakie mechanizmy sterują tymi procesami i w jakim stopniu badanie mechanizmów odpowiedzialnych za samoodnowę i różnicowanie komórek macierzystych może wpływać na lepsze zrozumienie pierwszych krytycznych decyzji dotyczących przeznaczenia komórek podejmowanych w zarodku. Katarzyna Filimonow* Magdalena Krupa* Aneta Suwińska * Zakład Embriologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, Warszawa * Zakład Embriologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, ul. I. Miecznikowa 1, Warszawa; tel.: (22) , asuwinska@biol.uw.edu.pl *Autorki miały jednakowy udział w tworzeniu artykułu Artykuł otrzymano 26 marca 2013 r. Artykuł zaakceptowano 2 kwietnia 2013 r. Słowa kluczowe: blastocysta, linie komórkowe, trofektoderma, epiblast, pierwotna endoderma Wykaz skrótów: EPI (ang. epiblast) epiblast; komórki ES (ang. embryonic stem cells) zarodkowe komórki macierzyste; ICM (ang. inner cel mass) węzeł zarodkowy; PE (ang. primitive endoderm) pierwotna endoderma; TE (ang. trophectoderm) trofektoderma; komórki TS (ang. trophoblast stem cells) trofoblastyczne komórki macierzyste; komórki XEN (ang. extraembryonic stem cells) komórki macierzyste pierwotnej endodermy Podziękowania: Artykuł powstał podczas realizacji projektu w ramach Programu PO- MOST/2010-1/9 Fundacji na rzecz Nauki Polskiej współfinansowanego przez Unię Europejską. Autorki pragną podziękować Pani Dr Katarzynie Szczepańskiej, Panu Prof. Markowi Maleszewskiemu oraz Pani Prof. Marii A. Ciemerych-Litwinienko za cenne uwagi dotyczące manuskryptu. Dziękujemy również Pani Neha Sharma za udostępnienie fotografii komórek TS oraz Panu Dr Jerome Artusowi za podarowanie fotografii komórek XEN. PIERWSZE DNI PO ZAPŁODNIENIU U myszy, w wyniku zapłodnienia powstaje jednokomórkowy zarodek zygota. Pierwsze etapy przedimplantacyjnego rozwoju zarodka myszy zachodzą w jajowodzie. Zarodek przechodzi wówczas bruzdkowanie, czyli dzieli się mitotycznie na komórki potomne (Ryc. 1). W stadium 2-komórkowym dochodzi do masowej aktywacji genomu zarodkowego. Od tego momentu podziały oraz cykle komórkowe są regulowane przez RNA oraz białka syntetyzowane głównie w oparciu o genom zarodka [1]. Postępy Biochemii 59 (2)

2 Rycina 1. Etapy rozwoju przedimplantacyjnego zarodka myszy. Trzy podziały bruzdkowania prowadzą do powstania stadium 8-komórkowego (morula). Na tym etapie zwiększa się adhezja między komórkami i dochodzi do kompakcji zarodka. W stadium komórkowym można wyróżnić dwie populacje komórek: zewnętrzne i wewnętrzne, które rozwijają się odpowiednio w kierunku TE i ICM. W zarodku 32-komórkowym rozpoczyna się proces kawitacji, czyli tworzenia jamy blastocysty, która sukcesywnie powiększa swoje rozmiary. Od momentu pojawienia się przestrzeni wypełnionej płynem zarodek określa się mianem blastocysty. Tuż przed implantacją, w późnej blastocyście obecne są już trzy linie komórkowe: TE oraz powstające w obrębie ICM: PE i EPI. W ciągu pierwszych 72 godzin zarodek przechodzi trzy podziały bruzdkowania, w wyniku których powstaje osiem blastomerów, które morfologicznie niczym się od siebie nie różnią. Mają one sferyczny kształt, nie są ze sobą ściśle połączone, a ich błony komórkowe nie są spolaryzowane (Ryc. 1). W późnym stadium 8-komórkowym dochodzi do szeregu zmian związanych z zachodzącym wtedy procesem kompakcji. Kompakcja polega na zmianie sposobu kontaktu blastomerów, które zaczynają wtedy ściśle do siebie przylegać, co nadaje zarodkowi zwartą postać. Procesowi kompakcji towarzyszy reorganizacja białek cytoszkieletu i polaryzacja blastomerów polegająca na zmianie lokalizacji kilku charakterystycznych białek adhezyjnych (Ryc. 2). Na skutek polaryzacji w błonie komórkowej blastomerów można wyróżnić dwie domeny: kontaktującą się ze środowiskiem zewnętrznym domenę szczytową i znajdującą się na styku komórek domenę spodnioboczną (Ryc. 2A). W powierzchni szczytowej zlokalizowane są białka, takie jak: apkc (ang. atypical protein kinase C), Par3 i Par6 (ang. partitioning defective 3 i 6), aktyna biorąca udział w tworzeniu mikrokosmków, a także ezryna, która je stabilizuje [2]. W częściach spodnich i bocznych lokalizuje się m.in. Par1 oraz kompleks kadheryna E/a i b-katenina, odgrywający główną rolę w powstaniu połączeń między blastomerami podczas kompakcji [3]. Białka te tworzą płytki przylegania (ang. adherens junctions), które wiążą ze sobą komórki i powodują ich silne przyleganie do siebie (Ryc. 2B). W następnym etapie tworzone są połączenia desmosomalne, a także połączenia ścisłe (ang. tight junctions). W ich powstaniu bierze udział kompleks białek uczestniczących w polaryzacji komórek Par3/ Par6/aPKC oraz okludyna, ZO-1 i ZO-2 (ang. zona ocludens 1 i 2), Rab 13 i cingulina [4,5] (Ryc. 2B). Polaryzacja blastomerów powoduje, że po kolejnym, czwartym podziale bruzdkowania zarodek 16-komórkowy budują dwa rodzaje komórek: spolaryzowane zewnętrzne, które kontaktują się ze środowiskiem i niespolaryzowane wewnętrzne, stykające się jedynie z innymi komórkami (Ryc. 1). To zróżnicowanie stanowi punkt wyjścia do wytworzenia w zarodku dwóch pierwszych populacji komórek posiadających odmienne właściwości i wykazujących różne dalsze losy rozwojowe. Kompaktny zarodek złożony z około 32 komórek, zwany morulą, przemieszcza się z jajowodu do macicy, gdzie przechodzi kawitację (Ryc. 1). Proces tan polega na utworzeniu pomiędzy blastomerami jednej, bądź kilku łączących się później jamek. Za tworzenie jamki odpowiedzialne są komórki zewnętrzne zarodka. W błonach tych komórek obecna jest pompa sodowo-potasowa [6], której aktywność prowadzi do powstania różnicy stężenia jonów, głównie Na + i K +, pomiędzy wnętrzem zarodka a środowiskiem, w którym się on rozwija. Utworzony w ten sposób gradient jonów powoduje, że pomiędzy blastomery wnika woda [7]. Utworzenie różnicy w stężeniu jonów oraz utrzymanie płynu zgromadzonego pomiędzy blastomerami możliwe jest dzięki utworzonym wcześniej połączeniom ścisłym pomiędzy komórkami zewnętrznymi zarodka. W wyniku kawitacji w środku zarodka powstaje jama, a zarodek od tego momentu nazywamy blastocystą (Ryc. 1). BLASTOCYSTA OSTATNIE STADIUM PRZEDIMPLANTACYJNE Z procesem kawitacji wiąże się pierwsza fala różnicowania, w wyniku której zarodek przyjmuje postać pęcherzyka złożonego z dwóch rodzajów komórek. W jego wnętrzu, na jednym z biegunów, znajduje się grupa pluripotencjalnych komórek zwanych węzłem zarodkowym blastocysty (ICM, ang. inner cell mass). Powstaną z niego wszystkie tkanki zarodka oraz większość błon płodowych (Ryc. 3). Warstwa komórek tworzących ścianę pęcherzyka nosi nazwę trofektodermy (TE, ang. trophectoderm). Komórki trofektodermy pokrywające węzeł zarodkowy tworzą tzw. trofektodermę biegunową, natomiast komórki otaczające jamę blastocysty noszą nazwę 132

3 Rycina 2. Polaryzacja i tworzenie połączeń międzykomórkowych w zarodku myszy. (A) Kompakcja w zarodku 8-komórkowym i typy podziałów blastomerów. W spolaryzowanych blastomerach kompaktnego zarodka 8-komórkowego można wyróżnić powierzchnię szczytową i spodnio-boczną, w których lokalizują się charakterystyczne dla nich białka. Wskutek podziału asymetrycznego tylko jedna komórka dziedziczy domenę szczytową, pozostaje na zewnątrz i jest prekursorem TE. Druga apolarna komórka lokuje się w środku zarodka 16-komórkowego i rozwija w kierunku ICM. Podział symetryczny prowadzi do powstania dwóch spolaryzowanych komórek, z których każda dziedziczy domenę szczytową, lokalizuje się na powierzchni zarodka 16-komórkowego i rozwija w kierunku TE. (B) Lokalizacja obwódek przylegania i połączeń ścisłych we wczesnej blastocyście (stadium 32-komórkowe). W skład połączeń ścisłych wchodzi szereg białek domeny szczytowej - kompleks Par3/Par6/aPKC, okludyna, ZO-1, ZO-2, Rab13 i cingulina. Białkami wchodzącymi w skład obwódek przylegania są E-kadheryna, β-katenina i białko Par1. trofektodermy ściennej (Ryc. 1). TE jest pierwszą, pozazarodkową linią komórkową, która podczas implantacji będzie odpowiedzialna za nawiązanie kontaktu z tkankami macicy oraz weźmie udział w tworzeniu zarodkowej części łożyska [8]. Piątego dnia po zapłodnieniu, tuż przed zagnieżdżeniem się blastocysty w ścianie macicy, zachodzi druga fala różnicowania. W obrębie węzła zarodkowego dochodzi do wyodrębnienia kolejnych linii komórkowych: drugiej po TE linii pozazarodkowej, pierwotnej endodermy (PE, ang. primitive endoderm), której komórki tworzą pojedynczą warstwę kontaktującą się bezpośrednio z jamą blastocysty oraz epiblastu (EPI), zlokalizowanego w środku, pomiędzy TE biegunową i PE. Pomiędzy PE i EPI zostaje wytworzona błona podstawna zbudowana głównie z lamininy [9]. Po implantacji EPI utworzy ciało zarodka oraz mezodermę pozazarodkową, która wejdzie w skład błon płodowych: owodni, kosmówki i pęcherzyka żółtkowego oraz utworzy całą omocznię. Z PE powstanie warstwa endodermy pęcherzyka żółtkowego (Ryc. 3). Trofektoderma da początek trzonowi łożyskowemu oraz ektodermie pozazarodkowej kosmówki. Tkanki te wezmą udział w tworzeniu zarodkowej części łożyska (Ryc. 3). Pierwotne linie komórkowe powstają więc na skutek dwóch, następujących po sobie fal różnicowania. Kiedy zapada decyzja dotycząca wyboru ścieżki różnicowania w TE i ICM, a następnie w PE i EPI? Jakie czynniki decydują o losie komórek i jakie mechanizmy odpowiadają za formowanie pierwotnych linii komórkowych? Rycina 3. Powstawanie linii komórkowych w przedimplantacyjnym zarodku myszy i tkanki wywodzące się z nich po implantacji. W wyniku dwóch fal różnicowania w przedimplantacyjnym zarodku myszy powstają trzy linie komórkowe. Pierwsza decyzja dotyczy różnicowania komórek w kierunku TE i ICM. We wczesnej blastocyście (32-64 komórki) białka charakterystyczne dla poszczególnych linii komórkowych współwystępują w większości komórek. Obecność Cdx2 jest na tym etapie ograniczona do komórek zewnętrznych, gdzie hamuje syntezę białek Gata i Nanog. W 64-komórkowej blastocyście obserwowany jest wzajemnie wykluczający się wzór syntezy poszczególnych białek. Rozmieszczone w sposób mozaikowy komórki prekursorowe EPI i PE sortują na tej podstawie do odpowiednich warstw w ICM. Tuż przed implantacją (4.5 dnia rozwoju) w obrębie ICM można wyróżnić odrębne morfologicznie warstwy PE i EPI. Po implantacji, z TE i PE powstaną struktury pozazarodkowe, odpowiednio łożysko i warstwa endodermy pęcherzyka żółtkowego, a epiblast utworzy głównie ciało zarodka. Komórki każdej z linii komórkowych wykazują ekspresję charakterystycznych markerów. Postępy Biochemii 59 (2)

4 WYBÓR ŚCIEŻKI RÓŻNICOWANIA DECYZJA NR 1: TROFEKTODERMA VS WĘZEŁ ZARODKOWY Pierwszy pomysł na wyjaśnienie, w jaki sposób dochodzi do wyodrębnienia się w zarodku trofektodermy i węzła zarodkowego narodził się jeszcze w latach 60. ubiegłego wieku. Zgodnie z hipotezą stworzoną przez Tarkowskiego i Wróblewską, której nadano nazwę inside-outside, blastomery aż do stadium 32-komórkowego są równocenne, a czynnikiem decydującym o dalszym losie komórek jest ich przestrzenne ułożenie w zarodku [10]. Komórki, które w 32-komórkowej moruli znajdują się na powierzchni różnicują w TE, a te znajdujące się w jej wnętrzu utworzą ICM. Hipoteza inside-outside została poparta wynikami doświadczeń, w których modyfikowano ułożenie blastomerów w zarodku, w konsekwencji czego komórki adaptowały się do nowej pozycji i przyjmowały los zgodny ze swoim nowym położeniem [11]. Kolejna teoria, będąca uzupełnieniem poprzedniej, pojawiła się w latach 80. ubiegłego wieku, wraz z odkryciem zjawiska polaryzacji blastomerów podczas kompakcji. Według niej los komórek ustala się już w zarodku 8-komórkowym i wynika ze sposobu podziału jego blastomerów [12]. Blastomery w stadium 8-komórkowym mogą bowiem podlegać dwóm rodzajom podziałów: symetrycznym lub asymetrycznym (Ryc. 2A). Jeśli płaszczyzna podziału jest prostopadła do powierzchni zarodka, dochodzi do podziału symetrycznego (konserwatywnego), który generuje dwie spolaryzowane komórki zewnętrzne, wchodzące następnie w skład TE. Jeśli natomiast płaszczyzna podziału przebiega równolegle do powierzchni zarodka, komórka dzieli się asymetrycznie, dając jedną komórkę polarną, dziedziczącą domenę szczytową i pozostającą na zewnątrz zarodka oraz jedną komórkę niepolarną, która będzie lokalizowała się w jego środku i zasiedli przyszły ICM (Ryc. 2A). Oba rodzaje podziałów zachodzą w trakcie rozwoju zarodka nie tylko przy przejściu ze stadium 8- do 16-komórkowego, ale także w trakcie dwóch następnych podziałów: i Autorzy tej teorii nie wskazali czynnika, który mógłby być odpowiedzialny za decyzję o tym, w jaki sposób przebiegnie podział blastomerów. Dziś wiadomo, że gdy w blastomerze eksperymentalnie obniży się poziom białek uczestniczących w polaryzacji apkc i Par3, to wywodzące się z niego komórki preferencyjnie zostają włączone do węzła zarodkowego [13]. Natomiast brak białka Par6 skutkuje nieobecnością prawidłowych połączeń ścisłych, a w konsekwencji brakiem kawitacji. Nie jest wykluczone, że to właśnie kompleks białek uczestniczących w polaryzacji jest odpowiedzialny za różnicowanie komórek w kierunku TE [14]. CDX2 główny regulator linii TE Komórki TE i ICM, poza morfologią oraz lokalizacją w zarodku, różnią się przede wszystkim profilem ekspresji charakterystycznych czynników transkrypcyjnych, które działają w stosunku do siebie antagonistycznie, wzajemnie regulując swoją ekspresję. Czynnikiem charakterystycznym dla TE, który reguluje jej powstawanie, jest białko Cdx2 (ang. Caudal type homeobox 2; Ryc. 4A). Zarodki pozbawione Cdx2 nie tworzą funkcjonalnej trofektodermy [14]. Najnowsze badania wskazują, że mysie zarodki posiadają pulę matczynego mrna kodującego białko Cdx2 [15]. Wzmocnienie ekspresji zarodkowego Cdx2 rozpoczyna się w stadium 8-komórkowym, ale poziom tego białka w poszczególnych komórkach jest zróżnicowany. W późnym stadium 32-komórkowym białko to jest już obecne tylko w komórkach zewnętrznych, a w blastocyście jego ekspresja jest ograniczona wyłącznie do trofektodermy [14,16,17]. Ekspresja Cdx2 w komórkach TE jest stymulowana przez polarność blastomerów [18] i wynika prawdopodobnie z obecności domeny szczytowej [19]. Wykazano ponadto, że matczyny mrna Cdx2 jest zlokalizowany przede wszystkim w części szczytowej spolaryzowanych blastomerów i w związku z tym po podziale jest dziedziczony przez komórki zewnętrzne zarodka [19,20]. Z kolei białko Cdx2 reguluje polarność komórki poprzez wzmacnianie ekspresji genu kodującego kinazę apkc i lokalizację tego białka w szczytowych częściach blastomerów [19]. Innymi czynnikami zaangażowanymi w rozwój TE są Gata3 (ang. GATA binding protein 3) oraz Eomes (ang. Eomesodermin). Białko Gata3 jest niezbędne do prawidłowego tworzenia łożyska w poimplantacyjnym rozwoju zarodkowym [21]. Wyniki badań nad rolą tego czynnika przed implantacją są niejednoznaczne. W zależności od metody wyciszania ekspresji genu Gata3 zarodki wykazują nieprawidłowości w rozwoju albo już na etapie kawitacji [22] albo są zdolne do implantacji, ale rozwijają się tylko do połowy ciąży [21]. Eomes jest z kolei niezbędna w późniejszym etapie rozwoju zarodka, w trakcie dalszego różnicowania komórek trofektodermy. W regulację ekspresji genów Cdx2 oraz Gata3 zaangażowany jest szlak przekazywania sygnału Hippo i czynnik transkrypcyjny Tead4 (ang. TEA domain family member 4) [23,24] (Ryc. 4A i B). mrna Tead4 wykrywany jest już w stadium 2-komórkowym, a białko obecne jest od tego momentu we wszystkich komórkach zarodka przez cały okres przedimplantacyjny [25]. Zarodki pozbawione tego białka nie wytwarzają trofektodermy. W komórkach wewnętrznych, w wyniku działania szlaku Hippo i biorących w nim udział kinaz Lats1 i Lats2 (ang. Large tumor suppressor homolog 1/2), białko Yap (ang. Yes-associated protein), będące koaktywatorem Tead4, ulega fosforylacji. Warunkuje to jego lokalizację w cytoplazmie. W konsekwencji nie tworzy się kompleks Tead4 Yap i ekspresja genu Cdx2 nie jest indukowana (Ryc. 4B). W komórkach zewnętrznych zarodka szlak Hippo jest nieaktywny. Nieufosforylowane białko Yap przedostaje się do jądra komórkowego, gdzie wiąże się z Tead4 aktywując transkrypcję Cdx2, głównego markera trofektodermy (Ryc. 4B). Szlak Hippo jest więc aktywny tylko w komórkach wewnętrznych, które są otoczone innymi komórkami. Informacja pozycyjna poprzez szlak Hippo umożliwia powiązanie teorii inside-outside z teorią polaryzacji i wyjaśnia wpływ położenia blastomerów na determinację ich losu, czyli różnicowanie w określoną linię rozwojową. Nadal nie jest jednak wiadomo, jakie czynniki powodują aktywację lub inhibicję szlaku przekazywania sygnału Hippo

5 Rycina 4. Mechanizmy tworzenia ICM i TE. (A) Regulacja różnicowania komórek ICM i TE przez specyficzne czynniki transkrypcyjne. Tead4 aktywuje ekspresję Cdx2 i Gata3, które biorą udział w różnicowaniu TE. Antagonizm między białkami Cdx2 a Oct4 i Nanog zapewnia wzajemnie wykluczający się wzór syntezy tych białek odpowiednio w TE i ICM. (B) Rola szlaku Hippo w różnicowaniu komórek ICM i TE. Fosforylacja uniemożliwia wejście Yap do jądra i aktywację czynnika transkrypcyjnego Tead4. W rezultacie ekspresja genów charakterystycznych dla TE jest w blastomerach wewnętrznych zahamowana. W komórkach zewnętrznych (kolor szary) ścieżka Hippo jest nieaktywna, ale mechanizm tu działający nie jest do końca poznany. Białko Yap w formie nieufosforylowanej zmienia lokalizację na jądrową, gdzie razem z białkiem Tead4 aktywuje transkrypcję genów charakterystycznych dla linii TE, w tym Cdx2. OCT4/NANOG/SOX2 regulatory pluripotencji Czynnikami transkrypcyjnymi odpowiedzialnymi za utrzymanie pluripotencji komórek ICM są Oct4 (ang. Octamer-binding transcription factor 4) [26], Nanog (Nanog homeobox) [48,84] oraz Sox2 (ang. Sex determining region Y box containing gene 2) [8,27] (Ryc. 4A). W stadium 8-komórkowym białka te są syntetyzowane we wszystkich blastomerach, ale po uformowaniu blastocysty ich synteza zostaje stopniowo wyciszana w komórkach zewnętrznych i ostatecznie ograniczona tylko do komórek ICM, a następnie epiblastu [16,28,29]. Zarodki, w których inaktywowano oba allele każdego z tych genów, obumierają w okresie okołoimplantacyjnym. W przypadku braku genu Oct4 zarodki rozwijają się do stadium blastocysty, jednak powstający węzeł zarodkowy nie jest pluripotencjalny i jego komórki różnicują w TE [30]. Z kolei w zarodkach pozbawionych funkcjonalnej kopii genu Sox2 ekspresja czynnika transkrypcyjnego Oct4 jest zahamowana i w zarodkach takich nie dochodzi do wytworzenia epiblastu, a powstają w nich jedynie komórki pierwotnej endodermy [27]. Wykazano, że Cdx2 negatywnie reguluje geny kodujące czynniki charakterystyczne dla komórek węzła zarodkowego Oct4, Nanog i Sox2. Wzajemna hamowanie syntezy tych białek prowadzi do wyodrębnienia się dwóch pierwszych linii komórkowych w stadium blastocysty: ICM i TE [31] (Ryc. 4A). Brak obu alleli genu Cdx2 uniemożliwia bowiem obniżenie ekspresji genów Oct4 i Nanog w komórkach zewnętrznych, czyli przyszłej trofektodermie. Nie dochodzi wówczas do kawitacji i implantacja oraz dalszy rozwój zarodka staje się niemożliwy [14]. DECYZJA NR 2: EPIBLAST VS PIERWOTNA ENDODERMA Węzeł zarodkowy: homogenna czy heterogenna populacja komórek? Do niedawna wydawało się, że węzeł zarodkowy 64-komórkowej blastocysty zbudowany jest z homogennej populacji bipotencjalnych komórek, które mogą się rozwinąć zarówno w PE, jak i w EPI. Według tej teorii, podobnie jak w hipotezie inside-outside, los komórek determinowany byłby przez ich pozycję zajmowaną w węźle zarodkowym. Komórki, które znajdują się na powierzchni ICM i mają kontakt z jamą blastocysty wytworzyłyby pierwotną endodermę, zaś te położone głębiej epiblast. Model ten opierał się na obserwacjach węzłów zarodkowych izolowanych z późnych blastocyst [32] oraz kul zarodkowych (EB, ang. embryoid bodies) [33]. Kule zarodkowe powstają wskutek agregacji mysich zarodkowych komórek macierzystych (wyizolowanych z ICM i hodowanych in vitro). Uważane są one za model komórek ICM, gdyż zachodzące w nich etapy różnicowania odzwierciedlają wydarzenia mające miejsce w trakcie normalnej embriogenezy. Zaobserwowano, że na powierzchni EB, podobnie jak na powierzchni izolowanych ICM, tworzy się warstwa komórek PE. Jednak wyniki naszych ostatnich badań nad izolowanymi węzłami zarodkowymi zaprzeczają tezie, że odtwarzana na ich powierzchni warstwa PE pochodzi z komórek epiblastu wyeksponowanych na środowisko zewnętrzne. Nasze obserwacje świadczą o tym, że warstwa PE pochodzi w znacznej mierze z proliferujących komórek PE, które po izolacji węzła pozostają na fragmencie jego powierzchni, a nie z komórek epiblastu, które miałyby się przeprogramować zgodnie z nowym położeniem [34]. Badania prowadzone m.in. z wykorzystaniem techniki poklatkowego filmowania zarodków oraz badania profili ekspresji genów w pojedynczych komórkach ICM wyraźnie wskazują na to, że los komórek ICM, czyli wybór ścieżki różnicowania w PE lub EPI, ustala się wcześniej niż do tej pory uważano. Już w 64-komórkowej blastocyście obecne są dwie odrębne populacje komórek będące prekursorami PE i EPI, różniące się ekspresją markerów specyficznych dla tych linii (Ryc. 3). Są one rozmieszczone w ICM w sposób mozaikowy, według wzoru sól i pieprz (ang. salt and pepper ) [9,35 37]. ICM stanowi zatem heterogenną populację komórek o wykluczającym się wzorze czynników transkrypcyjnych specyficznych dla linii PE i EPI (Ryc. 3). Postępy Biochemii 59 (2)

6 Białka GATA 4/6 i NANOG główne regulatory linii PE i EPI Białkami specyficznymi dla linii PE są należące do rodziny Gata: Gata4 i Gata6 [38,39], a także Sox17 i Sox7 (ang. SRY-box containing gene 17 i 7) [40] oraz receptor Pdgfrα (ang. platelet derived growth factor receptor alpha) [41]. Białko Gata6 jest wykrywane w niektórych blastomerach już w zarodku 4-komórkowym [36]. Z kolei Gata4 pojawia się później, w stadium blastocysty liczącej około 64 komórki. W dojrzałej blastocyście, liczącej powyżej 100 komórek, synteza obu białek ograniczona jest już tylko do warstwy pierwotnej endodermy (Ryc. 3). Mutacje w genie Gata4 lub Gata6 nie wpływają na powstawanie PE w zarodku przedimplantacyjnym, prawdopodobnie dzięki częściowemu uzupełnianiu się funkcji obu białek lub dzięki obecności białka matczynego. Jednak w mutantach takich nie dochodzi ostatecznie do wytworzenia tkanek wywodzących się z pierwotnej endodermy [38,39]. Ekspresja Sox17 gwałtownie wzrasta przy przejściu ze stadium 16- do 32-komórkowego. W 64-komórkowej blastocyście czynnik ten jest obecny jedynie w komórkach prekursorowych PE, a w dojrzałej blastocyście, liczącej ponad 100 komórek, współwystępuje w powierzchniowej warstwie ICM z innymi białkami charakterystycznymi dla PE: Gata6, Gata4, Sox7 i Pdgfrα [42,43]. Wykazano, że gen Pdgfrα odpowiada również za ekspansję PE [41]. Zarodki pozbawione obu alleli genu Pdgfrα wykazywały zmniejszoną liczbę komórek PE i co ciekawe, zwiększoną liczbę komórek EPI. Może to sugerować zaangażowanie PE w regulację wielkości populacji EPI. Czynnikiem transkrypcyjnym charakterystycznym dla epiblastu jest Nanog, odpowiadający za utrzymanie komórek w stanie niezróżnicowanym. W normalnych zarodkach białko to syntetyzowane jest już w stadium 8-komórkowym [16,44]. Doświadczenia z udziałem myszy pozbawionych funkcjonalnego genu Nanog wykazały, że nie jest on wymagany do prawidłowej segregacji TE oraz ICM. Istotne defekty rozwojowe w zarodkach takich myszy pojawiają się dopiero w momencie formowania się PE i EPI [45]. Co ciekawe, dotyczą one nie tylko braku EPI, ale również PE. W takich zarodkach są obecne pojedyncze komórki syntetyzujące Gata4, jednak nie są one w stanie przetrwać i wytworzyć warstwy pierwotnej endodermy bez wsparcia prawidłowo uformowanego i funkcjonalnego epiblastu [45-47]. Ekspresja genu Nanog wydaje się być zatem warunkiem koniecznym do powstania nie tylko EPI, ale również prawidłowo rozwiniętej warstwy PE. W poszukiwaniu źródła heterogenności ICM rola szlaku FGF/kinaza MAP Wciąż nie wiadomo, w jaki sposób tworzą się różnice między komórkami budującymi ICM i jakie czynniki determinują powstawanie prekursorów PE i EPI. Udowodniono, że komórki ICM różnią się między sobą zdolnością do odpowiedzi na Fgf4 (ang. fibroblast growth factor 4) aktywujący szlak kinazy MAP (ang. mitogen-activated protein kinase). Fgf4 łączy się z receptorem będącym kinazą tyrozynową (RTK, ang. receptor tyrosine kinase) FgfR2 (ang. fibroblast growth factor receptor 2) [9] (Ryc. 5A). W stadium 64-komórkowej blastocysty Fgf4 eksprymowany jest jedynie przez komórki prekursorowe epiblastu [48] i, poprzez białko Grb2 (ang. growth factor receptor-bound protein 2) pełniące funkcję cząsteczki przekazującej sygnał w komórce z receptora FgfR2, aktywuje ścieżkę kinazy MAP [49] (Ryc. 5A). Rycina 5. Segregacja komórek EPI i PE. (A) Zaangażowanie ścieżki Fgf4/kinaza MAP w formowanie PE. Synteza Fgf4 wzrasta w komórkach prekursorowych EPI od stadium 32-komórkowego, podczas gdy synteza receptora dla Fgf, FgfR2 rośnie w prekursorach PE. Fgf4 wydzielany przez komórki prekursorowe EPI oddziałuje na receptor FgfR2, aktywując Grb2 i kinazę MAP w komórkach prekursorowych PE. Kinaza MAP indukuje ekspresję genów charakterystycznych dla linii PE, takich jak Gata6. Jednocześnie Fgf4 hamuje ekspresję Nanog, dodatkowo blokując rozwój komórek w kierunku EPI. (B) Lokalizacja komórek prekursorowych EPI i PE w 3.5- oraz 4.5-dniowej blastocyście. W 3.5-dniowej blastocyście komórki prekursorowe EPI (kolor niebieski) i PE (kolor zielony) są wciąż rozmieszczone w ICM w sposób mozaikowy. W tym stadium część komórek wykazuje jeszcze bipotencjalność, czyli zdolność do wytworzenia zarówno EPI jak i PE (gwiazdka). Komórki prekursorowe PE znajdujące się wewnątrz ICM sortują w kierunku jamy blastocysty (czerwona strzałka). Z kolei komórki prekursorowe EPI zlokalizowane bezpośrednio przy jamie blastocysty przemieszczają się do wnętrza ICM (niebieska strzałka). Komórki, które nie zmienią lokalizacji na prawidłową, zgodną z profilem ekspresji genów, mogą być albo eliminowane na drodze apoptozy albo zmieniać profil ekspresji genów na zgodny z zajmowaną przez nie pozycją. W 4.5 dniu rozwoju komórki PE ograniczone są jedynie do powierzchni węzła zarodkowego, odgraniczając komórki EPI od jamy blastocysty. Aktywacja szlaku Fgf4/kinaza MAP poprzez podanie egzogennego Fgf4 powoduje indukcję ekspresji genu Gata6 i represję Nanog, a więc różnicowanie komórek w kierunku PE [9,47,50-52]. Z kolei hodowla zarodków w obecności inhibitorów szlaku Fgf/kinaza MAP prowadzi do odwrotnego efektu, czyli różnicowania wszystkich komórek ICM w kierunku EPI [51]

7 Frankenberg i wsp. zaproponowali trzystopniowy mechanizm formowania PE [47]. Według tego modelu początkowa ekspresja Gata6 w 8-komórkowym zarodku jest indukowana bezpośrednio przez Fgf4 działający poprzez receptor RTK i jest niezależna od Nanog. W zarodkach pozbawionych obu alleli genu Nanog wszystkie lub większość komórek ICM wykazuje bowiem obecność Gata6. W miarę dalszego rozwoju, od stadium wczesnej 32-komórkowej blastocysty, Gata6 obecna jest jedynie w komórkach pozbawionych Nanog, którego synteza hamowana jest przez ścieżkę Fgf/kinaza MAP. Z kolei późniejsze markery PE Sox17 i Gata4 do indukcji swojej ekspresji wymagają bezpośredniego sygnału płynącego od Fgf4 wydzielanego przez wykazujące ekspresję Nanog komórki EPI. Sugeruje to, że czynnik transkrypcyjny Nanog nie jest potrzebny do zainicjowania różnicowania w kierunku PE i związanej z tym ekspresji czynnika transkrypcyjnego Gata6, ale do jego późniejszego podtrzymania i ekspresji kolejnych czynników transkrypcyjnych, warunkujących tworzenie tej właśnie linii komórkowej. W przeciwieństwie do komórek prekursorowych PE, komórki EPI charakteryzuje słaba odpowiedź na Fgf4 prawdopodobnie wskutek niewystarczającej ekspresji FgfR2 [35,48]. Umożliwia to ekspresję Nanog, który jednocześnie hamuje transkrypcję Gata poprzez bezpośrednie wiązanie się z promotorami genów kodujących te białka [53] (Ryc. 5A). Mutacje w genach kodujących Fgf4 [54, 55], FgfR2 [56] czy Grb2 [9] skutkują bardzo podobnym fenotypem zarodków. Wszystkie komórki ICM rozwijają się w kierunku EPI, a zarodki obumierają w okresie okołoimplantacyjnym. Najnowsze badania pokazały, że w zarodkach pozbawionych funkcjonalnego genu Fgf4 początkowa faza współwystępowania białek charakterystycznych dla PE i EPI jest inicjowana, ale ostatecznie węzeł zarodkowy zbudowany jest wyłącznie z syntetyzujących białko Nanog komórek EPI. Sugeruje to, że Fgf4 potrzebny jest raczej do utrzymania populacji komórek pierwotnej endodermy w węźle zarodkowym i ustalenia wzoru sól i pieprz, a nie do zapoczątkowania formowania PE [57]. DWIE RUNDY PODZIAŁÓW ASYMETRYCZNYCH: ŹRÓDŁO KOMÓREK PROGENITOROWYCH PE I EPI? Komórki ICM różnią się między sobą wrażliwością na Fgf4. Ale jakie jest źródło tej odmiennej reakcji? Może to wynikać z faktu, iż komórki wewnętrzne, tworzące ICM, powstają w wyniku dwóch następujących po sobie rund podziałów asymetrycznych, czyli różnicujących komórki na zewnętrzne i wewnętrzne. Pierwsza runda podziałów zachodzi przy przejściu ze stadium 8- do 16-komórkowego, a druga, gdy zarodek dzieli się z 16 na 32 komórki. Te dwie populacje komórek powstają więc w różnych okresach bruzdkowania i to właśnie mogłoby być źródłem ich odmiennych właściwości oraz różnej zdolności do odpowiedzi na Fgf4 [58]. Według innej teorii komórki w węźle zarodkowym różnią się początkowo tylko nieznacznie pobudliwością na ten sygnał, a co za tym idzie ekspresją genów Gata6 oraz Nanog, niezależnie od rundy podziałów asymetrycznych. Dopiero te drobne różnice i wzajemny antagonizm białek kodowanych przez te dwa geny wymuszają różnicowanie w kierunku PE lub EPI, prowadząc do uzyskania wzoru ekspresji typu sól i pieprz [36,51]. Rozważania nad rolą podziałów asymetrycznych w tworzeniu komórek prekursorowych PE i EPI zapoczątkowała praca Chisholm i Houliston z 1987 roku. Autorzy ci wysunęli hipotezę, że komórki prekursorowe PE powstają głównie w wyniku II podziału asymetrycznego [59]. W 2010 roku ukazały się dwie prace, które dotyczyły tej tematyki. Odmienne podejścia eksperymentalne zaowocowały przeciwstawnymi wynikami. W pierwszej z prac [60] śledzono losy wszystkich komórek w zarodkach od stadium 8-komórkowego do momentu, gdy EPI i PE są już morfologicznie rozróżnialne i stanowią odrębne warstwy. Poklatkowa rejestracja takich zarodków pokazała, że istnieje zależność między rundą podziałów asymetrycznych a tworzeniem komórek prekursorowych EPI i PE. W I rundzie podziałów asymetrycznych generowane były głównie komórki prekursorowe EPI oraz komórki bipotencjalne, które mogły się różnicować zarówno w EPI, jak i PE. Natomiast w II rundzie powstawały głównie komórki PE. Co więcej, w około 1/3 zarodków zidentyfikowano III podział asymetryczny (w stadium komórkowym), w wyniku którego tworzone były tylko komórki przyszłej PE. Ponadto komórki powstające w wyniku I tury podziałów wykazywały wyższy poziom mrna Sox2, a więc czynnika warunkującego pluripotencję i będącego markerem EPI [48], a komórki powstające w wyniku II tury podziałów - wyższy poziom charakterystycznych dla PE białek Gata6 i Sox17 [60]. W drugiej ze wspomnianych prac Yamanaka i wsp. [51] znakowali pojedynczy blastomer w mysim zarodku 8-komórkowym, a następnie badali lokalizację komórek powstających z tego blastomeru po implantacji zarodka w macicy samicy biorczyni. Autorzy obserwowali sposób podziału znakowanego blastomeru i klasyfikowali zarodki na takie, które zawierały wyznakowane wewnętrzne blastomery powstałe w wyniku I lub II rundy podziałów asymetrycznych. Po implantacji zarodków śledzono los znakowanych komórek, czyli ich rozmieszczenie w poszczególnych tkankach. Nie zaobserwowano żadnej korelacji pomiędzy rundą podziału asymetrycznego a losem komórek pochodzących z ICM. W pracy tej potwierdzono natomiast znaczenie ścieżki sygnałowej Fgf4/kinaza MAP w determinacji losów komórek wewnętrznych zarodka. Hamowanie tej ścieżki lub jej indukcja powodowała bowiem zmiany proporcji komórek ICM tworzących EPI lub PE. SORTOWANIE KOMÓREK PE I EPI W blastocyście liczącej komórki większość markerów linii komórkowych współwystępuje we wszystkich komórkach [36] (Ryc. 3). Dopiero w miarę dojrzewania blastocysty, na skutek wzajemnego antagonistycznego działania białek specyficznych dla linii komórkowych dochodzi do ustalenia wykluczającego się wzoru ich syntezy w poszczególnych komórkach, które różnicują w TE, PE lub EPI. Obecność w ICM białek specyficznych dla PE i EPI determinuje los komórek, które prawdopodobnie z tego powodu oraz dzięki odmiennym właściwościom adhezyjnym lokują się w charakterystycznych dla siebie rejonach w węźle zarodkowym. Postępy Biochemii 59 (2)

8 Śledzenie losów komórek eksprymujących Pdgfrα umożliwiło poznanie mechanizmu sortowania komórek, prowadzącego do utworzenia warstw PE i EPI w dojrzałej, implantującej się blastocyście. Komórki, które wykazywały ekspresję tego receptora i znajdowały się na powierzchni węzła zarodkowego, nie zmieniały swojej pozycji. Z kolei komórki syntetyzujące ten receptor i położone w środku ICM przemieszczały się na jego powierzchnię [36] (Ryc. 5B). Co ciekawe, komórki o słabszej ekspresji Pdgfrα, pozostające w środku ICM, wciąż były w stanie wyciszyć jego ekspresję (Ryc. 5B), co sugeruje że zachowały potencjał do wytworzenia EPI. Komórki wykazujące silną ekspresję Pdgfrα, które znajdowały się wewnątrz ICM i nie zmieniły swojej lokalizacji, były eliminowane na drodze apoptozy [36] (Ryc. 5B). Apoptoza obserwowana w czasie tworzenia warstw PE i EPI służyłaby więc w głównej mierze eliminacji niewłaściwie zlokalizowanych komórek PE [37]. Sugeruje się, że proces sortowania komórek prekursorowych PE i EPI jest związany z odmiennymi właściwościami adhezyjnymi tych komórek. Marker pierwotnej endodermy Gata6 aktywuje geny kodujące lamininę i Dab2 (ang. disabled homolog 2) [61], które odpowiadają za właściwości adhezyjne komórek i mogą inicjować ich sortowanie do odpowiednich rejonów węzła zarodkowego. Mutacja w genie Dab2 powoduje zaburzenia sortowania komórek PE, które pozostają rozrzucone w ICM [42]. Badania polegające na depolimeryzacji włókien aktynowych w przedimplantacyjnych zarodkach myszy pokazały, że ruch komórek w obrębie ICM wymaga funkcjonalnej aktyny [37]. Proces sortowania komórek PE i EPI nie jest więc zjawiskiem pasywnym, wywołanym zachodzącymi podziałami komórkowymi. Jest to proces aktywny, zależny od cytoszkieletu aktynowego. Gdy komórki osiągną pozycję zgodną z syntezą charakterystycznych dla danej linii markerów, przestają się przemieszczać. Po osiągnięciu powierzchni ICM pozycja komórek PE mogłaby być utrzymywana dzięki ich polaryzacji i nabyciu właściwości komórek nabłonkowych, prowadząc do zmiany ich kształtu i eliminacji niespolaryzowanych komórek EPI z powierzchniowej warstwy ICM [36]. W przypadku wyodrębniania linii PE i EPI mamy więc do czynienia z sytuacją odwrotną, niż przy różnicowaniu TE i ICM, kiedy to komórki najpierw przyjmowały odpowiednią pozycję, a dopiero potem dochodziło w nich do ekspresji charakterystycznych czynników transkrypcyjnych. Komórki PE i EPI wykazują natomiast obecność specyficznych dla tych linii markerów jeszcze przed przyjęciem właściwej, docelowej pozycji w zarodku i na tej podstawie sortują do odpowiedniej warstwy w ICM. Informacja pozycyjna komórek nie jest jednak bez znaczenia w podejmowaniu przez nie decyzji o kierunku różnicowania (Ryc. 5B). UTRATA POTENCJI ROZWOJOWYCH KOMÓREK A PLASTYCZNOŚĆ ZARODKÓW Niezależnie od tego, w jaki sposób wyodrębniają się pierwotne linie komórkowe w zarodku, embriogeneza może być rozpatrywana jako proces, w którym zachodzi stopniowe ograniczenie potencji rozwojowych komórek [62]. Rozwój rozpoczyna zygota, która jest komórką totipotencjalną, gdyż mogą z niej powstać wszystkie linie komórkowe, zarówno te zarodkowe, jak i pozazarodkowe. Oba blastomery 2-komórkowego zarodka również są totipotencjalne. Każdy z nich może rozwinąć się w prawidłową blastocystę [63], która po przeszczepieniu do dróg rodnych samicy biorczyni przechodzi pomyślnie całą ciążę i może dać początek dorosłemu, płodnemu osobnikowi. W przeciwieństwie do innych gatunków zwierząt, totipotencja blastomerów z zarodków myszy w późniejszych stadiach rozwoju nie została dowiedziona. Nie udało się bowiem uzyskać pełnego rozwoju z pojedynczych blastomerów 4- i 8-komórkowego zarodka myszy. Jeśli jednak pojedyncze blastomery pochodzące ze stadium 4- lub 8-komórkowego połączy się z tzw. blastomerami pomocniczymi i w ten sposób wspomoże ich rozwój, to mogą one tworzyć wszystkie tkanki zarodkowe i dać w konsekwencji zdrowe, płodne potomstwo. A to świadczy o ich pluripotencji [64,65]. Rolę komórek pomocniczych mogą pełnić blastomery z zarodka tetraploidalnego. Zarodki takie uzyskuje się w wyniku elektrofuzji blastomerów 2-komórkowego zarodka, a następnie jego dalszej hodowli [66]. Wiadomo, że w uzyskanych doświadczalnie diploidalno-tetraploidalnych zarodkach komórki tetraploidalne są eliminowane z tkanek budujących ciało zarodka, ale utrzymują się i funkcjonują w tkankach pozazarodkowych (łożysku i błonach płodowych). Wykazano, że także blastomery z późniejszych stadiów rozwojowych, tj. 16-komórkowych zarodków, nadal zachowują pluripotencję. W wyniku dezagregacji takich zarodków można uzyskać blastomery zewnętrzne oraz wewnętrzne. Agregując ze sobą 16 komórek wyłącznie zewnętrznych lub wyłącznie wewnętrznych można otrzymać normalne blastocysty, które po przeniesieniu do dróg rodnych samicy biorczyni rozwijają się w pełni zdrowe, płodne zwierzęta [67]. Pluripotencję blastomerów 16-komórkowego zarodka udowodniono również izolując pojedyncze blastomery, a następnie otaczając je pomocniczymi blastomerami tetraploidalnymi. Z tak zrekonstruowanych zarodków uzyskano zdrowe młode, których wszystkie tkanki i narządy powstały z potomnych komórek pojedynczego blastomeru [68]. Nie wiadomo dokładnie, w którym momencie rozwoju następuje determinacja losów komórek, a wybór ścieżki ich różnicowania staje się ostateczny i nieodwracalny. Blastomery wewnętrzne 32-komórkowego zarodka wydają się dłużej zachowywać pluripotencję w porównaniu z blastomerami zewnętrznymi. Agregaty 32-óch wyłącznie zewnętrznych blastomerów nie są już w stanie rozwinąć się w prawidłową blastocystę. Z kolei zarodki uzyskane metodą agregowania 32-óch wyłącznie wewnętrznych komórek są nadal zdolne do odtworzenia prawidłowej morfologicznie blastocysty, w której komórki regulują ekspresję genów specyficznych dla linii komórkowych zgodnie ze swoim nowym położeniem. Transplantacja takich zarodków do dróg rodnych samicy biorczyni nie skutkuje jednak narodzinami potomstwa, co może świadczyć o tym, że zapewne przeprogramowanie budujących je komórek nie jest jednak kompletne [67]. Z drugiej strony wykazano, że z pojedynczych komórek wewnętrznych pochodzących z zarodków 32-komórkowych, otoczonych tetraploidalnymi blastomerami nośnikowymi, można, choć niezmiernie rzadko, otrzymać normalne płody [68]. Ostateczny wybór kierunku różnicowania komórek w obrębie węzła zarodkowego podejmowany jest jeszcze później. Wykazano, że 138

9 nawet w 64-komórkowej blastocyście, w której obecne są już prekursory PE i EPI, charakteryzujące się syntezą typowych dla tych linii markerów, komórki nadal są plastyczne i mogą zmieniać swój los. Po wprowadzeniu tych komórek do zarodków biorców w stadium blastocysty wchodzą one bowiem w skład wszystkich linii komórkowych, łącznie z TE [52]. PRZEDIMPLANTACYJNY ZARODEK MYSZY ŹRÓDŁO KOMÓREK MACIERZYSTYCH Pierwotne linie komórkowe istnieją w zarodku tylko przejściowo. Dość szybko powstają z nich określone tkanki pełniące różne funkcje w rozwijającym się płodzie. Niewykluczone, że właśnie z powodu ogromnej plastyczności, która charakteryzuje przedimplantacyjne zarodki myszy można zatrzymać na dłużej tożsamość i unikalne właściwości pierwotnych linii komórkowych, hodując zarodki poza ustrojem w warunkach przypominających te istniejące in vivo i uzyskując z nich komórki macierzyste. Z epiblastu można wyizolować zarodkowe komórki macierzyste (komórki ES, ang. embryonic stem cells), z trofektodermy trofoblastyczne komórki macierzyste (komórki TS, ang. trophoblast stem cells), a z pierwotnej endodermy komórki macierzyste pierwotnej endodermy (komórki XEN, ang. extraendoderm stem cells). Zgodnie z definicją komórek macierzystych, niezależnie od różnego stopnia ograniczenia potencjału różnicowania, komórki te mają pewne, wyróżniające je cechy wspólne. Charakteryzuje je zarówno zdolność do samoodnowy, czyli proliferacji przez nieograniczony czas bez utraty niezróżnicowanego stanu, jak i możliwość różnicowania, zarówno in vivo jak i in vitro, w różne rodzaje komórek. KOMÓRKI ES PLURIPOTENCJALNE KOMÓRKI Z WĘZŁA ZARODKOWEGO Mysie zarodkowe komórki macierzyste, zwane komórkami ES, wyizolowano po raz pierwszy w 1981 roku [69,70]. Ponad dekadę później wyprowadzono linie tych komórek z zarodków małp rezus i uisiti białouchej [71,72], w 1998 z zarodków człowieka [73], a w 2008 roku szczura [74,75]. Hodowlę blastocyst, z których po raz pierwszy uzyskano linię mysich komórek ES prowadzono na warstwie odżywczej inaktywowanych mysich zarodkowych fibroblastów (MEF, ang. mouse embryonic fibroblasts). Wkrótce okazało się, że warstwę odżywczą można zastąpić przez wzbogacenie pożywki hodowlanej zawierającej surowicę z płodów bydlęcych (FBS, ang. fetal bovine serum) czynnikiem przeciwbiałaczkowym (LIF, ang. leukemia inhibitory factor) [76,77] (Ryc. 6). Odkryto również, że za utrzymywanie pluripotencji komórek ES odpowiadają ścieżki sygnalizacyjne aktywowane przez LIF oraz czynnik morfogenetyczny kości (BMP4, ang. bone morphogenetic protein). Dodając tylko te dwa czynniki do pożywki można hodować komórki ES w pożywce niezawierającej surowicy, którą standardowo wykorzystuje się w tego rodzaju hodowlach. Intensywne próby znalezienia optymalnych warunków hodowli komórek ES doprowadziły do odkrycia, że zachowanie szczególnych właściwości tych komórek nie wymaga aktywacji ścieżek sygnalizacyjnych odpowiedzialnych za pluripotencję, ale zahamowania szlaków sygnałowych zaangażowanych w ich różnicowanie, np. aktywnej również w zarodku ścieżki Fgf4/ kinaza MAP (inhibitory receptora FgfR2 PD i kinazy MEK, ang. Map/Erk kinase kinase PD ) czy ścieżki za- Rycina 6. Komórki macierzyste wyprowadzane z blastocysty myszy. Blastocysta myszy stanowi źródło trzech typów komórek macierzystych: trofoblastycznych komórek macierzystych (komórki TS) uzyskiwanych z trofektodermy, zarodkowych komórek macierzystych (komórki ES) z epiblastu oraz macierzystych komórek pierwotnej endodermy (XEN). Komórki te różnią się morfologią, potencjałem rozwojowym w tworzonych zarodkach chimerowych, ekspresją charakterystycznych czynników transkrypcyjnych oraz warunkami hodowli umożliwiającymi ich izolację i namnażanie. FGFi inhibitor ścieżki Fgf4/ kinaza MAP; GSK3i inhibitor kinazy syntazy glikogenu-3, elementu szlaku WNT (ang. Wingless typed signaling pathway). Postępy Biochemii 59 (2)

10 leżnej od WNT (inhibitor GSK3, ang. glycogen synthase kinase 3 CHIR99021) (Ryc. 6). Dzięki temu opracowano skład pożywki, zawierającej specyficzne inhibitory blokujące różne elementy tych szlaków, przez co udało się wyprowadzić komórki ES nie tylko z różnych szczepów myszy, ale także z gatunków innych zwierząt, jak np. szczur [74,75], z których przez długi czas nie można było ich uzyskać. Mysie i ludzkie komórki ES, choć te drugie mają odmienne wymagania hodowlane, można obecnie otrzymać nie tylko z blastocyst, ale także ze stadiów wcześniejszych bruzdkujących kilkukomórkowych zarodków, a nawet z pojedynczych komórek pobranych z zarodków [78-80]. Od chwili, gdy opracowano procedury hodowli komórek ES naukowcy nie ustają w staraniach, aby zidentyfikować czynniki odpowiedzialne za szczególne właściwości tych komórek, czyli ich macierzystość. Wiadomo, że główną rolę w utrzymaniu pluripotencji i niezróżnicowanego charakteru komórek ES odgrywa sieć regulatorów obejmujących czynniki transkrypcyjne: Oct4, Nanog i Sox2 (Ryc. 6). Białka te pozytywnie regulują swoją ekspresję, ale także hamują ekspresję genów promujących różnicowanie [81,82]. Odpowiedni poziom białka Oct4 wydaje się być krytyczny dla zachowania przez komórki pluripotencji. Spadek ekspresji genu kodującego to białko indukuje w komórkach ES różnicowanie w TE, podczas gdy wzrost ekspresji powoduje różnicowanie w komórki mezodermy i PE [83]. Potencje rozwojowe komórek macierzystych można sprawdzić klasyczną metodą uzyskiwania zwierząt chimerowych. Polega ona na mikrochirurgicznym wprowadzaniu badanych komórek do jamy 3,5-dniowych blastocyst lub zespalaniu ich (agregacji) z 8- lub 4-komórkowymi zarodkami. Wiadomo, że w tak uzyskanych chimerowych zarodkach komórki ES zasiedlają prawie wyłącznie węzeł zarodkowy. Po transplantacji takich zarodków do dróg rodnych samicy biorczyni komórki wywodzące się z komórek ES budują wszystkie tkanki rozwijającego się płodu, a tylko sporadycznie biorą udział w formowaniu struktur pochodzących z linii pozazarodkowych: łożyska i błon płodowych [84]. Są więc pluripotencjalne, a nie totipotencjalne. KOMÓRKI TS LINIA REPREZENTUJĄCA TROFEKTODERMĘ W 1998 roku świat naukowy po raz pierwszy usłyszał o komórkach macierzystych wyizolowanych z trofektodermy biegunowej, czyli komórkach TS [85]. Udało się je wyprowadzić i utrzymać in vitro hodując blastocysty na warstwie MEF w pożywce zawierającej surowicę, wzbogaconej czynnikiem Fgf4 (Ryc. 6), który w trakcie embriogenezy jest niezbędny m.in. do prawidłowego rozwoju TE. Dalsze badania doprowadziły do zidentyfikowania kluczowych regulatorów odpowiedzialnych za utrzymanie komórek TS; są to białka aktywina i Tgfβ (ang. transforming growth factor β). Komórki TS charakteryzują się, podobnie jak komórki trofektodermy w zarodku, obecnością białka Cdx2, Gata3 i Eomes (Ryc. 6). Komórki TS mają bardziej ograniczone potencje rozwojowe w porównaniu z komórkami ES. Po wprowadzeniu ich do jamy blastocysty biorą one udział w formowaniu jedynie struktur wywodzących się z trofektodermy, czyli komórek budujących łożysko. Są zatem multipotencjalne. Komórki posiadające pewne cechy komórek TS udało się uzyskać, oprócz myszy, jedynie z blastocyst małp rezus [86] oraz nornika zwyczajnego [87]. Komórki TS małp wykazują syntezę charakterystycznego dla TE naczelnych białka gonadotropiny kosmówkowej. Izolacja i utrzymywanie w hodowli komórek TS zarówno małp, jak i nornika nie wymaga, w przeciwieństwie do komórek TS myszy, wzbogacenia pożywki czynnikiem Fgf4 [86,87]. KOMÓRKI XEN KOMÓRKI ODPOWIADAJĄCE PIERWOTNEJ ENDODERMIE W przeciwieństwie do komórek ES i TS, które wymagają ściśle określonego składu pożywki, linie komórek XEN myszy udało się uzyskać stosując kilka różnych procedur (Ryc. 6). W oryginalnym protokole blastocysty lub wyizolowane z blastocyst węzły zarodkowe umieszczono na warstwie MEF w pożywce z dodatkiem Fgf4 [88]. Linie tych komórek z powodzeniem uzyskuje się także hodując zarodki na warstwie MEF, w pożywce stosowanej do hodowli komórek ES zawierającej LIF (Ryc. 6). Od niedawna wiadomo, że w izolacji i namnażaniu komórek XEN ważną rolę odgrywa, podobnie jak w różnicowaniu pierwotnej endodermy w zarodku, szlak z udziałem Pdgf [41]. Komórki XEN wykazują ekspresję czynników transkrypcyjnych charakterystycznych dla linii PE, z której się wywodzą: Gata4, Gata6, Sox7 i Sox17 [88,89] (Ryc. 6), a w chimerach zasiedlają jedynie wywodzący się z PE pęcherzyk żółtkowy. Komórki o właściwościach podobnych do mysich komórek XEN wyizolowano również z blastocyst szczura [90,91]. KOMÓRKI ES JAKO ŹRÓDŁO INNYCH KOMÓREK MACIERZYSTYCH Jeszcze do niedawna powszechny był pogląd, że komórki ES stanowią populację homogenną. Wykazano jednak, że podobnie jak pluripotencjalne komórki ICM w zarodku, morfologicznie niezróżnicowane komórki ES wykazują wysoki stopień heterogenności ekspresji określonych genów. Jednym z genów, którego ekspresja jest istotnie różna w fenotypowo niezróżnicowanych komórkach ES, jest marker komórek pluripotencjalnych, Nanog [53]. Co więcej, wykazano, że białka będące markerami komórek zróżnicowanych, takie jak Gata6 [53] czy Sox17 [92] również są obecne w pewnej puli komórek ES. Komórki ES są zatem, podobnie jak komórki ICM w zarodku, heterogenną mieszaniną komórek, które wykazują tendencję do różnicowania w określonym kierunku. Może to tłumaczyć ich niezwykłą zdolność do różnicowania w inne rodzaje komórek. Spontanicznie komórki ES nie są w stanie przekształcić się w inne komórki macierzyste, jak np. XEN czy TS. Inne rodzaje komórek macierzystych można uzyskać z komórek ES poprzez manipulacje genetyczne lub zmianę warunków hodowli. Nadekspresja genów z rodziny Gata w mysich komórkach ES jest wystarczająca, aby przyjęły one fenotyp oraz właściwości komórek XEN [61,93]. Możliwe jest również uzyskanie komórek XEN bezpośrednio z komórek ES bez konieczności dokonywania manipulacji genetycznych. Wystarczy dodać egzogenny kwas retinowy i aktywinę do pożywki, w której hoduje się komórki ES, aby uzyskać komórki XEN identyczne z tymi uzyskanymi bezpośrednio z zarodka [94]. Wykazano, że przekształcenie to nie byłoby możliwe bez udziału ścieżki Fgf4/kinaza MAP. Z kolei inaktywacja genu Oct4 w komórkach ES powoduje utratę pluripotencji, aktywację genów markerowych dla linii trofektodermy i nabywanie właściwości komórek TS [31,95]. Podobny efekt wywołuje nadekspresja genu Cdx2 lub Eomes 140

11 [31,95]. Mysie komórki ES mogą przekształcić się w komórki TS także bez konieczności manipulowania ekspresją genów kluczowych dla linii tych komórek [96,97]. Ta przemiana wymaga jednak modyfikacji warunków hodowlanych - hodowli na podłożu z kolagenem IV [96] lub w pożywce pozbawionej czynnika LIF i wzbogaconej białkiem Wnt3a [97]. PODSUMOWANIE Odkrycie różnych rodzajów komórek macierzystych, które odzwierciedlają właściwości linii komórkowych blastocysty otworzyło nowy rozdział w badaniach wczesnych etapów rozwoju ssaków. Umożliwiło również zdefiniowanie mechanizmów leżących u podstaw pluripotencji i różnicowania komórek zarówno in vivo, jak i in vitro. W przyszłości może to pomóc w opracowaniu technik pozwalających na dowolne sterowanie losem komórek. Jest to niezwykle istotne, jeśli ma się spełnić wizja wykorzystania stale proliferujących, pluripotencjalnych komórek w terapiach wielu nieuleczalnych dotychczas chorób. Informacje zgromadzone w oparciu o badania z wykorzystaniem zarówno przedimplantacyjnych zarodków, jak i komórek macierzystych, stanowiły podwaliny dla opracowania w 2006 roku metody uzyskiwania indukowanych komórek pluripotencjalnych (ips, ang. induced pluripotent cells) [98]. Wiedza ta pozwoliła nie tylko na zaprojektowanie warunków eksperymentalnych, koniecznych do przekształcenia zróżnicowanych komórek somatycznych w komórki pluripotencjalne, ale przyczyniła się również do zrozumienia zagrożeń, jakie kryją w sobie te budzące ogromne nadzieje komórki [99]. PIŚMIENNICTWO 1. Tadros W, Lipshitz HD (2009) The maternal-to-zygotic transition: a play in two acts. Development 136: Yamanaka Y, Ralston A, Stephenson RO, Rossant J (2006) Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev Dyn 235: De Vries WN, Evsikov AV, Haac BE, Fancher KS, Holbrook AE, Kemler R, Solter D, Knowles BB (2004) Maternal beta-catenin and E-cadherin in mouse development. Development 131: Collins JE, Fleming TP (1995) Epithelial differentiation in the mouse preimplantation embryo: making adhesive cell contacts for the first time. Trends Biochem Sci 20: Borsuk E, Ciemerych AM, Ożdżeński (2007) Rozwój zarodkowy mysz W: Maleszewski M (red) Ćwiczenia z biologii rozwoju zwierząt. Wydawnictwa Uniwersytetu Warszawskiego, Warszawa, str Watson AJ (1992) The cell biology of blastocyst development. Mol Reprod Dev 33: Borland RM, Biggers JD, Lechene CP (1977) Studies on the composition and formation of mouse blastocoele fluid using electron probe microanalysis. Dev Biol 55: Pfeffer PL, Pearton DJ (2012) Trophoblast development. Reproduction 143: Chazaud C, Yamanaka Y, Pawson T, Rossant J (2006) Early lineage segregation between epiblast and primitive endoderm in mouse blastocysts through the Grb2-MAPK pathway. Dev Cell 10: Tarkowski AK, Wróblewska J (1967) Development of blastomeres of mouse eggs isolated at the 4- and 8-cell stage. J Embryol Exp Morphol 18: Hillman N, Sherman MI, Graham C (1972) The effect of spatial arrangement on cell determination during mouse development. J Embryol Exp Morphol 28: Johnson MH, Ziomek CA (1981) The foundation of two distinct cell lineages within the mouse morula. Cell 24: Plusa B, Frankenberg S, Chalmers A, Hadjantonakis A-K, Moore CA, Papalopulu N, Papaioannou VE, Glover DM, Zernicka-Goetz M (2005) Downregulation of Par3 and apkc function directs cells towards the ICM in the preimplantation mouse embryo. J Cell Sci 118: Strumpf D, Mao C-A, Yamanaka Y, Ralston A, Chawengsaksophak K, Beck F, Rossant J (2005) Cdx2 is required for correct cell fate specification and differentiation of trophectoderm in the mouse blastocyst. Development 132: Jedrusik A, Bruce AW, Tan MH, Leong DE, Skamagki M, Yao M, Zernicka-Goetz M (2010) Maternally and zygotically provided Cdx2 have novel and critical roles for early development of the mouse embryo. Dev Biol 344: Dietrich J-E, Hiiragi T (2007) Stochastic patterning in the mouse preimplantation embryo. Development 134: Ralston A, Rossant J (2008) Cdx2 acts downstream of cell polarization to cell-autonomously promote trophectoderm fate in the early mouse embryo. Dev Biol 313: Kondratiuk I, Bazydlo K, Maleszewski M, Szczepanska K (2012) Delay of polarization event increases the number of Cdx2-positive blastomeres in mouse embryo. Dev Biol 368: Jedrusik A, Parfitt D-E, Guo G, Skamagki M, Grabarek JB, Johnson MH, Robson P, Zernicka-Goetz M (2008) Role of Cdx2 and cell polarity in cell allocation and specification of trophectoderm and inner cell mass in the mouse embryo. Genes Dev 22: Skamagki M, Wicher KB, Jedrusik A, Ganguly S, Zernicka-Goetz M (2013) Asymmetric localization of Cdx2 mrna during the first cellfate decision in early mouse development. Cell Rep 3: Pandolfi PP, Roth ME, Karis A, Leonard MW, Dzierzak E, Grosveld FG, Engel JD, Lindenbaum MH (1995) Targeted disruption of the GATA3 gene causes severe abnormalities in the nervous system and in fetal liver haematopoiesis. Nat Genet 11: Home P, Ray S, Dutta D, Bronshteyn I, Larson M, Paul S (2009) GATA3 is selectively expressed in the trophectoderm of peri-implantation embryo and directly regulates Cdx2 gene expression. J Biol Chem 284: Nishioka N, Yamamoto S, Kiyonari H, Sato H, Sawada A, Ota M, Nakao K, Sasaki H (2008) Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse embryos. Mech Dev 125: Nishioka N, Inoue K, Adachi K, Kiyonari H, Ota M, Ralston A, Yabuta N, Hirahara S, Stephenson RO, Ogonuki N, Makita R, Kurihara H, Morin-Kensicki EM, Nojima H, Rossant J, Nakao K, Niwa H, Sasaki H (2009) The Hippo signaling pathway components Lats and Yap pattern Tead4 activity to distinguish mouse trophectoderm from inner cell mass. Dev Cell 16: Yagi R, Kohn MJ, Karavanova I, Kaneko KJ, Vullhorst D, DePamphilis ML, Buonanno A (2007) Transcription factor TEAD4 specifies the trophectoderm lineage at the beginning of mammalian development. Development 134: Palmieri SL, Peter W, Hess H, Schöler HR (1994) Oct-4 transcription factor is differentially expressed in the mouse embryo during establishment of the first two extraembryonic cell lineages involved in implantation. Dev Biol 166: Avilion AA, Nicolis SK, Pevny LH, Perez L, Vivian N, Lovell-Badge R (2003) Multipotent cell lineages in early mouse development depend on SOX2 function. Genes Dev 17: Albert M, Peters AHFM (2009) Genetic and epigenetic control of early mouse development. Curr Opin Genet Dev 19: Szczepanska K, Stanczuk L, Maleszewski M (2011) Isolated mouse inner cell mass is unable to reconstruct trophectoderm. Differentiation 82: Nichols J, Zevnik B, Anastassiadis K, Niwa H, Klewe-Nebenius D, Chambers I, Schöler H, Smith A (1998) Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell 95: Niwa H, Toyooka Y, Shimosato D, Strumpf D, Takahashi K, Yagi R, Rossant J (2005) Interaction between Oct3/4 and Cdx2 determines trophectoderm differentiation. Cell 123: Postępy Biochemii 59 (2)

12 32. Dziadek M (1979) Cell differentiation in isolated inner cell masses of mouse blastocysts in vitro: onset of specific gene expression. J Embryol Exp Morphol 53: Becker S, Casanova J, Grabel L (1992) Localization of endoderm-specific mrnas in differentiating F9 embryoid bodies. Mech Dev 37: Świtoń K (2011) Czy węzły zarodkowe wyizolowane z późnych, 4,5-dniowych blastocyst myszy są zdolne do odtworzenia warstwy pierwotnej endodermy podczas hodowli in vitro. Praca licencjacka wykonana w Zakładzie Embriologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski 35. Kurimoto K, Yabuta Y, Ohinata Y, Ono Y, Uno KD, Yamada RG, Ueda HR, Saitou M (2006) An improved single-cell cdna amplification method for efficient high-density oligonucleotide microarray analysis. Nucleic Acids Res 34: e Plusa B, Piliszek A, Frankenberg S, Artus J, Hadjantonakis A-K (2008) Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst. Development 135: Meilhac SM, Adams RJ, Morris SA, Danckaert A, Le Garrec J-F, Zernicka-Goetz M (2009) Active cell movements coupled to positional induction are involved in lineage segregation in the mouse blastocyst. Dev Biol 331: Morrisey EE, Tang Z, Sigrist K, Lu MM, Jiang F, Ip HS, Parmacek MS (1998) GATA6 regulates HNF4 and is required for differentiation of visceral endoderm in the mouse embryo. Genes Dev 12: Koutsourakis M, Langeveld A, Patient R, Beddington R, Grosveld F (1999) The transcription factor GATA6 is essential for early extraembryonic development. Development 126: Artus J, Piliszek A, Hadjantonakis A-K (2011) The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17. Dev Biol 350: Artus J, Panthier J-J, Hadjantonakis A-K (2010) A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst. Development 137: Yang D-H, Smith ER, Roland IH, Sheng Z, He J, Martin WD, Hamilton TC, Lambeth JD, Xu X-X (2002) Disabled-2 is essential for endodermal cell positioning and structure formation during mouse embryogenesis. Dev Biol 251: Gerbe F, Cox B, Rossant J, Chazaud C (2008) Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst. Dev Biol 313: Zernicka-Goetz M, Morris SA, Bruce AW (2009) Making a firm decision: multifaceted regulation of cell fate in the early mouse embryo. Nat Rev Genet 10: Messerschmidt DM, Kemler R (2010) Nanog is required for primitive endoderm formation through a non-cell autonomous mechanism. Dev Biol 344: Silva J, Nichols J, Theunissen TW, Guo G, Van Oosten AL, Barrandon O, Wray J, Yamanaka S, Chambers I, Smith A (2009) Nanog is the gateway to the pluripotent ground state. Cell 138: Frankenberg S, Gerbe F, Bessonnard S, Belville C, Pouchin P, Bardot O, Chazaud C (2011) Primitive endoderm differentiates via a three-step mechanism involving Nanog and RTK signaling. Dev Cell 21: Guo G, Huss M, Tong GQ, Wang C, Li Sun L, Clarke ND, Robson P (2010) Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Dev Cell 18: Pawson T, Scott JD (1997) Signaling through scaffold, anchoring, and adaptor proteins. Science 278: Nichols J, Silva J, Roode M, Smith A (2009) Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo. Development 136: Yamanaka Y, Lanner F, Rossant J (2010) FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development 137: Grabarek JB, Zyzyńska K, Saiz N, Piliszek A, Frankenberg S, Nichols J, Hadjantonakis A-K, Plusa B (2012) Differential plasticity of epiblast and primitive endoderm precursors within the ICM of the early mouse embryo. Development 139: Singh AM, Hamazaki T, Hankowski KE, Terada N (2007) A heterogeneous expression pattern for Nanog in embryonic stem cells. Stem Cells 25: Feldman B, Poueymirou W, Papaioannou VE, DeChiara TM, Goldfarb M (1995) Requirement of FGF-4 for postimplantation mouse development. Science 267: Wilder PJ, Kelly D, Brigman K, Peterson CL, Nowling T, Gao QS, Mc- Comb RD, Capecchi MR, Rizzino A (1997) Inactivation of the FGF-4 gene in embryonic stem cells alters the growth and/or the survival of their early differentiated progeny. Dev Biol 192: Arman E, Haffner-Krausz R, Chen Y, Heath JK, Lonai P (1998) Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development. Proc Natl Acad Sci USA 95: Kang M, Piliszek A, Artus J, Hadjantonakis A-K (2013) FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse. Development 140: Rossant J, Chazaud C, Yamanaka Y (2003) Lineage allocation and asymmetries in the early mouse embryo. Philos Trans R Soc Lond, B, Biol Sci 358: ; discussion Chisholm JC, Houliston E (1987) Cytokeratin filament assembly in the preimplantation mouse embryo. Development 101: Morris SA, Teo RTY, Li H, Robson P, Glover DM, Zernicka-Goetz M (2010) Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo. Proc Natl Acad Sci USA 107: Fujikura J, Yamato E, Yonemura S, Hosoda K, Masui S, Nakao K, Miyazaki Ji J, Niwa H (2002) Differentiation of embryonic stem cells is induced by GATA factors. Genes Dev 16: Suwińska A (2012) Preimplantation mouse embryo: developmental fate and potency of blastomeres. Results Probl Cell Differ 55: Tarkowski AK (1959) Experiments on the development of isolated blastomers of mouse eggs. Nature 184: Tarkowski AK, Ozdzenski W, Czołowska R (2001) Mouse singletons and twins developed from isolated diploid blastomeres supported with tetraploid blastomeres. Int J Dev Biol 45: Tarkowski AK, Ozdzenski W, Czolowska R (2005) Identical triplets and twins developed from isolated blastomeres of 8- and 16-cell mouse embryos supported with tetraploid blastomeres. Int J Dev Biol 49: Kubiak JZ, Tarkowski AK (1985) Electrofusion of mouse blastomeres. Exp Cell Res 157: Suwińska A, Czołowska R, Ozdzeński W, Tarkowski AK (2008) Blastomeres of the mouse embryo lose totipotency after the fifth cleavage division: expression of Cdx2 and Oct4 and developmental potential of inner and outer blastomeres of 16- and 32-cell embryos. Dev Biol 322: Tarkowski AK, Suwińska A, Czołowska R, Ożdżeński W (2010) Individual blastomeres of 16- and 32-cell mouse embryos are able to develop into foetuses and mice. Dev Biol 348: Evans MJ, Kaufman MH (1981) Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292: Martin GR (1981) Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 78: Thomson JA, Kalishman J, Golos TG, Durning M, Harris CP, Becker RA, Hearn JP (1995) Isolation of a primate embryonic stem cell line. Proc Natl Acad Sci USA 92: Thomson JA, Kalishman J, Golos TG, Durning M, Harris CP, Hearn JP (1996) Pluripotent cell lines derived from common marmoset (Callithrix jacchus) blastocysts. Biol Reprod 55: Thomson JA, Marshall VS (1998) Primate embryonic stem cells. Curr Top Dev Biol 38:

13 74. Buehr M, Meek S, Blair K, Yang J, Ure J, Silva J, McLay R, Hall J, Ying Q-L, Smith A (2008) Capture of authentic embryonic stem cells from rat blastocysts. Cell 135: Li P, Tong C, Mehrian-Shai R, et al. (2008) Germline competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts. Cell 135: Smith AG, Heath JK, Donaldson DD, Wong GG, Moreau J, Stahl M, Rogers D (1988) Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature 336: Williams RL, Hilton DJ, Pease S, Willson TA, Stewart CL, Gearing DP, Wagner EF, Metcalf D, Nicola NA, Gough NM (1988) Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature 336: Chung Y, Klimanskaya I, Becker S, Marh J, Lu S-J, Johnson J, Meisner L, Lanza R (2006) Embryonic and extraembryonic stem cell lines derived from single mouse blastomeres. Nature 439: Klimanskaya I, Chung Y, Becker S, Lu S-J, Lanza R (2006) Human embryonic stem cell lines derived from single blastomeres. Nature 444: Wakayama S, Hikichi T, Suetsugu R, Sakaide Y, Bui H-T, Mizutani E, Wakayama T (2007) Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies. Stem Cells 25: Boyer LA, Lee TI, Cole MF, Johnstone SE, Levine SS, Zucker JP, Guenther MG, Kumar RM, Murray HL, Jenner RG, Gifford DK, Melton DA, Jaenisch R, Young RA (2005) Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell 122: Loh Y-H, Wu Q, Chew J-L, Zhang W, Chen X, Bourque G, George J, Leong B, Liu J, Wong KY, Sung KW, Lee CW, Zhao XD, Chiu KP, Lipovich L, Kuznetsov VA, Robson P, Stanton LW, Wei CL, Ruan Y, Lim B, Ng HH (2006) The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells. Nat Genet 38: Niwa H, Miyazaki J, Smith AG (2000) Quantitative expression of Oct- 3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat Genet 24: Beddington RS, Robertson EJ (1989) An assessment of the developmental potential of embryonic stem cells in the midgestation mouse embryo. Development 105: Tanaka S, Kunath T, Hadjantonakis AK, Nagy A, Rossant J (1998) Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science 282: Vandevoort CA, Thirkill TL, Douglas GC (2007) Blastocyst-derived trophoblast stem cells from the rhesus monkey. Stem Cells Dev 16: Grigor eva EV, Shevchenko AI, Mazurok NA, Elisaphenko EA, Zhelezova AI, Shilov AG, Dyban PA, Dyban AP, Noniashvili EM, Slobodyanyuk SY, Nesterova TB, Brockdorff N, Zakian SM (2009) FGF4 independent derivation of trophoblast stem cells from the common vole. PLoS ONE 4: e Kunath T, Arnaud D, Uy GD, Okamoto I, Chureau C, Yamanaka Y, Heard E, Gardner RL, Avner P, Rossant J (2005) Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts. Development 132: Moerkamp AT, Paca A, Goumans M-J, Kunath T, Kruithof BPT, Kruithof-de Julio M (2013) Extraembryonic Endoderm cells as a model of endoderm development. Dev Growth Differ doi: /dgd Debeb BG, Galat V, Epple-Farmer J, Iannaccone S, Woodward WA, Bader M, Iannaccone P, Binas B (2009) Isolation of Oct4-expressing extraembryonic endoderm precursor cell lines. PLoS ONE 4: e Galat V, Binas B, Iannaccone S, Postovit L-M, Debeb BG, Iannaccone P (2009) Developmental potential of rat extraembryonic stem cells. Stem Cells Dev 18: Niakan KK, Ji H, Maehr R, Vokes SA, Rodolfa KT, Sherwood RI, Yamaki M, Dimos JT, Chen AE, Melton DA, McMahon AP, Eggan K (2010) Sox17 promotes differentiation in mouse embryonic stem cells by directly regulating extraembryonic gene expression and indirectly antagonizing self-renewal. Genes Dev 24: Shimosato D, Shiki M, Niwa H (2007) Extra-embryonic endoderm cells derived from ES cells induced by GATA factors acquire the character of XEN cells. BMC Dev Biol 7: Cho LTY, Wamaitha SE, Tsai IJ, Artus J, Sherwood RI, Pedersen RA, Hadjantonakis A-K, Niakan KK (2012) Conversion from mouse embryonic to extra-embryonic endoderm stem cells reveals distinct differentiation capacities of pluripotent stem cell states. Development 139: Hough SR, Clements I, Welch PJ, Wiederholt KA (2006) Differentiation of mouse embryonic stem cells after RNA interference-mediated silencing of OCT4 and Nanog. Stem Cells 24: Schenke-Layland K, Angelis E, Rhodes KE, Heydarkhan-Hagvall S, Mikkola HK, Maclellan WR (2007) Collagen IV induces trophoectoderm differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cells 25: He S, Pant D, Schiffmacher A, Meece A, Keefer CL (2008) Lymphoid enhancer factor 1-mediated Wnt signaling promotes the initiation of trophoblast lineage differentiation in mouse embryonic stem cells. Stem Cells 26: Takahashi K, Ichisaka T, Yamanaka S (2006) Identification of genes involved in tumor-like properties of embryonic stem cells. Methods Mol Biol 329: Archacka A, Grabowska I, Ciemerych MA (2010) Indukowane komórki pluripotentne - nadzieje, obawy i perspektywy. Post Biol Kom 37: The first developmental decisions cell differentiation in preimplantation mouse embryo Katarzyna Filimonow*, Magdalena Krupa*, Aneta Suwińska * Department of Embryology, Faculty of Biology, University of Warsaw, 1 I. Miecznikowa St., Warsaw, Poland * asuwinska@biol.uw.edu.pl *The authors equally contributed to the article Key words: blastocyst, cell lineages, trophectoderm, epiblast, primitive endoderm ABSTRACT The question, how multicellular fetus emerges from a totipotent single cell, the zygote, raises ceaseless curiosity of researchers. During embryogenesis, the cells of the embryo gradually lose their full developmental potency and begin to differentiate. The initial period of embryonic development of mammals, including the mouse, is primarily devoted to cell commitment of the pluripotent lineage that will give rise to all of the tissues of the embryo proper, as well as to the formation of extraembryonic tissues essential for embryo survival within the mother s uterus. The milestone in the studies of early stages of embryogenesis was derivation and maintenance of in vitro cultured stem cells that mimic the identity and properties of the primary cell lineages. It made possible to explore the mechanisms responsible for the critical early cell fate decisions taking place in vivo within the embryo. Postępy Biochemii 59 (2)