FLUORESCENCYJNA HYBRYDYZACJA IN SITU W DETEKCJI INFEKCYJNYCH POWIKŁAŃ PRZEWLEKŁEJ STYMULACJI SERCA BADANIA PILOTAŻOWE

Transkrypt

1 PRACA ORYGINALNA FLUORESCENCYJNA HYBRYDYZACJA IN SITU W DETEKCJI INFEKCYJNYCH POWIKŁAŃ PRZEWLEKŁEJ STYMULACJI SERCA BADANIA PILOTAŻOWE FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION IN THE DETECTION OF INFECTIOUSCOMPLICATIONS OF PERMANENT HEARTPACING PILOT STUDY AGNIESZKA SROKA-OLEKSIAK 1, 2, MATEUSZ ULMAN 3, BARBARA MAŁECKA 3, 4, MAŁGORZATA BULANDA 5 1 Zakład Mykologii Medycznej Katedry Mikrobiologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum 2 Zakład Molekularnej Mikrobiologii Medycznej Katedry Mikrobiologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum 3 Kliniczny Oddział Elektrokardiologii Krakowskiego Szpitala Specjalistycznego im. Jana Pawła II 4 Instytut Kardiologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum 5 Zakład Epidemiologii Zakażeń Katedry Mikrobiologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum m m Małgorzata Bulanda Zakład Epidemiologii Zakażeń Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum ul. Czysta 18, Kraków Tel.: , Fax: mbbuland@cyf-kr.edu.pl Wpłynęło: Zaakceptowano: Opublikowano on-line: Cytowanie: Sroka-Oleksiak A, Ulman M, Małecka B, Bulanda M. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w detekcji infekcyjnych powikłań przewlekłej stymulacji serca badania pilotażowe. Zakażenia XXI wieku 2019;2(2): /zakazenia/2019/2/Z Copyright by MAVIPURO Polska Sp. z o.o., Warszawa, Wszystkie prawa zastrzeżone. Żadna część niniejszej publikacji nie może być powielana i rozpowszechniana w jakiejkolwiek formie i w jakikolwiek sposób bez zgody wydawcy. STRESZCZENIE: Wstęp. Przewlekła stymulacja serca jest związana z ryzykiem wystąpienia w późniejszym okresie powikłań, w tym najgroźniejszego, czyli odelektrodowego zapalenia wsierdzia (ang. lead dependent infective endocarditis LDIE). Wówczas kluczowe jest zastosowanie odpowiedniej terapii, której istotnym etapem jest usunięcie wszystkich elementów układu stymulującego, a także jak najwcześniejsza identyfikacja czynnika etiologicznego, co umożliwia zastosowanie celowanej antybiotykoterapii. Obecnie stosowane metody diagnostyczne oparte na hodowli krwi charakteryzuje niska czułość i długi czas oczekiwania na wynik badania. Poszukiwane są alternatywne rozwiązania, które można by stosować w warunkach diagnostyki szpitalnej. Cel. Celem badań było określenie czułości i przydatności fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) oraz porównanie jej z metodami hodowlanymi. Materiały i metody. Badanym materiałem były próbki krwi i/lub wymazy pobrane od pacjentów z LDIE; po odpowiednim przygotowaniu poddano je hybrydyzacji z sondami fluorescencyjnymi, charakterystycznymi dla bakterii z rodzaju Staphyloccoccus i rodziny Enterobacteriaceae. Wyniki. Rezultaty badań oceniano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Zastosowanie FISH umożliwiło identyfikację patogenów w 90% przypadków, a przy użyciu metod hodowlanych zaledwie w 30%. Wnioski. Czułość fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ znacznie przewyższa metody oparte na hodowli krwi. W celu kompleksowej identyfikacji patogenów w przyszłych badaniach należy uwzględnić sondę fluorescencyjną, specyficzną dla grzybów z rodzaju Candida. SŁOWA KLUCZOWE: FISH, stymulacja serca, infekcyjne zapalenie wsierdzia, metoda klasycznego posiewu ABSTRACT: Introduction. Permanent heart pacing is associated with the risk of later complications, including the most serious complication, i.e. the risk of Lead Dependent Infective Endocarditis (LDIE). Then, it is essential to introduce an appropriate therapy with an important stage being removal of all components of the pacing 71

2 system, and also to identify as early as possible the etiological factor allowing for the use of targeted antibiotic therapy. Current diagnostic methods based on blood culture are characterized by low sensitivity and a long waiting time for test results. Alternative solutions are sought that could be implemented in hospital diagnostic conditions. Aim. The aim of the study was to determine the sensitivity and usefulness of fluorescence in situ hybridization (FISH) and to compare it with culture methods. Material and Methods. The analyzed material consisted of blood samples and/or swabs taken from patients with LDIE, which, after appropriate preparation were hybridized with fluorescent probes, specific to bacteria of the genus and the family of Enterobacteriaceae. Results. The results were evaluated by fluorescence microscopy. The use of FISH allowed the identification of pathogens in 90% of cases, while using culture methods only in 30%. Conclusions. The sensitivity of fluorescent in situ hybridization is much higher than methods based on the blood culture. For comprehensive identification of pathogens, a fluorescent probe specific to Candida fungi should be studied in further research. KEY WORDS: FISH, heart pacing, infective endocarditis, culture methods 72 WSTĘP Przewlekła stymulacja jest powszechnie stosowaną metodą leczenia arytmii serca, przebiegających ze zwolnieniem rytmu, takich jak: zespół chorego węzła zatokowego i zaawansowane bloki przedsionkowo-komorowe. Wprawdzie wszczepienie układów stymulujących skutecznie zapobiega nagłej śmierci sercowej i ma dobroczynny wpływ na jakość życia pacjenta, wiąże się jednak z możliwością wystąpienia w późnym okresie pooperacyjnym takich komplikacji wynikających z obecności elektrod endokawitarnych, jak przerwanie elektrody, pęknięcie przewodów metalowych lub uszkodzenie izolacji [1]. W konsekwencji rozszczelnienia elektrody endokawitarnej może się rozwinąć specyficzne i zależne od elektrody infekcyjne zapalenie wsierdzia, nazwane również odelektrodowym zapaleniem wsierdzia (ang. lead-dependent infectiveendocarditis LDIE) [2]. Wszystkie infekcyjne powikłania przewlekłej stymulacji stanowią wskazanie do natychmiastowego usunięcia całego układu stymulującego i zastosowania odpowiedniej terapii antybiotykowej. Podjęcie tych kroków utrudnia niekiedy niespecyficzny i skąpoobjawowy obraz LDIE oraz trudność z zastosowaniem kryteriów rozpoznawania LDIE w praktyce klinicznej [3]. W leczeniu zakażeń układów stymulujących kluczowym etapem jest szybkie wykrycie oraz identyfikacja mikroorganizmów odpowiedzialnych za rozwój infekcji. Nierozpoznane i/lub nieleczone zakażenia stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia i życia pacjenta. W diagnostyce, niestety, nadal złotym standardem są hodowle krwi na specjalnych podłożach wzrostowych, charakteryzujące się niską czułością i koniecznością długiego oczekiwania na wyniki, nawet do pięciu dni [4]. Z tego powodu poszukuje się alternatywnych metod wykrywania drobnoustrojów. Wśród nich przodują techniki molekularne, głównie PCR. Choć czułość metody PCR jest znacznie wyższa niż klasycznych metod hodowlanych, nie jest jednak możliwe wprowadzenie jej do rutynowej diagnostyki we wszystkich szpitalach, ponieważ wymaga specjalnego wyposażenia oraz wygospodarowania przynajmniej trzech osobnych pomieszczeń, aby zapobiec ewentualnej kontaminacji. Alternatywnym rozwiązaniem może być fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (ang. fluorescent in situ hybridization FISH). Argumentami przemawiającymi za zastosowaniem tej metody jako testu skriningowego jest krótki czas od przygotowania próbki do interpretacji wyników, możliwość identyfikacji bakterii bez konieczności wcześniejszej hodowli oraz izolacji, która jest równie czasochłonną procedurą. CEL PRACY Celem pracy była ocena czułości i skuteczności metody fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w wykrywaniu czynników etiologicznych infekcji będącej powikłaniem przewlekłej stymulacji serca, a także porównanie otrzymanych rezultatów z metodą klasycznego posiewu. MATERIAŁY I METODY Materiałem poddanym badaniu były wymazy z loży rozrusznika lub elektrody i/lub krew obwodowa, pobrane od pacjentów, których hospitalizowano na oddziale elektrokardiologii Szpitala Specjalistycznego im. św. Jana Pawła II w Krakowie z powodu infekcyjnych powikłań przewlekłej stymulacji serca. Podstawą kwalifikacji pacjentów było oprócz klinicznego podejrzenia lub rozpoznania infekcji (miejscowe cechy zakażenia loży stymulatora, charakterystyczne zmiany w przezklatkowym lub przezprzełykowym badaniu echokardiograficznym) uzyskanie świadomej, pisemnej zgody na udział w badaniach. Brak podpisanej zgody lub wycofanie jej na dowolnym etapie badań stanowiło podstawę wykluczenia próbek wyłącznie z badań molekularnych. Rutynowym, diagnostycznym badaniem, w którym wykorzystano krew, były klasyczne metody posiewu (automatyczny system do posiewów krwi BacT/ALERT)

3 wykonywanego na bieżąco w Pracowni Mikrobiologii wyżej wymienionego szpitala. Po stwierdzeniu dodatniej hodowli krwi wykonywano antybiogram, który stanowił podstawę ustalenia terapii celowanej. Pozostałą krew z wszystkich próbek w objętości ok. 200 μl wykorzystano do przeprowadzenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w Katedrze Mikrobiologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum; to badanie wykonywano zbiorczo po zebraniu odpowiedniej kolekcji próbek. Procedura obejmowała wstępne przygotowanie próbek (wirowanie, przepłukanie peletu, naniesienie materiału na specjalne szkiełka do hybrydyzacji), następny etap to utrwalanie preparatów, denaturacja, po czym hybrydyzacja przy użyciu charakterystycznych dla danej grupy bakterii sond znakowanych fluorescencyjnie. Dla każdej próbki wykonano po dwa preparaty: w pierwszym była możliwa identyfikacja bakterii z rodzaju (sonda STA, 5'-TCCTCCATATCTTGCGC-3', znakowana CY3 kolor czerwony) oraz pozostałych patogenów Gram dodatnich lub Gram ujemnych (sonda EUB, 5 - GCTGCCTCCCGTAGGA GT-3, znakowana FITC kolor żółty), a w drugim preparacie identyfikowano pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae (sonda ENT, 5'-CTCTTTG- GTCTTGCGACG-3', znakowana CY3 kolor czerwony) oraz jak wyżej pozostałe patogeny (sonda EUB). Szczegółowy opis poszczególnych etapów procedury został przedstawiony w publikacji Gosiewskiego i współautorów [5]. Po hybrydyzacji preparaty traktowano barwnikiem DAPI (kolor niebieski) i oglądano pod mikroskopem fluorescencyjnym Olympus BX96 przy użyciu oprogramowania CellSense (Olympus). Była wykonywana kontrola jakości badania ze szczepem wzorcowym. mikroorganizmów przy użyciu metody FISH. Przykładowe zdjęcia uzyskane z mikroskopu fluorescencyjnego przedstawiona na rycinie 1. OMÓWIENIE Rozpoznawanie i kwalifikacja infekcyjnych powikłań stymulacji wciąż jest trudnym problemem. Przykładem dylematów związanych z nazewnictwem infekcji układów stymulujących jest najnowszy dokument Europejskiego Towarzystwa Kardiologicznego, zaproponowano w nim bowiem podział na trzy rodzaje infekcji miejscowych i pięć ogólnych [6]. Pozytywny wynik hodowli krwi stanowi ważne kryterium rozpoznawcze i podstawę wyboru antybiotykoterapii w infekcyjnych powikłaniach przewlekłej stymulacji serca. Niestety, jak wspomniano we wstępie, metoda ta charakteryzuje się niską czułością, umożliwia bowiem określenie patogenu jedynie w 1520% przypadków [4]. Przyczyną tego może być wyjściowo niewielka liczba drobnoustrojów WYNIKI Badano dziesięć próbek pobranych od ośmiu pacjentów z infekcyjnymi powikłaniami stymulacji serca; stosując fluorescencyjną hybrydyzację in situ, w dziewięciu próbkach zidentyfikowano czynnik etiologiczny, natomiast przy użyciu metody hodowlanej zaledwie w trzech próbkach (tab. 1). Wszystkie drobnoustroje zaobserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym należały do rodzaju, a w jednej próbce (2/1) dodatkowo występowały Gram ujemne pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae. Zgodność wyników otrzymanych metodą klasycznego posiewu i FISH odnotowano w odniesieniu do dwóch materiałów. W próbce oznaczonej jako 1/2 (pobranej z loży rozrusznika) uzyskano sprzeczne rezultaty: przy użyciu metod hodowlanych stwierdzono obecność Candida parapsilosis, natomiast za pomocą metody fluorescencyjnej hybrydyzacji obecność jedynie bakterii. Ze względu na brak sond fluorescencyjnych służących do wyznakowania grzybów w materiale klinicznym nie była możliwa identyfikacja tych WWRyc. 1. Przykładowe/wybrane zdjęcia badanych próbek, z obserwacji w mikroskopie fluorescencyjnym. Czerwony kolor fluorescencji odnosi się do bakterii z rodzaju i pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae, niebieska fluorescencja to pozostałości elementów morfotycznych krwi. 73

4 WWTab. 1. Porównanie wyników identyfikacji patogenów metodami: FISH i klasycznego posiewu. Lp. Próbki Rodzaj materiału Klasyczny posiew (diagnostyka szpitala) /1 1/2 2/1 2/2 krew wymaz z loży wymaz z loży wymaz z elektrody C. parapsilosis 5 3/1 wymaz z loży S. epidermidis 6 4/1 krew 7 5/1 krew 8 6/1 krew 9 7/1 wymaz z loży S. epidermidis 10 8/1 wymaz z elektrody FISH (UJCM), Enterobacteriaceae 74 we krwi [7]. Ponadto szanse na wyhodowanie czynnika etiologicznego znacznie maleją, jeśli wcześniej zastosowano antybiotykoterapię. Infekcyjne powikłania przewlekłej stymulacji serca przybierają różne postacie, a rozpoznawanie LDIE jest trudne z powodu mylących objawów oraz zmiennego i nieprzewidywalnego przebiegu choroby [2, 3, 8]. LDIE dotyczy wsierdzia jam prawego serca, w związku z tym w obrazie klinicznym dominują objawy infekcji układu oddechowego: kaszel, ból w klatce piersiowej, nawracające zapalenie płuc o nietypowym nasileniu, prowokujące do wczesnego zastosowania antybiotykoterapii, bez wykrycia czynnika etiologicznego. W tej sytuacji jest konieczne zastosowanie alternatywnych i przede wszystkim czułych metod umożliwiających szybszą diagnostykę. W niniejszej pracy proponowanym rozwiązaniem jest fluorescencyjna hybrydyzacja in situ. Wyniki badań pilotażowych świadczą o tym, że metoda FISH jest trzykrotnie bardziej czuła niż klasyczne posiewy. W pracach Gosiewskiego i wsp. [6] oraz Źródłowskiego i wsp. [9] analizowano przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ próbki krwi pacjentów z klinicznymi objawami sepsy, rezultaty były zbliżone do prezentowanych w tym badaniu. Niewątpliwie szanse na wykrycie patogenów w badanych próbkach krwi zwiększa wstępna preparatyka, polegająca na lizie erytrocytów i komórek żernych oraz na zagęszczaniu materiału wraz z bakteriami. Ograniczeniem wynikającym z prezentowanych badań jest zastosowanie sond fluorescencyjnych specyficznych wyłącznie do identyfikowania bakterii. Na podstawie analizy dostępnych danych literaturowych ustalono, że najczęstszą przyczyną powikłań po zastosowaniu urządzeń stymulujących są Gram dodatnie ziarenkowce z rodzaju, głównie S. aureus i S. epidermidis [3, 10, 11, 12, 13]. Bakterie te charakteryzuje łatwa adhezja do podłoża, co stwarza dogodne warunki do podziału i tworzenia gęstej warstwy biofilmu na powierzchni elektrod. Struktura biofilmu chroni drobnoustroje przed mechanizmami układu odpornościowego, a także utrudnia ich eradykację antybiotykami i chemioterapeutykami. Gram ujemne pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae (E. faecalis, E. coli, K. pneumoniae) należą do bakterii, które rzadko są stwierdzane w przebiegu tego typu infekcji [10, 11, 12]. Opierając się na tych informacjach, w niniejszych badaniach wykorzystano sondy fluorescencyjne umożliwiające identyfikację wyżej wymienionych grup. W przypadku obecności innych gatunków równie rzadko spotykanych dodatkowo wprowadzono sondę, która umożliwia wizualizację każdej bakterii za pomocą emisji żółtej fluorescencji. Nie zastosowano natomiast sondy, która wykazywałaby obecność grzybów z rodzaju Candida, co stanowi w tym przypadku ograniczenie badania, w przyszłości zaś konieczność uwzględnienia tego rodzaju grzybów. Mimo to uzyskane wyniki są tak interesujące, że skłaniają do dalszych badań, przede wszystkim na znacznie większej puli próbek oraz po rozszerzeniu ich o identyfikację gatunkową zarówno dla bakterii, jak i grzybów. Takie podejście mogłoby stanowić podstawę do późniejszego wprowadzenia metody fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ jako testu skriningowego w diagnostyce mikrobiologicznej krwi pacjentów nie tylko z powikłaniami po przewlekłej stymulacji serca, ale również w każdym przypadku, który stanowi wskazanie do wykonania posiewu krwi [14, 15]. WNIOSKI 1. Zastosowana metoda fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ charakteryzuje się znacznie wyższą czułością niż metody klasycznego posiewu na podłożach wzrostowych. 2. Wprowadzenie metody FISH do rutynowej diagnostyki medycznej mogłoby zwiększyć szansę identyfikacji patogenów, a także skrócić czas oczekiwania na wynik badania i wprowadzenia terapii ukierunkowanej. 3. W celu kompleksowego wykrywania drobnoustrojów w materiałach klinicznych konieczne jest uwzględnienie w przyszłych badaniach sond fluorescencyjnych, przeznaczonych do identyfikacji grzybów z rodzaju Candida.

5 KONFLIKT INTERESÓW: nie zgłoszono. Projekt uzyskał pozytywną opinię Komicji Bioetycznej UJ (KBET/ z r.) oraz był finansowany z Dotacji Statutowej Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum (K/ZDS/007827). Kierownik projektu: prof. dr hab. med. Małgorzata Bulanda. PIŚMIENNICTWO 1. Małecka B, Lelakowski J, Szczepkowski J i wsp. Niepowodzenia przewlekłej stymulacji serca typu DDD związane z dysfunkcją elektrody obserwacja własna. Folia Cardiol 2004;11(3): Małecka B, Kutarski A. Lead-dependent infective endocarditis: An old problem, a new name. Cardiol J 2010;17(2): Małecka B, Ząbek A. Infectious complications of electrotherapy: theory and practice. Pol Arch Med Wewn 2016;126(6): /pamw Jamal W, Tamaray G, Pazhoor A i wsp. Comparative evaluation of BacT/ALERT 3D and BACTEC Systems for the recovery of pathogens causing bloodstream infections. Med Prin Pract. 2006;15(3): / Gosiewski T, Pietrzyk A, Brzychczy-Włoch M i wsp. Zastosowanie metod PCR i FISH w szybkiej diagnostyce bakteryjnych zakażeń krwi. Ann Acad Med Siles 2011;65(5): Bongiorni MG, Burri H, Deharo JC i wsp. ESC Scientific Document Group EHRA expert consensus statement on lead extraction: recommendations on definitions, endpoints, researchtrial design, and data collection requirements for clinical scientific studies and registries: endorsed by APHRS/HRS/LAHRS. Europace 2018;20(7): /europace/euy Gosiewski T, Szała L, Pietrzyk A i wsp. Comparison of methods for isolation of bacterial and fungal DNA from human blood. Curr Microbiol 2014;68(2): /s Lelakowski J. Rozpoznawanie bakteryjnego zapalenia wsierdzia. Folia Cardiologica Excerpta 2009;4(2): Źródłowski TW, Jurkiewicz-Badacz D, Sroka-Oleksiak A i wsp. Comparison of PCR, fluorescent in situ hybridization and blood cultures for detection of bacteremia in children and adolescents during antibiotic therapy. Pol J Microbiol. 2018;67(4): / pjm Deharo J-C, Quatre A, Mancini J i wsp. Long-term outcomes following infection of cardiac implantable electronic devices: a prospective matched cohort study. Heart 2012;98(9): /heartjnl Greenspon AJ, Prutkin JM, Sohail MR i wsp. Timing of the most recent device procedure influences the clinical outcome of lead-associated endocarditis. J Am Coll of Cardiol 2012;59(7): /j.jacc Margey R, McCann H, Blake G i wsp. Contemporary management of and outcomes from cardiac device related infections. Europace 2010;12(1): /europace/eup Massoure P-L, Reuter S, Lafitte S i wsp. Pacemaker endocarditis: Clinical features and management of 60 consecutive cases. PACE 2007;30: /j x 14. Peters RPH, Savelkoul PHM, Simoons-Smit AM i wsp. Faster identification of pathogens in positive blood cultures by fluorescence in situ hybridization in routine practice. J Clin Microbiol 2006;44(1): /JCM Kempf VAJ, Trebesius K, Autenrieth IB. Fluorescent in situ hybridization allows rapid identification of microorganisms in blood cultures. J Clin Microbiol 2000;38(2):