SESJA 3 STRUKTURA I FUNKCJE RNA PLAKATY

Transkrypt

1 SESJA 3 STRUKTURA I FUNKCJE RNA PLAKATY

2 52 SESJA 3 PLAKATY P03-01 SYNTEZA ANALOGÓW ADENOZYNY I ICH WPŁYW NA TRWAŁOŚĆ TERMODYNAMICZNĄ DUPLEKSÓW RNA Elżbieta Walczak, Ryszard Kierzek Komunikat przedstawia wstępne wyniki projektu mającego na celu poznanie wpływu wybranych modyfikacji adenozyny na trwałość termodynamiczną dupleksów i struktur szpilkowych RNA. Wszystkie typy komórkowych RNA zawierają modyfikowane nukleozydy. Z 95 różnych opublikowanych struktur 80 jest obecna w trna. Z 23 naturalnie występujących modyfikacji adenozyny, 19 znajduje się w trna, a większość jest charakterystyczna dla pozycji 37. Modyfikacje adenozyny umiejscowione są najczęściej na funkcji egzoaminowej, charakterystyczna jest także grupa metylotiolowa w pozycji 2. Modyfikowane dupleksy RNA zawierające 6N-izopentenyloadenozynę(naturalnie występującą modyfikacjęadenozyny) i 6N-izopentanyloadenozynęw różnych położeniach dupleksu oraz referencyjne stopiono. Następnie korzystając z programu MeltWin uzyskano parametry termodynamiczne. Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono, że zarówno izopentenyloadenozyna jak i izopentanyloadenozyna znacznie destabilizują dupleksy. Podstawnik izopentenylowy i izopentanylowy w podobny sposób obniżają trwałość termodynamiczną dupleksów. Wpływ wiązania podwójnego jest więc nieznaczny. Destabilizacja zależy od położenia modyfikacji w dupleksie. Największą zaobserwowano dla sparowanej, zmodyfikowanej adenozyny w tandemowej wewnętrznej parze zasad. Dupleks ten jest o 1.38 kcal/mol mniej trwały od dupleksu, w którym modyfikacje umieszczono jako rozdzieloną wewnętrzną parę zasad. Na trwałość dupleksu mają przede wszystkim wpływ wiązania wodorowe i oddziaływania warstwowe. Porównanie efektu 3` niesparowanego końca dupleksów modyfikowanych i referencyjnego sugeruje, że destabilizacjępowodują głównie słabsze wiązania wodorowe w modyfikowanych dupleksach. P03-02 BADANIE ROLI ODWROTNEJ TRANSKRYPTAZY WIRUSA HIV W PROCESIE REKOMBINACJI RNA Anna Kurzyńska, Magdalena Broda, Marek Figlerowicz Rekombinacja jest podstawowym procesem warunkującym zmienność genetyczną organizmów eukariotycznych. Okazuje się, że wirusy RNA również wykorzystują zjawisko rekombinacji jako strategię adaptacyjną umożliwiającą szybką rearanżacjęcząsteczek genomowych. Uzyskane dotychczas dane wskazują, że proces ten zachodzi zgodnie z hipotezą copy choice podczas syntezy nici potomnej replikaza wirusowa zmienia cząsteczkę matrycową. Czynnikami warunkującymi przeskoki rekombinacyjne są: struktura pierwszo- i drugorzędowa cząsteczek RNA, specyficzne oddziaływania RNA-RNA, RNA-białko oraz struktura samego enzymu. Pomimo licznych obserwacji mechanizm rekombinacji nie został jeszcze dokładnie poznany. Pytanie czy wszystkie zależne od RNA polimerazy w związku z dużym podobieństwem strukturalnym wykazują zbliżoną aktywność rekombinacyjną pozostaje nadal otwarte. Ciekawym obiektem badań jest odwrotna transkryptaza ludzkiego wirusa upośledzenia odporności (HIV RT). Wiadomo, że HIV RT posiada naturalną zdolność wykonywania przeskoków (podczas replikacji dwukrotnie zmienia matrycę), dodatkowo znana jest struktura rentgenowska enzymu. Opracowaliśmy zatem system umożliwiający śledzenie procesu rekombinacji in vitro, następnie przeprowadziliśmy ekspresjęhiv RT w systemie bakteryjnym i uzyskaliśmy homogenny preparat o aktywności polimerazy DNA zależnej od RNA (heterodimer p66/p51). Otrzymane białka wykorzystywane są do badania wpływu struktury i właściwości kompleksu replikacyjnego na proces rekombinacji RNA.

3 STRUKTURA I FUNKCJE RNA 53 P03-03 STRUKTURALNE UWARUNKOWANIA REKOMBINACJI GENETYCZNEJ RNA Magdalena Alejska, Nelli Malinowska, Marek Figlerowicz Rekombinacjęgenetyczną RNA zdefiniować można jako proces tworzenia nowej nici kwasu rybonukleinowego w oparciu o co najmniej dwie cząsteczki genomowe wirusa RNA lub retrowirusa. Zgodnie z powszechnie akceptowanym, jednak nadal hipotetycznym mechanizmem wybiórczego kopiowania (ang.-copy choice), rekombinacja RNA zachodzi podczas syntezy nici potomnej, gdy wirusowy kompleks replikacyjny zmieni cząsteczkęmatrycową. Zależnie od budowy oraz funkcji rekombinujących cząsteczek wyróżniamy dwa podstawowe typy rekombinacji: rekombinacjęhomologiczną i niehomologiczną. W celu stwierdzenia jakie właściwości genomu czy białek wirusowych decydują o aktywności rekombinacyjnej drobnoustroju posłużyliśmy sięniezwykle efektywnym systemem eksperymentalnym stworzonym w oparciu o wirusa mozaiki stokłosy (BMV). Umożliwia on obserwacjęi bezpośrednie porównywanie obu typów rekombinacji RNA. Wykazaliśmy, iż w procesie przenoszenia nowosyntetyzowanej nici RNA z jednej cząsteczki matrycowej na drugą uczestniczy wirusowy kompleks replikacyjny. Stwierdziliśmy, że wprowadzając specyficzne mutacje w obrębie wirusowej polimerazy RNA możemy wpływać na częstość homologicznej i niehomologicznej rekombinacji RNA oraz na lokalizację przeskoków homologicznych. Uzyskane wyniki wskazywały równocześnie, iż umiejscowienie przeskoków niehomologicznych zależy głównie od struktury rekombinujących cząsteczek. Badając ten problem potwierdziliśmy wcześniejsze obserwacje, iż lokalna hybrydyzacja pomiędzy cząsteczkami genomowymi BMV wyraźnie wspiera niehomologiczną rekombinacjęrna. Stwierdziliśmy jednak, że wbrew uprzednim oczekiwaniom, efektywność badanego procesu nie zależy od długości lokalnych dupleksów RNA lecz od struktury pierwszo- i drugorzędowej oddziałujących cząsteczek. P03-04 SELEKCJA IN VITRO CZĄSTECZEK RNA WIĄŻĄCYCH JONY Co 2+ Jan Wrzesiński, Michał Brzustowski, Jerzy Ciesiołka Cząsteczki RNA pełnią wiele ważnych funkcji w komórce, przy czym i chcharakterystyczną cechą jest różnorodna struktura trzeciorzędowa niezbędna dla wlaściwego rozpoznawania przez inne cząsteczki kwasów nukleinowych i białek. Decydującą rolęw zapewnieniu funkcjonalnej struktury RNA odgrywają jony metali. Miejsca ich specyficznego wiązania w strukturze RNA wystepują w postaci charakterystycznych motywów strukturalnych. Znane są przede wszystkim motywy RNA wiążące jony Mg(II), chociaż wiele innych jonów metali może te jony w funkcjonowaniu RNA zastępować. W szczególności, w reakcjach katalizy RNA aktywne są również jony: Mn(II), Ca(II) oraz Co(II). Struktura motywów RNA wiążących jony Co(II)nie została jak dotąd poznana. W komunikacie przedstawiono wyniki badań mających na celu zdefiniowanie motywów RNA wiążących specyficznie jony Co(II) z wykorzystaniem metody selekcji RNA in vitro. Skonstruowano bibliotekękombinatoryczną RNA zawierającą cząsteczek i poddano ją selekcji wedlug kryterium wiązania do jonow Co(II) unieruchomionych na złożu. Eksperyment prowadzono według procedury podobnej do opisanej wcześniej dla cząsteczek RNA wiążących jony Zn(II) [A: , Ciesiołka J., Yarus M., (1996) RNA] oraz jony Ni(II) [B: (2) Hofmann, H-S., (1997) RNA, 3: ]. Po 15 cyklach selekcji-amplifikacji otrzymano bibliotekękombinatoryczną RNA wzbogaconą w cząsteczki wiążące specyficznie jony Co(II). Po klonowaniu otrzymanej biblioteki i zsekwencjonowaniu szeregu wyselekcjonowanych wariantów, przeprowadzona zostanie analiza porównawcza ze znanymi motywami RNA, które wiążą specyficznie inne jony metali.

4 54 SESJA 3 PLAKATY P03-05 REAKCJA AUTOKATALITYCZNEGO PRZECINANIA SIĘ RYBOZYMU DELTA TYPU ANTYGENOMOWEGO Michał Łęgiewicz, Jan Wrzesiński, Bartosz Brzezicha, Barbara Smólska, Jerzy Ciesiołka Rybozymy delta są fragmentami sekwencji wirusa zapalenia wątroby typu D (HDV). Jest to jak do tej pory jedyny znany wirus zwierzęcy, którego zarówno genomowa nić RNA jak i powstająca podczas replikacji nić antygenomowa zawiera sekwencje nukleotydowe wykazujące wlaściwości rybozymalne. W przedstawionym komunikacie skoncentrowaliśmy sięna rybozymie delta typu antygenomowego, badając kinetykęprzebiegu reakcji w zależności od zastosowanego wariantu rybozymu, rodzaju jonów metali dwuwartościowych i ich stężenia wymaganego w reakcji katalizy. Stwierdziliśmy, że zarówno dwa badane warianty rybozymu w układzie cis jak i rybozym w układzie trans wykazują wysoka aktywność w obecności jonów Mg(II), Mn(II) i Ca(II), jednak rybozymy w układzie cis są znacznie bardziej aktywne. Ponadto, rybozym w układzie trans jest również aktywny w obecności jonów Co(II) i Sr(II). Rybozymy są natomiast nieaktywne w obecnosci kompleksu Co(NH 3 ) 6 (III), co sugeruje bezpośrednią koordynacjęjonu metalu do RNA istotną dla ich aktywności katalitycznej. Ponieważ wirus HDV w regionach rybozymalnych nie wykazuje naturalnej zmienności, postanowiliśmy wykorzystać metodęselekcji RNA in vitro do otrzymania wariantów sekwencyjnych rybozymu delta typu antygenomowego. Wyjściowa biblioteka kombinatoryczna RNA, licząca wariantów, poddawana jest selekcji z wykorzystaniem złoża wiążącego kowalencyjnie cząsteczki RNA, z którego w wyniku reakcji katalizy uwalniane są warianty aktywne. Wyselekcjonowane warianty posłużą do analizy typu filogenetycznego określającej zakres zmienności krytyczny dla zachowania aktywności katalitycznej rybozymu i ułatwią identyfikacjępotencjalnych oddziaływań trzeciorzędowych na podstawie mutacji zsynchronizowanych. P03-06 ANALIZA STRUKTURALNA REGIONU NIEKODUJĄCEGO 3 (3 UTR) WIRUSA HCV Mariola Dutkiewicz, Jerzy Ciesiołka Według raportu WHO-Światowej Organizacji Zdrowia około 3% populacji światowej zakażone jest wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV). Wysoka zmienność wirusa utrudnia pracęnad szczepionką, a leczenie interferonem nie jest skuteczne. Zainteresowania badaczy skierowane są na najbardziej konserwatywne odcinki wirusowego RNA, kórych zablokowanie lub odcięcie mogłoby spowodować zatrzymanie procesów życiowych wirusa. Najbardziej zachowawczym regionem genomu HCV jest tzw. region X, końcowy odcinek dłuższego fragmentu sekwencji z końca 3, nie ulegającego translacji (3 UTR). Wykazano, że pełni on ważną funkcjęw procesie replikacji wirusa. Zsyntetyzowaliśmy oligomer RNA o sekwencji odpowiadającej regionowi X oraz oligomer o sekwencji komplementarnej, który jest fragmentem nici minus wirusowego RNA powstającej podczas jego replikacji. Oligomery otrzymane zostały metodą transkrypcji RNA in vitro w systemie T7 RNA polimerazy. Badano ich strukturę stosując specyficzne cięcie rybonukleazami T1 i S1 oraz cięcie jonami Pb(II) Na podstawie otrzymanych wyników zaproponowano modyfikacje modelu struktury drugorzędowej regionu X. Przeprowadzono także mapowanie miejsc dostępnych do hybrydyzacji z wykorzystaniem bibliotek kombinatorycznych oligodeoksynukleotydów i RNazy H [Wrzesinski i wsp. (2000) Nucleic Acids Res., 28, ]. Wyniki uzyskane tą metodą mogą posłóżyć do zaprojektowania oligomerów DNA typu antysens oraz do konstrukcji rybozymów wymierzonych przeciwko wirusowi HCV. W toku są prace nad syntezą i analizą strukturalną dłuższych oligomerów RNA obejmujących cały region 3 UTR wirusowego RNA.

5 STRUKTURA I FUNKCJE RNA 55 P03-07 MUTATIONAL ANALYSIS OF POTATO LEAFROLL VIRUS GENOME Ewa Sadowy A, Anna Wisniewska A, Bruno Gronenborn B, Danuta Hulanicka A A: IBB PAN, Warszawa B: ISV CNRS, France Potato leafroll virus (PLRV) belongs to the genus poleroviruses and family Luteoviridae of plant viruses. Its monopartite 6kb RNA genome contains six major open reading frames (ORFs). The ORF0 product of unknown function shows no homology to known proteins. Sequence motifs, characteristic for serine proteinases and viral replicases have been identified in the ORF1 and ORF2 products, respectively. Infectious clones play an important role in a molecular research of viruses. Therefore, the infectious clone of PLRV has been constructed. The full-length PLRV cdna was cloned under the control of the 35S transcription promoter of cauliflower mosaic virus in the binary T-DNA vector Bin19 of Agrobacterium tumefaciens. As determined by Northern hybridisation and immunoblotting, transcripts resulting form an expression of the clone in leaf discs were able to replicate and to direct the synthesis of viral proteins. Subsequently, site-directed mutagenesis was used to introduce the following mutations into the full-length PLRV cdna: (1) mutations that selectively prevent ORF0 translation; (2) mutations of the codons of amino acids constituting the putative catalytic triad of serine proteinase in the ORF1 product; (3) mutation in codons of the replicase GDD motif in ORF2. All these mutated clones were unable to replicate in plant cells. These data indicate the involvement of the ORF0, ORF1, and ORF2 products in PLRV replication. P03-08 WYMOGI STRUKTURALNE CZĄSTECZKI LUDZKIEGO pre-trna LEU (CAA) ZAWIERAJĄCEGO INTRON W KONTEKŚCIE PODATNOŚCI NA METYLACJĘ PIERWSZEJ POZYCJI ANTYKODONU (C 34 ) PRZEZ m 5 C 34 METYLAZĘ Urszula Karwowska, Danuta Dera-Komin, Zofia Szweykowska-Kulińska Zakład Ekspresji Genów, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu Wyizolowano 3 ludzkie geny leucynowego trna posiadające antykodon CAA. Dwa z nich zawierają intron długości 22 nukleotydów, a trzeci ma intron długości 23 nukleotydów. Każdy z nich można ułożyć w strukturę drugorzędową podobną do opisanych wcześniej pięciu innych ludzkich genów leucynowego trna CAA, a także genów drożdżowego trna Leu CAA. We wszystkich wypadkach w obrębie przedłużonego ramienia antykodonowego występują dwa ramiona co sugeruje, że pełnią one istotną rolę w rozpoznawaniu przez metylazępre-trna leu. Ustalono, że obecność intronu jest konieczna dla metylacji cytozyny C 34 w pierwszej pozycji antykodonu pre-trna Leu, która z kolei jest niezbędna do prawidłowego procesu dekodowania mrna. W celu scharakteryzowania wymogów substratowych dla zależnej od intronu m 5 C 34 metylazy jeden z wyizolowanych genów poddano ukierunkowanej mutagenezie konstruując szereg mutantów pozwalających na analizę zależności metylacji od struktury przedłużonego ramienia antykodonowego. Stwierdzono, że podobnie jak w przypadku drożdżowego pre-trna Leu zmiana struktury intronu zaburza proces modyfikacji. Usunięcie jednego lub drugiego ramienia struktury drugorzędowej intronu uniemożliwia utworzenie m 5 C 34. Zmiana niektórych nukleotydów w sąsiedztwie C 34 również prowadzi do zahamowania procesu metylacji. Wyniki naszych badań wykazują, że metylaza rozpoznaje dwie cechy cząsteczki leucynowgo pre-trna CAA : strukturędrugorzędową przedłużonego ramienia i sekwencję nukleotydową w pobliżu podlegającego modyfikacji nukleotydu. P03-09 KINETYKA HYDROLIZY ALKALICZNEJ PIERŚCIENIA IMIDAZOLOWEGO DINUKLEOTYDOWYCH ANALOGÓW 5 -KOŃCA mrna Alicja Stachelska A, Zbigniew Wieczorek A, Edward Darżynkiewicz B A: Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie, Katedra Fizyki i Biofizyki, Olsztyn B: Uniwersytet Warszawski, Zakład Biofizyki, Warszawa Eukariotyczne mrna posiada specyficzną strukturęna 5 -końcu zwaną cap (7-metylo-G(5 )ppp(5 )N). 5 -koniec mrna jest niezbędny w procesie inicjacji translacji, obecność cap utrudnia również nukleolityczną degradację

6 56 SESJA 3 PLAKATY mrna i wpływa na efektywność składania mrna. Celem prowadzonych badań było określenie kinetyki alkalicznego rozpadu pierścienia imidazolowego dinukleotydowych pochodnych cap. Badania prowadzono przy użyciu metod spektroskopowych. Pomiary zmian absorbancji w czasie były wykonywane w stałej temperaturze 298K, w środowisku o ph 11,7 i 12. Zauważono, że wzrost ph przyspiesza rozpad pierścienia imidazolowego. Obecność grup fosforanowych, jak również drugiego nukleotydu powoduje znaczne obniżenie szybkości reakcji w stosunku do 7-metyloguanozyny. Pierwotne sugestie [Darżynkiewicz, E., Labadi, I., Haber, D., Burger, K., Lönnberg, H., Acta Chem. Scand. B 42 (1988) 86.] wyjaśniające spowolnienie reakcji w przypadku dinukleotydowych analogów w stosunku do mononukletydowych występowaniem oddziaływania warstwowego nie znalazły pełnego potwierdzenia w uzyskanych wynikach. Szybkości reakcji dla dinukleotydów purynowych były tylko nieznacznie mniejsze niż w przypadku dinukletydów, w których drugim nukleotydem był nukleotyd pirymidynowy, mimo że różnice w stałych oddziaływania warstwowego są bardzo wyraźne [Wieczorek, Z., Zdanowski, K., Chlebicka, L., Stępiński, J., Jankowska, M., Kierdaszuk, B., Temeriusz, A., Darżynkiewicz, E., Stolarski, R., BBA 1354 (1997) ]. Badania wspierane przez KBN 6 P04A oraz BS P03-10 BADANIE SEKWENCJI 3 UTR GENU POLIMERAZY DNA Anna Wilczyńska, Ryszard Konopiński, Janusz A. Siedlecki Centrum Onkologii Instytut, Zakład Biologii Molekularnej, Warszawa U SZCZURA Znane są dwie formy mrna polimerazy DNA u szczura o długości 1,4 kb oraz 4,0 kb różniące sięjedynie długością 3 niekodującego końca transkryptów. Stwierdzono, że powstanie tych dwóch form mrna jest możliwe dzięki alternatywnej poliadenylacji. Analiza komputerowa sekwencji fragmentów 3 UTR wskazuje na możliwość powstawania w tym regionie struktur drugorzędowych, które poprzez oddziaływania z białkami mogłyby brać udział w wyborze miejsca cięcia i poliadenylacji, a także w regulacji post-transkrypcyjnej. Celem pracy jest identyfikacja białek oddziałujących z sekwencjami regulatorowymi 3 UTR transkryptów polimerazy DNA. Wyselekcjonowane sekwencje, jak i całe niekodujące fragmenty mrna zostały sklonowane w plazmidach umożliwiających ich transkrypcję in vitro. Sklonowano w sumie dziewięć sekwencji należących do 3 UTR transkryptów polimerazy DNA. Przeprowadzono reakcje transkrypcji in vitro wszystkich sklonowanych sekwencji ze znakowaniem radioizotopami. Uzyskane w ten sposób RNA inkubowano z ekstraktem białkowym z tkanki szczura i poddawano analizie ruchliwości w żelu akrylamidowym w warunkach neutralnych. Wstępne wyniki badań wskazują na obecność białek lub białka oddziałującego z fragmentami transkryptów. Podział ekstraktu białkowego na frakcje metodą wysalania pozwolił w przypadku jednego z fragmentów RNA na wyróżnienie frakcji, w której znajduje siębiałko lub białka oddziałujące z nim. Jednocześnie prowadzone są badania wykorzystujące system trójhybrydowy do detekcji oddziaływań pomiędzy RNA a białkami in vivo. P03-11 TERMODYNAMICZNE ASPEKTY ASOCJACJI CZYNNIKA TRANSLACYJNEGO eif4e Z ANALOGAMI 5 -KOŃCA ORAZ FRAGMENTAMI eif4g I 4E-BP1 Janusz Stępiński A, Anna Niedźwiecka A, Ryszard Stolarski A, Aleksandra Wysłouch-Cieszyńska B, Marzena Jankowska-Anyszka C, Dorota Haber A, Edward Darżynkiewicz A A: Zakład Biofizyki, Inst. Fizyki Dośw., Uniwersytet Warszawski B: IBB PAN, Warszawa C: Prac. Węglowodanów, Wydział Chemii, Uniwersytet Warszawski Specyficzne wiązanie eukariotycznego czynnika translacyjnego eif4e z 5-końcem mrna (kapem) ma zasadnicze znaczenie w regulacji szybkości procesu translacji. Chemicznie modyfikowane analogi kapu są inhibitorami inicjacji translacji poprzez konkurencyjne w stosunku do mrna wiązanie z eif4e. Dalsze tworzenie siękompleksu inicjacyjnego eif4f, złożonego z eif4e, eif4a i eif4g, jest regulowane przez białka 4E-BP, które współzawodniczą z eif4g o miejsce wiążące na eif4e. Wiązanie sięserii 18 modyfikowanych chemicznie mono- i dinukleotydowych analogów kapu z rekombinacyjnym białkiem mysim eif4e zbadano metodą wygaszania fluorescencji białka. Podobnie zbadano tworzenie siękompleksów dwuskładnikowych eif4e z syntetycznymi peptydami, fragmentami białek eif4gii i 4E-BP1 odpowiedzialnymi za asocjacjęz eif4e. Sprawdzono wpływ warunków środowiska: temperatury, ph, siły jonowej i rodzaju jonów na siłęwiązania kapu z eif4e. Zmierzone wartości równowagowej stałej asocjacji K zależą silnie od struktury analogów kapu. Decydujący wpływ na K ma obecność i ilość grup fosforanowych oraz obecność przynajmniej jednego protonu na grupie aminowej 7-podstawionej guaniny. Z tem-

7 STRUKTURA I FUNKCJE RNA 57 peraturowej zależności stałej asocjacji K uzyskano wartości parametrów termodynamicznych tworzenia kompleksów dwu- i trójskładnikowych, standardowej entalpii DH o i standardowej entropii DS o. Silne oddziaływania eif4e kap wynikają ze stosunkowo wysokiej entalpii DH o, która jest przede wszystkim uwarunkowana siłami elektrostatycznymi między ładunkami w centrum aktywnym białka i w cząsteczce kapu. Badania finansowane przez HF RG-0303/198-M i KBN 6 P04A P03-12 UDZIAŁ STRUKTURY REGIONU 5 UTR W REGULACJI EKSPRESJI GENU BRCA1 Krzysztof Sobczak, Włodzimierz Krzyżosiak Pracownia Genetyki Nowotworów, Mutacje genu BRCA1 związane są z występowaniem dziedzicznej formy nowotworów piersi i jajników. W sporadycznych formach tych nowotworów mutacje somatyczne wykryto w niewielkim odsetku przypadków, jednak niemal zawsze obserwowano znaczne obniżenie poziomu ekspresji genu BRCA1. Nie jest dotąd poznany mechanizm odpowiedzialny za występowanie bardzo niskiego poziomu białka BRCA1 w tkankach nowotworowych. Wykazano, że w zależności od tkanki, w której ulega ekspresji, mrna BRCA1 może mieć dwa różne regiony 5 UTR (transkrypcja rozpoczynać sięmoże od eksonu 1a lub 3-krotnie dłuższego 1b). Na przykład w komórkach jąder stwierdzono obecność obu regionów 5 UTR, z kolei w gruczole sutkowym i komórkach krwi obwodowej tylko krótszego 5 UTRa. W komórkach nowotworów piersi wykazano z kolei obecność obu sekwencji liderowych. Zbadano zatem strukturędrugorzędową alternatywnych regionów 5 UTR, stosując ograniczoną hydrolizęrna w roztworze wodnym z wykorzystaniem czterech enzymatycznych sond strukturalnych oraz jonów ołowiu. Na tej podstawie określono strukturędrugorzędową tych cząsteczek RNA w warunkach in vitro, a następnie wykazano, że w warunkach ekstraktu komórkowego struktury te nie ulegają zmianie. Uzyskany wynik eksperymentalny pozwala przypuszczać, że mrna zawierający sekwencję odpowiadającą eksonowi 1b, ze względu na występowanie w 5 UTRb stabilnych struktur drugorzędowych oraz krótkich otwartych ramek odczytu, podlega mniej efektywnie procesowi translacji niż mrna zawierający 5 UTRa. Zatem za obniżenie poziomu białka BRCA1, obserwowane w sporadycznych nowotworach piersi i jajników, odpowiedzialne może być rozregulowanie procesu transkrypcji genu BRCA1, prowadzące do zwiększenia puli mrna o niskiej zdolności translacyjnej. P03-13 INTRON ATAC W GENIE CBP20 Z ARABIDOPSIS THALIANA BADANIA SPLICINGU Dominika Lewandowska A, Craig Simpson B, John Brown B, Artur Jarmołowski A A: Zakład Ekspresji Genów, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu B: Scottish Crop Research Institute, Genetics Division, Scotland Introny typu ATAC występują w genomach wielu organizmów: od roślin wyższych aż do ssaków. Obecności ich nie stwierdzono jedynie w genomach Saccharomyces cerevisiae oraz Caenorhabditis elegans. Introny ATAC stanowią zaledwie 0,1% wszystkich intronów, jednak ich umiejscowienie wewnątrz odpowiadających sobie genów różnych gatunków jest silnie konserwatywne. Na tej podstawie przypuszcza się, że splicing intronów tej klasy może być ważnym etapem kontroli ekspresji genów. Główna sekwencja intronów klasy ATAC rozpoczyna sięod dinukleotydu AU, kończy sięnatomiast na AC. Różnią sięone także od intronów klasycznych obecnością odmiennych motywów strukturalnych tworzących sygnały splicingowe. W wycinaniu intronów tej klasy udział bierze alternatywny spliceosom, tzw. typu U12. Podobnie jak klasyczny spliceosom składa sięon z pięciu rodzajów snrna, z których jedynie U5 snrna jest wspólny dla obydwu rodzajów spliceosomów. Gen CBP20 z Arabidopsis thaliana zawiera 8 eksonów i 7 intronów. Intron 4 ma długość 136 pz i należy do klasy intronów ATAC. Na podstawie sekwencji kodującej genu CBP20 zaprojektowano specyficzne primery, które posłużyły do izolacji odpowiednich jego fragmentów z wykorzystaniem techniki PCR. Jako matrycęstosowano DNA z A. thaliana. Stosując kombinacje primerów otrzymano następujące produkty: fragment zawierający intron ATAC wraz z otaczającymi sekwencjami eksonowymi, trzy różne fragmenty dwuintronowe oraz jeden fragment obejmujący sekwencję genu CBP20 od eksonu 3 do 5 (trójintronowy). Wszystkie fragmenty zostały wklonowane w wektor ekspresyjny pdh515, w miejscu BamHI. Wektor ten zawiera promotor i terminator 35S. Uzyskane w ten sposób konstrukty będą wprowadzane do protoplastów tytoniu metodą transfekcji. Aby określić wydajność splicingu intronu ATAC oraz wpływ sąsiadujących sekwencji na jego wycinanie, izolowany z komórek tytoniu RNA analizowany będzie metodą RT-PCR. Dotychczas przeanalizowano w ten sposób jedynie pierwszy konstrukt zawierający intron ATAC wraz z sekwencjami eksonu 4 i 5. Uzyskane wyniki wyraźnie wskazują, że intron ATAC ulega wycinaniu zaledwie

8 58 SESJA 3 PLAKATY w 7%. Jednak wydajność splicingu tego intronu w A. thaliana jest wysoka, co sugeruje, że wpływa na nią obecność sąsiadujących sekwencji intronowych genu. Przeanalizowanie pozostałych konstruktów pozwoli na potwierdzenie tej hipotezy. P03-14 CHARAKTERYSTYKA KOMPLEKSU JĄDROWYCH BIAŁEK ARABIDOPSIS THALIANA WIĄŻĄCYCH SIĘ Z m 7 G NA KOŃCU 5 RNA Maciej Kmieciak, Artur Jarmołowski Zakład Ekspresji Genów, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu, Poznań Cząsteczki RNA transkrybowane przez polimerazęrna II posiadają specyficznie zmodyfikowany koniec 5 zwany kapem (zmetylowana w pozycji N7 reszta guanozyny połączona z pierwszym nukleotydem cząsteczki RNA wiązaniem 5-5 trijfosforanowym). 7-metyloguanozyna chroni RNA przed degradacją przez nukleazy. Kap wpływa na splicing pierwszego intronu w pre-mrna, wpływa na transport transkryptów z jądra komórkowego do cytoplazmy. Struktura kapu odgrywa również ważną rolęw inicjacji translacji. Zaobserwowano także wpływ m 7 G na reakcjępoliadenylacji. Kap rozpoznawany jest przez specyficzne białka. Nazywamy je białkami wiążącymi sięz kapem CBP (ang. cap binding protein). Białka takie zidentyfikowano zarówno w jądrze komórkowym jak i w cytoplazmie. W komórkach HeLa zidentyfikowano kilka jądrowych białek CBP, dwa z nich wyizolowano i dokładnie zbadano: CBP20 (o masie 20 kda) i CBP80 (o masie 80 kda). Za jądrowe funkcje kapu odpowiedzialny jest heterodimer CBP20/CBP80. Wykorzystując technikęrace sklonowano, a następnie zsekwencjonowano cdna CBP20 (AF140219) i CBP80 (AF268377) z A.thaliana. Szacowana masa AtCBP20 wynosi 29,6 kda (257 aminokwasów), a AtCBP80 96,5 kda (848 aminokwasów). W porównaniu z ludzkim CBP20, AtCBP20 posiada dłuższy C koniec bogaty w reszty glicynowe i argininowe. Białko to najprawdopodobniej nie posiada na N końcu charakterystycznego dla białek CBP80 sygnału lokalizacji jądrowej NLS. Analiza typu Southern blot wykazała, że w genomie jądrowym A.thaliana jest tylko po jednej kopii genów AtCBP20 i AtCBP80. Scharakteryzowano również strukturęobydwu genów. Gen AtCBP20 znajduje sięna chromosomie V i zawiera 8 eksonów i 7 intronów. Intron czwarty tego genu należy do rodziny tzw. intronów AT-AC. Gen AtCBP80 znajduje sięna chromosomie II i zawiera 18 eksonów i 17 intronów.