(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) T3 (1) Int. Cl. C07K14/41 C12N1/82 (06.01) (06.01) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej Europejski Biuletyn Patentowy /13 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Samoistnie aktywujące się białko odporności (30) Pierwszeństwo: DE (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 08/09 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 29.. Wiadomości Urzędu Patentowego / (73) Uprawniony z patentu: KWS Saat AG, Einbeck, DE PL/EP T3 (72) Twórca (y) wynalazku: STAHL Dietmar Jürgen, Einbeck, DE (74) Pełnomocnik: Przedsiębiorstwo Rzeczników Patentowych Patpol Sp. z o.o. rzecz. pat. Tagowska Magdalena Warszawa 130 skr. poczt. 37 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy samoistnie aktywującego się białka odporności do wywoływania odporności roślin na patogeny, sposobu wytwarzania rośliny transgenicznej jak również roślin transgenicznych. [0002] Choroby roślin, wywoływane przez grzyby, wirusy, nicienie i bakterie, powodują ogromne straty w plonach na całym świecie, mają negatywny wpływ na jakość produktów rolnych i sprawiają, że konieczne staje się stosowanie chemicznych środków ochrony roślin, jako że naturalna odporność roślin, dzięki której mogą one odeprzeć większość patogenów lub ograniczyć, czy opóźnić ich rozprzestrzenianie, często okazuje się niewystarczająca. W zakres mechanizmów odpornościowych roślin wchodzą reakcje nadwrażliwości, programowana śmierć komórek tkanki roślinnej zainfekowanych wirusami, wzmocnienie roślinnej ściany komórkowej poprzez drewnienie i odkładanie kalozy oraz wytwarzanie fitoaleksyn i białek towarzyszących patogenezie (PR ang. pathogenesis-related). Kluczowymi cząsteczkami w aktywacji indukowanej odporności są roślinne geny odporności (geny R). Zgodnie z hipotezą gen na gen, białko genu R wchodzi w interakcję z odpowiadającym mu białkiem awirulencji mikroorganizmu (produkt genu Avr) i wyzwala w ten sposób indukowaną reakcję obronną. [0003] Większość genów R można przypisać do jednej z pięciu klas, odpowiadających kodowanym przez nie białkom R (Martin et al, 03). Klasa 1 zawiera tylko gen Pto pomidora, kodujący kinazę serynową/treoninową. Większość roślinnych genów R należy do nadrodziny genów NBS-LRR, kodujących miejsce wiążące nukleotydy (ang. nucleotide binding site NBS) i powtórzenia bogate w leucynę (ang. leucine rich repeat LRR). Geny NBS-LRR, kodujące białka z domeną CC (ang. coiled coil) na N-końcu, np. z suwakiem leucynowym, przypisano do klasy 2 genów CC-NBS-LRR. Geny R typu CC-NBS-LRR odnajdywano we wszystkich roślinach okrytonasiennych. Do klasy 3 przypisano geny R typu TIR-NBS-LRR, kodujące białka, u których na N-końcu występuje zamiast domeny CC, sekwencja analogiczna do zwierzęcego regionu TIR (ang. toll-interleukin-1-receptor). Geny TIR-NBS-LRR stanowią wprawdzie 7% genów R u Arabidopsis thaliana, natomiast nie zostały stwierdzone w trawach ani burakach cukrowych (Tian et al., 04). [0004] Geny Cf pomidora stanowią klasę 4 genów R. Białka Cf nie zawierają domeny NBS, lecz domenę transbłonową (TM) i zewnątrzkomórkową domenę LRR. Do klasy przypisano białko Xa21 ryżu, składające się z zewnątrzkomórkowej domeny LRR, domeny transbłonowej i wewnątrzkomórkowej domeny spełniającej funkcję kinazy. [000] Geny R ulegają słabej ekspresji przy promotorach genów R. Znaczna, konstytutywna ekspresja genów R z klas 1, 2 i 3 prowadzi do samoistnej aktywacji białek R nawet przy nieobecności odpowiadających im produktów genów awirulencji, a tym samym aktywacji reakcji odpornościowych roślin na patogeny (Tang et al., 1999; Oldroyd and Staskawicz, 1998; Bendahmane et al., 02). [0006] Konstytutywna nadekspresja genów R w roślinach transgenicznych jest jednak przeważnie wiązana z niepożądanymi w rolnictwie cechami, takimi jak mikromartwica (Tang et al., 1999) lub zahamowanie wzrostu u roślin (Frost et al., 04). [0007] Inną możliwością uzyskania samoistnej aktywacji białek R klasy 2 i 3 jest mutacja konkretnych, konserwatywnych motywów aminokwasowych pełnych białek CC-NBS-LRR, względnie TIR-NBS-LRR. Mutacja sekwencji domen NBS lub LRR genu Rx ziemniaka (Bendahmane et al., 02) i domeny NBS genu L6 lnu (Howles et al., 0) prowadzi do powstania mutantów, w których po przejściowej ekspresji tych genów uruchamia się programowana śmierć komórek przy nieobecności odpowiedniego genu awirulencji. 1

3 [0008] Eksperymenty z delecją genu Rx pokazały, że produkty genu z delecją składające się z domeny CC i części domeny NBS mogą po przejściowej nadekspresji nadal wywoływać programowaną śmierć komórek i następuje ona szybciej niż przy stosowaniu produktów kompletnych genów R. Produkty genów z delecją wymagały oprócz domeny CC również pętli P, kinazy 2 i pełnej kinazy 3a z domeny NBS. Natomiast dalsze skracanie domeny NBS prowadziło do opóźnienia wyzwalania reakcji nadwrażliwości (HR) w porównaniu z produktem kompletnego genu R (Bendahmane et al. 02). [0009] Osiągnięcie samoistnej aktywacji genu L lnu z klasy 3 genów R było możliwe poprzez skonstruowanie skróconego białka TIR-NBS-LRR, składającego się z domeny TIR i 34 aminokwasów sąsiadującej domeny NBS, łącznie z pętlą P (Frost et al., 04). [00] Mimo że znane są liczne metody uzyskiwania samoistnej aktywacji genów R, nie opisano dotychczas żadnej rośliny transgenicznej, u której samoistna aktywacja białka R prowadziłaby do podwyższenia odporności na grzyby, nie zaburzając jednocześnie pożądanych w rolnictwie właściwości. Próby stabilnej transformacji lnu dwoma kompletnymi wariantami genu L6, ulegającymi samoistnej aktywacji, pod naturalnym promotorem genu odporności L6 lub promotorem indukowanym obecnością grzybów, prowadziły do wyhodowania roślin o prawidłowym wzroście lecz podatnych na grzybice lub odpornych na grzybice roślin o zaniżonym wzroście (Howles et al., 0). [0011] Zadaniem niniejszego wynalazku jest zmiana zdolności obronnych rośliny przed patogenami tak, aby reakcje obronne rośliny na infekcje patogenów były niezawodnie aktywowane, bez jednoczesnej utraty cech pożądanych w rolnictwie. [0012] Zgodnie z wynalazkiem udało się to zadanie zrealizować konstruując samoistnie aktywujące się białko odporności kodowane przez sekwencję zawierającą ograniczoną część genu odporności NBS-LRR, rozciągającą się od końca sekwencji kodującej genu odporności NBS-LRR w dół do początku domeny NBS genu odporności NBS-LRR i niezawierającą pętli P, przy czym gen odporności NBS-LRR nie jest genem odporności TIR-NBS-LRR. [0013] Ograniczona część genu odporności NBS-LRR rozpoczyna się kodonem startu translacji (kodon ATG) i sięga do domeny NBS, która odznacza się główne obecnością pętli P (motyw kinazy 1a). Dla funkcjonalności tej części genu odporności NBS-LRR konieczna jest nieobecność pętli P. Inne fragmenty domen NBS i LRR genu odporności NBS-LRR również nie powinny być obecne. Pojedyncze nukleotydy domeny NBS, w tym pętli P, mogą być wprawdzie obecne, ale tylko jeśli nie mają wpływu na wyzwalanie HR. [0014] Białko odpornościowe samoistnie aktywujące się definiuje się jako białko, które w nieobecności odpowiednich produktów genów awirulencji aktywuje reakcję odpornościową roślin na patogeny. W związku z tym wynalazek ma taką zaletę, że w celu wytworzenia odporności na patogeny nie jest konieczna interakcja białka odpornościowego z białkiem awirulencji, przez co reakcja obronna rośliny staje się znacznie bardziej bezpośrednia i przebiega w sposób bardziej niezawodny. [001] Samoistna aktywacja może, na przykład, przebiegać poprzez przejściową nadekspresję białka odpornościowego. Nadekspresja jest definiowana jako zwiększenie intensywności ekspresji względem naturalnego promotora genu R, przy którym kaskada transdukcji sygnału zależna od białka R zostaje uruchomiona pod nieobecność odpowiedniego produktu genu awirulencji mikroorganizmu. W ten sposób uaktywniona zostaje odporność rośliny na patogeny, co przekłada się na częściową lub całkowitą odporność roślin na choroby. 2

4 [0016] Samoistna aktywacja białka odporności może zostać również osiągnięta poprzez skrócenie kompletnych genów R BvKWS3_16, BvKWS3_13, Bv13033 i Bv169 buraka cukrowego oraz genu StR3a ziemniaka do obszaru końca, tak aby kodowany był N-koniec białka wolny od domen NBS i LRR, zawierający ewentualnie domenę CC. Dla celów niniejszego wynalazku, N-koniec definiowany jest jako wolny od domeny NBS, jeśli sekwencja kodująca białko odporności NBS-LRR nie rozciąga się od końca w stronę końca 3 na tyle daleko, żeby zawierać w swojej strukturze sekwencję pętli P białka odporności NBS- LRR. W prostym przypadku, pętla P jest całkowicie wycięta. Pojedyncze nukleotydy pętli P mogą być wprawdzie obecne w skróconym genie odporności, ale tylko jeśli nie opóźniają wyzwalania HR. Przy skracaniu białka odporności NBS-LRR, przy N-końcu powinny zostać również usunięte motywy kinazy 2, kinazy 3, GLPC i MHD wraz z sąsiadującymi aminokwasami, zgodnie z danymi z banku danych Prosite (Bairoch et al., 1996) i Pfam (Sonnhammer et al., 1997), jak również definicjami motywów, podanymi przez Bendahmane et al. (02). [0017] Zastosowanie skróconych genów R 16_#176, 13_#147, 13033_#19 i Bv169, jak również StR3a-#1-1, prowadzi do przyspieszonego w porównaniu z genem pełnej długości wyzwalania programowanej śmierci komórki w reakcjach odporności roślin. Połączenie z promotorem indukowalnym obecnością patogenu umożliwia wytworzenie lepszej, indukowanej obrony roślin przed patogenami. Odnosi się to również do białek R, które poprzez znane mutacje w domenie MHD lub VHD nie ulegają samodzielnej aktywacji, jak pokazuje ekspresja genów 13_#147 i BvKWS3_13-D480V. [0018] Jako że skrócone geny R, w porównaniu z genami o pełnej długości, umożliwiają wyraźnie szybsze rozpoczęcie procesu programowanej śmierci komórek, niższy poziom ekspresji skróconych genów wystarcza, żeby osiągnąć w procesach obrony przed patogenami progowe stężenie białka, wyzwalające pożądaną reakcję, co wykazano na przykładzie genu R 13_#147. [0019] Motywy pętli P lub kinazy 1a, wraz z motywami kinazy 2 i kinazy 3, są charakterystyczne dla białek hydrolizujących ATP lub GTP (Traut, 1994) i znajdują się w domenach NBS genów NBS-LRR. Pętla P cechuje obszar N-końca domeny NBS (Bendahmane et al., 02). Sekwencja zgodności (konsensusowa) pętli P genów R Prf, Rx, Rpm1, BvKWS3_13, BvKWS3_133 i BvKWS3_16 jest następująca: (I/V)VG(M/I)GG(L/I/S)GKTT(L/V). [00] Co zaskakujące, okazuje się, że szczególnie skuteczna samoistna aktywacja jest możliwa do osiągnięcia przy kwasach nukleinowych kodujących sekwencje aminokwasowe z motywem DAE. W szczególności dotyczy to nukleotydów kodujących sekwencję motywu AVLXDAE. Sekwencje motywów DAE i AVLXDAE znajdują się np. w SEK NR ID: 13 i 1. [0021] Korzystne sekwencje nukleotydowe należą do jednej z wymienionych poniżej grup: a) sekwencja nukleotydowa według SEK NR ID: 1 lub sekwencja nukleotydowa komplementarna do sekwencji nukleotydowej według SEK NR ID: 1 lub sekwencja nukleotydowa, która hybrydyzuje z sekwencją nukleotydową według SEK NR ID: 1 lub sekwencją nukleotydową komplementarną do sekwencji nukleotydowej według SEK NR ID: 1; b) sekwencja nukleotydowa według SEK NR ID: 2 lub sekwencja nukleotydowa komplementarna do sekwencji nukleotydowej według SEK NR ID: 2 lub sekwencja nukleotydowa, która hybrydyzuje z sekwencją nukleotydową według SEK NR ID: 2 lub sekwencją nukleotydową komplementarną do sekwencji nukleotydowej według SEK NR ID: 2; 3

5 c) sekwencja nukleotydowa według SEK NR ID: 3 lub sekwencja nukleotydowa komplementarna do sekwencji nukleotydowej według SEK NR ID: 3 lub sekwencja nukleotydowa, która hybrydyzuje z sekwencją nukleotydową według SEK NR ID: 3 lub sekwencją nukleotydową komplementarną do sekwencji nukleotydowej według SEK NR ID: 3; d) sekwencja nukleotydowa według SEK NR ID: 4 lub sekwencja nukleotydowa komplementarna do sekwencji nukleotydowej według SEK NR ID: 4 lub sekwencja nukleotydowa, która hybrydyzuje z sekwencją nukleotydową według SEK NR ID: 4 lub sekwencją nukleotydową komplementarną do sekwencji nukleotydowej według SEK NR ID: 4; e) sekwencja nukleotydowa według SEK NR ID: 16 lub sekwencja nukleotydowa komplementarna do sekwencji nukleotydowej według SEK NR ID: 16 lub sekwencja nukleotydowa, która hybrydyzuje z sekwencją nukleotydową według SEK NR ID: 16 lub sekwencją nukleotydową komplementarną do sekwencji nukleotydowej według SEK NR ID: 16. [0022] Skrócona część genu odporności NBS-LRR rozciąga się w przypadku korzystnych sekwencji nukleotydowych, jak wyszczególniono poniżej: SEK NR ID: 1 od poz SEK NR ID: 2 od poz SEK NR ID: 3 od poz SEK NR ID: 4 od poz [0023] Użyty tutaj termin hybrydyzować oznacza zdolność do hybrydyzacji w zwykle stosowanych warunkach, jak opisano przez Sambrook et al. (1989), najlepiej w warunkach ostrych. Ostre warunki hybrydyzacji to na przykład: hybrydyzacja w 4 x SSC przy 6 C i kilkakrotne płukanie w 0,1 x SSC przy 6 C przez łącznie ok. 1 godzinę. Mniej ostre warunki hybrydyzacji to na przykład: hybrydyzacja w 4 x SSC przy 37 C i kilkakrotne płukanie w 1 x SSC w temperaturze pokojowej przez łącznie ok. 1 godzinę. Ostre warunki hybrydyzacji mogą również oznaczać: hybrydyzację przy 68 C w 0,2 M fosforanu sodu, ph 7, 2, 7 % SDS, 1 mm EDTA i 1 % BSA przez 16 godzin i następnie dwukrotne płukanie w 2 x SSC i 0,1 % SDS przy 68 C. [0024] Korzystnie gen odporności kodujący samoistnie aktywujące się białko odporności pochodzi z buraka cukrowego lub ziemniaka. [002] Dalej korzystnie kwasy nukleinowe kodują sekwencje aminokwasowe z jedną z sekwencji zgodności, o numerach SEK NR ID: 13 do 1. W sekwencjach zgodności można podstawiać pojedyncze aminokwasy innymi, będącymi funkcjonalnie równoważnymi, np. Asp zamiast Glu, Leu zamiast Ile, Ala lub Val, Arg zamiast Lys, Phe zamiast Trp. [0026] Sekwencje zgodności SEK NR ID 13 i 14 stanowią dwa funkcjonalne segmenty. Nie określa się ściśle odstępu pomiędzy nimi. Preferowany odstęp pomiędzy dwoma segmentami jest związany z sekwencją zgodności SEK NR ID: 1, jak również sekwencją zgodności jak na Fig.. [0027] Zaleca się umieszczenie sekwencji nukleotydowej pod promotorem indukowalnym obecnością patogenu. Promotor indukowalny obecnością patogenu aktywuje się w odpowiedzi na zakażenie tkanek rośliny czynnikiem chorobotwórczym, np. grzybem, bakterią, wirusem lub nicieniem. Promotor indukowalny obecnością patogenu jest podczas inwazji patogenów na tkanki roślinne skutecznej lub nie bardziej aktywny niż przy braku zakażenia. 4

6 [0028] Promotory indukowalne obecnością patogenu są dobrze znane specjaliście w dziedzinie. Przykładami promotorów indukowalnych obecnością patogenu są promotor chitynazy (Samac i Shah 1991), promotor glukanazy (Hennig et al., 1993) i promotor prp-1 (Martini et al., 1993). [0029] Poprzez zastosowanie indukowalnej obecnością patogenu nadekspresji genu R, można uniknąć negatywnych skutków ekspresji konstytutywnej, np. obniżonego wzrostu lub zmniejszonych plonów. [0030] Szczególnie dobrze nadają się do stosowania w tym celu promotory syntetyczne. Termin ten odnosi się do skonstruowanych technikami biologii molekularnej promotorów, które nie występują w takiej postaci w naturze. Promotor syntetyczny jest promotorem minimalnym, zawierającym oprócz koniecznych dla funkcji promotora elementów jeden lub kilka wybranych, zdefiniowanych elementów cis. Te elementy cis są miejscami wiązania białek wiążących DNA, np. czynników transkrypcyjnych, i są izolowane z naturalnie występujących promotorów, pochodzą z wyizolowanych elementów cis lub są uzyskane techniką rekombinacji przy przypadkowej orientacji i dobrane z zastosowaniem odpowiednich metod. W porównaniu z promotorem naturalnym, promotor syntetyczny, z racji mniej złożonej budowy, jest aktywowany przez nieliczne czynniki egzo- lub endogenne, co umożliwia bardziej ścisłą kontrolę ekspresji. [0031] Promotor minimalny lub core jest sekwencją nukleotydową, zawierającą miejsce wiązania podstawowych kompleksów czynników transkrypcyjnych i umożliwiającą ścisłą kontrolę inicjacji transkrypcji z użyciem polimerazy II RNA. Motywami charakterystycznymi dla promotorów minimalnych są: kaseta TATA (ang. TATA-Box), miejsce inicjacji transkrypcji (Inr), sekwencja BRE (rozpoznawana przez TFBII) oraz DPE (ang. downstream core promoter element). Elementy te mogą w promotorze minimalnym występować samodzielnie lub w kombinacji. Promotory minimalne lub ich poszczególne sekwencje można otrzymać z rośliny rodzajowej lub genu wirusowego. [0032] W ramach niniejszego wynalazku skonstruowano syntetyczne promotory, które mogą być stosowane do wytwarzania roślin odpornych na patogeny tylko w połączeniu ze znanymi genami odporności, niekoniecznie kodującymi samoistnie uaktywniające się białko odporności. Są to syntetyczne promotory minimalne typu nxs-mxd, nxw2-mxd i nxgst1-mxd, które zawierają jeden lub więcej spośród poniższych kombinacji elementów cis: a) kaseta nxs-mxd b) kaseta nxw2-mxd c) kaseta nxgst1-mxd (przy czym n i m oznaczają liczbę naturalną od 1 do ) [0033] Kaseta S (CAGCCACCAAAGAGGACCCAGAAT) z sekwencją nukleotydową SEK NR ID: 6, kaseta W2 (TTATTCAGCCATCAAAAGTTGACCAATAAT) z sekwencją nukleotydową SEK NR ID: 7, kaseta D (TACAATTCAAACATTGTTCAAACAAGGAACC) z sekwencją nukleotydów SEK NR ID: 8 i kaseta Gst (TTCTAGCCACCAGATTTGACCAAAC) z sekwencją nukleotydową SEK NR ID: 9 zostały opisane przez Rushton et al., 02 łącznie z sekwencjami kluczowymi dla ich funkcji. [0034] Z racji obecności różnych elementów składowych (nxs-mxd, nxw2-mxd lub nxgst1-mxd) promotory różnią się podstawową aktywnością, zdolnością do indukcji przez obecność patogenów, kinetyką aktywności i poziomem ekspresji. Jako przykład można podać promotory z kombinacjami elementów cis: 2xS-2xD z sekwencją nukleotydową SEK NR ID:, 2xW2-2xD z sekwencją nukleotydową SEK NR ID: 11 i 2xGst1-2xD z sekwencją nukleotydową SEK NR ID: 12

7 Cechy syntetycznych promotorów można modyfikować w zależności od zapotrzebowania na ekspresję danego genu poprzez zmianę liczby elementów cis (n, m = 1 ). Porównanie promotora 2xS-2xD z wariantami 2xS-4xD, 4xS-2xD i 4xS-4xD pokazuje, że średnia siła promotora zbudowanego z tetramerów jest wyższa w porównaniu z dimerami. Zdolność do indukcji obecnością patogenu wzrasta od promotorów dimer-dimer (2xS-2xD) poprzez promotory tetramer-dimer i dimer-tetramer (4xS-2xD, 4xS-2xD) do promotorów tetramer-tetramer (4xS-4xD) przy wszystkich mierzonych odstępach czasowych. Wraz ze wzrostem siły promotora i zdolności do indukcji przez obecność patogenu, przy zastosowaniu promotora zawierającego tetramery ma miejsce w opisanych przykładach wzrost aktywności podstawowej. Ten przykład pokazuje, że ważne cechy promotora można regulować liczbą elementów cis i dla danych warunków technicznych można skonstruować i dobrać optymalny wariant promotora. [003] Analogiczne wyniki można też osiągnąć z kombinacjami elementów cis, które stanowią pochodne sekwencji nukleotydowych SEK NR ID:, SEK NR ID: 11 lub SEK NR ID: 12 i mają porównywalne cechy do kombinacji elementów cis SEK NR ID:, SEK NR ID: 11 lub SEK NR ID: 12. [0036] Promotory minimalne 2xS-2xD i 2xW2-2xD mogą być łączone na przykład z czterema pełnej długości genami R BvKWS3_133, BvKWS3_123, BvKWS3_13 oraz BvKWS3_16 i używane do transformacji buraka cukrowego. Test odporności na infekcje grzybicze roślin transgenicznych z zastosowaniem grzybów wywołujących chorobę liści buraka cukrowego, Cercospora beticola, wykazał przy każdym konstrukcie zwiększenie odporności na infekcję, przy czym rośliny transgeniczne nie różniły się wzrostem ani wartością dla rolnictwa od roślin nietransformowanych. Wyniki te wskazują, że zastosowanie promotorów indukowanych obecnością patogenów umożliwia nadekspresję genów R, wyzwalającą kaskadę programowanej śmierci komórki i tym samym podwyższenie odporności roślin na choroby, bez zaburzania wzrostu roślin. Zastosowanie zoptymalizowanych promotorów po wyborze dogodnej liczby powtórzeń elementów cis umożliwia dalszą poprawę odporności roślin na choroby. [0037] Niniejszy wynalazek ponadto dotyczy roślin transgenicznych transformowanych nowym konstruktem kwasu nukleinowego, w szczególności buraków cukrowych, części, nasion lub materiału genetycznego takich roślin, jak również zastosowania konstruktów kwasu nukleinowego do wytwarzania roślin transgenicznych. [0038] Wynalazek będzie bardziej szczegółowo opisany w oparciu o figury i przykłady. [0039] Opisany przykład zastosowania niniejszego wynalazku w buraku cukrowym można bez problemu rozszerzyć na inne rośliny użytkowe, jeśli możliwe jest wyizolowanie ich białek odporności Figury [0040] Fig. 1 przedstawia mapę binarnego wektora per-3sluci, zastosowanego przy wywołaniu przejściowej ekspresji genów R w buraku cukrowym za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens. Wektor niesie gen lucyferazy z Photinus pyralis z jednym intronem. Nie może on ulegać ekspresji w A. tumefaciens. Fig. 2 przedstawia wyzwolenie kaskady programowanej śmierci komórki w buraku cukrowym po przejściowej ekspresji genu R BvKWS3_133 za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens. Podczas przejściowej ekspresji konstruktu per-3sluci dochodzi do silnej ekspresji genu reporterowego w liściach buraka, po czym śmierć komórki wywołana ekspresją konstruktu per133-3sluci sprawia, że nie obserwuje się już aktywności genu reporterowego. 6

8 Fig. 3 przedstawia wektor pcamv-2, zastosowany przy przejściowej transformacji buraka cukrowego metodą biolistyczną. Geny R pełnej długości i skrócone, zgodnie z opisem, umieszczono w tym wektorze pod kontrolą podwójnego promotora 3S. Fig. 4 przedstawia wyzwolenie kaskady programowanej śmierci komórki w buraku cukrowym po przejściowej ekspresji genów R BvKWS3_123, BvKWS3_133 i BvKWS3_16 wskutek transformacji metodą biolistyczną. Geny BvKWS3_123, BvKWS3_133 i BvKWS3_16, umieszczono pod kontrolą podwójnego promotora 3S (d3s) i użyto razem z konstruktem genu reporterowego p70s-luc do kotransformacji. Aktywność genu reporterowego zmierzono godzin po transformacji. Wskutek wyzwolenia reakcji nadwrażliwości, aktywność genu reporterowego jest niższa niż w kontroli (pusty wektor pcamv-2 i p70s-luc). Przedstawiono wartość średnią dla trzech niezależnych badań po 9 powtórzeń na konstrukt. Słupki błędu ukazują błąd standardowy. Fig. przedstawia większą intensywność wyzwalania programowanej śmierci komórki poprzez ekspresję rejonu końca genu R BvKWS3_16 niż wskutek ekspresji pełnego genu R BvKWS3_16. Okolica N- końca genu R i gen R pełnej długości pod kontrolą promotora d3s (p70s-16_#17 i p70s-bvkws3_16) z konstruktem p70s-luc zostały użyte do kotransformacji buraka cukrowego metodą biolistyczną. Przedstawiono wartość średnią dla trzech niezależnych badań po 9-12 powtórzeń na konstrukt. Fig. 6 przedstawia wyzwolenie programowanej śmierci komórki poprzez ekspresję pełnego genu R BvKWS3_13 i porównanie z bardziej intensywnym wyzwoleniem programowanej śmierci komórki wskutek ekspresji okolicy końca 13_#147 genu R BvKWS3_13. Gen R pełnej długości i rejon N-końca 13_#147 genu R pod kontrolą promotora d3s (p70s-bvkws3_13 i p70s-13_#147) z konstruktem p70s-luc zostały użyte do kotransformacji buraka cukrowego metodą biolistyczną. Przedstawiono wartość średnią dla dwóch niezależnych badań po 9-12 powtórzeń na konstrukt. Fig. 7 przedstawia większą intensywność wyzwalania programowanej śmierci komórki poprzez ekspresję okolicy końca 13033_#19 genu R Bv13033 niż wskutek ekspresji pełnego genu R Bv Gen R pełnej długości i okolica N-końca 13033_#19 genu R pod kontrolą promotora d3s (p70s i p70s _#19) z konstruktem p70s-luc zostały użyte do kotransformacji buraka cukrowego metodą biolistyczną. Przedstawiono wartość średnią dla dwóch niezależnych badań po 9-12 powtórzeń na konstrukt. Fig. 8 przedstawia wyzwolenie kaskady programowanej śmierci komórki po ekspresji genu R Bv169. Fig. 9 przedstawia porównanie samoistnej aktywacji białka BvKWS3_13 poprzez skrócenie do okolicy końca klonu cdna 13_#147 i poprzez mutację motywu VHD domeny NBS. Fig. a)-c) przedstawiają porównanie sekwencji aminokwasowych skróconych, samoistnie aktywujących się białek Bv169, Bv13033_#19, BvKWS13_#147, BvKWS3_16_#17 i StR3a-#1-1 pomiędzy sobą i z sekwencjami odniesienia nieaktywujących się samoistnie, skróconych białek z ziemniaka (RX-160) i StR1 (3-40) oraz pełnej długości białek R typu NBS-LRR z Arabidopsis thaliana (AtAB028617), fasoli (PvulgarisJ71), ryżu (OsativaAP003073), soi (GmaxKR4) oraz pomidora (Tomato-I2). Zaznaczono sekwencje wspólne. Fig. 11 przedstawia, że delecja aminokwasów znacznie ogranicza możliwość samoistnej aktywacji białka 16_#17. Fig. 12 przedstawia aktywację syntetycznego promotora 2xS-2xD w transgenicznym buraku cukrowym po infekcji Cercospora beticola. Fig. 13 przedstawia aktywację syntetycznego promotora 2xW2-2xD w transgenicznym buraku cukrowym po infekcji Cercospora beticola. 7

9 Fig. 14 przedstawia porównanie aktywności genu reporterowego pod promotorami 2xS-2xD, 4xS-2xD, 2xS- 4xD i 4xS-4xD w transgenicznym buraku cukrowym po infekcji Cercospora beticola. Fig. 1 i 16 przedstawiają połączenie pełnej długości genów R 123, 133, 13, 16 z syntetycznym promotorem 2xS-2xD. Fig. 17 i 18 przedstawiają połączenie pełnej długości genów R 123, 133, 13, 16 z syntetycznym promotorem 2xW 2-2xD. Fig. 19 przedstawia zwiększenie odporności transgenicznej linii buraka cukrowego PR68-6 na infekcje grzybicze Cercospora beticola w porównaniu z kontrolą nietransformowanym burakiem linii 3DC416. Fig. przedstawia zwiększenie odporności transgenicznej linii buraka cukrowego PR70-32 na infekcje Cercospora beticola w porównaniu z kontrolą nietransformowanym burakiem linii 3DC416. Fig. 21 i 22 przedstawiają połączenie obszarów genów R, 16_#176 i 169, kodujących N-koniec białka, z syntetycznymi promotorami 2xS-2xD i 2xW 2-2xD Przykłady Potwierdzenie wywoływania szybkiej reakcji odpornościowej w buraku cukrowym przez nadekspresję genu BvKWS3_133 [0041] Przejściowa nadekspresja klonów cdna pełnej długości genu BvKWS3_133 w liściach buraka cukrowego z zastosowaniem Agrobacterium tumefaciens wyzwala szybką reakcję zaprogramowanej śmierci komórki bez tworzenia widocznych obszarów martwiczych. Klony cdna BvKWS3_133 łączono z promotorem d3s i wprowadzano do wektora binarnego per-3sluci (Fig. 1). Powstały wektor oznaczono jako per133-3sluci. Wektorami per-3sluci i per133-3sluci transformowano szczep C8C1 Agrobacterium (An 1987). Bakterie wykazujące ekspresję przejściową hodowano w pożywce 0 ml LB z 0 mg/ml spektynomycyny i µm acetosyringonu przez 4- h. Następnie zwirowano bakterie i zawieszono osad w roztworze mm MgCl 2, mm MES, 0 µm acetosyringonu uzyskując gęstość bakterii OD 600 = 0,1. Zawiesinę bakterii odstawiono na 2-3 h i strzykawką 2, ml wstrzyknięto po stronie spodniej do liści - tygodniowego buraka cukrowego. Po inkubacji roślin w 2 C w inkubatorze, w 1, 2 i 3 dniu po inokulacji mierzono aktywność genu reporterowego lucyferazy Photinus pyralis w liściach transfekowanych roślin. Aktywność lucyferazy określono z zastosowaniem zestawu Luciferase Assay System (Promega, Mannheim, Niemcy) w aparacie Sirius Luminometer (Berthold Detection System GmbH, Pforzheim, Niemcy) zgodnie z instrukcją producenta. Dla uzyskania ekstraktu enzymatycznego, odpowiedniego do wykonania pomiarów, przy każdym pomiarze stosowano dwa preparaty-krążki liści buraka. Dla każdego konstruktu wykonywano 8 pomiarów każdego dnia pomiarowego. Próbki liści homogenizowano w moździerzu z dodatkiem piasku morskiego w x objętości buforu PLB (Passive Lysis Buffer). Płynny supernatant zebrano do 1, ml eppendorfek i wirowano przez min w 4 C i 000 g. Zebrano przejrzysty supernatant i stosowano po µl nieprzetworzonego ekstraktu do pomiaru aktywności lucyferazy z Photinus. Liście buraka cukrowego, transformowane konstruktem per-3sluci, wykazywały pierwszego dnia nieznaczną aktywność lucyferazy, a 2. i 3. dnia aktywność o wartości względnie RLU/mg próbki liścia. Liście buraka cukrowego, transformowane konstruktem per133-3sluci, nie wykazywały przy żadnym pomiarze aktywności wyższej, niż w liściach inokulowanych MgCl 2 (Fig. 2). Przejściowa ekspresja klonów cdna genu BvKWS3_133 wyzwoliła więc szybką reakcję zaprogramowanej śmierci komórki w inokulowanych liściach buraka. 8

10 1 Konstytutywna ekspresja genów R BvKWS3_123, BvKWS3_133 i BvKWS3_16 wyzwala kaskadę zaprogramowanej śmierci w liściach buraka cukrowego [0042] Geny R Gen BvKWS3_133 oraz BvKWS3_16 z sekwencją nukleotydową SEK NR ID: oraz gen R BvKWS3_123 łączono z podwójnym promotorem 3S w wektorze pcamv-2 (Fig. 3). Powstałe wektory oznaczano p70s-bvkws3_133, p70s-bvkws3_16 oraz p70s-bvkws3_123. Dla wykazania działania genów R, wywołano ekspresję konstruktów p70s-bvkws3_133, p70s- BvKWS3_16 i p70s-bvkws3_123 wraz z genem reporterowym p70s-luc w liściach buraka cukrowego poprzez transformację metodą biolistyczną zgodnie z Schmidt et al., 04. Jako kontrolę pozytywną zastosowano pusty wektor pcamv-2 w połączeniu z genem reporterowym p70s-luc. Zrezygnowano z zastosowania wektora normalizującego, proponowanego przez Schmidt et al. (04). Aktywność lucyferazy oznaczono z zastosowaniem zestawu Luciferase Assay System (Promega, Mannheim, Niemcy) w h po transformacji. Eksperyment polegający na transformacji powtórzono trzykrotnie, przy czym każdy eksperyment obejmował 9 powtórzeń dla każdego konstruktu. Wartości średnie wyników trzech eksperymentów wykazały, że w porównaniu z aktywnością kontroli pozytywnej (pusty wektor), której wartość przyjęto jako 0% odniesienia, aktywność genu reporterowego przy p70s-bvkws3_133 wyniosła tylko 37,7%, przy p70s-bvkws3_16 tylko 66% i przy p70s- BvKWS3_123 tylko 68,7% (Fig. 4). Silna ekspresja genów R BvKWS3_133, BvKWS3_16 i BvKWS3_123 spod promotora d3s wyzwala w części komórek, które uległy transformacji, tak znaczną reakcję nadwrażliwości, a tym samym programowaną śmierć komórek, że koekspresja genu reporterowego, którym komórki te również zostały transformowane, jest zniesiona. Wykazano w ten sposób, że silna ekspresja trzech genów R prowadzi do reakcji nadwrażliwości i śmierci komórki pod nieobecność odpowiednich produktów genów awirulencji Obszar końca genu BvKWS3_16 wyzwala szybszą reakcję zaprogramowanej śmierci komórki niż klon cdna pełnej długości genu BvKWS3_16 [0043] Wychodząc od pełnej długości klonu cdna genu BvKWS3_16 z sekwencją nukleotydową SEK NR ID: w konstrukcie p70s-bvkws3_16, namnażano koniec genu z zastosowaniem polimerazy Pfu (Stratagene) oraz starterów S316 (ctcgagaattcgagctccaccgcgg) i S318 (ctggatcctcacctccgttcttcatgttgctctacc) i równocześnie wprowadzano kodon Stop w obszar kodujący. Namnażany obszar odpowiada sekwencji nukleotydowej SEK NR ID: 1 i koduje sekwencję aminokwasową 1-17 BvKWS3_16 (Fig. ). Sekwencja ta obejmuje tylko obszar N-końca BvKWS3_16 i nie zawiera domen NBS ani LRR (Fig. ). Produkt PCR-u pocięto restryktazami SacII i BamHI i wklonowano do wektora pcamv-2. Powstały wektor oznaczono jako p70s-16_#17. Sprawdzono ilościowo przydatność konstruktów p70s-bvkws3_16 i p70s-16_#17 do wywoływania zaprogramowanej śmierci komórek liści buraka cukrowego poprzez przejściową transformację metodą biolistyczną. Kotransformowano rośliny wektorem niosącym gen reporterowy p70s-luc. Jako kontrolę pozytywną zastosowano pusty wektor pcamv-2 w połączeniu z genem reporterowym p70s-luc. W porównaniu z transformacją pustym wektorem (pcamv-2), mierzona aktywność genu reporterowego po transformacji p70s-bvkws3_16 wynosiła 6% a po transformacji wektorem p70s-16_#17 zaledwie 38% (Fig. ). Wyniki te pokazują, że wywołanie ekspresji 17 aminokwasów z N-końca 16_#17 prowadzi do bardziej intensywnego wyzwalania programowanej śmierci komórki w transformowanych liściach buraka 9

11 1 2 cukrowego niż przy stosowaniu białka BvKWS3_16 pełnej długości, składającego się z 66 aminokwasów. Po ekspresji 16_#17 więcej komórek buraka cukrowego uległo apoptozie niż wskutek ekspresji BvKWS3_16. Przyczyną tej różnicy jest nowa, bardziej intensywna forma samoistnej aktywacji białek R dzięki skróceniu do rejonu N-końca. Obszar końca genu BvKWS3_13 wyzwala szybszą reakcję zaprogramowanej śmierci komórki niż klon cdna pełnej długości genu BvKWS3_13 [0044] Wychodząc od pełnej długości klonu cdna genu BvKWS3_13 w konstrukcie p70s-bvkws3_13, namnażano koniec genu z zastosowaniem polimerazy Pfu (Stratagene) oraz starterów S316 (ctcgagaattcgagctccaccgcgg) i S330 (ctggatcctcagggagaactccatctgggtggtcc) i równocześnie wprowadzano kodon Stop w obszar kodujący. Namnażany obszar odpowiada sekwencji nukleotydowej SEK NR ID: 2 i koduje sekwencję aminokwasową BvKWS3_13 (Fig. ). Sekwencja ta obejmuje tylko obszar N- końca BvKWS3_13 i nie zawiera domen NBS ani LRR, ani motywów obecnych w tych domenach. Produkty PCR-u pocięto restryktazami SacII i BamHI i wklonowano do wektora pcamv-2. Powstały wektor oznaczono jako p70s-13_#147. Sprawdzono ilościowo zdolność konstruktów p70s-bvkws3_13 i p70s-13_#147 do wywoływania zaprogramowanej śmierci komórek liści buraka cukrowego poprzez przejściową transformację metodą biolistyczną. Kotransformowano rośliny wektorem niosącym gen reporterowy p70s-luc. Jako kontrolę pozytywną zastosowano pusty wektor pcamv-2 w połączeniu z genem reporterowym p70s-luc. W porównaniu z transformacją pustym wektorem (pcamv-2), mierzona aktywność genu reporterowego po transformacji p70s-bvkws3_13 wynosiła 74,% a po transformacji wektorem p70s-13_#147 zaledwie 8,% (Fig. 6). Wyniki te wskazują, że ekspresja klonu genu BvKWS3_13 pełnej długości wyzwoliła reakcję zaprogramowanej śmierci komórki w transformowanych tkankach. Wywołanie ekspresji wyłącznie 147 aminokwasów z N-końca 13_#147 prowadzi do bardziej intensywnego wyzwalania programowanej śmierci komórki w transformowanych liściach buraka cukrowego niż przy stosowaniu białka BvKWS3_13 pełnej długości, składającego się z 844 aminokwasów. Po ekspresji 13_#147 więcej komórek buraka cukrowego uległo apoptozie niż wskutek ekspresji BvKWS3_13. Przyczyną tej różnicy jest nowa, bardziej intensywna forma samoistnej aktywacji białek R dzięki skróceniu do rejonu N-końca Obszar końca genu Bv13033 wyzwala szybszą reakcję zaprogramowanej śmierci komórki niż klon cdna pełnej długości genu Bv13033 [004] Wychodząc od pełnej długości klonu cdna genu Bv13033 w konstrukcie p70s-13033, namnażano koniec genu z zastosowaniem polimerazy Pfu (Stratagene) oraz starterów S316 (ctcgagaattcgagctccaccgcgg) i S333 (ctggatcctcaagaacaagtctcaggccttctgtt) i równocześnie wprowadzano kodonu Stop w obszar kodujący. Namnażany obszar odpowiada sekwencji nukleotydowej SEK NR ID: 3 i koduje sekwencję aminokwasową 1-19 Bv13033 (Fig. ). Sekwencja ta obejmuje tylko obszar N-końca Bv13033 i nie zawiera domen NBS ani LRR, ani motywów obecnych w tych domenach. Produkty PCR-u pocięto restryktazami SacII i BamHI i wklonowano do wektora pcamv-2. Powstały wektor oznaczono jako p70s-13033_#19. Sprawdzono ilościowo zastosowanie konstruktów p70s i p70s-13033_#19 do wywoływania zaprogramowanej śmierci komórek liści buraka cukrowego poprzez przejściową transformację metodą biolistyczną. Kotransformowano rośliny wektorem niosącym gen reporterowy p70s-luc. Jako kontrolę pozytywną zastosowano pusty wektor pcamv-2. W porównaniu z transformacją pustym wektorem (pcamv-2), mierzona aktywność genu reporterowego po transformacji p70s wynosiła 9% a po

12 transformacji wektorem p70s-16_#17 zaledwie 68% (Fig. 7). Wyniki te wskazują, że ekspresja klonu genu Bv13033 pełnej długości wyzwoliła nieznaczną reakcję zaprogramowanej śmierci komórki w transformowanych tkankach. Natomiast wywołanie ekspresji wyłącznie 19 aminokwasów z N-końca 13033_#19 prowadzi do intensywnego wyzwalania programowanej śmierci komórki w transformowanych liściach buraka cukrowego. Przyczyną tej różnicy jest nowa, bardziej intensywna forma samoistnej aktywacji białek R dzięki skróceniu do rejonu N-końca Wyzwolenie kaskady programowanej śmierci komórki w liściach buraka cukrowego po ekspresji obszaru końca genu Bv169 [0046] Gen R Bv169 z sekwencją nukleotydową SEK NR ID: 4 koduje sekwencję 166 aminokwasów z N- końca białka R. Białko Bv169 nie zawiera domen NBS i LRR, wykazuje jednak wyraźną homologię z N- końcami o długości 17, 147 i 19 aminokwasów samoistnie aktywujących się białek R 16_#17, 13_#147 i 13033_#19 (Fig. ). Klony cdna łączono z promotorem 3S z wektora pcamv-2 (Fig. 3) i wstawiano do wektora p70s-169. Dla wykazania działania genu R Bv169, wywołano ekspresję konstruktu p70s- 169 wraz z genem reporterowym p70s-luc w liściach buraka cukrowego poprzez transformację metodą biolistyczną. Aktywność genu reporterowego w liściach transformowanych p70s-169 i p70s-luc wyniosła w trzech niezależnych próbach tylko 1% aktywności, mierzonej w kontroli pozytywnej (pusty wektor pcamv-2 i p70s-luc) (Fig. 8). Ekspresja 166 aminokwasów z białka Bv169 wyzwoliła więc kaskadę programowanej śmierci komórki w komórkach buraka cukrowego. Skrócenie genu BvKWS3_13 prowadziło do ekspresji samoistnie aktywującego się białka R, w przeciwieństwie do mutacji w domenie MHD [0047] Stanowiący istotę wynalazku mechanizm samoistnej aktywacji białka R typu NBS-LRR po skróceniu go do N-końca, pozbawionego sekwencji NBS i LRR, porównano z metodą uzyskania samoistnej aktywacji poprzez wprowadzenie mutacji motywu MHD. Wprowadzenie mutacji motywu MHD genów Rx ziemniaka i genów L6 Gens lnu prowadziło do samoistnej aktywacji wzmiankowanych genów (Bendahmane et al., 02; Howles et al., 0). Klon cdna BvKWS3_13 koduje motyw VDH, odpowiadający motywowi MHD, równie często spotykany w genach R co motyw MDH (Bendahmane et al., 02; Howles et al., 0). Przeprowadzenie odpowiedniej mutacji w klonie BvKWS3_13 pełnej długości zostało opisane przez Bendahmane et al. (02). Polega ona na podstawieniu aminokwasu aspartanu aminokwasem waliną w motywie VDH genu BvKWS3_13. Powstały gen oznaczono jako BvKWS3_13_D480V. Funkcjonalność genów 13_#147, BvKWS3_13_D480V i niezmodyfikowanego genu BvKWS3_13 sprawdzono poprzez przejściową nadekspresję w liściach buraka cukrowego z zastosowaniem Agrobacterium tumefaciens. W tym celu klony cdna BvKWS3_13 łączono z promotorem d3s i wprowadzano do wektora binarnego per-3sluci. Powstały wektor oznaczono jako per13-3sluci. Podobną procedurę zastosowano do skróconego klonu cdna 13_#147 z sekwencją nukleotydową SEK NR ID:2, jak również zawierającego mutację klonu cdna BvKWS3_13_D480V. Powstałe wektory oznaczono jako per13_#147-3sluci i per13_d480v-3sluci. Wektorami tymi transformowano szczep C8C1 Agrobacterium i zastosowano je wraz z kontrolą pozytywną per-3sluci do transformacji liści buraka cukrowego. W 1, 2 i 3 dniu po inokulacji mierzono aktywność genu reporterowego lucyferazy Photinus pyralis w liściach transfekowanych roślin. Liście buraka cukrowego, transformowane konstruktem per- 3Sluci, wykazywały pierwszego dnia nieznaczną aktywność lucyferazy, a 2. i 3. dnia aktywność o wartości 11

13 i RLU/mg próbki liścia. Liście buraka, transformowane konstruktem per13-3sluci, wykazywały 2. i 3. dnia aktywność lucyferazy o wartości i RLU/mg próbki liścia, co wskazuje na mierzalną różnicę poziomu apoptozy w porównaniu z kontrolą pozytywną per-3sluci. Aktywność genu reporterowego po transformacji konstruktem per_13_d480v-3sluci wyniosła 2. i 3. dnia i RLU/mg (Fig. 9). Wykazano więc, że wprowadzenie mutacji do sekwencji MHD genu BvKWS3_13 prowadzi do mniejszej, wręcz nieznacznej samoistnej aktywacji. Z kolei wprowadzenie skróconego genu R 13_#147 zgodnie z tą samą procedurą dało w 2. i 3. dniu aktywność genu reporterowego o wartości i RLU/mg (Fig. 9), co wskazuje wyraźnie na silniejsze wyzwalanie apoptozy i samoistną aktywację konstruktów per13-3sluci i per_13_d480v-3sluci. Identyfikacja wspólnych motywów aminokwasowych na N-końcach białek R BvKWS3_16, BvKWS3_13, Bv13033 oraz Bv169 i StR3a [0048] Porównano homologię pomiędzy końcami N liczącymi 17, 147, 19 i 166 aminokwasów białek R BvKWS3_16, BvKWS3_13, Bv13033 i Bv169 oraz końcem N liczącym 1 aminokwasów z N-końca białka genu R3 ziemniaka (Huang et al., 0) i odnaleziono sekwencje wspólnych motywów. Podczas porównywania zidentyfikowano więcej sekwencji zgodności na N-końcu samoistnie aktywujących się białek R. Sekwencje wspólnych motywów zaznaczono jako sekwencje zgodności na Fig. a). [0049] Sekwencja zgodności odpowiada sekwencji aminokwasowej SEK NR ID: 13: AVLXDAEXKQXX XXXLXXWLXD LKDXVYDXDD ILDE. Inna sekwencja zgodności odpowiada sekwencji aminokwasowej SEK NR ID: 14: IXEIXXKLDD L [000] Literą X oznaczono dowolny aminokwas. [001] Obie sekwencje zgodności występowały w opisanej formie tylko na N-końcach białek R CC-NBS- LRR, których ekspresja prowadziła do samoistnej aktywacji. Tak więc sekwencja kodująca 160 aminokwasów z domeny CC genu RX nie umożliwia wyzwolenia programowanej śmierci komórki lub reakcji nadwrażliwości (Bendahmane et al., 02). Przejściowa ekspresja genu kodującego 177 aminokwasów z N- końca białka R BvKWS3_133_e08 buraka cukrowego i 40 aminokwasów z N-końca białka R1 ziemniaka (Ballvora et al., 02) nie wyzwalała intensywniejszej apoptozy w porównaniu z ekspresją pełnej długości genu R BvKWS3_133_e08, a w przypadku genu R1 nie wyzwalała programowanej śmierci komórek wcale (danych nie przedstawiono). Porównanie sekwencji aminokwasów z N-końca samoistnie aktywujących się białek BvKWS3_16_#176, BvKWS3_13_#147, Bv13033_#19, Bv169 i StR3a-#1-1 z sekwencjami aminokwasów domen CC białek Rx-, StR1- i BvKWS3_133_#177 wykazało nieobecność powyżej opisanych sekwencji zgodności w nieaktywujących się samoistnie N-końcach (Fig. b). Szczególnie pomocna w identyfikacji białek, których N-koniec ulega samoistnej aktywacji, jest sekwencja motywu DAE. Z zastosowaniem sekwencji motywu DAE jako sekwencji zgodności udało się znaleźć liczne geny R, specyficzne dla różnych gatunków roślin, nadające się do samoistnej aktywacji. Patrz Fig. c, gdzie przedstawiono przykłady z Arabidopsis thaliana (AtAB028617), fasoli (PvulgarisJ71), ryżu (osativaap003073), soi (GmaxKR4) i pomidora (Tomato-I2). 40 Sekwencja aminokwasów jest istotna dla samoistnej aktywacji białka R 16_#17 [002] W celu identyfikacji odcinków sekwencji aminokwasowych w białku 16_#17, które są istotne dla samoistnej aktywacji N-końca białek NBS-LRR, skrócono kodujący obszar klonów cdna genu 16_#17. Klony cdna genu 16_#93 i 16_#146 kodują sekwencje aminokwasów 1-93 i białka 16_#17. 12

14 Przejściowa transformacja metodą biolistyczną z zastosowaniem konstruktów p70s_16_#93, p70s_16_#146 i p70s_16_#17 wykazała, że tylko białko 16_#17 wyzwala wysoki poziom programowanej śmierci komórki, w przeciwieństwie do 16_#93 i 16_#146 (Fig. 11). Sekwencja aminokwasów jest więc kluczowa dla samoistnej aktywacji białek NBS-LRR. W tym obszarze znajduje się sekwencja konserwatywnego motywu, obecnego we wszystkich badanych białkach (Fig. a) Szybka aktywacja syntetycznego, indukowanego obecnością patogenów promotora 2xS-2xD i 2xW2-2xD poprzez infekcję grzybiczą [003] Do kontroli nadekspresji całościowego lub skróconego genu odporności, indukowanej obecnością patogenu, szczególnie dobrze nadają się syntetyczne promotory typu nxs-mxd, nxw2-mxd i nxgst1-mxd, przy czym n=1,2,3,4,,6,7,8,9, i m=1,2,3,4,,6,7,8,9,. Jako przykład analizowano promotory typu 2xS- 2xD o SEK NR ID., 2xW2-2xD o SEK NR ID. 11 oraz 2xGst1-2xD o SEK NR ID. 12 połączone z genem lucyferazy z Photinus pyralis, wprowadzone do buraka cukrowego i indukowane obecnością infekcji grzybiczej. Do transformacji roślin stosowano wektory binarne 2xS-2xD-luc-kan, 2xW2-2xD-luc-kan i 2xGst1-2xD-luckan. Wektorami binarnymi transformowano szczep C8C1 Agrobacterium tumefaciens zawierający plazmid pgv2260, z zastosowaniem protokołu bezpośredniej transformacji DNA (An, 1987). Selekcji klonów zrekombinowanych bakterii A. tumefaciens dokonano z zastosowaniem antybiotyku kanamycyny (0 mg/l). Transformacji buraka cukrowego dokonano zgodnie z protokołem opisanym przez Lindsey et al. (1991) z zastosowaniem antybiotyku kanamycyny. Transgeniczny charakter roślin potwierdzono reakcją PCR. Do namnażania fragmentu DNA liczącego 3 bp genu nptii zastosowano startery GTGGAGAGGCTATTCGGTA i CCACCATGATATTCGGCAAG. Reakcję PCR prowadzono z zastosowaniem ng DNA genomowego, starterów w stężeniu 0,2 µm, temperatury przyłączania starterów C i aparatu Multicycler PTC-0 (MJ Research, Watertown, USA). [004] Dla zbadania indukowalności promotorów obecnością patogenów, transgeniczne buraki cukrowe infekowano wywołującym chorobę liści grzybem Cercospora beticola w warunkach in-vitro. Zanurzono po 4 rośliny linii transgenicznej w zawiesinie strzępek grzybni C. beticola ( strzępek/ml) i, dla kontroli, po 4 rośliny w rozcieńczonym soku warzywnym. Następnie zainfekowane i kontrolne rośliny inkubowano przy 2 C i 16-godzinnym naświetleniu w inkubatorze. Zainfekowany i niezainfekowany materiał liści zebrano w 1, 2, 3, 4 i 6-7 dniu po inokulacji i mierzono aktywność lucyferazy z zastosowaniem zestawu Luciferase Assay System (Promega, Mannheim, Niemcy) zgodnie z opisem. Zarówno promotor 2xS-2xD, jak i 2xW2-2xD wykazały silną i szybką indukcję patogenem we wczesnych stadiach infekcji, różniły się jednak aktywnością podstawową i siłą (Fig ). Promotor 2xS-2xD w linii transgenicznej PR39/11, PR39/48 i PR39/49 ulegał indukcji bardzo szybko. Już pierwszego dnia po inokulacji jego indukcja była 11-9 razy, a drugiego dnia razy silniejsza niż w roślinach niezainfekowanych (Fig. 12). Pierwszego dnia ma miejsce tylko wzrost strzępek grzybni na epidermie rośliny, natomiast drugiego dnia dochodzi do penetracji liścia poprzez aparaty szparkowe i tym samym wnikania w tkanki liścia. W późnej fazie infekcji, po 7 dniach, znamionowana pojawieniem się widocznych zmian martwiczych, ma miejsce krotna indukcja promotora. Aktywność podstawowa promotora 2xS-2xD, mierzona jako aktywność genu reporterowego niezainfekowanych roślin, jest nieznaczna i przekłada się na zaledwie 1- razy większą aktywność lucyferazy, niż w roślinach nietransformowanych. 13

15 Aktywacja promotora 2xW2-2xD przebiega nieco wolniej, niż promotora 2xS-2xD. Pierwszego dnia infekcji, promotor 2xW2-2xD wykazał tylko 2-17 razy większą aktywność a drugiego dnia -6 razy większą aktywność wywołaną obecnością patogenu. Wraz z pojawieniem się zmian martwiczych 7. dnia, promotor osiągnął najwyższy poziom indukcji patogenem: razy wzmożoną aktywność (Fig. 13). Zmierzona aktywność podstawowa promotora 2xW2-2-D była -0 razy wyższa niż w roślinach nietransformowanych (porównanie aktywności genu reporterowego) niż w przypadku promotora 2xS-2xD. Promotor 2xW2-2xD wyraźnie odznacza się razy wyższą siłą od promotora 2xS-2xD Optymalizacja cech promotorów poprzez modyfikację liczby elementów cis [00] Cechy syntetycznych promotorów typu nxs-mxd, nxw2-mxd i nxgst1-mxd, gdzie n=1,2,3,4,,6,7,8,9, i m=1,2,3,4,,6,7,8,9,, można zmieniać i optymalizować w zależności od zapotrzebowania na poziom ekspresji danego genu poprzez zmianę liczby elementów cis. Ukazano to na przykładzie promotora typu nxs-mxd. Skonstruowano wektory binarne 2xS-2xD-luc-kan, 4xS-2xD-luc-kan, 2xS-4xD-luc-kan oraz 4xS-4xD-luc-kan i transformowano nimi buraka cukrowego. Rośliny transgeniczne infekowano C. beticola, jak opisano powyżej, i mierzono aktywność genów reporterowych każdego dnia po inokulacji grzybem. Wyniki pomiarów dla 13 niezależnych linii 2xS-2xD-luc, 14 niezależnych linii 4xS-2xD-luc, 1 niezależnych linii 2xS-4xD-luc oraz 1 niezależnych linii 4xS-4xD-luc uśredniono i porównano średnie wartości siły promotora, indukowalności patogenem i aktywności podstawowej. Porównanie cech promotora 2xS-2xD z wariantami 2xS-4xD, 4xS-2xD i 4xS-4xD pokazuje, że średnia siła promotora zbudowanego z tetramerów jest wyższa w porównaniu z dimerami (Fig. 14). Ponadto, zdolność do indukcji obecnością patogenu wzrasta od promotorów dimer-dimer (2xS-2xD) poprzez promotory tetramer-dimer i dimer-tetramer (4xS-2xD, 4xS-2xD) do promotorów tetramer-tetramer (4xS-4xD) przy wszystkich mierzonych odstępach czasowych (tabela 1). Tabela 1: Indukowalność promotorów 2xS-2xD, 4xS-2xD, 2xS-4xD i 4xS-4xD obecnością patogenu w transgenicznym buraku cukrowym po infekcji Cercospora beticola. Przedstawiono wartość średnią indukowalności patogenem w 13-1 niezależnych liniach transformantów na każdy konstrukt promotora w 1-4 dniu po inokulacji. Promotor (liczba 1. dzień 2. dzień 3. dzień 4. dzień niezależnych transformantów) 2xS-2xD (13 linii) 1,9 3, xS-2xD (14 linii) 3,1 4, xS-4xD (1 linii) 1,4 9, xS-4xD (1 linii) 2,9 9, [006] Wraz ze wzrostem siły promotora i zdolności do indukcji przez obecność patogenu, przy zastosowaniu promotora zawierającego tetramery ma miejsce wzrost aktywności podstawowej (tabela 2). 14

16 Tabela 2: Aktywność podstawowa promotorów 2xS-2xD, 4xS-2xD, 2xS-4xD i 4xS-4xD w liściach transgenicznych buraków cukrowych. Przedstawiono wartość średnią aktywności podstawowej w 13-1 niezależnych liniach transformantów na każdy konstrukt promotora, które stanowiły niezainfekowaną kontrolę podczas czterodniowych badań nad zainfekowanymi burakami. Aktywność podstawową można określić na podstawie aktywności genu reporterowego roślin transgenicznych w porównaniu z niespecyficzną aktywnością tła przy roślinach nietransformowanych. Promotor (liczba 1. dzień 2. dzień 3. dzień 4. dzień niezależnych transformantów) 2xS-2xD (13 linii) 4,7,,2 2,6 4xS-2xD (14 linii) 14,2 21 7,8 11 2xS-4xD (1 linii) 24,6 13,3 7 22,3 4xS-4xD (1 linii) 3,,3 6, [007] Ten przykład pokazuje, że ważne w tym kontekście cechy promotora, takie jak siła, indukowalność obecnością patogenu i aktywność podstawowa, można regulować liczbą elementów cis i dla danych warunków technicznych można skonstruować optymalny wariant promotora. W badanych przykładach, ze względu na indukowalność obecnością patogenu, optymalna liczba elementów cis w promotorach indukowanych obecnością patogenu jest większa niż w opisanym przez Rushton et al., 02 rozwiązaniu polegającym na zastosowaniu dimerów. Wytwarzanie odporności buraka cukrowego na grzyby poprzez transformację genami odporności na patogeny [008] W celu podniesienia odporności buraka cukrowego na patogeny, promotory 2xS-2xD lub 2xW 2-2xD mogą być łączone z jednym z czterech genów BvKWS3_123, BvKWS3_133, BvKWS3_13 i BvKWS3_16 i używane do transformacji buraka cukrowego. Do tego celu stosowano wektory binarne 2xS-2xD-luc-kan, 2xW2-2xD-luc-kan i 2xGst1-2xD-luc-kan o długości względnie kb, pocięte restryktazą SacI. Miejsce cięcia stępiono polimerazą T4 DNA. Następnie pocięto wektory restryktazą XhoI, rozdzielono elektroforetycznie w żelu i wektory długości względnie kb oddzielono od genu lucyferazy długości 1 67 kb i wyizolowano. Geny odporności ZR wyizolowano z wektorów p70s-bvkws3_123, p70s-bvkws3_133, p70s- BvKWS3_13 i p70s-bvkws3_16. W tym celu linearyzowano wektory restryktazą NotI i stępiono miejsce cięcia fragmentem Klenowa. Następnie pocięto wektory restryktazą XhoI i wyizolowano geny R. Powstałe wektory oznaczono 2xS-2xD-BvKWS3_123, 2xS-2xD-BvKWS3_133, 2xS-2xD-BvKWS3_13 i 2xS-2xD- BvKWS3_16 lub 2xW 2-2xD-BvKWS3_123, 2xW 2-2xD-BvKWS3_133, 2xW 2-2xD-BvKWS3_13 i 2xW 2-2xD- BvKWS3_16 (Fig. 1-18). Wektory binarne są stosowane, jak opisano powyżej, do produkcji transgenicznych buraków cukrowych. 1

17 1 Oznaczanie odporności buraka cukrowego na grzyby poprzez test odporności z zastosowaniem Cercospora beticola [009] Obserwuje się podwyższoną odporność roślin na grzyby podczas testów, takich jak opisane poniżej przykłady testów odporności buraka cukrowego na Cercospora beticola. Do zarażenia chorobą liści, wywoływaną przez C. beticola, zastosowano transgeniczne buraki cukrowe oraz hodowane w szklarni buraki cukrowe nietransformowane o genotypie 3DC416 (który stosowano do transformacji). Dwa tygodnie przed planowaną inokulacją, szczepiono płytki z sokiem warzywnym (40% sok warzywny Albani) izolatem patogennego szczepu C. beticola Ahlburg i inkubowano przy 2 C. Bezpośrednio przed inokulacją, przerośnięty grzybnią agar zebrano za pomocą szkiełka podstawnego i odrobiny wody. Stężenie strzępek grzybni i zarodników grzybów oznaczono z zastosowaniem komory do zliczania. Inokulum rozcieńczono wodą do uzyskania 000 strzępek na ml. Infekcję przeprowadzano nurzając -12 tygodniowe rośliny do góry nogami w l zlewce z inokulum. Przed inokulacją badanej linią, inokulowano 30 roślin i losowo umieszczono w szklarni. Rośliny po inokulacji inkubowano przez 4 dni przy 28 C i 9% wilgotności powietrza w szklarni. Po 4 dniach zmniejszono wilgotność powietrza do 60%-70%. W dwa, trzy i cztery tygodnie po inokulacji oceniano wzrokowo infekcję liści z zastosowaniem dziewięciostopniowej skali oceny, opracowanej przez KWS (Kleinwanzlebener Saatzucht) w 1970 r., gdzie 1 = zdrowe liście, 9 = liście zniszczone w 0%. Linie transgeniczne, transformowane konstruktami 2xS-2xD-BvKWS3_123, 2xS-2xD-BvKWS3_133, 2xS- 2xD-BvKWS3_16, 2xW 2-2xD-BvKWS3_123, 2xW 2-2xD-BvKWS3_133, 2xW 2-2xD-BvKWS3_13 lub 2xW 2-2xD-BvKWS3_16, wykazywały wyższą odporność na infekcję grzybiczą, w porównaniu z kontrolą (tabela 3). Tabela 3: Podwyższenie odporności transgenicznego buraka cukrowego na grzyby Cercospora beticola Kontrola (roślina nietransgeniczna) T3 1 Linia transgeniczna oznaczenie linii Konstrukt AUD T3 1 AUDPC 2 PC 2 6,0 2 PR68-6 4, xS-2xD-BvKWS ,8 193 PR ,1 17 2xS-2xD-BvKWS ,1 167 PR7-8 2, xS-2xD-BvKWS3-16 6,0 2 PR69-1, xW 2-2xD-BvKWS ,0 226 PR74-73, 182 2xW 2-2xD-BvKWS ,8 193 PR74-73,6 1 2xW 2-2xD-BvKWS3-13 6,8 229 PR74-73, xW 2-2xD-BvKWS Trzecia i ostatnia wartość w skali oceny odporności na grzyby (1 = zdrowa roślina, 9 = 0% 2 zniszczenia powierzchni liścia). 2 AUDPC (Area under disease progress curve) Wartość uśredniona z trzech uzyskanych wartości w skali oceny (T1-T3). Pojedyncza wartość AUDPC obejmuje przebieg intensywności infekcji w kilku punktach mierzenia w skali odporności. 16

18 [0060] Analiza przebiegu rozwoju infekcji w czasie w transformantach PR68-6 i PR70-32 z zastosowaniem trzech pomiarów w skali odporności pokazuje, że w czasie, objętym badaniem, różnica w stopniu rozwoju infekcji pomiędzy kontrolą i linią transgeniczną wzrasta (Fig. 19 i ). Wyniki te wskazują, że indukowana ekspresja różnych genów R buraka cukrowego z zastosowaniem promotorów specyficznych dla patogenu prowadzi do podwyższonej odporności na grzyby. 1 Wytwarzanie roślin odpornych na grzyby poprzez transformację obszarem N-końca genów R pod kontrolą indukowanych patogenem promotorów [0061] W celu uzyskania odporności roślin na grzyby z zastosowaniem fragmentów N-końca genów R, połączono skrócone geny R 13033_#19, 13_#147, 16_#17 i Bv169 z promotorami 2xS-2xD i 2xW2-2xD i transformowano powstałymi konstruktami buraki cukrowe. Do tego celu stosowano wektory binarne 2xS-2xD-luc-kan, 2xW2-2xD-luc-kan i 2xGst1-2xD-luc-kan o długości względnie kb, pocięte restryktazą SacI. Miejsce cięcia stępiono polimerazą T4 DNA. Następnie pocięto wektory restryktazą XhoI, rozdzielono elektroforetycznie w żelu i wektory długości względnie kb oddzielono od genu lucyferazy długości 1 67 kb i wyizolowano. Skrócone geny R wyizolowano z wektorów p70s-169, p70s-13033_#19, p70s-13_#147 i p70s- 16_#17. Wektory linearyzowano restryktazą XbaI, stępiono końce DNA fragmentem Klenowa i następnie pocięto wektory restryktazą XhoI. Wyizolowane fragmenty genów R wklonowano do przygotowanych wcześniej wektorów binarnych. Powstałe wektory oznaczono 2xS-2xD-169, 2xS-2xD-13033_#19, 2xS- 2xD-13_#147, 2xS-2xD-16_#17 względnie 2xW2-2xD-169, 2xW2-2xD-13033_#19, 2xW2-2xD- 13_#147, 2xW2-2xD-16_#17 (Fig ). Wektory binarne zastosowano, jak opisano powyżej, do transformacji buraków cukrowych i zidentyfikowano odporne transformantów testem na odporność na infekcje grzybicze Cercospora beticola Literatura: [0062] Altschul, S.F. et al. (1990). Basic Local Alignment search tool, J.Mol. Biol. 21: An, G. (1987). Binary Ti vectors for plant transformation and promoter analysis. Methods Enzymol. 13, Bairoch et al., (1996) The PROSITE database, its status in 199. Nucleic Acids Res 24: Ballavora A., Ercolana M R., Weiss J., Meksem K., Bormann C.A.I, Oberhagemann P., Salamini F., Gebhardt C. (02). The R1 gene for potato resistance to late blight (Phytophthora infestans) belongs to the leucine zipper/nbs/lrr class of plant resistance genes. Plant J. 30(3): Bendahmane A., Farnham G., Moffett P., and Baulcombe D.C. (02). Constitutive gainof-function mutants in a nucleotide binding site-leucine rich repeat protein encoded at the Rx locus of potato. Plant J. Oct;32(2): Frost D., Way H., Howles P., Luck J., Manners J., Hardham A., Finnegan J., and Ellis J. (04). Tobacco transgenic for the flax rust resistance gene L expresses allele-specific activation of defense responses. Mol Plant Microbe Interact. 17(2): Hennig, J., Dewey. R.E., Cutt, J. R, and Klessig, D. F. (1993). Pathogen, salicylic acid and developmental dependent expression of a beta-1,3-glucanase/gus gene fusion in transgenic tobacco plants. Plant J. 4(3):

19 Howles P., Lawrence G., Finnegan J., McFadden H., Ayliffe M., Dodds D., and Ellis J. (0). Autoactive Alleles of the Flax L6 Rust Resistance Gene Induce Non-Race-Specific Rust Resistance Associated with the Hypersensitive Response. Mol Plant Microbe Interact. 18(6): Huang S., an der Vossen E.A., Kuang H., Vlesshouwers V.G., Zhang N:, Borm, T.J., van Eck H.J., Baker B., Jacobsen E., and Visser R.G. (0). Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato. Plant J. 42(2): Lindsey, K,. Gallois, P., and Eady, C. (1991). Regeneration and transformation of sugar beet by Agrobacterium tumefaciens. Plant Tissue Culture Manual B7: 1-13; Kluwer Academic Publishers. Lupas, A., Van Dyke M., and Stock J. (1991) Predicting coiled coils from protein sekwencjas. Science 22: Martin, G. B., Bogdanove, A. J., and Sessa, G. (03). Understanding the functions of plant disease resistance proteins. Annu. Rev. Plant-Biol. 4: Martini, N., Egen, M., Rüntz, I., and Strittmatter, G. (1993). Promoter sekwencjas of a potato pathogenesisrelated gene mediate transcriptional activation selectively upon fungal infection. Mol Gen Genet 236: Oldroyd, G. E. D., and. Staskawicz, B. J. (1998). Genetically engineered broad-spectrum disease resistance in tomato. Proc Natl Acad Sci U S A. 9(17): Rushton P. J., Reinstadler A., Lipka V., Lippok B., Somssich I.E. (02). Synthetic plant promoters containing defined regulatory elements provide novel insights into pathogenand wound-induced signaling. Plant Cell 14(4): Samac, D.A and Shah, D.M. (1991). Developmental and Pathogen-Induced Activation of the Arabidopsis Acidic Chitinase Promoter. Plant Cell. 3(): Schmidt K., Heberle B., Kurrasch J., Nehls R., and Stahl D. J. (04). Suppression of phenylalanine ammonia lyase expression in sugar beet by the fungal pathogen Cercospora beticola is mediated at the core promoter of the gene. Plant Mol. Biol., : Sonnhammer, E. L., Eddy, S. R., and Durbin, R. D. (1997) Pfam: A comprehensive database of protein domain families based on seed alignments. Proteins 28:40-. Tang X., Xie M., Kim Y.J., Zhou J., Klessig D.F., Martin G.B. (1999). Overexpression of Pto activates defense responses and confers broad resistance. Plant Cell 11(1):1-29. Tian Y., Fan L., Thurau T., Jung C., and Cai D. (04). The absence of TIR-Rodzaj resistance gene analogues in the sugar beet (Beta vulgaris L.) genome. J. Mol. Evol. 8(1):40-3. Traut, T. W. (1994). The functions and consensus motifs of nine Rodzajs of peptide segments that form different Rodzajs of nucleotide binding sites. Eur. J. Biochem. 222: Zgłaszający Ulica: Grimsehlstrasse 31 Miasto: Einbeck Stan: Kraj: Niemcy Kod pocztowy: D-37 Numer telefonu: Numer faksu: Adres info@kws.de 18

20 <1> Nazwa organizacji: KWS SAAT AG Projekt, którego dotyczy zgłoszenie <1> Nazwa: Samoistnie aktywujące się białko odporności <130> Kod aplikacji: KWS SAAT AG <140> Aktualny numer aplikacji: <140> Aktualna data aplikacji: - - Sekwencja <213> Nazwa organizmu: <400> Sekwencja wstępna: 1 <212> Rodzaj : DNA <211> Długość : 660 Nazwa sekwencji : sekwencja 1 Opis sekwencji : Sekwencja <213> Nazwa organizmu : <400> Nić sekwencji wstępnej : 2 <212> Rodzaj : DNA <211> Długość : 604 Nazwa sekwencji : sekwencja 2 Opis sekwencji : Sekwencja <213> Nazwa organizmu : <400> Nić sekwencji wstępnej : 30 <212> Rodzaj : DNA <211> Długość : 80 Nazwa sekwencji : sekwencja 3 Opis sekwencji : Sekwencja 19