Rafael Manfro, Fabiano Silva Fonseca, Marcelo Carlos Bortoluzzi & Wilson Roberto Sendyk

Transkrypt

1 Porównawcza, histologiczna i histomorfometryczna analiza trzech nieorganicznych, ksenogenicznych bydlęcych preparatów kościozastępczych: Bio-Oss, Bone-Fill i Gen- Ox Anorganic Rafael Manfro, Fabiano Silva Fonseca, Marcelo Carlos Bortoluzzi & Wilson Roberto Sendyk Journal of Maxillofacial and Oral Surgery ISSN DOI /s z 1 23

2 Your article is protected by copyright and all rights are held exclusively by Association of Oral and Maxillofacial Surgeons of India. This e-offprint is for personal use only and shall not be self-archived in electronic repositories. If you wish to self-archive your article, please use the accepted manuscript version for posting on your own website. You may further deposit the accepted manuscript version in any repository, provided it is only made publicly available 12 months after official publication or later and provided acknowledgement is given to the original source of publication and a link is inserted to the published article on Springer's website. The link must be accompanied by the following text: "The final publication is available at link.springer.com. 1 23

3 DOI /s z RESEARCH PAPER Porównawcza, histologiczna i histomorfometryczna analiza trzech nieorganicznych, ksenogenicznych bydlęcych preparatów kościozastępczych: Bio-Oss, Bone-Fill i Gen- Ox Anorganic Rafael Manfro Fabiano Silva Fonseca Marcelo Carlos Bortoluzzi Wilson Roberto Sendyk Received: 12 April 2013 / Accepted: 16 July 2013 ÓAssociation of Oral and Maxillofacial Surgeons of India 2013 Abstrakt Wprowadzenie Nieorganiczne ksenogeniczne przeszczepy bydlęce pokazują najlepsze wyniki jako substytuty kości w implantologii. Bio-Oss jest nieorganicznym substytutem kości najczęściej używanym i badanym na świecie. Artykuł porównuje dwa nieorganiczne bydlęce preparaty kościozastępcze (Bone-Fill and Gen-Ox anorganic) z preparatem Bio-Oss. Materiał i metody Osiem królików nowozelandzkich zaimplantowano 4 tytanowymi cylindrami, losowo wypełnionymi preparatami Bio-Oss, Bone-Fill, Gen-Ox anorganic lub skrzepem krwi. Po 8 tygodniach uśmiercono 4 zwierzęta; po 12 kolejnych tygodniach uśmiercono pozostałe cztery. Zawartość cylindrów wyjęto cięto i barwiono HE zanim zostały ocenione przy użyciu mikroskopu optycznego. Próbki poddano histomorfometrii w celu analizy. Wyniki Tworzenie kości przy preparacie Bio-Oss po 8 tygodniach wyniosło 8.43 mm 2 ; po 12 tygodniach 9.32 mm 2. Tworzenie kości przy preparacie Bone-Fill po 8 tygodniach wyniosło 7.24 mm 2 ; po 12 tygodniach 9.01 mm 2. R. Manfro (&) Department of Dental Implantology, SOEBRAS, Street Presidente Coutinho 264/903, Florianópolis, SC CEP , Brazil manfroimplante@hotmail.com F. S. Fonseca Vitória, ES, Brazil M. C. Bortoluzzi Department of Implantodontic Maxillofacial Surgery, UNOESC, Joaçaba, SC, Brazil W. R. Sendyk UNISA, Santo Amaro, SP, Brazil Tworzenie kości przy preparacie GenOx anorganic po 8 tygodniach wyniosło 2.78 mm 2 ; po 12 tygodniach 3.02 mm 2. Tworzenie kości przy skrzepie wyniosło po 8 tygodniach was 0.65 mm 2 ; po 12 tygodniach 0.63 mm 2. Wnioski Na podstawie modelu stwierdzono porównywalność pre-paratów Bone-Fill i Bio-Oss oraz przewagę nad Gen-Ox oraz skrzepem krwi. Słowa kluczowe Osteointegracja implantów, przebudowa kości, nieorgan-iczny, bydlęcy przeszczep ksenogeniczny. Wprowadzenie Resorpcja kości oraz następowa utrata zębów wymaga od chirurgów poszukiwania technik oraz materiałów do regeneracji oraz odbudowy tych tkanek, co pozwala na założenie osteointegracyjnych implantów. Istnieje wiele raportów z badań nad kilkoma substytutami kości w poszukiwaniu materiału o większej zdolności tworzenia kości oraz mniejszej tendencji do występowania powikłań i niepowodzenia. Autogenna kość stanowi standard w sztuce przy odbudowie kości w implantologii [1]; omówiona została szeroko w literaturze oraz zapewnia lepszą przewidywalność w zakresie ilości i jakości uzyskanej kości [1,2], ponieważ jako jedyna zapewnia osteogenezę, osteoindukcję oraz osteokondukcję podczas wszystkich faz przebudowy [1,3]. Wady zastosowani kości autogennej, takie jak wzrost ryzyka powikłań i niepowodzenia oraz wydłużenie czasu zabiegu, ograniczona ilość dostępnej kości oraz większa utrata krwi, skłoniła do opracowania biologicznego lub alloplastycznego materiału który mógłby zostać użyty jako substytut kości [4]. Badania porównawcze z substytutami kości, wskazują nieorganiczną, ksenogeniczną kość bydlęcą jako substytut kości z najlepszą wydajnością rekonstrukcyjną kości przy zakładaniu implantów osteointegracyjnych [2-4]; w kilku

4 badaniach opublikowanych w literaturze, nieorganiczna, ksenogeniczna kość bydlęca wykazała podobne właściwości jak kość autogenna, zarówno samodzielnie jak i połączona z kością autogenną [4-12]. Jedną z głównych zalet stosowania nieorganicznej ksenogenicznej kości bydlęcej stanowi fakt, iż jest ona naturalna oraz może wspomagać komponenty strukturalne podobnie jak kość ludzka [13]. Kolejną zaletą jest zwiększona ilość kości dzięki bardziej przewidywalnej regeneracji we wczesnych etapach odbudowy, ułatwienie przedwczesnej migracji komórek linii osteoblastów w bliźnie kostnej, charakter osteokonduktora przeszczepu, zwiększa powierzchnię dostępną do osadzania kości [14]. Nowsze badania wykazały, że nieorganiczna kość bydlęca zakłóca genetycznie funkcje osteoblastów, co może być przyczyną jej skuteczności klinicznej [15, 16]. Preparat Bio-oss jest złotym standardem wśród nieorganicznych ksenogenicznych kości bydlęcych. W Brazylii znaleźć można również tańsze ksenogeniczne preparaty bydlęce które są łatwiej dostępne. Pomimo podobieństw przy produkcji Bio-Oss i produktów brazylijskich, produkty te nie zostały odpowiednio przebadane klinicznie. Celem artykułu była ocena możliwości osteokondukcji dwóch brazylijskich nieorganicznych preparatów bydlęcych oraz porównanie ich histologicznie i histomorfometrycznie do preparatu Bio-oss, który stanowi najlepiej przebadany oraz skomercjalizowany preparat kości ksenogenicznej. Materiał i metody Do badań wybrano osiem królików, samców rasy nowozelandzkiej, w wieku od 8 do 10 miesięcy, oraz wadze około 4 kg, dostarczone przez zwierzętarnie Uniwersytetu Santo Amaro (UNISA). Króliki podzielono na dwie grupy, po cztery w każdej z nich. Cztery tytanowe cyl-indry (Ryc. 1) wszczepiono w czaszkę zwierzęcia. Trzy z nich wypełniono nieorganiczną, ksenogeniczną kością bydlęcą (Bio-Oss 1, Bone-Fill 2 oraz GenOx 3 ) a ostatni skrzepem. Pierwsza grupa została uśmiercona po 8 tygodniach od wszczepu, druga po 12 tygodniach od wszczepu. Zwierzęta zostały zważone, tak aby dobrać idealną dawkę znieczulenia dla każdego z nich. Znieczulenie wykonano przy użyciu Ketaminy 10 mg/kg, Midazolan 0.5 mg/kg oraz Atropiny 10 mg/kg podane śródmięśniowo (IM). Podtrzymanie znieczulenia wykonano Ketaminą oraz nasiękowo podaną 3% Mepiwakainą. Ryc. 1 Tytanowe pierścienie wraz z śrubami Dostęp chirurgiczny wykonano przez strzałkowe nacięcie obejmujące skórę, tkanki podskórne oraz okostną czaszki, a następnie odsłonięcie całej czaszki. Cztery szerokie na 6 mm oraz wysokie na 4 mm cylindry wykonane specjalnie na potrzebny badań, wszczepiono w czaszkę królika, przy użyciu dwóch szerokich na 1,5 mm oraz głębokich na 3 mm śrub. Dekortykację wewnętrznej części cylindra wykonano przy użyciu wiertła o średnicy 1.1 mm ze stałą irygacją 0.9 % roztworem soli fizjologicznej. Procedura ta miała na celu ułatwienie ponownego unaczynienia przeszczepów do założenia. Cylindry wypełniono losowo preparatami Bio-Oss, Bone-Fill, Gen-Ox anorganic oraz skrzepem (Ryc. 2). Płat podzielono w celu ułatwienia pierwotnego zamknięcia. Do założenia szwów użyto nici mononylon 5-0 (Ethicon). Zwierzętom podawano Benzatine Penicillin 40,000 UI/kg IM co 48 h przez 15 dni oraz podskórnie Dipirone Sodium 0.25 mg/kg. 1 Bio-Oss Switzerland Re-Order. No Bone-Fill Bionnovations. São Paulo Brasil Lot. 1096/03. 3 Gen-Ox Baumer São Paulo Brasil Lot Ryc. 2 Cylindry z biomateriałami

5 Po odpowiednim dla grupy czasie - grupa I, 8 tygodni oraz grupa II, 12 tygodni - króliki uśmiercono stosując odpowiednie dawki leków uspokajających. Następnie ponownie wykonano dostęp chirurgiczny. Pokrywki cylindrów wyjęto i konsystencję wewnętrznej zawartości cylindra testowano końcówką łyżeczki 2/4 Molt. Przy pomocy wiertła trepanacyjnego o średnicy 4.3 mm na prostnicę, usunięto wewnętrzną część cylindra wraz z otaczającą kością (Ryc. 3). Próbki umieszczono w 10 % roztworze formaliny. Preparaty wykonano w laboratorium histologicznycm UNISA wg poniższej instrukcji: próbki odwapniono przy użyciu 20% kwasu azotowego działającego przez średni okres około 1 tygodnia. Próbki umyto, odwodniono i utrwalono w parafinie. Następnie przecięto cylinder w części górnej i dolnej. Następnie wybarwiono je w hematoksylinie i eozynie oraz oglądano pod mikroskopem świetlnym. Zaobserwowano: - obecność reakcji zapalnej; - obecność komórek zdolnych do tworzenia kości (niezróżnicowane komórki mezenchymalne, osteoblasty, makrofagi); - zbliżoność uformowania kostnego z uformowaniem kości czaszki; - obecność nowo powstawjących naczyń; - regenerację kości; - tworzenie tkanki włóknistej; - obecność ksenogenicznych pozostałości. Jedna próbka z każdego materiału z każdego gatunku została przedłożona do histomorfometrii w laboratorium histologicznym UNICAMP Histology laboratory (Campinas/ SP).W czasie histomorfometrii badano ilość uformowanej tkanki kostnej, ilość cząstek resztkowych oraz tkanki niezmineralizowanej. Obliczono średnie próbki z każdego materiału, a wyniki poddano analizie statystycznej z z-testu dla dwóch średnich wartości. Próbki 8 tygodniowe Skrzep krwi Próbki zawierające skrzep wykazały dużą ilość włókien kolagenowych, fibroblastów oraz małą ilość tkanki kostnej (Ryc. 4). Gen-ox Próbki z materiałem Gen-ox posiadały dużą ilość materiału, stwierdzono niski poziom resorpcji, obecność włókien kolagenowych, fibroblastów oraz kilka stref nowo tworzonej kości. Nowo powstająca kość wykazywała nieregularną budowę oraz niską gęstość (Ryc. 5) Bone-Fill Próbki z materiałem Bone-Fill posiadały mniejszą ilość pozostałości materiału niż Gen-Ox, większą ilość nowo powstałej kości oraz gęstszą i lepiej zorganizowaną strukturalnie kość. Zaobserwowano również małą ilość włókien kolagenowych (Ryc. 6). Stwierdzano wyraźne oznaki resorpcji głównie wewnątrz materiału, dając wszczepionej kości aspekt porowatości. Bio-Oss Próbki z materiałem Bio-Oss wykazywały obecnośćpozostałości materiału po resorpcji, dużą ilość makrofagów, obecność nowo powstającej kości, kość początkową z kilkoma systemami Haversa I nowymi naczyniami. Zaobserwowano małą ilość włókien kolagenowych (Ryc. 7). Wyniki Po analizie w mikroskopie świetlnym zaobserwowano: Ryc. 3 Materiał usunięty z cylindrów po 8 tygodniach Ryc. 4 Skrzep krwi po 8 tygodniach (oryginalne powiększenie 40x): duża ilość włókien kolagenowych oraz mała ilość kostniwa

6 Ryc. 5 Gen-Ox po 8 tygodniach (oryginalne powiększenie 40x): duża ilość pozostałości materiału, mała ilość kości oraz sporo włókien kolagenowych Ryc. 7 Bio-Oss po 8 tygodniach (oryginalne powiększenie 40x): obecność resztek materiału, widoczna porowatość, obecność niedojrzałej kości oraz kostniwa Ryc. 6 Bone-Fill po 8 tygodniach (oryginalne powiększenie 40x): FC: włókna kolagenowe. Widoczne resztki materiału, widoczna porowatość, nowa kość w trakcie tworzenia z obecnością gotowych komórek Ryc. 8 Skrzep krwi po 12 tygodniach (oryginalne powiększenie 40x): widoczna obecność niedojrzałej kości w połączeniu z kostniwem oraz włóknami kolagenowymi Próbki 12 tygodniowe Skrzep krwi Próbki zawierające skrzep posiadały duża ilość włokien kolagenowych oraz fibroblastów, wykazywały obecność kostniwa oraz formującej się kości pierwotnej (Ryc. 8). Gen-Ox Próbki zawierające materiał Gen-Ox wykazywały obecność kości wtórnej z mniejszą ilością materiałów resztkowych. Większą ilość materiałów resztkowych stwierdzano w górnej części cylindra niż w dolnej części. Ślady resorpcji materiału widoczne były w całym cylindrze. Podobnie w całym cylindrze obserwowano włókna kolagenowe (Ryc. 9). Bone-Fill Próbki zawierające materiał Bone-Fill wykazywały obecność kości wtórnej w całym cylindrze. Ilość materiałów resztkowych znacznie się zmniejszyła, a wzrosła ilość kości wtórnej w porównaniu do próbek 8 tygodniowych (Ryc. 10). Bio-Oss Próbki zawierające materiał Bio-Oss wykazywały obecność wtórnej kości w całym cylindrze w większych ilościach w porównaniu z próbkami 8 tygodniowymi. Zaobserwowano również większy stopień resorpcji materiałów resztkowych. Stwierdzono również mniejszą ilość włokien kolagenowych (Ryc. 11).

7 Ryc. 9 Gen-Ox po 12 tygodniach (oryginalne powiększenie 40x): mała ilość świeżo uformowanej kości, duża ilość materiału resztkowego Ryc. 11 Bio-Oss po 12 tygodniach (część proksymalna cylindra, oryginalne powiększenie 40x): widoczna ilość uformowanej kości oraz wtórnie mała ilość resztek materiału Tab. 1 Histomorfometryczne analizy przez 8 tyg. Bio- Oss Bone- Fill Gen- Ox Blood clot New bone (mm 2 ) à 0.65 à Residual particles (mm 2 ) à Non-mineralized tissue (mm 2 ) Significant difference compared to Bio-Oss à Significant difference compared to Bone-Fill à 3.84 à Tab. 2 Histomorfometryczne analizy przez 12 tyg. Ryc. 10 Bone-Fill po 12 tygodniach (oryginalne powiększenie 40x): pewna ilość wtórnej kości, mała ilość materiału resztkowego oraz jego resorpcji Analizę histomorfometryczną przedstawiono w tabelach 1 oraz 2. Dyskusja Bio-Oss stanowi najbardziej rozpowszechniony oraz przebadany produkt tego typu na rynku. Podobne produkty dostępne są w Brazylii, jednak z mniejszym podparciem naukowym. Główny cel artykułu to porównanie wspomnianych materiałów ze złotym standardem, materiałem Bio- Oss. Zastosowanie kliniczne potwierdziło trafność użycia nieorganicznej ksenogenicznej kości bydlęcej. Artykuły porównujące wiele substytutów kości stosowanych w implantologii pokazały, że materiał ten posiada najlepsze właściwości kliniczne, histologiczne jak i histomorfometryczne [4-7]. Cząstki nieorganicznego ksenogenicznego przeszczepu Bio- Oss Bone- Fill Gen- Ox Blood clot New bone (mm 2 ) à 0.63 à Residual particles (mm 2 ) Non-mineralized tissue (mm 2 ) Significant difference compared to Bio-Oss à Significant difference compared to Bone-Fill bydlęcego ksenogeniczne bydlęcej stopniowo resorbują się i zostają i zastąpione przez nową kość, o cechach konstrukcyjnych bardzo podobnych do kości ludzkiej [4, 5, 13, 17]. Jedną z przyczyn może być uwalnianie włokien kolagenowych typu I podczas resorpcji preparatu Bio-Oss, co zostało zweryfikowane przez Taylor oraz współpracowników pod mikroskopem elektronowym [18]. Uwalnianie to powoduja większą agregację kryształów hydroksyapatytu. W tej samej pracy autorzy zwrócili uwagę, iż degradacja preparatu Bio -Oss walnych podczas procesów resorpcji oraz formowania

8 nowej kości ludzkiej, co może stanowić kolejny klucz do sukcesu. Zmiana genetyczna w funkcji genów osteoblastów spowodowana biomateriałem staje się najważniejszym czynnikiem spośród cytowanych [15,16]. Powtórzenie badań z innymi materiałami, wg schematu zaproponowanego przez autorów, pomoże ustalić jak ważny dla procesów naprawczych jest potencjał genetyczny wywoływany przez preparat Bio- Oss [15]. Potrzeba takich badań spowodowała wykorzystanie BioOss jako materiału porównawczego w tym badaniu, gdyż nie ma wątpliwości co do jego skuteczności jako substytutu kości w implantologii [4]. Pomimo licznych badań przeprowadzonych na królikach, nie ma wzoru w odniesieniu do części ciała gdzie preparat ma być stosowany, rodzaju defektu oraz czasu oceny [4, 7, 19-25]. Możliwość zastosowania do procesów regeneracyjnych oparto na wnioskach Frame a z 1980 roku [26]; badał uszkodzenia przy pomocy trepanów o różnych średnicach w sklepieniach czaszek królików, w celu określenia wielkości uszkodzenia nadającego się do badania. Stwierdzono, że minimalne uszkodzenie do naprawy, mogące być uznanym za wiarygodne to średnica 15 mm. Cylindry zastosowane w sklepieniach czaszek królików, stosowano już wcześniej do porównywania substytutów kości [7, 19-24]. Zastosowanie cylindrów pozwala na porównanie czterech preparatów u jednego zwierzęcia i pozwala na stworzenie większej złożoności danego ubytku niż w implantologii [7, 21, 23]. Cylinder wyprodukowany specjalnie na potrzeby tych badań, dobrze dopasowywał się do sklepienia czaszki królika; to w połączeniu z idealnym dopasowaniem przykręcanego wieczka cylindra, zapobiegało penetracji tkanek z okostnej oraz tkanki podskórnej, co nie zakłócało nowo formowania kości wywołanego badanym preparatem. Okres oceny 8 i 12 tygodniowy oparto na kilku publikacjach w literaturze, w których to zastosowano te same okresy. Frost [27] stwierdził, że 6 tygodni obserwacji odpowiada 17 tygodniom ludzkim, tak więc 8 tygodni u królika koresponduje z 24 tygodniami w przypadku organizmu ludzkiego; tak więc wyniki przedstawione w artykule odpowiadają rekomendacjom co do implantacji po zabiegach rekonstrukcyjnych u ludzi. Wypełnienie cylindrów losowo zapobiega różnicom w gęstości oraz unaczynieniu kości w sklepieniu czaszki zwierzęcia i ich wpływowi na wyniki badań. Metodologia pozwoliła nam na ustalenie wiarygodnego modelu znajdującego zastosowanie w przypadku człowieka. Wyniki uzyskane w 8 tygodniowych próbkach były podobne zarówno makroskopowo jak i mikroskopowo. Makroskopowo, Bio-Oss wykazywał mineralizację wraz z dobrym wbudowaniem cząsteczek. Wygląd makroskopowy, potwierdzony został histologicznie. Pod mikroskopem świetlnym, próbki z materiałem Bio- Oss ukazały wbudowanie cząsteczek w nowo formowanej kości. Pomimo, że kość nadal była nie dojrzała, stwierdzano to w licznych obszarach. Zauważono również resorpcję materiału. Część drobin wykazała wewnątrz resorpcję lub formowanie kości. Spowodowane to było porowatością granulek Bio-Oss. Makroskopowo preparat Bone-Fill przypominał Bio- Oss. W niektórych parach, mikroskopowo stwierdzono również podobieństwo nowo formowanej kości do kości wtórnej. Potwierdzono również obecność pozostałości materiału podobnie jak małej ilości włokien kolagenowych. W porównaniu do Bio-Oss, preparat Bone-Fill spowodował uformowanie kości w mniejszym zakresie, jednak bardziej ustrukturyzowanej. Zaobserwowany proces resorpcji był bardzo podobny jak przy preparacie Bio-Oss również w odniesieniu do nowo formowania kości, co nadawało cząsteczkom Bone- Fill porowatość. Cecha ta widoczna w Bio-Oss, obecna najprawdopodobniej również w Bone-Fill, jest przytaczana jako jeden z głównych czynników w dużym potencjale kościotwórczym takich materiałów [4, 5, 18, 27]. Przy usuwaniu próbek, Gen-Ox anorganic wykazał niewielkie wbudowanie cząsteczek preparatu, głównie w górnej części cylindra, a także małą ilość zmineralizowanych tkanek. Wrażenie makroskopowe potwierdzone zostało obserwacją w mikroskopie świetlnym. Stwierdzono duże ilości pozostałego materiału oraz włókien kolagenowych. Znaczna ilość nowo powstałej kości obecna była tylko w jednym skrawku, przy małej ilości nowej kości stwierdzanej w pozostałych. We wszystkich próbkach gdzie stwierdzano obecność kości, była ona w początkowym okresie mineralizacji, bez stabilnej struktury. Poziom resorpcji w przypadku preparatu Gen-Ox anorganic odbiegał od innych preparatów. Żaden ze skrawków nie ujawnił wewnętrznej resorpcji resztek w okolicach obwodowych. Sugeruje to, że ma terał ten nie wykazuje porowatości, co może tłumaczyć wolniejszą resorpcję oraz mniejszy poziom uformowanej kości niż w przypadku innych preparatów. Makro jak i mikroskopowe ustalenia znalazły potwierdzenie w analizie histomorfometrycznej, która zamieniła na liczby wyniki poprzednio przeprowadzonych testów. Wnioski Model badań zaproponowany w powyższych rozważaniach pozwala na stwierdzenie, że mimo iż wszystkie trzy preparaty wykazywały właściwości kościotwórcze, histologicznie Bio-Oss oraz Bone-Fill wykazały podobne oraz lepsze cechy niż Gen-Ox anorganic, wykazujący mniejszy stopień tworzenia kosci, wykazując tym samym najgorsze właściwości wśród trzech nieorganicznych, ksenogenicznych preparatów bydlęcych.

9 Podziękowania Autorzy wyrażają wdzięczność Sistema de Implantes Nacional reprezentowanemu przez Neide Lenharo oraz Dr. Ariel Lenharo za podarowanie tytanowych cylinder oraz śrub stosowanych w badaniach. Autorzy dziękują również Dr. Nelson Villa (Department of Histology, School of Dentistry, University of Santo Amaro/SP) oraz Dr. Andre Pelegrine za zabezpieczenie chirurgiczne. Autorzy nie podają konfliktu interesów w związku z przeprowadzeniem badań. References 1. Rokn AR, Khodadoostan MA, Reza Rasouli Ghahroudi AA, Motahhary P, Kharrazi Fard MJ, Bruyn HD, Afzalifar R, Soolar E, Soolari A (2011) Bone formation with two types of grafting materials: a histologic and histomorphometric study. Open Dent J 5: Fugazzotto PA, Vlassis J (1998) Long-term success of sinus augmentation using various surgical approaches and grafting materials. Int J Oral Maxillofac Implants 13: Al Ruhaimi KA (2001) Bone graft substitutes: a comparative qualitative histologic review of current osteoconductive grafting materials. Int J Oral Maxillofac Implants 16: Jensen T, Schou S, Stavropoulos A, Terheyden H, Holmstrup P (2012) Maxillary sinus floor augmentation with Bio-Oss or Bio- Oss mixed with autogenous bone as graft: a systematic review. Clin Oral Implants Res 23: McAllister BS, Margolin MD, Cogan AG et al (1999) Eighteenmonth radiographic and histologic evaluation of sinus grafting with anorganic bovine bone in the chimpanzee. Int J Oral Maxillofac Implants 14: Schlegel KA, Fichtner G, Shultze-Mosgau S (2003) Histologic Findings in sinus augmentation with autogenous bone chips versus a bovine bone substitute. Int J Oral Maxillofac Implants 18: Slott EC, Lundgren D, Burgos PM (2003) Placement of autogeneic bone chips or bovine bone mineral in guided bone augmentation: a rabbit skull study. Int J Oral Maxillofac Implants 18: Ferreira CEA, Novaes AB Jr, Haraszthy VI, Bittencourt M, Martinelli CB, Luczyszyn SM (2009) A clinical study of 406 sinus augmentation with 100 % anorganic bovine bone. J Periodontol 80: Urban IA, Nagursky H, Lozada JL (2011) Horizontal ridge augmentation with a resorbable membrane and particulated autogenous bone with or without anorganic bovine bone-derived mineral: a prospective case series in 22 patients. Int J Oral Implants 26: Aghazadeh A, Rutger Persson G, Renvert S (2012) A singlecentre randomized controlled clinical trial on the adjunct treatment of intra-bony defects with autogenous bone or a xenograft: results after 12 months. J Clin Periodontol 39: Jensen T, Schou S, Stavropoulos A, Terheyden H, Holmstrup P (2012) Maxillary sinus floor augmentation with Bio-Oss or Bio- Oss mixed with autogenous bone as graft in animals: a systematic review. Int J Oral Maxillofac Surg 41: Jensen T, Schou S, Gundersen HJ, Forman JL, Terheyden H, Holmstrup P (2013) Bone-to-implant contact after maxillary sinus floor augmentation with Bio-Oss and autogenous bone in different ratios in mini pigs. Clin Oral Implants Res 24: Cohen RE, Mullary RH, Noble B, Comeau RL, Neiders ME (1994) Phenotypic characterization of mononuclear cells following anorganic bovine bone implantation in rats. J Periodontol 65: Hämmerle CH, Lang NP (2001) Single stage surgery combining transmucosal implant placement with guide bone regeneration and bioresorbable materials. Clin Oral Implants Res 12: Carinci F, Piatelli A, Degidi M, Palmieri A, Perrotto V, Scapoli L, Martinelli M, Laino G, Pezzetti F (2006) Genetic effects of anorganic bovine bone (Bio-Oss) on osteoblast-like MG63 cells. Arch Oral Biol 51: Palmieri A, Pezzetti F, Brunelli G, Martinelli M, Muzio L, Scarano A, Scapoli L, Arlotti M, Guerzoni L, Carinci F (2010) Anorganic bovine bone (Bio-Oss) regulates mi RNA of osteoblast-like cells. Int J Periodontics Restor Dent 30: Piatelli M, Favero GA, Scarano A, Orsini G, Piatelli A (1999) Bone reactions to anorganic bovine bone (Bio-Oss) used in sinus augmentation procedures: a histologic long-term report of 20 cases in humans. Int J. Oral Maxillofac Implants 14: Taylor JC, Cuff SE, Leger JPL et al (2002) In vitro osteoclast resorption of bone substitute biomaterials used for implant site augmentation: a pilot study. Int J Oral Maxillofac Implants 17: Aghaloo TL, Moy PK, Frymiller EG (2004) Evaluation of platelet-rich plasma in combination with anorganic bovine bone in the rabbit cranium: a pilot study. Int J Oral Maxillofac Implants 19: Schmidlin PR, Nicholls F, Kruse A, Zwahlen RA, Weber FE (2013) Evaluation of moldable, in situ hardening calcium phosphate bone graft substitutes. Clin Oral Impl Res 24: Ezirganlı S, Polat S, Barıs E, Tatar I, Celik HH (2013) Comparative investigation of the effects of different materials used with a titanium barrier on new bone formation. Clin Oral Impl Res 24(312): Polo CI, Lima JLO, De Lucca L, Piacezzi CB, Homem MGN, Chavez VEA, Sendyk WR (2013) Effect of recombinant human bone morphogenetic protein 2 associated with a variety of bone substitutes on vertical guided bone regeneration in rabbit calvarium. J Periodontol 84: Dung SZ, Tu YK (2012) Effect of different alloplast materials on the stability of vertically augmented new tissue. Int J Oral Maxillofac Implants 27: Lundgren AK, Lundgren D, Hämmerle CH, Nyman S, Sennerby L (2000) Influence of decortication of the donor bone on guided bone augmentation. An experimental study in the rabbit skull bone. Clin Oral Implants Res 11: Guirado JLG, Fernández MPR, Negri B, Ruiz RAD, de-val JEMS, Moreno JG (2013) Experimental model of bone response to collagenized xenografts of porcine origin (OsteoBiol Ò mp3): a radiological and histomorphometric study. Clin Implant Dent Relat Res 15: Frame JW (1980) A convenient animal model for testing bone substitute materials. J Oral Surg 38: Frost HM (1963) Bone remodeling dynamics. Charles C Thomas Publisher, Springfield