PIWet-PIB, PUłAWY, 2009 r. Wersja 6,

Transkrypt

1 WDRAŻANIE SYSTEMU ZARZĄDZANIA W LABORATORIACH BADAJĄCYCH MIĘSO NA OBECNOŚD WŁOŚNI METODĄ WYTRAWIANIA PRÓBKI ZBIORCZEJ WSPOMAGANEGO MIESZADŁEM MAGNETYCZNYM PIWet-PIB, PUłAWY, 2009 r. 1

2 Opracowano w Zakładzie Higieny Żywności Pochodzenia Zwierzęcego Krajowym Laboratorium Referencyjnym ds. Włośni. Autorzy: lek.wet. Mirosław Różycki dr Mirosław Michalski prof. dr hab. Jacek Osek 2

3 Wstęp:... 5 Korzyści z posiadania sytemu zarządzania w laboratorium wg ISO Wdrażanie systemu zarządzania w laboratorium wg ISO etapy pracy... 6 Dokumentacja... 7 Polityka jakości... 7 Księga Jakości i procedury ogólne... 7 Identyfikacja dokumentacji... 8 Procedury... 9 Przykładowe procedury w laboratorium... 9 Instrukcje... 9 Zapisy Walidacja i sterowanie jakością Autoryzacja wyników Realizacja Badanie mięsa na włośnie metoda wytrawiania próbki zbiorczej wspomaganego mieszadłem magnetycznym Rutynowe badanie mięsa świń w ubojniach System identyfikacji Wytrawianie Aktywność pepsyny Kontrola procesu wytrawiania Proces sedymentacji Sedymentacja I Sedymentacja II Kontrola sedymentacji Wymagania stawiane personelowi, pomieszczeniom, sprzętowi i wyposażeniu w laboratoriach Personel Szkolenia Pomieszczenia Wyposażenie laboratorium Wymagania dla sprzętu stosowanego w laboratorium Rozdrabniacze, blendery (miksery) Wagi Warunki środowiskowe w laboratorium Wzorcowanie Odważniki kontrolne Termometry Chłodziarka lub komora chłodnicza Urządzenia do mycia szkła Mikroskop optyczny lub trychinoskop Mierniki i regulatory pomiaru czasu (zegary, stopery, minutniki) Pipety/pipetory Szklane naczynia i inne materiały laboratoryjne Przechowywanie Odkażanie sprzętu/szkła Aparatura i odczynniki niezbędne do wykonania badań: Wymagania w odniesieniu do trychinoskopów Odczynniki Gwarancja wysokiej jakości metody badania:

4 Walidacja metody Materiał odniesienia Procedura badawcza w laboratorium Ocena mięsa w przypadku stwierdzenia larw włośni Informacje dodatkowe: Wytyczne do przesyłania izolatów włośni Audit w laboratorium Sprawdzanie kompetencji (badanie biegłości) Przykłady dokumentacji przydatnej do oceny laboratorium jeszcze przed przystąpieniem do procesu akredytacji Opis systemu akredytacji Polskie Centrum Akredytacji - informacje ogólne Proces akredytacji Proces akredytacji obejmuje zawsze: Wniosek o akredytację Dokumentacja klienta Przegląd wniosku Skład zespołu oceniającego Przegląd dokumentacji i wizytacja wstępna Ocena Niegodność Ocena wykonania korekcji / działań korygujących Decyzja w procesie akredytacji Ogólne zasady prowadzenia procesów nadzoru Nadzór specjalny Zawieszenie akredytacji Wymagania szczegółowe Akredytacja organizacji mającej laboratoria w wielu lokalizacjach Wymagania akredytacyjne Parametry zakresu: W zakresie akredytacji laboratorium badawczego podaje się: Zasady prowadzenia oceny laboratoriów badawczych w procesach akredytacji i nadzoru Pobieranie próbek Laboratorium musi przedstawić dowody potwierdzające kompetencje personelu Proces nadzoru Planowane procesy nadzoru Dokumenty przywołane Dokumenty pomocnicze Dziedzinę badań i grupa obiektów: Uwagi końcowe:

5 Wstęp: Niniejszy dokument został opracowany w celu przybliżenia zagadnień związanych z akredytacją laboratoriom badającym mięso na włośnie. Stanowi on uzupełnienie Normy PN- EN ISO/IEC :2005 Ogólne wymagania dotyczące kompetencji laboratoriów badawczych i wzorcujących oraz podaje szczegółowe wskazówki w zakresie akredytacji laboratoriów badających mięso na włośnie. Opracowanie przeznaczone jest dla laboratoriów przygotowujących się do akredytacji. Wymagania normy EN ISO/IEC pozostają dokumentem wiążącym. Celem wdrażania systemu zarządzania w laboratorium diagnostyki włośnicy, jest uzyskanie wiarygodności jego działania i spełnienie wymagań prawnych. System zarządzanie to sformułowanie polityki laboratorium określonej w Księdze Jakości, określenie jej struktury organizacyjnej, ustalenie podziału odpowiedzialności, wyznaczenie osób nadzorujących obszary działania, udostępnienie zasobów niezbędnych do utrzymania systemu. System zarządzania winien być zgodny z wymaganiami normy PN-EN ISO/IEC :2005 "Ogólne wymagania dotyczące kompetencji laboratoriów badawczych i wzorcujących", oraz z obowiązującymi w Polsce przepisami prawa, w szczególności z Rozporządzeniem WE 2075/2005. Zasadą systemu zarządzania jest spełnienie wymagań klienta. W przypadku badania na włośnie metodą wytrawiania wspomaganego mieszadłem magnetycznym klientem laboratorium jest urzędowy lekarz weterynarii, który na podstawie wyniku badania podejmuje decyzję o przydatności mięsa do spożycia. Wymagania - to ustalone, przyjęte lub prawne wymagania i oczekiwania dotyczące jakości świadczonych usług. W celu zapewnienie zaufania, że wymagania te są spełnione, laboratorium ustala system zarządzania, obowiązujący na wszystkich etapach postępowania analitycznego. 5

6 Norma PN-EN ISO/IEC :2005 Ogólne badawczych i wzorcujących wymagania dotyczące laboratoriów Norma zawiera wymagania dotyczące jakości funkcjonowania laboratorium (w tym zakresie obejmuje między innymi: nadzór nad dokumentacją, kontakty z klientem, audit, itp.), jak również wymagania techniczne, jakie muszą spełnione w laboratorium (odnoszą się one między innymi do: kompetencji personelu, warunków i wyposażenia, wzorcowania, spójności pomiarowej, zapewnienie jakości wyników badań i wzorcowań). Korzyści z posiadania sytemu zarządzania w laboratorium wg PN-EN ISO/IEC : wiarygodność badań, - zapewnienie jakości badań, - spełnienie wymagań prawnych (do r. laboratoria diagnostyki włośnicy powinny poddać się procesowi akredytacji), - ograniczenie kosztów, - zwiększenie wydajności, - potwierdzenie kompetencji laboratorium do wykonywania określonych badań. Wdrażanie systemu zarządzania w laboratorium wg PN-EN ISO/IEC : etapy pracy Proces prac wdrożeniowych systemu zarządzania prowadzony jest w 9 etapach: 1. Ocena wstępna jest to określenie stopnia zgodności prowadzonej działalności z wymaganiami normy PN-EN ISO/IEC :2005 oraz Rozporządzenia Komisji WE 2075/ Szkolenie z zakresu opracowywania dokumentacji. 3. Przygotowanie dokumentacji - opracowywanie procedur, instrukcji, uprawnień i zakresu odpowiedzialności. 4. Opis funkcjonowania laboratorium pod kątem wymagań normy PN-EN ISO/IEC : Szkolenie auditorów wewnętrznych. 6. Szkolenie z wymagań normy ISO/IEC Wdrożenie systemu, korygowanie systemu. 6

7 8. Zgłoszenie laboratorium do akredytacji. 9. Akredytacja laboratorium. Dokumentacja Obowiązkiem laboratorium jest opracowanie dokumentacji związanej z systemem zarządzania. Dokumentacja ta formułuje wymagania i deklaruje ich spełnienie. W skład podstawowej dokumentacji laboratorium wchodzą: Polityka jakości Najważniejszym dokumentem systemu zarządzania jest sformułowana na piśmie polityka jakości. Opisuje ona strategię laboratorium, dotyczącą działania, rozwoju i doskonalenia systemu zarządzania. Zawiera deklaracje kierownictwa dotyczące stosowania wymagań norm, prowadzenia ciągłego doskonalenia, przeznaczenia niezbędnych dla rozwoju systemu zasobów, identyfikacji oraz spełniania potrzeb i oczekiwań klientów oraz cele postawione przez systemem. Można w niej zawrzeć informacje o potencjalnym udziale kontrahentów i partnerów, procesie doskonalenia pracowników, itp. Polityka jakości jest dokumentem jawnym i pełni kilka funkcji. Najważniejszą jest jej znaczenie dla zarządu laboratorium. Jest ona podstawą do ustanowienia celów i zadań w realizowanych procesach oraz stanowi ramy do utrzymania i doskonalenia usług. Określona i zakomunikowana umożliwia lepsze zrozumienie przez pracowników strategii działania laboratorium, celów i zadań a także precyzuje odpowiedzialność poszczególnych osób za jej realizację. Przy określaniu polityki jakości kierownictwo powinno uwzględniać przyjętą strategię rozwoju i jej główne cele. Polityka ta powinna być jasna i zrozumiała dla zainteresowanych stron, okresowo przeglądana i nowelizowana w celu odzwierciedlenia zmieniających się warunków zewnętrznych i procesów wewnętrznych. W związku z włączeniem laboratoriów badające mięso w kierunku włośni w strukturę ZHW nie będą one pisać własnej polityki jakości a jedynie polityka jakości ZHW zostanie rozszerzona o cele i strategię dotyczącą tych laboratoriów. Zadaniem laboratoriów diagnostyki włośnicy będzie zapoznanie się i dostosowanie się do niej. Księga Jakości i procedury ogólne przedstawiają zasady funkcjonującego systemu, odpowiedzialności i metody działania. Księga Jakości jest drugim, co do ważności dokumentem systemu zarządzania. 7

8 Księga Jakości obejmuje: opis systemu zarządzania, politykę jakości i procedury (treść lub tylko wykaz), normy zastosowane, sposób spełnienia wymagań, dokumentację systemu, nadzór działań związanych z jakością, stanowi przewodnik po systemie zarządzania, definiuje jakość laboratorium, wskazuje, że system jakości spełnia wymagania PN-EN ISO/IEC :2005. Forma przygotowania księgi jest dowolna, jednak należy ją podzielić na punkty i rozdziały, aby móc wykazać zdolność do zarządzania opisywanymi w nich wymaganiami w laboratorium. Ułatwieniem dla laboratorium jest układ treści zgodny z PN-EN ISO/IEC :2005 Księgę Jakości pisze się zwykle jako ostatni dokument systemu zarządzania. Przykładowa struktura Księgi Jakości: 1. Tytuł, 2. Spis treści, 3. Zakres Księgi Jakości, 4. Przedstawienie laboratorium, 5. Struktura organizacyjna, 6. Polityka jakości, 7. Lista celów jakości, 8. Procedury (lista lub treść), 9. Definicje i terminy, 10. Opis elementów systemu zarządzania. Identyfikacja dokumentacji Księga Jakości powinna posiadać stronę wstępną, na której znajdą się podpisy osób sprawdzających i zatwierdzających dokument, numer wersji oraz datę wydania. Przedstawienie laboratorium powinno zawierać nazwę, dane adresowe wyjaśnienie charakteru 8

9 i rodzaju działalności oraz krótką historię wraz z posiadanym doświadczeniem. Księga Jakości oraz zmiany wprowadzane w niej powinny być nadzorowane. Procedury obowiązujące w laboratorium obejmują: przekaz informacji, metody przygotowania próbek do badania, badania, wypełniania dokumentacji badawczej, korekcję czy audit. Przykładowy schemat procedury: 1. Cel, 2. Przedmiot procedury, 3. Zakres stosowania, 4. Terminologia, 5. Odpowiedzialność, 6. Zawartość procedury, 7. Struktura dokumentów, 8. Dokumenty związane, 9. Załączniki. Przykładowe procedury w laboratorium Procedura badania mięsa na włośnie metoda wytrawiania próbki zbiorczej wspomaganego mieszadłem magnetycznym, Procedura nadzoru nad dokumentami, Procedura nadzoru nad wyposażeniem pomiarowym, Procedura zakupu usług i dostaw, Procedura postępowania z próbkami do badań, Procedura sterowania jakością badań, Procedura zachowania poufności, Procedura przeglądu zarządzania, Procedura szkoleń personelu, Procedura nadzoru nad odpadami, Procedura nadzoru nad czystością w laboratorium. Instrukcje techniczne zawierają szczegółowe wytyczne postępowania. 9

10 Księga Jakości może zawierać procedury i instrukcje jednak w większych laboratoriach celowe jest publikowanie ich jako oddzielnych dokumentów. Instrukcje są opisem przebiegu procesów, w którym szczegółowo przedstawia się kolejne czynności oraz uprawnienia i odpowiedzialność wykonawców. Laboratorium diagnostyki włośnicy musi ustalić i opisać system identyfikacji próbek, pobierania próbek, przechowywania i transportu materiału do laboratorium, system przyjmowania, identyfikacji i segregacji próbek oraz rejestracji i przygotowania próbek do wykonania zleconych badań. Zapisy potwierdzą spełnienie wymagań (stanowią dokumentacje operacyjną pracy systemu). Walidacja i sterowanie jakością Aby zapewnić zaufanie i zdobyć dowody, iż uzyskiwane wyniki badań rutynowych spełniają ustalone wymagania odnośnie ich jakości oraz będą użyteczne w ocenie mięsa, laboratorium powinno stosować zwalidowane metody badawcze z oszacowaną niepewnością pomiarów. Walidacja metody badania na włośnie metodą wytrawiania próbki zbiorczej wspomaganego mieszadłem magnetycznym walidacja została wykonana i opublikowana przez : Lorry B. Forbes a, W. Brad Scandrett a oraz Alvina A. Gajadhara w 1999 r. Walidacja metody zakłada minimalną wykrywalność larw włośni w próbkach z badań biegłości na poziomie > 75%, a docelową wykrywalność w badaniach na poziomie 1larwy w 1g badanej próbki. Uzyskanie wyniku pozytywnego w badaniach biegłości jest równoznaczne z walidacja metody. Sterowanie jakością badań powinno być ujęte w procedurze, celem sterowania jakością jest zapewnienie jakości wyników badań. Procedura ta ustala tryb i zasady sterowania jakością badań. Kierownik komórki organizacyjnej zatwierdza plan sterowania jakością badań zaś nadzorujący badania są odpowiedzialni za opracowanie i wdrażanie planów sterowania jakością oraz ich poprawność. Wykonujący badania są odpowiedzialni za realizację planów sterowania jakością. W sterowaniu jakością można stosować następujące metody: - badanie próbek z certyfikowanych materiałów odniesienie (CRM), - materiałów odniesienia zakupionych w handlu (RM) - przygotowanych w laboratorium (HRM) - badanie próbek o znanej charakterystyce, - badanie próbek archiwizowanych, jeżeli istnieje możliwość jej podziału, 10

11 - badanie równoległe tej samej próbki laboratoryjnej, jeżeli istnieje możliwość jej podziału przed badaniem. Próbki stosowane w kontroli wewnętrznej powinny zawierać larwy włośni jednak należy również stosować próbki ujemne. Wyniki oznaczeń należy zapisywać w karcie kontrolnej. Każde laboratorium ma obowiązek regularnego uczestnictwa w programach porównań międzylaboratoryjnych lub programach badania biegłości, w zakresie stosowanych metod badawczych. Ich celem jest potwierdzenie własnych kompetencji technicznych w tym obszarze. Uzyskane wyniki podlegają analizie przez nadzorującego badanie wraz z wykonawcą badania. Nadzorujący badania sporządza zapisy, które przekazuje kierownikowi ds. jakości. W przypadku uzyskania niezadowalających rezultatów z uczestnictwa w programach porównań międzylaboratoryjnych lub programach badania biegłości, nadzorujący badania wraz z kierownikiem ds. jakości ustalają przyczynę zaistniałej niezgodności i określają plan działań korygujących. Skuteczność przyjętego systemu wewnętrznego sterowania jakością jest oceniana wynikami uzyskiwanymi w programach porównań miedzylaboratoryjnych. Badania takie są organizowane od 2005 r. przez Państwowy Instytut Weterynaryjny Państwowy Instytut Badawczy - Krajowe Laboratorium Referencyjne (KLR). Uczestnictwo w tych programach jest obligatoryjne, zgodnie z Rozporządzeniem (WE) 2075/2005 oraz z polityką Polskiego Centrum Akredytacji. Polityka ta dotyczy wykorzystywania badań biegłości / porównań międzylaboratoryjnych w procesach akredytacji i nadzoru laboratoriów. Wyniki wewnętrznej i zewnętrznej kontroli jakości pozwalają na monitorowanie stabilności systemów analitycznych oraz rozpoznanie potrzeb w celu podejmowania działań korygujących i zapobiegawczych. Autoryzacja wyników Laboratorium musi posiadać ustalony system autoryzacji wyników, postępowania z wynikami negatywnymi oraz formę wydawanego sprawozdania z badań. Sprawozdanie powinno być sporządzane zgodnie z potrzebami odbiorców i zawierać wszelkie istotne informacje niezbędne do prawidłowej interpretacji wyników. Sprawozdania autoryzują wyznaczeni lekarze weterynarii. 11

12 Realizacja System zarządzania powinni realizować wszyscy pracownicy laboratorium. Obejmuje on: sformułowanie celów jakościowych, ustalenie i opracowanie procedur postępowania dla każdego obszaru działalności laboratorium, przygotowanie dokumentacji przedstawiającej zasady funkcjonującego systemu oraz sposób ich realizacji, prowadzenie dokumentacji potwierdzającej realizację zasad systemu, wykonywanie badań przez kompetentny personel zwalidowanymi metodami, znajomość procedur i instrukcji technicznych obowiązujących na danym stanowisku pracy oraz zgodne z nimi postępowanie, zapewnienie nadzoru oraz systematycznego szkolenia personelu, System zarządzania i prawidłowe sterowanie jakością, wdrożone w celu spełnienia wymagań, wymaga oszacowania ich potrzeb, systematycznego poddawania auditom wewnętrznym poszczególnych obszarów działalności laboratorium, przeprowadzania przeglądów zarządzania, a w przypadku stwierdzenia niezgodności, bezzwłocznego wdrażania działań korekcyjnych i zapobiegawczych. Podejmowane działania zapobiegawcze mogą być miarą ciągłego doskonalenia funkcjonowania systemu, bowiem wdrożony system zarządzania obliguje do podejmowania starań, aby wykraczać ponad oczekiwania klienta. Badanie mięsa na włośnie metoda wytrawiania próbki zbiorczej wspomaganego mieszadłem magnetycznym Włośnica jest zoonozą wywoływaną przez nicienie wewnętrzne. Zarażenie następuje po spożyciu mięsa, w którym znajdują się żywe larwy włośni. Jedynym sposobem zapobiegania włośnicy jest przerwanie jej łańcucha epizootycznego. Badanie mięsa ma na celu wyeliminowanie tusz zarażonych włośniami. Obecnie stosowana metoda badania polegająca na wytrawianiu próbki zbiorczej, składającej się z próbek o masie, co najmniej 1 g, jest uważana za wystarczającą do zabezpieczenia 12

13 konsumentów przed skutkami zarażenia włośnicą. Dla produktów spożywanych bez gotowania zaleca się bardziej dokładne badania. Rutynowe badanie mięsa świń w ubojniach Do rutynowego badania tusz świńskich zalecana jest metoda wytrawiania próbki zbiorczej z zastosowaniem wspomagania mieszadłem magnetycznym. Metoda wytrawiania larw włośni jest metodą rekomendowaną jako metoda referencyjna, pozwala ona na wykrycie minimum trzech larw w 100 gramach mięsa w 75% testów. Walidacja metody wytrawiania dla wieprzowiny i mięsa końskiego była wykonana w akredytowanym laboratorium w Kanadzie (Forbes i Gajadhar, 1999). Metoda ta jest opisana w Załączniku I Rozporządzenia (WE) 2075/2005. Wiadomym jest, że czasem są stosowane pewne modyfikacje w zalecanej metodyce wytrawiania. Jednakże nie mogą one wpływać na wynik końcowy wytrawiania. Istnieje kilka zasad, które muszą być bezwarunkowo spełnione w celu uwiarygodnienia metody. Zasady te opisano poniżej: System identyfikacji Sprawdzalny system zbierania i identyfikacji próbek. System ten musi gwarantować bezwarunkowo, że 1 g lub większe indywidualne próbki tworzące próbkę zbiorczą zapewnią identyfikację poszczególnych zwierząt. Do badania próbki mięsa muszą zostać pobrane natychmiast po uboju i bezzwłocznie przebadane w laboratorium dopuszczonym do badania mięsa na obecność włośni. Skrawki tkanki mięśniowej nie powinny zawierać tłuszczu i powięzi, ponieważ nie są one wytrawialne i nie zawierają larw włośni. Tak przygotowane skrawki winny być poddane procesowi miksowania, mielenia lub maceracji, który wspomaga proces trawienia (metoda samego rozdrabniania pozostaje sprawą indywidualnego wyboru). W celu przygotowania próbki przez miksowanie należy zmieszać do 100 g tkanki z równą objętością wody z kranu i zmiksować (5-10 sekund) w rozdrabniaczu. Zbyt krótkie miksowanie może skutkować brakiem pełnego wytrawienia, z kolei zbyt długie może zniszczyć larwy włośni. Zalecane jest rozdrabnianie próbek zbiorczych i indywidualnych w rozdrabniaczu, aż do uzyskania jednolitej masy. Wytrawianie Każda ze 100 g próbek powinna być wytrawiana w objętości 2 litrów kwaśnego płynu trawiącego. Wszystkie części rozdrabniacza mające kontakt z badaną próbką powinny zostać 13

14 starannie przepłukane podgrzaną (45 ± 2 0 C) i zakwaszoną HCl wodą wodociągową, która po uzupełnieniu do 2 litrów, będzie stanowić objętość wytrawianej próbki. Płyn trawiący musi być zawsze dobry jakościowo i przygotowany w sposób zapobiegający spadkowi aktywności pepsyny. Należy pamiętać, że przygotowując płyn trawiący należy zawsze dodać kwas solny do wody a dopiero potem pepsynę. Taka kolejność chroni enzym przed jego degradacją spowodowaną użyciem stężonego kwasu. W przypadku rozdrabniania przy użyciu rozdrabniacza, odpowiednia ilość pepsyny powinna zostać dodana na etapie maceracji tkanki mięśniowej a następnie całość przepłukana i przeniesiona do 3 litrowej zlewki z zakwaszoną wodą (o objętości jak wyżej). Do wytrawiania próbek (zawieszonych w 2 litrach objętości) należy używać 3 litrowych zlewek zakrytych folią aluminiową, która zabezpiecza przed rozpryskaniem płynu podczas intensywnego mieszania na mieszadle magnetycznym (magnesy o długości ok. 5 cm) Minimalny czas wytrawiania wynosi 30 minut (w niektórych przypadkach wymagany jest dłuższy czas trawienia). Zasadą metody jest pełne rozpuszczenie tkanki mięśniowej. Temperatura płynu trawiącego powinna wynosić C i być kontrolowana przez cały czas tego etapu. Wytrawianie jest zakończone, gdy w płynie trawiącym nie widać nawet najmniejszych kawałków tkanki mięśniowej. Aktywność pepsyny Inne czynniki, takie jak pochodzenie i jakość enzymu, warunki przechowywania pepsyny, ilości używanego enzymu i kwasu, stosunek wagowy płynu trawiącego do masy wytrawianej próbki, powinny odpowiadać opublikowanym zaleceniom. Temperatura utrzymywana w procesie wytrawiania nie powinna przekroczyć C. Wyższe temperatury inaktywują enzym i przez to wpływają negatywnie na skuteczność procesu wytrawiania, powodują destrukcję larw, zmniejszają ich ruchliwość a przez to obniżają ich wykrywalność. Kontrola procesu wytrawiania Po etapie trawienia (minimum 30 minut), na sitku mogą pozostać jedynie nierozpuszczone resztki tkanki łącznej (maksymalnie 5% masy próbki zbiorczej). Wytrawianie tkanki mięśniowe powinno być całkowite, aby zapewnić skuteczność metody. W celu spełnienia warunku całkowitego wytrawienia można przedłużyć czas trawienia maksymalnie do 1 h. Jeśli po tym czasie nie nastąpiło rozpuszczenie tkanki mięśniowej to 14

15 należy zweryfikować jakość pepsyny. Obecność tkanki mięśniowej w ilości powyżej 5% świadczy o nieprawidłowym procesie wytrawiania, uzyskanie Proces sedymentacji Sedymentacja I Proces sedymentacyjny i czas opadania larw powinny spełniać wymóg odzyskiwania jak największej liczby larw. W obecnie stosowanych procedurach zakłada się 30 minutowy czas sedymentacji. Skracanie tego czasu może skutkować odzyskiwaniem mniejszej liczby larw, a w konsekwencji tego nieprawidłowymi wynikami. Przedłużenie tego czasu skutkuje powstaniem strontów białkowych i trudnościami w odczycie. Pozyskanie warstwy sedymentacyjnej z rozdzielacza musi odbyć się przy całkowitym otwarciu części spustowej, zapobiegając w ten sposób recyrkulacji larw oraz pozwalając, aby włośnie znajdujące się na ściankach bocznych rozdzielacza zostały porwane strumieniem płynu wytrawiającego. Z rozdzielacza należy pozyskać 40 ml płynu do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Sedymentacja II Druga sedymentacja ma na celu skupienie larw włośni przed ostatecznym badaniem. Po pozyskaniu 40 ml płynu i 10 minutowej sedymentacji należy ostrożnie usunąć wierzchnią warstwę płynu (w ilości 30 ml) tak, aby w kolbie miarowej pozostało 10 ml płynu z larwami włośni. Płyn ten należy przenieść do rynienki do liczenia larw. Następnie należy przepłukać kolbę miarową ciepłą wodą w ilości 10 ml, popłuczyny należy przenieść do rynienki tak aby w chwili badania znajdowało się w niej 20 ml płynu. Kontrola sedymentacji Płyn sedymentacyjny musi być na tyle przejrzysty, aby można dostrzec larwy włośni. Standardowym testem przejrzystości jest możliwość odczytu druku gazetowego podłożonego pod dnem rynienki do zliczania larw zawierającego płyn do badania. Przy braku przejrzystości, dostrzeżenie larw jest bardzo utrudnione lub wręcz niemożliwe. W takim wypadku należy doczyścić preparat poprzez przeprowadzenie dodatkowej sedymentacji z czystą wodą w ilości 30 ml. 15

16 Wymagania stawiane personelowi, pomieszczeniom, sprzętowi i wyposażeniu w laboratoriach Personel Badanie metodą wytrawiania może być wykonywane przez personel posiadający doświadczenie w tej dziedzinie. Osoby te powinny mieć podstawową wiedzę o włośniach, powinny znać ich morfologię, znać inne larwy nicieni jak również powinny rozpoznawać niestrawione elementy próbki (fragmenty tkanki mięśniowej, sierści, itp.). Personel powinien raz w roku uczestniczyć w badaniach biegłości. Od personelu laboratorium zawsze wymagana jest absolutna czystość, podobnie jak wymaga się utrzymywania w czystości pomieszczeń, sprzętu: - personel zobowiązany jest ubierać się w pracy w czystą specjalną odzież, myć ręce kilka razy w czasie dnia pracy i po każdej przerwie; - nie wolno dopuścić, aby w laboratoriach dopuszczonych do badania mięsa na obecność włośni przebywało jakiekolwiek zwierzę; - używany sprzęt i instrumenty muszą być utrzymane w bezwzględnej czystości i dobrym stanie; - wyposażenie musi być dokładnie myte kilka razy w ciągu dnia pracy i po jej zakończeniu. W celu uniknięcia przemęczenia i jego następstw, personelowi powinny przysługiwać krótkie przerwy w trakcie pracy. Szkolenia Odpowiednie szkolenie powinno obejmować wszystkie aspekty metody, zawierać procedurę badania, biologię i odporność włośni na warunki środowiska. Każdorazowe szkolenie powinno zawierać zajęcia teoretyczne i praktyczne. Szkolenie powinno być prowadzone przez wykwalifikowany personel (np. przez personel z KLR bądź innego specjalistę będącego pod jurysdykcją KLR), zdobytymi umiejętnościami kursant powinien się wykazać podczas przeprowadzonego testu. Warunki lokalowe i środowiskowe Warunki środowiskowe powinny spełniać wymagania normy PN-EN ISO/IEC :2005, która dostarcza dodatkowych wskazówek dla laboratoriów wykonujących badania urzędowe. 16

17 W przypadku laboratoriów diagnostyki włośnicy (zlokalizowanych przy ubojni) wymagane są następujące pomieszczenia lub wydzielone miejsca opisane poniżej. Pomieszczenia Istnieją określone wymagania środowiskowe dotyczące warunków do przeprowadzania badań. Zaleca się, w zależności od rodzaju wykonywanych badań, ograniczyć dostęp do laboratorium tylko dla uprawnionego personelu. Tam, gdzie takie ograniczenia obowiązują, zaleca się poinformowanie personelu o: przeznaczeniu danego obszaru; ograniczeniach obowiązujących w czasie pracy w takim obszarze; powodach wprowadzenia takich ograniczeń; właściwych stopniach izolacji. Tab. 1. Wydzielone miejsca lub pomieszczenia i wymagania w laboratoriach badania mięsa w kierunku włośni. 1. Miejsce przygotowywania próbek; jego ściany muszą być gładkie i muszą być wykończone zmywalnym pokryciem w jasnym kolorze lub farbą do wysokości 2 metrów. 2. Miejsce do badania z użyciem trychinoskopu 3. Wentylacja zapewniająca, że temperatura w pomieszczeniu nie przekroczy +25 o C; 4. Naturalne bądź sztuczne oświetlenie, które nie powoduje zmiany kolorów; 5. Sprzęt do mycia i dezynfekowania rąk; 6. Lodówki do przechowywania pepsyny i próbek; 7. Miejsce przeznaczone do mycia i dezynfekowania sprzętu do przeprowadzania badań (np. pojemników na próbki, sprężarek, noży i nożyczek), posiadające: 8. Wodoszczelne, nierdzewne pojemniki, przeznaczone do zbierania próbek po przebadaniu, zaprojektowane w ten sposób, by zapobiec nieuprawnionemu usuwaniu zawartości; 9. Odpowiedni sprzęt do ochrony przed szkodnikami (owadami, gryzoniami itp.) Zaleca się, aby przestrzeń robocza była dostatecznie duża, umożliwiająca utrzymanie czystości i porządku. Powinna ona być proporcjonalna do liczby wykonywanych analiz oraz 17

18 ogólnej wewnętrznej organizacji laboratorium. Zaleca się, aby spełniała ona wymagania określone w krajowych przepisach dotyczących tych zagadnień, o ile takie istnieją. Zaleca się, aby laboratoria posiadały odpowiednią wentylację i temperaturę. Można to zapewnić przy pomocy naturalnej lub wymuszonej wentylacji, lub też korzystając z urządzeń klimatyzacyjnych. W wypadku zastosowania urządzeń klimatyzacyjnych, zaleca się stosowanie odpowiedniego typu filtrów oraz dokonywanie ich przeglądów, konserwacji i wymiany zgodnie z rodzajem wykonywanej pracy. Wyposażenie laboratorium Laboratorium musi być wyposażone w sprzęt odpowiedni do stosowanej metody i zatrudniać osoby upoważnione do jego obsługi. Laboratorium powinno posiadać przynajmniej jeden dodatkowy zestaw badawczy w na wypadek wystąpienia awarii sprzętu używanego w badaniach bieżących. Fartuchy i narzędzia pomocnicze (np. może, nożyczki, pęsety, rozdrabniacze do mięsa, mieszadła magnetyczne, szklane pojemniczki) powinny być okresowo wymieniane. Pojemniki z HCl powinny stać w odpowiednim miejscu z filtrami, bądź z odpowiednim systemem odprowadzania oparów. Kwas powinien być dodawany pod wyciągiem chemicznym, bądź pod zamkniętym systemem nie pozwalającym na przedostawania się oparów. Personel pracujący z HCl musi być stosownie ubrany i mieć zabezpieczaną twarz i ręce. Materiały zużywalne (zarówno jednorazowego użytku jak i chemikalia) powinny być dostępne w odpowiednich, wystarczających do badań ilościach i przechowywanych w odpowiednich miejscach. Wymagania dla sprzętu stosowanego w laboratorium Sprzęt stosowany z laboratorium powinien być sprawny technicznie i metrologicznie. Należy poddawać go regularnym sprawdzeniom w zakresie poprawności działania oraz konserwować zgodnie z zaleceniami producenta. Wszelkie czynności metrologiczne oraz konserwacyjne powinny być udokumentowane. Sprzęt będący na gwarancji wymaga postępowania zgodnego z tymi warunkami. Rozdrabniacze, blendery są sprzętem stosowanym do rozdrabniania tkanki mięśniowej. W laboratorium można stosować rozdrabniacze obrotowe z regulowaną szybkością obrotów w zakresie wymaganym metodyką lub inne urządzenie do homogenizowania o odpowiedniej skuteczności. Zwykle czas rozdrabniania w homogenizatorze wynosi od 1 do 3 min. Należy pamiętać aby rozdrabnianie prowadzić pulsacyjnie. Homogenizatory, mieszadła pulsacyjne 18

19 należy regularnie czyścić i dezynfekować. Dezynfekcję przeprowadzać tylko w przypadku badania materiału zawierającego larwy włośni. Wagi stosowane są do odważania próbki analitycznej. Laboratorium powinno być wyposażone w wagi, o wymaganym zakresie udźwigu dla odważania różnych produktów i o określonej niepewności pomiaru. Jeżeli nie określono tego, zaleca się, aby przy ważeniu próbek maksymalny błąd wynosił 1% lub był mniejszy. Dla metody wytrawiania dokładność wag powinna wynosić 0,1 g. Warunki środowiskowe w laboratorium powinny być zgodne z wymaganiami podanymi przez producenta urządzenia, zawartymi w instrukcjach obsługi poszczególnych wag analitycznych. Należy monitorować warunki środowiska w laboratorium. Dotyczy to zarówno pomieszczeń, w których znajdują się wagi jak również pomieszczeń, w których znajdują się trichinoskopy. Zalecane warunki środowiska dla trichinoskopów to temperatura w granicach C. Wagi należy umieszczać na stabilnej poziomej powierzchni, dostosowując ją, jeśli to konieczne do zapewnienia poziomu i zabezpieczenia aparatu przed wibracjami i przeciągami. Zaleca się, aby po stosowaniu lub w następstwie rozlania podczas odważania lub zanieczyszczenia waga była czyszczona i dezynfekowane odpowiednimi środkami niepowodującymi korozji. Wykonywanie wzorcowania i sprawdzeń powinno być regularne. Sprawność wagi w czasie pracy oraz po czyszczeniu/konserwacji powinna być regularnie sprawdzana kontrolnym odważnikiem przez przeszkoloną osobę. Wzorcowanie powinno być wykonywane w zakresie stosowanego ważenia przez uprawnione laboratorium wzorcujące z ustaloną częstotliwością zależną od stosowania. Wagi powinny być poddawane wzorcowaniu, co dwa lata. Laboratorium musi stworzyć program wzorcowania i sprawdzania parametrów wyposażenia, które ma bezpośredni wpływ na wyniki badań. Częstotliwość wzorcowań i sprawdzania parametrów powinna być określana na podstawie udokumentowanego doświadczenia i ma wynikać z potrzeby, rodzaju i wcześniejszego zachowywania się wyposażenia. Odstępy czasu pomiędzy wzorcowaniami i sprawdzeniami powinny być krótsze, niż czas, jaki by upłynął do stwierdzenia, że odchylenia parametrów / wskazań wyposażenia zaczęły przekraczać dopuszczalne granice. Odważniki kontrolne Odważniki mogą być także sprawdzane bezpośrednio po wzorcowaniu wagi. Odważniki kontrolne powinny także podlegać nadzorowi metrologicznemu. Przed przystąpieniem do 19

20 każdego ważenia należy wykonać sprawdzenie wagi. W celu sprawdzenia wagi należy zważyć odważnik kontrolny o masie zbliżonej do ważonych próbek. Jeżeli uzyskany wynik wykracza poza dopuszczalne granice określone w świadectwie wzorcowania, należy wagę doprowadzić do stanu używalności. Sprawdzenie wagi należy udokumentować. Termometry Wszystkie termometry używane w laboratorium powinny być sprawdzane w odniesieniu do termometru wzorcowego zgodnie z założonym planem lub wzorcowane co 1-2 lata. Przed wstępnym użyciem i przynajmniej raz na 5 lat termometry odniesienia (wzorcowe) powinny być wzorcowane z zapewnieniem spójności pomiarowej z wzorcami krajowymi lub międzynarodowymi. Zaleca się okresowe sprawdzanie w pojedynczym punkcie, np. punkcie topnienia lodu. Taka czynność to udokumentowane sprawdzenie w mieszaninie lodowowodnej (0ºC). Element pomiarowy termometru należy zanurzyć na głębokość 10 cm, mieszać i odczytać po 2 min. Można dodatkowo sprawdzać/kalibrować termometry we wrzącej wodzie uwzględniając temp. wrzenia wody na danej wysokości od poziomu morza i ciśnienia atmosferycznego. Termometry i inne przyrządy monitorujące temperaturę powinny zapewnić pomiar wymaganej mierzonej temperatury z podaniem maksymalnych dopuszczalnych błędów. Zaleca się, aby niepewność pomiaru przyrządów monitorujących temperaturę była czterokrotnie niższa niż wartość dopuszczalnego maksymalnego błędu. Na przykład dla przyjętego maksymalnego dopuszczalnego błędu 1 C zaleca się, aby niepewność pomiaru wynosiła 0,25 C; dla przyjętego maksymalnego dopuszczalnego błędu 0,5 C, niepewność pomiaru wynosiła ±0,125 C. Termometry (sondy w przypadku termometrów elektronicznych) umieszczane w łaźni wodnej powinny być zanurzone w wodzie zgodnie z indywidualnymi wymaganiami, np. przez częściowe zanurzenie termometrów do głębokości podanej dla danego termometru, na przykład 70 mm lub 100 mm. Termometry i termopary należy utrzymywać czyste i w dobrym stanie. Nie wolno stosować termometrów, jeżeli rurka z rtęcią lub alkoholem została uszkodzona. Urządzenia chłodnicze i grzejne Chłodziarka lub komora chłodnicza pozwala na przechowywanie próbek mięsa oraz odczynników w niskich temperaturach. W celu ochrony próbek do badań przed zepsuciem należy zapewnić temperaturę 5 C ± 2 C. Idealnym rozwiązaniem byłoby przechowywanie próbek i odczynników w oddzielnych chłodziarkach (lodówkach). Temperaturę komory należy sprawdzać codziennie termometrem lub sondą zainstalowaną na stałe w lodówce.. 20