Metody bioinformatyki Podstawy inżynierii genetycznej prof. dr hab. Jan Mulawka
Czym jest inżynieria genetyczna Zbiór technik rekombinowania i klonowania DNA Wydzielanie i charakteryzowanie pojedyńczych genów Poznaje się strukturę i działanie genów
Fragmentowanie DNA Gdy poszukujemy pojedynczych genów w genomie danego organizmu Narzędziem są na ogół enzymy restrykcyjne Można też użyć ultradźwięków przepuszczając DNA przez wąską kapilarę
Enzymy restrykcyjne (restryktazy) Enzymy klasy II endonukleazy Tną dwuniciowe DNA w specyficznym miejscu wyznaczonym przez charakterystyczny dla tego enzymu ciąg nukleotydów. Np. enzym EcoRI wytwarzany przez E. coli tnie pomiędzy G oraz A (w nici wiodącej) oraz pomiędzy A oraz G (w nici opóźniającej), jeśli napotka następującą sekwencję: 5' : : : GAATTC : : : 3' 3' : : : CTTAAG : : : 5'
Rekombinowanie DNA in vitro to łączenie fragmentów DNA Enzym ligazy DNA wytwarza wiązania fosfodiestrowe Wektory to niewielkie cząsteczki DNA mające zdolność do samodzielnej replikacji w komórce
Klonowanie DNA Podłączony do wektora fragment DNA będzie po wprowadzeniu zrekombinowanej cząsteczki do komórki ulegał powielaniu Podczas klonowania strawione przy pomocy enzymów restrykcyjnych fragmenty DNA ligujemy z wektorami a następnie wprowadzamy je do komórek w procesie transformacji
Wektory plazmidowe Plazmid to mała kolista cząstka DNA, która nie jest związana z żadnym chromosomem. Może być wprowadzona do komórki bakterii, od której się wywodzi. Często używa się plazmidów E. coli. Plazmid musi zawierać miejsce startu replikacji (aby mógł się replikować, gen lub kilka genów odpowiedzialnych za odporność na pewne anybiotyki.
Pozostaje jeszcze pewna część w DNA plazmidu, w którą można wstawić fragment obcego DNA (o długości do 15-20 kbp) Następnie hoduje się bakterie, dodając antybiotyk. Te bakterie, które zawierają plazmidy z genem odporności na ten antybiotyk przeżywają Powstaje w ten sposób kolonia klonów
Wektory fagów Fagi są wirusami atakującymi bakterie E.coli Ich genom ma rozmiar 50 kbp, z czego 25 kpb można usunąć, wymieniając na obcy DNA, bez wpływu na proces infekowania bakterii Fag namnaża się w zainfekowanej komórce, produkując nawet więcej niż 100 kopii w jednej komórce Zabija przy tym bakterię, uwalniając zreplikowane nowe kopie wirusa Przygotowanie zmutowanych fagów można przeprowadzać in vitro
Inne wektory Kosmidy: połączenie techniki wykorzystania plazmidów z techniką fagów Tworzy się duże plazmidy, które są wprowadzane do bakterii przy pomocy obudowy" od fagów Dzięki temu pomysłowi można tworzyć wstawki o długości 45 kbp Wektory P1: 100 kbp
Mapa restrykcyjna Jest to obraz cząsteczki DNA, na którym zaznaczone są miejsca rozpoznawane przez różne enzymy restrykcyjne z uwzględnieniem odległości między nimi wyrażonej w nukleotydach.
Elektroforetogram dla wektorów puc19 i pms02
Mapa restrykcyjna wektora pms02
Mapa plazmidu pbr322 Podkreślono symbole enzymów przecinających cząsteczkę tylko w jednym miejscu Liczby oznaczają numer kolejny nukleotydu od EcoRI
Zastosowanie plazmidu pbr322 do klonowania DNA Wyróżnianie klonów zawierających zrekombinowane wektory
Mapa restrykcyjna plazmidowego wektora puc19
Wytwarzanie krótkich delecji i insercji w sklonowanych genach
Wytwarzanie serii delecji genowych
Metody sekwencjonowania Metoda chemiczna Maxama-Gilberta (1977) Przeprowadza się cztery reakcje chemiczne, które tną nić DNA w miejscach A+G (puryny), C+T (pirymidyny), C Reakcja jest tak przeprowadzana, aby każdą nić przeciąć tylko w jednym miejscu Używając elektroforezy na żelu, porównuje się długości pociętych fragmentów(radioaktywnie zaznacza się jeden koniec nici i przeprowadza autoradiografię prążków powstałych w żelu). Ta metoda jest pracochłonna i kosztowna
Sekwencjonowanie DNA metodą Maxama i Gilberta
Metoda enzymatyczna Sangera (1977) Matrycą jest jednoniciowe DNA. Do niej dołącza się starter (tzw. primer) Jest on syntetycznie wyprodukowany. Jego koniec 5' jest oznakowany radioaktywnie Proces przeprowadza się w 4 probówkach. W każdej z nich znajduje się matryca ze starterem, nukleotydy A, C, G, T oraz jeden z czetrech rodzajów nukleotydów pozbawiony grupy 3'- hydroksylowej (tzw. dideoksy ATP, CTP, GTP, TTP)
Do tego dodaje się enzym DNA polimerazy, który powoduje wydłużanie nici zaczynającej sie starterem Dołączenie w danym momencie dideoksy powoduje, że proces wydłużania zostaje zatrzymany (bo nie ma końca 3') Następnie denaturuje się podwójne nici, wykonuje elektroforezę dla porównania długości i przeprowadza autoradiografię prążków powstałych w żelu
Sekwencjonowanie DNA metodą Sangera
Technika PCR PCR (Polimerase Chain Reaction) reakcja łańcuchowa polimerazy odkryta przez Kary Mullisa (1985) Jest używana do szybkiego kopiowania materiału genetycznego Proces ma charakter wzrostu wykładniczego
Podstawowe kroki procesu PCR Chcemy powielić materiał genetyczny zawarty w pewnym regionie DNA Wytwarzamy syntetycznie startery (dwa rodzaje), których pozycje będą ograniczały ten region z obu stron Dajemy bardzo dużo starterów oraz wolnych nukleotydów do materiału, który mamy powielić Dodajemy enzym polimerazy (Taq polimerazę z bakterii Thermus aquaticus, żyje w 72C)
Powtarzamy cyklicznie trzy kroki: 1. Podgrzewamy roztwór do temperatury 95C. Następuje denaturacja nici materiału genetycznego 2. Ochładzamy do 60C. Wówczas startery łączą się z pojedynczymi nićmi Ponieważ materiału genetycznego jest mało w porównaniu z liczbą starterów, to szansa połączenia nici materiału genetycznego ze sobą jest mała
3.Następuje faza budowania nowych (komplementarnych) nici przez enzym polimerazy. Po zakończeniu tej fazy cykl powtarzamy tak długo aż uzyskamy odpowiednią ilość materiału genetycznego. Po każdym cyklu PCR ilość materiału genetycznego podwaja się. W ten sposób można powielać (amplifikować) fragmenty o długości do 20 kbp Przykładowe zastosowanie: wykrywanie wirusa HIV w bardzo wczesnym stadium zarażenia (przed wystąpieniem objawów)
Biblioteki genomowe Pobiera się genomowe DNA, tnie na kawałki 20 kbp przy pomocy enzymu, którym się również tnie genom faga Następnie tworzy się zrekombinowane fagi po czym zaraża nimi bakterie, aby wytworzyć dużą liczbę kopii Tak otrzymane kolonie nazywają się bibliotekami genomowymi Zamiast faga używa się również plazmidów czy też sztucznych chromosomów
Historia poznawania sekwencji genomów Zsekwencjonowanych jest ponad 180 genomów różnych organizmów. Poniżej przedstawiono chronologię najważniejszych wydarzeń związanych z projektami sekwencjonowania: Bakteriofag X174 (5,4 kbp) pierwszy całkowicie zsekwencjonowany w całości materiał genetyczny (Sanger, 1972) Fag (48,5 kbp), Sanger 1982
Bakteria Haemophilus influenze (1 830 kbp), Venter 1995 Bakteria Mycoplasma genitalium (580 kbp), Venter 1995 Drożdże piekarskie Saccharomyces cerevisiae (13 500 kbp) { pierwszy genom eukariota, (współpraca międzynarodowa), 1996 Bakteria Escherichia coli (4600 kbp), 1997 Nicień Caenorhabditis elegans (100600 kbp) 1998
Człowiek, chromosom 22, (35600 kbp) 1999 Człowiek, chromosom 21, (34ó00 kbp) 2000 Muszka owocowa Drosophila melanogaster (160600 kbp) 2000. Rzodkiewnik Arabidopsis thaliana (100600 kbp), 2000 Człowiek, cały genom Homo sapiens (3500600 kbp), 2001
Mysz Mus musculus (3600600 kbp), 2002 Kurczak Gallus gallus (1 300600 kbp), 2004 Ryż Oryza sativa (390600 kbp), 2005 Szympans Pan troglodytes (3 100600 kbp), 2005
Genom człowieka (Human Genome Project) Zapis całego genomu zajmie (używając alfabetu A,C,G,T) około 750 Mb pamięci Inicjatywa projektu powstała w USA pod koniec 1984 Uruchomienie projektu nastąpiło w 1988 Główną rolę przy realizacji przewidziano dla NIH (National Institutes of Health) ale również mocno zaangażowany jest Departament Energii
Główny udział w odkodowaniu ludzkiego genomu mają: Francis Collins Craig Venter
Projekt zaplanowano na 15 lat i łączny budżet 3 mld USD (po 200 mln USD na rok) Jest to obecnie bardzo duże międzynarodowe przedsięwzięcie, w którym udział biorą m.in.: USA, Francja, Japonia, Niemcy, Rosja, Wielka Brytania W lutym 2001 zaanonsowano ukończenie pierwszego szkicu całego genomu człowieka
Francis Collins i Craig Venter na spotkaniu 26.06.2000 u prezydenta Billa Clintona Spotkaliśmy się, żeby obejrzeć mapę o jeszcze większym znaczeniu dla ludzkości Otwiera się dla nas nowa era Posiedliśmy moc uzdrawiania Genetyka zrewolucjonizuje medycynę Genetyka wyleczy nas z większości, choć nie ze wszystkich chorób
Przewidywania Collinsa na rok 2010 Genetyczne testy diagnostyczne na co najmniej 12 różnych chorób będą powszechnie dostępne Będziemy mogli zmniejszyć ryzyko zachorowania na kilka z tych chorób Wielu lekarzy pierwszego kontaktu będzie korzystało z medycyny opartej na genetyce Diagnostyka preimplantacyjna będzie powszechnie dostępna
Nie sprawdziły się przewidywania Odnośnie powstania nowych leków dzięki inżynierii genetycznej (zarzuca się koncernom, że często tworzą leki bez zrozumienia biologii) Nie osiągnięto zbyt wiele w dziedzinie genetyki raka, mimo że poświęcono na to wiele czasu i ogromne fundusze Chociaż koszt odczytywania materiału genetycznego spada, to jednak zalewa uczonych fala informacji, która przeciąża ich umysły i dyski komputerów
Osiągnięcia w inżynierii genetycznej dokonane przez ostatnie 10 lat Nastąpił ogromny postęp w technologiach odczytujących DNA Drastyczny spadek ceny za te usługi zmniejszyły się one 14 tysięcy razy! Odczytano pełną informację genetyczną wielu organizmów w tym 14 gatunków ssaków Rozwój genetyki zmienił prace ewolucjonistów Udostępniono już genomy 13 osób
Dzisiejsza genetyka rozwija się w dwóch kierunkach Odczytywanie jak największej ilości materiału genetycznego, by mieć bazę do porównań Poszukiwanie odpowiedzi na pytanie, jakie jeszcze funkcje pełni w organizmie ludzkim DNA
Rola ciemnej materii DNA Nasze skłonności do chorób w większości wcale nie znajdują się w genach Przypuszcza się, że zapisane są one w tzw. ciemnej materii DNA (introny) Materiał ten na pierwszy rzut oka jest śmietnikiem i nie koduje niczego Jak mamy szukać informacji, jeśli nie wiemy, co jest śmieciem, a co nie
Sztuczne życie W maju 2010 Craig Venter poinformował o stworzeniu pierwszej komórki, której kod genetyczny został w całości wyprodukowany przez człowieka w laboratorium Opracowanie technologii syntetycznej bakterii Bakteria ta ma przetwarzać dwutlenek węgla na paliwo Venter postanowił opatentować swoją metodę naukową
Dalszy postęp inżynierii genetycznej upatruje się w: Ogólnym postępie technologicznym Użyciu superkomputerów działających z szybkością tysiąc razy szybciej do porównań tysięcy DNA Odczytaniu informacji zawartych w bakteriach