Zastosowanie technologii interferencji RNA w medycynie

Zastosowanie technologii interferencji RNA w medycynie Application of RNA interference in medicine Marta Gabryelska 1, Eliza Wyszko 1, Stanis³aw Nowak 2, Ryszard ukiel 2, Jan Barciszewski 1 1 z Instytutu Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu 2 z Katedry i Kliniki Neurochirurgii i Neurotraumatologii A.M. im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu kierownik: prof. dr Stanis³aw Nowak Streszczenie Interferencja RNA nale y do technik anty-mrna adaptowanych do celów terapeutycznych. Ma potencjalne zastosowanie w leczeniu chorób wirusowych, nowotworowych, neurodegeneracyjnych i innych. Wykorzystanie RNAi zale y od trwa³oœci wyciszenia docelowego genu, ³atwoœci dostarczenia sirna do chorej tkanki z zachowaniem jej aktywnoœci oraz brakiem efektów ubocznych. Obecnie prowadzone s¹ liczne badania kliniczne sprawdzaj¹ce skutecznoœæ i bezpieczeñstwo terapii opartej na tej technologii. Wiele firm farmaceutycznych i biotechnologicznych pracuje nad komercjalizacj¹ zastosowañ RNAi. Summary RNA interference is one of anty-mrna techniques, adapted for a therapeutic purpose. It can be used for treatment of cancer, viral, neurodegenerative or other diseases. Therapeutic applications of RNAi depend on persistent gene silencing and lack of side effects. Clinical trials are in progress, checking an effectiveness and safety of RNAi. Many pharmaceutical and biotechnological companies are seeking for commercial application of that technology. S³owa kluczowe: interferencja RNA, inhibicja ekspresji genów, badania kliniczne, gen docelowy, efekty uboczne Key words: RNA interference, gene epression inhibition, gene - target, side effects Wstêp Organizmy eukariotyczne maj¹ naturalny mechanizm obronny w postaci interferencji RNA (ang. RNA interference, RNAi). Jest to proces, w którym d³ugie odcinki dwuniciowych RNA ulegaj¹ hydrolizie do krótkich dupleksów RNA o d³ugoœci 21 do 28 nukleotydów oraz indukuj¹ swoist¹ degradacjê jednoniciowych RNA (ang. single stranded RNA, ssrna), takich jak mrna lub egzogenny RNA, np. wirusowy (18). Dlatego w³aœnie RNAi mo e funkcjonowaæ jako specyficzny stra nik genomu oraz regulator ekspresji genów (18). Zjawisko interferencji RNA badano u A. thaliana, S. pombe, S. cerevisiae, D. melanogaster, C. elegans, N. crassa, M. musculus, H. sapiens oraz wielu innych organizmach (1). Mimo wielu podobieñstw wystêpuj¹ drobne ró nice miedzy organizmami. Dotycz¹ one roli tego procesu w komórkach, rozprzestrzeniania siê sygna³u wyciszania, obecnoœci okreœlonych komponentów maszynerii RNAi oraz mo - liwoœci ich wykorzystania (18, 19). W 2001 roku przeprowadzono pierwsze eksperymenty z wykorzystaniem sirna w komórkach ssaków, a tak e pojawi³y siê doniesienia o efektach ubocznych tej techniki (62). Nie zmieni³o to jednak faktu, e interferencja RNA jest bardzo obiecuj¹c¹ metod¹ wyciszania genów ciesz¹c¹ siê wielkim zainteresowaniem zarówno w badaniach podstawowych jak i w biotechnologicznych zastosowaniach. Terapia chorób wirusowych i nowotworów Konwencjonalne metody terapeutyczne maj¹ na celu zahamowanie syntezy lub aktywnoœci biologicznej danej cz¹steczki, bia³ka strukturalnego, enzymu lub receptora. Wp³yw dowolnego terapeutyku na komórkê mo e dotyczyæ transkrypcji docelowego genu, etapu potranskrypcyjnego lub potranslacyjnego. Prze³omem w poszukiwaniu nowych preparatów medycznych okaza³y siê wykonane 30 lat temu badania antysensownych kwasów nukleinowych. Nieco póÿniej pojawi³y siê trójniciowe kompleksy (3), rybozymy oraz aptamery i 10 lat temu interferencja RNA. Systematyczne wyciszanie kolejnych produktów genów przy pomocy RNAi mo e byæ pomocne w znalezieniu genu krytycznego dla wzrostu komórek rakowych, a mniej istotnego dla proliferacji komórek zdrowych (39). Jego identyfikacja u³atwi zaprojektowanie Neuroskop 2006, nr 8 143

Tabela 1. Charakterystyka kwasów nukleinowych wykorzystywanych do inhibicji mrna (5). PNA ang. peptide nucleic acid, LNA ang. locked nucleic acid. Charakterystyka kwasów Antysensowne sirna nukleinowych do inhibicji mrna oligonukleotydy Oligonukleotydy DNA lub RNA RNA Struktura Jednoniciowe; 16-30 nukleotydów Dwuniciowe; 19-21 nukleotydów z dwunukleotydowymi niesparowaniami na koñcach Mo liwe modyfikacje chemiczne Wi¹zanie fosforotioatowe, Koniugacja z cholesterolem, 2 -O-metoksyetyl, 2 -O-metyl, LNA, 2 -deoxy-2 -fluorourydyna, PNA, LNA, morpholino 2 -fluoropirymidyna Udzia³ prekursorów w syntezie Nie Tak (poprzez dzia³anie Dicer) Rodzaj hydrolizy mrna RNaza H RISC Standardowa dawka efektywna in vitro 50-400 nmol/l 5-100 nmol/l Pierwsze wykorzystanie in vivo 1991 2002 Badania kliniczne Liczne fazy kliniczne 1-3 w toku; Lokalna aplikacja lokalna lub ogólna aplikacja 144 Neuroskop 2006, nr 8 RNAi, które mo e byæ wykorzystane przeciwko dowolnemu czynnikowi patologicznemu, zarówno endogennemu jak i egzogennemu. W odniesieniu do chorób o zdefiniowanej etiologii przeprowadzono badania z wykorzystaniem RNAi in vitro i in vivo w organizmach modelowych. Interferencyjny RNA obok rybozymów, deoxyrybozymów i antysensownych oligonukleotydów zalicza siê do technologii anty-mrna (tab. 1). Antysensowne oligonukleotydy (ang. antisense-oligodeoxynucleotides, AS-ON), s¹ to ³añcuchy (10-20 nukleotydowe) komplementarne do docelowego mrna (38). Wiêkszoœæ z nich aktywuje RNazê H, która hydrolizuje niæ RNA w utworzonych heterodupleksach DNA-RNA. Inne AS-ON, nie aktywuj¹ce RNazy H, powoduj¹ zahamowanie translacji poprzez blokowanie rozpoznania przez rybosom (38). Dotychczas tylko jeden lek oparty na AS-ON (Vitravene) wykorzystywany jest w leczeniu choroby oczu wywo³anej przez cytomegalowirusy (CMV) u pacjentów z AIDS (38, 56). Jednak nowsza metoda leczenia AIDS HAART (ang. Highly Active Anti-Retroviral Therapy) skutecznie zapobiega zapaleniom siatkówki i popyt na lek DNA jest ograniczony (66). Innym terapeutykiem typu AS-ON jest preparat Genasense, obni aj¹cy poziom bia³ka Bcl-2 (56). Rybozymy s¹ katalitycznymi cz¹steczkami RNA, które swoiœcie hydrolizuj¹ mrna i uniemo liwiaj¹ syntezê kodowanego przez niego bia³ka. Praktyczne zastosowanie rybozymów zosta³o poddane w w¹tpliwoœæ, poniewa rybozymowy lek na ó³taczkê typu C wywo³a³ u doœwiadczalnej ma³py œlepotê, prawdopodobnie z powodu zbyt wysokich dawek, natomiast inny lek z tej grupy nie hamowa³ rozwoju nowotworu u chorych z zaawansowanym rakiem piersi (66). Dotychczas aden lek oparty na katalitycznych RNA nie zosta³ wprowadzony do praktyki medycznej i zatwierdzony przez DA (ang. ood and Drug Administration) (56). Etap badañ klinicznych osi¹gnê³y dotychczas preparaty Angiozyme ( aza II) oraz Herzyme ( aza I) (38). Pierwsze zastosowania RNAi wzbudzi³y wielki entuzjazm, jakiego naukowcy nie doœwiadczyli wczeœniej w przypadku innych metod (39). Jednak e jej powodzenie jako nowej techniki terapeutycznej bêdzie zale a³o g³ównie od mo liwoœci wprowadzenia nie zdegradowanego leku do chorych komórek, który musi byæ wystarczaj¹co trwa³y, aby wyciszyæ mrna (66). Ka dy lek oparty o RNAi musi byæ zatem stabilny, selektywny, nietoksyczny, móc pokonaæ barierê w postaci b³on komórkowych i nie powodowaæ negatywnego wp³ywu na organizm (64). Zastosowania interferencji RNA Oczywistym celem ograniczenia ekspresji genów z wykorzystaniem technologii RNAi s¹ wirusy stanowi¹ce powa ne zagro enie dla cz³owieka, miedzy innymi wirus HIV (ang. human immunodeficiency virus), wirusy grypy (ang. influenza virus), wirusowego zapalenia w¹troby typu B (ang. hepatitis B virus, HBV) i C (HCV), wirusy polio (ang. poliovirus), brodawczaka (ang. human papilloma virus, HPV), wirusy herpes (ang. herpes simplex virus, HSV),

Tabela 2. Wybrane przyk³ady inhibicji infekcji wirusowych za pomoc¹ interferencji RNA. NP bia³ko nukleokapsydu, PA sk³adnik transkryptazy RNA wirusa grypy, bia³ko 94 kda, U38 - polimeraza DNA, UL27 - glikoproteina, UL29 bia³ko wi¹ ¹ce DNA, UL54 polimeraza DNA, Env poliproteina otoczki wirusa, Tat transaktywator transkrypcji, Rev bia³ko regulatorowe, Zta czynnik transkrypcyjny, TRS sekwencja reguluj¹ca transkrypcjê, Spike bia³ko otoczki, PBMCs - ang. peripheral blood mononuclear cells, jednoj¹drzaste komórki krwi obwodowej (limfocyty, monocyty). Nazwa Czynnik Cz¹steczka Gen Efekt Lit. choroby etiologiczny RNAi docelowy interferencji RNA AIDS HIV-1 sirna Env Inhibicja replikacji wirusa 52 w kom. krwi, sirna Tat, Rev PBMCs Inhibicja replikacji 10 wirusa w kulturach lhrna (plazmid) Nef kom. Inhibicja replikacji 37 wirusa w kulturach kom. Roseola herpesvirus-6b sirna U38 Inhibicja replikacji wirusa 76 infantum, (HHV-6B) w linii kom. Exanthem subitum Opryszczka Herpes simplex sirna UL27, UL29 Ochrona myszy 51 narz¹dów virus 2 (HSV-2) przed letaln¹ infekcj¹ p³ciowych Cytomegalia CMV sirna UL54 Inhibicja replikacji wirusa 72 w linii kom. Mononukleoza Epstein Barr sirna Zta Inhibicja replikacji wirusa 6 zakaÿna virus (EBV) (plazmid psuper) w linii kom. Zapalenie w¹troby typu B HBV sirna (plazmid Regiony Inhibicja replikacji wirusa 80 psilencer) zachowawcze w linii kom. Grypa, influenza virus sirna (plazmid NP, PA Inhibicja replikacji wirusa 41 Ptasia grypa (wirus grypy) peg P) w linii kom. Zapobieganie i leczenie 21 infekcji u myszy Ciê ki ostry SARS sirna TRS, 3'-UTR, Inhibicja replikacji wirusa 74 zespó³ coronavirus Spike w linii kom. oddechowy (SCV) sirna Zapobieganie i leczenie 40 infekcji u Macaca mulatta rotawirusy, RSV (ang. respiratory syncytial virus), cytomegalowirusy (ang. human cytomegalovirus, HCMV), wirus West Nile i wiele innych (64). Wiele badañ in vitro oraz in vivo, maj¹cych na celu inhibicjê ekspresji wirusowych genów, przynios³o jednoznaczne wyniki wskazuj¹ce na mo liwoœæ hamowania replikacji wirusów (tab. 2). Jako geny docelowe u wirusów wymienia siê te zaanga owane w replikacjê i sk³adanie cz¹stek wirusowych, specyficzne sekwencje ich genomów oraz transkrypty komórkowe gospodarza u³atwiaj¹ce inwazjê lub patogennoœæ takie jak specyficzne receptory komórkowe czy czynniki transkrypcyjne (64). G³ównym problemem w leczeniu chorób infekcyjnych jest opornoœæ na stosowane leki. Dotyczy to zw³aszcza szybko mutuj¹cych wirusów. Wydaje siê zatem, e inhibicja wirusa wieloma interferuj¹cymi RNA jednoczeœnie skierowanymi przeciwko ró - nym regionom genomu zmniejsza jego szanse na unikniêcie efektu RNAi poprzez spontaniczne mutacje (64). Ludzkie wirusy wykszta³ci³y pewn¹ formê ochrony genomu przed efektem RNAi, opart¹ o oddzia³ywania Neuroskop 2006, nr 8 145

Tabela 3. Wybrane przyk³ady terapii chorób nowotworowych za pomoc¹ RNAi. E6, E7 regulatory replikacji wirusa, EG R receptor czynnika wzrostu naskórka, XIAP zwi¹zany z chromosomem X inhibitor apoptozy, K-ras regulator cyklu komórkowego, COX-2 - cyclooksygenaza-2, Bcr-abl bia³aczkowy gen fuzyjny. Nazwa Czynnik Cz¹steczka Gen Efekt interferencji RNA Lit. choroby etiologiczny RNAi docelowy Rak szyjki human shrna E6, E7 Komórki rakowe (HeLa) 53 macicy papillomavirus (wektor wra liwe na chemioterapiê (HPV) lentiwirusowy) Rak p³uc wiele czynników dsrna EG R Zmniejszenie iloœci EG R 78 w linii kom., inhibicja wzrostu guza u myszy Rak piersi wiele czynników sirna Kinaza Redukcja proliferacji, indukcja 22 cholinowa ró nicowania w linii kom. sirna XIAP Inhibicja proliferacji, pobudzenie 81 (plazmid) apoptozy w linii kom. Rak trzustki wiele czynników sirna K-ras Zwiêkszenie odpowiedzi 71 apoptotycznej w linii kom. Rak wiele czynników sirna COX-2 Zmniejszenie iloœci COX-2 7 okrê nicy w linii kom. Bia³aczka wiele czynników sirna Bcr-abl Znaczne obni enie ekspresji 70 szpikowa Bcr-abl, inhibicja proliferacji linii kom. Guzy wiele czynników shrna EG R Zmniejszenie iloœci EG R 82 mózgu (plazmid) w kulturach tk. oraz u myszy, zwiêkszenie prze ywalnoœci myszy pomiêdzy kapsydem a genomem (58). Nukleokapsyd wirusa miêsaka Rous a (ang. Rous sarcoma virus) os³ania wprowadzany wirusowy RNA przed degradacj¹, a koñcowy efekt RNAi zale y od wybranego docelowego fragmentu RNA (64). Podobny rodzaj supresji RNAi jest obserwowany w przypadku wirusa RSV (ang. respiratory syncytial virus), gdzie genom mo e byæ niedostêpny dla sirna z powodu utworzenia kompleksu z bia³kiem (45). Podobna sytuacja dotyczy innych wirusów, np. HIV. Z tego powodu proces degradacji docelowego RNA musi rozpocz¹æ siê w odpowiednim momencie cyklu rozwojowego wirusa, kiedy jego genom bêdzie dostêpny. Do g³ównych markerów biochemicznych zaanga owanych w powstawanie nowotworów zalicza siê receptor bia³kowej kinazy tyrozynowej (ang. protein tyrosine kinase, PTK), gruczolakowatej polipowatoœci coli (ang. adenomatous polyposis coli, APC), onkogen Gli (ang. glioma-associated oncogene, Gli), fosfoinozytolow¹ kinazê 3 (ang. phosphoinisitide 3-kinase, PIK3), szlak transdukcji bia³ek SMAD, czynnik transkrypcyjny indukuj¹cy niedotlenienie (ang. hypoxia-inducible transcription factor, HI ), retinoblastoma (ang. retinoblastoma, Rb) oraz szlak 146 Neuroskop 2006, nr 8 apoptozy (APOP) (50). Wœród wyciszanych genów znajduj¹ siê geny wirusowe, onkogeny, geny fuzyjne, geny opornoœci wielolekowej (ang. multidrug resistance, MDR) (32), regulatory proliferacjii i inne (tab. 3). Obecnoœæ mechanizmu RNAi potwierdzono tak e u Trypanosoma brucei, Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii, Paramecium, Leichmania donovanii (1). Jest to istotne poniewa pierwotniaki s¹ Ÿród³em wielu chorób (64). Wyzwanie dla interferencji RNA stanowi¹ tak e choroby wywo³ane przez takie czynniki jak cukrzyca, czy oty- ³oœæ (tab. 4), choroby wywo³ane przez mutacje punktowe, choroby neurodegeneracyjne oraz zwi¹zane ze zmienn¹ liczb¹ powtórzeñ mikrosatelitarnych. Du a dok³adnoœæ i skutecznoœæ dzia³ania sirna umo liwia leczenie chorób wywo³anych przez mutacje punktowe, insercje czy delecje zidentyfikowanych genów (18). Olbrzymim wyzwaniem s¹ choroby, u których pod³o a le y alternatywny splicing, który w oko³o 70%-90% prowadzi do powstania bia³ek o zmienionych funkcjach (20). Do chorób tych zaliczane s¹ miêdzy innymi demencja czo³owo-skroniowa (ang. frontotemporal dementia), parkinsonizm zwi¹zany z chromosomem 17, niedobór hormonu wzrostu i inne (20).

Tabela 4. Terapia innych chorób za pomoc¹ RNAi; berghepain-1 i 2 proteaza cysteinowa, DHODH dehydrogenaza dihydroorotowianu, PEPCK karboksykinaza fosfoenolo-pirogronianowa, AGRP - agouti-related peptide, SOD1 dysmutaza ponadtlenkowa, Htt - IT15, huntingtyna. Nazwa Czynnik Cz¹steczka Gen Efekt choroby etiologiczny RNAi docelowy interferencji RNA Lit. Malaria Plasmodium sp. sirna berghepain-1 i 2 Obni enie poziomu mrna 48 paso yta u myszy dsrna DHODH Obni enie tempa namna ania siê paso yta 46 Cukrzyca wiele czynników (wektor) PEPCK Obni enie poziomu cukru 23 we krwi, poprawiona tolerancja glukozy u myszy. Pl¹sawica wzrost iloœci shrna zmutowany htt Poprawa zachowania 27 Huntingtona powtórzeñ CAG (wektor AAV) i nieprawid³owoœci w genie htt neuropatologicznych u myszy Oty³oœæ wiele czynników sirna, AGRP Przyspieszony metabolizm, 43 shrna (wektor redukcja masy cia³a myszy. psuper) Stwardnienie mutacja w genie shrna SOD1 OpóŸnienie objawów 54 zanikowe SOD1 (wektor i postêpu choroby boczne (ALS) lentiwirusowy) u myszy Terapeutyczne RNAi Jak podkreœlono wczeœniej terapeutyczne zastosowanie RNAi zale y od trwa³oœci wyciszenia, ³atwoœci rozprzestrzeniania siê sirna w obrêbie chorej tkanki, ich aktywnoœci biologicznej, a tak e brak efektów ubocznych. sirna uwa a siê za skuteczny, je eli w stê eniu 1-20 nm prowadzi do efektywnego i specyficznego wyciszenia 90% (47). Ró nice w efektywnoœci sirna, skutecznoœci transfekcji, rodzaju wykorzystanej linii komórkowej i stabilnoœci bia³ek mog¹ wp³ywaæ na osi¹gniêty efekt RNAi (45). Nale y pamiêtaæ, e rezultaty uzyskane w badaniach in vitro nie ³atwo przek³adaj¹ siê na wyniki otrzymane in vivo. Rolê induktora wyciszania (ang. trigger) w przypadku ssaków skutecznie spe³niaj¹ dwuniciowe shrna (ang. short hairpin RNA) lub sirna (ang. short interfering RNA) o d³ugoœci 20 do 23 nukleotydów, zawieraj¹ce niesparowane 2 nukleotydy przy koñcu 3' (60). U ssaków d³ugie cz¹steczki dsrna indukowa³y interferon (60). W przypadku innych grup organizmów oraz niektórych linii komórkowych (np. ES, P19) mo liwe jest u ycie dsrna bez indukcji odpowiedzi immunologicznej (68). Doœwiadczenia z komórkami linii embrionalnej (ang. embryonic stem cells, ES) czy linii potworniakorakowej P19 (ang. teratocarcinoma cells) s¹ trudne ze wzglêdu na opornoœæ na transfekcjê (68). sirna charakteryzuje siê wysok¹ efektywnoœci¹ wprowadzenia do komórki oraz mo liwoœci¹ osi¹gniêcia tam wysokiego stê enia. Zastosowanie takich cz¹steczek jest ograniczone ze wzglêdu na nietrwa³y efekt wyciszenia, który zale y od tempa podzia³ów komórkowych, komórki ssaków nie maj¹ systemu powielania RNAi (jak w przypadku C. elegans i roœlin) (26). W badaniach procesu interferencji RNA istotna jest odpowiednia linia komórkowa, je eli doœwiadczenia na ywym organizmie s¹ utrudnione lub niemo liwe. Komórki takie musz¹ byæ ³atwe w hodowli, ³atwo ulegaæ transfekcji oraz posiadaæ nisk¹ wra liwoœæ na ewentualne modyfikacje chemiczne dostarczanych cz¹steczek sir- NA. Bardzo czêsto wykorzystuje siê komórki nowotworowe ze wzglêdu na ich ³atwe namna anie (tab. 5), chocia nie wszystkie typy schorzeñ s¹ reprezentowane przez wymienione linie komórkowe. Przylegaj¹ce do pod³o a linie komórkowe, takie jak HeLa i U2OS umo liwiaj¹ ³atwy, efektywny sposób wprowadzenia cz¹steczek interferencyjnego RNA oraz szybki, silny wzrost w dobrze zorganizowanych pojedynczych warstwach, co u³atwia obserwacjê mikroskopow¹ (15). Wtórne linie komórkowe nie s¹ odpowiednikami ludzkich komórek chorobowych i dlatego trudno porównywaæ badania na nich wykonywane. Efektywnoœæ transfekcji pierwotnych linii komórkowych wynosi mniej ni kilka procent. Skutecznoœæ zale y nie tylko od typu komórek, ale tak e od liczby pasa y i stopnia konfluencji komórek (45). Wiele linii komórkowych wykazuje tak e genetyczn¹ niestabilnoœæ, co prowadzi do utraty klonal- Neuroskop 2006, nr 8 147

Tabela 5. Linie komórkowe wykorzystywane w badaniach wyciszania genów przez sirna (68, 63). Linia komórkowa Tkanka Ÿród³owa A-431 Ludzki rak skóry A549 Ludzki rak p³uc BV173 Ludzki prekursor B bia³aczki C-33A Rak szyjki macicy HPV-negatywny CA46 Ludzki ch³oniak Burkitt a Caco2 Ludzkie komórki nab³onka okrê nicy CHO Jajnik chiñskiego chomika COS-7 Nerka afrykañskiej ma³py 5 ibroblasty szczura H1299 Ludzkie niema³e komórki raka p³uc HaCaT Ludzkie keratynocyty HEK 293 Ludzka embrionalna nerka HeLa Rak szyjki macicy HPV-pozytywny Hep3B Ludzki rak komórek w¹trobowych HUVEC Ludzkie komórki nab³onka y³y pêpkowej IMR-90 Ludzki diploidalny fibroblast K562 Ludzka przewlek³a bia³aczka szpikowa Karpas 299 Ludzki ch³oniak limfocytów T MC -7 Ludzki rak piersi MDA-MB-468 Ludzki rak piersi MV-411 Ludzka ostra bia³aczka monocytowa NIH/3T3 ibroblasty myszy P19 Embrionalny rak u myszy SDI Ludzka ostra bia³aczka limfoblastyczna SKBR3 Ludzki rak piersi T98G Ludzkie komórki glioblastomy U2OS Ludzkie komórki miêsaka kostnego noœci oraz zmian kariotypu i fizjologii (15). W zale noœci od podatnoœci komórek na transfekcjê proponowane s¹ ró ne rozwi¹zania metodyczne (ryc. 1). Wstêpne badania skutecznoœci interferencji RNA w uk³adach komórkowych pozwalaj¹ oceniæ stosowane cz¹steczki sirna lub shrna. Zaproponowano dwufunkcjonaln¹ konstrukcjê sirna-dna zwan¹ crook sirna (34). Umo liwia ona wykrywanie bardzo niskiego poziomu sirna efektywnego dla RNAi, pobranej przez komórki iloœci sirna, lokalizacji komórkowej, rozprowadzenia do tkanek, a tak e farmakokinetyki. W crook sirna do koñca 3 sensownej nici sirna do³¹czona jest struktura DNA typu spinka do w³osów odporna na dzia³anie nukleaz (34). Umo liwia to zarówno efektywne wyciszanie genów jak i amplifikacjê PCR, przy minimalnej wykrywanej iloœci sirna 8 nm (34). Dla skutecznego zastosowania lub efektywnego badania procesu interferencji niezbêdny jest wybór odpowiedniego celu molekularnego (mrna) o znanej sekwencji. Jego wyciszenie powinno daæ widoczny lub mo liwy do obserwacji efekt. W niektórych doœwiadczeniach in vitro pokazano efekty uboczne zwi¹zane z wielokierunkowym dzia³aniem sirna. Dla ich unikniêcia dany gen nie powinien zawieraæ wielu sekwencji homologicznych. Celowe jest skorzystanie z baz danych sekwencji genomowych BLAST (NCBI Unigene, EST, Celera) dla weryfikacji poprawnoœci celu RNAi (47). Dostêpne s¹ algorytmy u³atwiaj¹ce projektowanie skutecznych sirna (tab. 6). Wprowadzaj¹c tam numer dostêpu (ang. accession number) lub sekwencjê genu koduj¹cego cel terapeutyczny, otrzymujemy listê kompatybilnych oligonukleotydów. Wielu skutecznych sirna nie mo na jednak przewidzieæ tylko na podstawie analizy in silico. Wszystkie mo liwe sekwencje okreœlonej d³ugoœci powinny byæ analizowane w liniach komórkowych dla upewnienia, czy wszystkie sir- NA zosta³y zidentyfikowane (67). Jest to bardzo kosztowne. atwiejsz¹ alternatywê stanowi stworzenie genowospecyficznej biblioteki sirna poprzez przygotowanie Rycina 1. Schemat interferencji RNA w zale noœci od podatnoœci komórek na transfekcjê oraz trwa- ³oœæ wyciszenia (59). 148 Neuroskop 2006, nr 8

Tabela 6. Adresy internetowe wybranych algorytmów do projektowania sirna. URL http://katahdin.cshl.org:9331/rnai/html/rnai.html http://www.rnaiweb.com/rnai/sirna_design/index.html http://hydra1.wistar.upenn.edu/projects/sirna/sirnaindex.htm https://www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai?op=help http://jura.wi.mit.edu/sirnaext/ http://www.ambion.com/techlib/misc/sirna_finder.html http://i.cs.hku.hk/~sirna/software/sirna.php http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html http://www.dharmacon.com/sidesign/ https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/ http://203.199.182.73/gnsmmg/databases/sirna/dstho.html http://codex.cshl.org/scripts/newmain.pl http://itb1.biologie.hu-berlin.de/~nebulus/sirna http://sirna.cgb.ki.se Nazwa RNAi OligoRetriever The RNAi Web sirna Design sirna selector sirna Target inder WI sirna Selection Program sirna Target inder sirna Design Software The sirna user guide Dharmacon sidesign Center BLOCK-iT RNAi Designer DSTHO RNAi codex HuSiDa sirnadb mieszaniny cz¹steczek o mo liwej sekwencji, ekspresji w liniach komórkowych, selekcji wybranych fenotypów i na tej podstawie identyfikacji skutecznej sekwencji sirna (67). Efekty uboczne Warunkiem bezpiecznego wykorzystania RNAi w terapii jest brak efektów ubocznych (ang. off-target effects). sirna mo e funkcjonowaæ jako mirna i na odwrót, wykazuj¹c wieloraki wp³yw na ekspresjê genów (33). Wykorzystanie ró nych sirna dla jednego docelowego mrna mo e powodowaæ uzyskanie ró nych niespecyficznych wzorców ekspresji dla ka dej z u ytych cz¹steczek. Mimo e jedn¹ z cech RNAi jest specyficznoœæ, efekty off-target stanowi¹ potencjalny problem. Nadal nieznane s¹ parametry okreœlaj¹ce minimalny poziom homologii niezbêdny do efektywnego i bezpiecznego wyciszania genów (69). Efektów ubocznych nie obserwowano, gdy wprowadzano dsrna do organizmów prymitywnych. Wydaje siê, e sirna powstaj¹ce z dsrna s¹ dok³adnie wybierane przez Drosha i Dicer oraz inne komponenty endogennej maszynerii RNAi, które mog¹ mieæ aktywnoœæ korekcyjn¹, która zabezpiecza przed niespecyficznym wyciszaniem (14). sirna powstaj¹cy z prekursora dsrna w wyniku dzia³ania kompleksów enzymatycznych w komórkach ssaków indukuje niespecyficzne efekty w znacznie mniejszym stopniu. Wi¹ e siê to w tym przypadku z odpowiedzi¹ interferonow¹ (14). D³ugie dsrna efektywnie wyciszaj¹ geny w komórkach owadów i komórkach embrionalnych ssaków, nie aktywuj¹c uk³adu immunologicznego (68). Do dojrza³ych komórek ssaków wprowadziæ mo na wy³¹cznie sirna o d³ugoœci poni ej 30 par zasad (60). W przypadku d³u - szych cz¹steczek mo liwa jest aktywacja odpowiedzi interferonowej, prowadz¹cej do apoptozy. Nastêpuje aktywacja szlaku Jak-Stat (ang. Janus kinase - signal transducers and activators of transcription) oraz wzrostu poziomu ekspresji genów stymulowanych interferonem (interferon-stimulated genes, ISGs) (63). Transfekcja sirna swoistego dla GAPDH powodowa³a co najmniej dwukrotny wzrost ekspresji 52 genów ISG (63). W wiêkszoœci przypadków poziom ekspresji zale ny by³ od iloœci dostarczonego sirna, przy stê eniu 100 nm powoduj¹c ponad dziesiêciokrotny wzrost ekspresji. D³ugi RNA o strukturze spinki do w³osów (ang. long-hairpin RNA, lhrna), ulegaj¹cy ekspresji w komórkach ssaków z wektora plazmidowego nie indukowa³ odpowiedzi immunologicznej (37). Aktywacja uk³adu immunologicznego przez sirna i zwi¹zana z tym toksycznoœæ s¹ zale ne od sekwencji nukleotydowej (35). Zidentyfikowano immunostymuluj¹ce motywy bogate GU, co pozwala na zaprojektowanie sirna, który mo e wyciszaæ gen, jednoczeœnie indukuj¹c minimaln¹ odpowiedÿ interferonow¹ (35). Przypuszcza siê, e stymulacja odpowiedzi immunologicznej wywo³ana obecnoœci¹ obcego RNA zachodzi z udzia³em dwóch typów bia³ek: transmembranowych receptorów TLR (ang. Toll-like receptor) oraz cytoplazmatycznych receptorów typu PKR (ang. protein kinase R) i produktu genu RIG-1 (ang. retinoic acid-inducible gene 1), (ryc. 2) (61). TLR znajduj¹ siê na b³onie komórkowej oraz w innych wewn¹trzkomórkowych kompartmentach. W endosomach sirna zawieraj¹cy motyw immunostymuluj¹cy aktywuje TLR3, TLR7, TLR8 i TLR9, co prowadzi do uaktywnienia czynników transkrypcyjnych N -ê, Neuroskop 2006, nr 8 149

Rycina 2. OdpowiedŸ komórki na wprowadzenie ró nych typów dsrna. A. Wektor wirusowy zawieraj¹cy sekwencjê shrna integruje z genomem i ulega transkrypcji. Powsta³y shrna jest transportowany do cytoplazmy przez eksportynê-5, hydrolizowany przez Dicer do sirna zawieraj¹cego niesparowane koñce i prowadzi do specyficznej degradacji docelowego mrna. OdpowiedŸ immunologiczna nie ma miejsca, gdy zosta³y wykorzystane naturalne mechanizmy RNAi. B. Syntetyczny sirna dostarczony do organizmu w zawiesinie liposomalnej, dostaje siê do endosomu, gdzie aktywuje receptory TRL, co prowadzi do transdukcji sygna³u do j¹dra komórkowego i ekspresji genów cytokin zapalnych i interferonu. sirna zawieraj¹cy dwa niesparowane nukleotydy przy koñcu 3 mo e wejœæ na szlak RNAi, a sirna ze sparowanymi koñcami aktywuje odpowiedÿ immunologiczn¹. C. Wprowadzony do komórki d³ugi dsrna aktywuje kinazê bia³kow¹ PKR i RNazê L, co prowadzi do degradacji RNA i zablokowania inicjacji translacji, a w konsekwencji do apoptozy. TLR ang. Toll-like receptor, PKR kinaza bia³kowa zale na od dsrna, RIG-1 ang. retinoic acidinducible gene I, EI 2 podjednostka czynnika inicjacji translacji. IR -3 oraz IR -7, które stymuluj¹ ekspresjê genów I N. Helikazowa domena bia³ka RIG-1 w cytoplazmie rozpoznaje dsrna, a pozosta³e domeny aktywuj¹ szlak prowadz¹cy do syntezy interferonu i cytokin zapalnych (61). sirna zawieraj¹cy dwa niesparowane nukleotydy przy koñcu 3 nie aktywuje bia³ka RIG-1, w odró nieniu od sirna nie zawieraj¹cego niesparowanych koñców (44). Tak e shrna ulegaj¹ce ekspresji z wektora nie aktywuj¹ odpowiedzi interferonowej. Natomiast reakcjê tê stymuluje syntetyczny sirna dostarczony za pomoc¹ noœnika lipidowego (55). Modyfikacja chemiczna sirna mo e utrudniæ rozpoznanie przez TLR, co u³atwi³oby stosowanie sirna bez wzbudzania odpowiedzi immunologicznej (61). Aktywacja kinazy bia³kowej PKR nastêpuje po zwi¹zaniu dsrna. Hamuje ona translacjê na skutek fosforylacji podjednostki czynnika inicjacji translacji EI 2, co prowadzi do ca³kowitego zablokowania syntezy bia³ka. Komórka kierowana jest na drogê apoptozy. Wi¹zanie dsrna przez syntazê 2',5'-oligoA powoduje jej aktywacjê i syntezê oligonukleotydów adenylowych (pppa(2 p5 A) n ), które aktywuj¹ RNazê L, powoduj¹c¹ degradacjê RNA (45). Chemiczne cechy dsrna, poziom ekspresji lub dawki oraz sposób dostarczenia RNA do komórki mog¹ wp³ywaæ na poziom aktywacji odpowiedzi interferonowej (63). Istnieje mo liwoœæ wspó³zawodnictwa egzogennych sirna z endogennymi mirna o dostêp do RISC (ang. RNA-induced silencing complex). mirna odgrywaj¹ rolê regulatorów ekspresji genów. Zaburzenie ich funkcjonowania mo e powodowaæ komplikacje terapeutyczne. W niektórych przypadkach nadekspresja genów mir mo e prowadziæ do onkogenezy, z kolei w komórkach nowotworowych obserwowano zredukowany poziom 150 Neuroskop 2006, nr 8

niektórych mirna (69). Obni enie iloœci stosowanego sirna mo e przyczyniæ siê do obni enia ryzyka wyst¹pienia efektów niespecyficznych (28). sirna wykazuj¹cy pe³n¹ komplementarnoœæ do docelowego genu mo e powodowaæ, oprócz degradacji w³aœciwego mrna, tak- e spadek poziomu bia³ek w komórce (18). Zaprojektowany sirna, zawieraj¹cy trzy do czterech nukleotydów niesparowanych z nukleotydami transkryptu docelowego inhibitora 1A kinazy zale nej od cyklin (ang. cyclindependent kinase inhibitor 1A, CDKN1A), wp³ywa³ g³ównie na poziom bia³ek, w sposób podobny do mirna (33). Badano wp³yw d³ugotrwa³ego wysokiego poziomu ekspresji shrna na w¹troby doros³ych myszy zbadano stosuj¹c 49 ró nych wektorów AAV/shRNA, unikalnych pod wzglêdem d³ugoœci i sekwencji przeciwko szeœciu genom docelowym (24). 36 spoœród nich powodowa³o powa ne uszkodzenia w¹troby zale ne od stosowanej dawki, z czego 23 ostatecznie prowadzi³y do œmierci ponad 150 zwierz¹t w ci¹gu 2 miesiêcy (12, 24). Zachorowalnoœæ by³a zwi¹zana z obni eniem iloœci endogennych mirna, wskazuj¹c na prawdopodobn¹ konkurencjê pomiêdzy mirna i egzogennymi shrna o ograniczon¹ iloœæ czynników komórkowych zaanga owanych w funkcjonowanie RNAi (24). Elementem ograniczaj¹cym funkcjonowanie mirna jest eksportyna-5, ulegaj¹ca wysyceniu przez shrna (17, 24). Wprowadzanie cz¹steczek sirna do komórek sirna mo na otrzymaæ in vitro, metod¹ syntezy chemicznej, transkrypcji in vitro oraz poprzez trawienie d³ugich dsrna enzymami RNazaIII/Dicer. Mo liwa jest tak- e ich ekspresja in vivo. Regulacja ekspresji genów za pomoc¹ sirna jest przemijaj¹ca i czêsto trwa przez 3-5 dni w linii komórkowej (2). Dla wyciszania genów w komórkach embrionalnych Drosophila melanogaster najefektywniejsz¹ cz¹steczk¹ wyciszaj¹c¹ jest sirna o d³ugoœci 21 nukleotydów i dwoma niesparowanymi nukleotydami przy koñcu 3 (16). Dalsze badania wykaza³y, e skutecznoœæ cz¹steczek sirna wzrasta wraz z d³ugoœci¹ dupleksu a do 27pz (36). D³u sze cz¹steczki charakteryzuje mniejsza skutecznoœæ (2). W mechanizmie interferencji RNA, dsrna jest rozpoznawany i hydrolizowany przez Dicer w odpowiedniej odleg³oœci od koñca helikalnego (42). Mo na wykorzystaæ Dicer do wyboru i wyciêcia najbardziej efektywnej cz¹steczki sirna z wprowadzonej do komórki nici shrna lub dsrna. Istnieje mo liwoœæ zaprojektowania disrna (ang. Dicer substrate sirna), który po hydrolizie przez Dicer dawa³by specyficzne sirna o d³ugoœci 21 nukleotydów. Uzyskane cz¹steczki disrna powodowa³y maksymaln¹ inhibicjê ekspresji genów przy ni szych stê eniach, a wyciszenie trwa³o d³u ej (2). Spowodowane jest to prawdopodobnie rozpoznaniem i hydroliz¹ przez Dicer oraz efektywniejszym wprowadzeniem do RISC (2). Istnieje zale noœæ skutecznoœci disrna od wyciszanego genu. dsrna o d³ugoœci oko³o 200 nukleotydów skutecznie wycisza³ gen tenascyny-c (TN-C) in vitro i in vivo (84). Strategiê oparto na za³o eniu, e Dicer wi¹ e i hydrolizuje dsrna do dupleksów o d³ugoœci 21-25 nukleotydów, które po wprowadzeniu do RISC mog¹ zwielokrotniæ efekt wyciszenia, poprzez wi¹zanie siê do wielu miejsc mrna wiêkszej iloœci cz¹steczek (84). Na podobnej zasadzie projektowano d³ugi RNA o strukturze spinki do w³osów (long-hairpin RNA, lhrna) w celu wyciszenia genów wirusa HIV (37). Ekspresja lhrna prowadzi do powstania sirna skierowanych przeciwko wielu regionom genu nef, co powodowa³o wydajniejsz¹ inhibicjê namna ania patogenu (37). W wektorach ekspresyjnych sirna wykorzystywane s¹ g³ównie promotory polimerazy RNA III (Pol III) oraz II (Pol II). Ze wzglêdu na obfitoœæ komórkowych niekoduj¹cych RNA transkryptów Pol III, czêsto wykorzystuje siê promotory dla tej polimerazy w badaniach nad RNAi w komórkach ssaków. Promotory te umo liwiaj¹ produkcjê cz¹steczek RNA o cechach charakterystycznych dla sirna nie zawieraj¹cych struktury cap przy koñcu 5' oraz poliadenylowanego koñca 3'. Wœród promotorów Pol III do produkcji sirna in vivo wykorzystuje siê promotor U6 genu ma³ych j¹drowych RNA (ang. small nuclear RNA, snrna) oraz promotor H1 genu RNazy P (77). W przypadku promotora H1, istotn¹ zalet¹ jest uzyskiwanie transkryptów zawieraj¹cych niesparowane koñce 3'. Wykorzystywane s¹ równie promotory typu II. W kilku przypadkach okaza³o siê, e s¹ one efektywniejsze od promotorów typu III oraz prowadz¹ do zagêszczenia sirna w cytoplazmie. Cz¹steczki ulegaj¹ce ekspresji z wykorzystaniem promotorów U6 wystêpuj¹ g³ównie w j¹drze komórkowym. Dicer wykazuje wy sz¹ aktywnoœæ w cytoplazmie i przetwarzanie shrna w aktywny sirna mo e byæ tam bardziej efektywne (77). Wykorzystanie promotorów Pol II poza pewnymi typami komórek jest jednak bardzo ograniczone. Pol II uczestniczy w transkrypcji genów koduj¹cych bia³ka. Transkrypty maj¹ typowe modyfikacje koñców 3' i 5', takie jak struktura cap czy poli(a) Nie odpowiada to strukturalnym wymaganiom sirna. Z wyj¹tkiem kilku typów komórek d³ugie dsrna uzyskane dziêki promotorom Pol II, s¹ natychmiast transportowane do cytoplazmy, gdzie indukuj¹ odpowiedÿ interferonow¹ (77). Uda³o siê uzyskaæ efekt wyciszenia z u yciem wektorów, zawieraj¹cych promotory Pol II. Ekspresja dwuniciowych RNA w komórkach mo liwa jest na dwóch drogach. Pierwsza oparta jest o syntezê dwóch komplementarnych nici sirna o d³ugoœci 21-23 nukleotydów z dwóch ró nych promotorów U6, z kaset zlokalizowanych tandemowo na tym samym wektorze Neuroskop 2006, nr 8 151

Tabela 7. Mechanizmy indukcji ekspresji shrna. DSE - ang. distal sequence element; Dox - doksycyklina; GAL4 - N- koñcowy fragment transkrypcyjnego aktywatora dro d y; KRAB - rodzina transkrypcyjnych represorów zwi¹zanych z Kruppel box; PSE - ang. proximal sequence element; RXR - receptor Retinoidu X; teto - operator tetracyklinowy; ttr - bia³ko represorowe tetracykliny; VgEcR - zmodyfikowany receptor ekdyzonu, neo - neomycyna. System Promotor Charakterystyka Lit. Pol III Plazmid, U6, Sekwencja teto zlokalizowana bezpoœrednio poni ej TATA box. 13 indukowany 7SK, W nieobecnoœci Dox, ttr wi¹ e siê do teto i hamuje transkrypcjê shrna. tetracyklin¹ H1 Dodanie Dox powoduje dysocjacjê ttr, co prowadzi do aktywacji jednostki transkrypcyjnej i ekspresji shrna. Plazmid, U6 Wiele sekwencji teto znajduje siê pomiêdzy elementami promotora 8 indukowany doksycyklin¹ lub na dwóch ró nych plazmidach (77). Drugi sposób wymaga u ycia jednego promotora, aby uzyskaæ ekspresjê sirna o strukturze spinki do w³osów (shrna), przy czym koniec 3' 19- do 21-nukleotydowej sekwencji po- ³¹czony jest z koñcem 5' komplementarnej sekwencji tej samej d³ugoœci poprzez pêtlê zawieraj¹c¹ 3 do 9 nukleotydów (77). W obu przypadkach powstaj¹ dwuniciowe cz¹steczki sirna, przy czym drugi sposób wymaga zaanga owania przez komórkê enzymu Dicer. Istnieje mo liwoœæ uzyskania ekspresji shrna zwi¹zanych z trna przy koñcu 3, co zwiêksza efektywnoœæ dostarczenia cz¹steczek do cytoplazmy (2). Wykazano, 152 Pol III DSE i PSE oraz TATA box. Taka budowa poprawia kooperatywne wi¹zanie ttr do sekwencji teto i jednoczeœnie blokuje komunikacjê pomiêdzy ka dym z tych elementów. Dox powoduje dysocjacjê ttr, co prowadzi do aktywacji jednostki transkrypcyjnej i ekspresji shrna Lentiwirus, H1 U ycie bia³ka hybrydowego ttr-krab, kontrolowanego tetracyklin¹. 73 indukowany W nieobecnoœci Dox, ttr-krab wi¹ e siê do teto i hamuje transkrypcjê tetracyklin¹ shrna. Dodanie Dox powoduje dysocjacjê ttr-krab, co prowadzi do aktywacji jednostki transkrypcyjnej i ekspresji shrna Wirus U6 Obejmuje trzy wektory retrowirusowe: ekspresja dwóch z nich prowadzi 25 Moloney do syntezy dwóch czynników transkrypcyjnych VgEcR i RXR, a trzeciego Murine do syntezy produktu genu po³¹czonego Gal4, bêd¹cego poœrednim Leukemia aktywatorem, pozostaj¹cego pod kontrol¹ indukowalnego promotora. (MoMLV), Ekdyzon powoduje dimeryzacjê czynników transkrypcyjnych i wi¹zanie indukowany siê ich do indukowalnego promotora, co aktywuje aktywator poœredni ekdyzonem GAL4. ¹czy siê on do czterech miejsc wi¹zania GAL4 w DNA, aktywuj¹c promotor U6, co prowadzi do aktywacji jednostki transkrypcyjnej i ekspresji shrna System U6 U myszy transgeniczej nie dochodzi do ekspresji U6-ploxPneo- gfr2 11 LoxP-Cre i wyciszenia genu gfr2. Promotor U6 jest nieaktywny z powodu insercji sekwencji neo. Po skrzy owaniu z mysz¹, u której w linii komórek rozrodczych dochodzi do ekspresji Cre, dochodzi do wyciêcia neo i promotor U6 jest aktywny. Plazmid H1 Promotor H1 ma wprowadzony operator lac. Zastosowanie w transgenicznych 29 indukowany liniach komórkowych, w których ekspresji ulega represor lac. IPTG Po zastosowaniu IPTG, represor lac oddysocjowuje i mo liwa jest transkrypcja. Neuroskop 2006, nr 8 e trna-shrna, ulegaj¹cy ekspresji z wykorzystaniem promotora ludzkiego genu dla trna Val prowadzi do specyficznej inhibicji ekspresji genu fuzyjnego PML-RAR zarówno in vitro jak i in vivo (49). Badania wyciszania genów zwi¹zanych z cyklem komórkowym, apoptoz¹ i rozwojem s¹ bardzo trudne. Hydroliza mrna krytycznego dla organizmu na danym etapie rozwoju mo e prowadziæ do zaburzeñ i uniemo liwiæ uzyskanie wyników na kolejnych etapach. Aby temu zapobiec mo na stosowaæ wektory, zawieraj¹ce promotory warunkowe (ang. conditional promoters) (tab. 7, ryc. 3). W tym celu wykorzystano promotory Pol III, pomimo ich

Rycina 3. Zale noœæ syntezy sirna od tetracykliny (Tet) lub doksycykliny (Dox). TetR represor tetracyklinowy; TetO operator tetracyklinowy. mniejszej wszechstronnoœci w porównaniu z Pol II. Tego typu konstrukcje œciœle reguluj¹ transkrypcjê sirna w komórkach, w których zachodzi przejœciowa lub stabilna ekspresja represora Tet (TetR) (77). Sekwencja operatora tertracyklinowego TetO umieszczona jest powy ej sekwencji promotorów H1, U6 lub 7SK. Przy³¹czenie siê represora do operatora hamuje transkrypcjê. Tetracyklina lub doksycyklina powoduj¹ dysocjacjê kompleksu, co prowadzi do aktywacji jednostki transkrypcyjnej i ekspresji interferuj¹cego RNA. Wektory tego typu umo liwiaj¹ kontrolê poziomu docelowego bia³ka poprzez regulacjê stê enia czynnika indukcyjnego. Trwaj¹ prace nad wykorzystaniem wektorów, w których ekspresja interferencyjnego RNA zale na jest od dwóch czynników kontrolnych ekdyzonu oraz produktu genu Gal4 (25). Promotory warunkowe Pol III umo liwiaj¹ regulacjê ekspresji shrna tkankowo- lub komórkowospecyficznej poprzez ekspresjê aktywatora GAL4 pozostaj¹cego pod kontrol¹ tkankowospecyficznych promotorów (47). Wektory maj¹ce promotory warunkowe uda³o siê zastosowaæ w doœwiadczeniach in vitro. Pokazano kontrolowane wy³¹czenie genu DMNT1 (DNA metylotransferaza-1) w ludzkich komórkach rakowych, prowadz¹ce do zahamowania ich wzrostu, wyciszenia genu CXCR4 (receptor CXC4, zwi¹zany z ruchliwoœci¹) w komórkach raka piersi, znacznego zahamowania ich przemieszczania; oraz do wy³¹czenia genu -kateniny w komórkach raka okrê nicy, uzyskuj¹c zahamowanie cyklu komórkowego i wzrostu (47). Opisany system indukcyjny zosta³ tak e sprawdzony in vivo u myszy, u której wystêpowa³y przerzuty nowotworu, przy czym ekspresja sirna nie podlega³a w tym przypadku tak œcis³ej regulacji jak w przypadku badañ in vitro na wyselekcjonowanych komórkach (77). W wiêkszoœci przypadków plazmidy ulegaj¹ przejœciowej ekspresji z wytworzeniem sirna. Drugi typ noœników wykorzystywanych do uzyskania wyciszenia docelowych genów stanowi¹ wektory wirusowe. W celu dostarczenia do komórek ekspresyjnych kaset sirna mo na wykorzystaæ trzy rodziny cz¹steczek wirusowych: oparte na retrowirusach (zarówno onkowirusy jak i lentiwirusy), adenowirusach oraz wirusach AAV (ang. adeno-associated viruses) (77), które do replikacji potrzebuj¹ wirusa wspomagaj¹cego (adenowirusa lub herpeswirusa). Zastosowanie wektorów wirusowych daje mo liwoœæ uzyskania stabilnego wyciszenia docelowego genu, w zwi¹zku z mo - liwoœci¹ integracji genomu wirusa z genomem gospodarza i d³ugotrwa³ej transkrypcji wyciszaj¹cego RNA. Wektory wirusowe ró ni¹ siê miêdzy sob¹ typem preferowanych komórek docelowych, ³atwoœci¹ zastosowania in vitro i in vivo, zdolnoœci¹ do integracji z genomem gospodarza lub jej brakiem, poziomem immunogennoœci oraz maksymalnym mo liwym rozmiarem insertu. Kontrola procesu interferencji RNA mo e byæ zrealizowana w przypadku po³¹czenia cech wektorów wirusowych i systemów ekspresji sirna opartych na promotorach warunkowych. W przeprowadzonych doœwiadczeniach in vitro, równoczesna infekcja wektorem adenowirusowym, zawieraj¹cym system ekspresji sirna pozostaj¹cy pod kontrol¹ promotora H1, zale nego od doksycykliny oraz wektorem adenowirusowym koduj¹cym represor tetracyklinowy, doprowadzi³a do inhibicji ekspresji genów p53 i c-myc w sposób zale ny od doksycykliny i dawki wirusa (30). W ten sposób uda³o siê uzyskaæ podwójny system kontroli. dsrna mo e zostaæ wprowadzony do komórki na drodze elektroporacji, mikroiniekcji, zanurzania organizmu w roztworze dsrna, drog¹ pokarmow¹ lub z wykorzystaniem wektorów plazmidowych lub wirusowych. Metody te by³y stosowane w stosunku do ró nych organizmów (1). Podanie myszy o wadze 20 g zastrzyku roztworu sirna o objêtoœci 1ml odpowiada iniekcji 3,5 l roztworu pacjentowi o wadze 70 kg (5). Istnieje mo liwoœæ wprowadzenia sirna do organizmu drog¹ inhalacji. Wprowadzony w ten sposób sirna u myszy zahamowa³ infekcjê wywo³an¹ wirusami RSV (ang. respiratory syncytial virus) oraz PIV (ang. parainfluenza virus) (4, 79). Dla lokalnego dostarczania cz¹steczek RNAi istotny jest wybór powierzchni wnikania terapeutyku. B³ony œluzowe s¹ miejscem wnikania wielu czynników infekcyjnych, dlatego wydaj¹ siê byæ doskona³ym celem dla RNAi (59). Istnieje szansa na stworzenie leku opartego na technologii RNAi bez koniecznoœci wykonywania zastrzyków, ale poprzez kontakt z b³on¹ œluzow¹ dróg oddechowych, rozrodczych, czy uk³adu pokarmowego. Badania kliniczne Badania wyciszania genów RNAi wkroczy³y na etap badañ klinicznych. W fazie I eksperymentalny lek jest testowany po raz pierwszy na ma³ej grupie ludzi (20-80 osób), w celu okreœlenia bezpiecznej dawki leku oraz identyfikacji efektów ubocznych. W fazie II badaniu podlega wiêksza liczba osób stosuj¹cych dany lek (100-300). Celem tego etapu jest sprawdzenie efektywnoœci preparatu oraz dalsze sprawdzanie jego bezpieczeñstwa. Eksperymentalny œrodek podawany wiêkszej grupie ludzi (1000-3000) charakteryzuje fazê III badañ klinicznych. Neuroskop 2006, nr 8 153

Tabela 8. Badania kliniczne RNAi (5, 17). AMD ang Age-related macular degeneration, degeneracja plamki ó³tej, DMO Diabetic macular oedema, cukrzycowy obrzêk plamki ó³tej, IND proœba do DA o pozwolenie na testowanie nowego leku na ludziach. irma Produkt Choroba/ Etap badañ okolicznoœæ Acuity Pharmaceuticals Cand5 AMD aza I kliniczna od X 2004 (www.acuitypharma.com) Bevasiranib AMD, DMO aza II od 2006 Sirna Therapeutics Sirna-027 AMD aza I kliniczna od XI 2004 (www.sirna.com) Alnylam Ocular sirna Tx AMD aza I kliniczna od 2005 (www.alnylam.com) RSV sirna Tx Infekcja RSV aza I kliniczna od 2006 Benitec BLT-HCV Wirusowe zapalenie aza I kliniczna 2005/2006 (www.benitec.com) w¹troby typu C RNAi HIV Tx HIV I AIDS aza I kliniczna od 2006 Genesis R&D RNAi Astma aza I kliniczna od 2006 (www.genesis.co.nz) ToleroTech ToleroVax Odrzucanie przeszczepów Wniosek IND 2005 (www.tolerotech.com) PTC Therapeutics PTC-299 VEG aza I kliniczna od 2006 (www.ptcbio.com) Atugen aturnai Cukrzyca Wniosek IND 2005/2006 (www.atugen.com) Jej celem jest potwierdzenie jego efektywnoœci, monitorowanie efektów ubocznych, porównanie z powszechnie stosowanymi lekami oraz zbieranie informacji umo - liwiaj¹cych w przysz³oœci bezpieczne jego stosowanie. W fazie IV zbierane s¹ dodatkowe informacje, ju po wprowadzeniu leku na rynek. Badania te dotycz¹ ryzyka stosowania leku, korzyœci oraz dawki optymalnej (75). Chorobotwórczy gen ApoB (apoliproteina B) zosta³ wyciszony u ma³p poprzez wprowadzenie sirna do krwiobiegu (9). sirna specyficzny wobec ApoB w postaci cz¹stek SNALP (ang. stable nucleic acid lipid particles) podany w wysokiej dawce (1 i 2.5 mg kg 1 ) akumulowa³ siê w w¹trobie po 48 godzinach powoduj¹c wyciszenie ponad 90% (83). Efekt utrzyma³ siê przez 11 dni, nie zaobserwowano efektów toksycznych dla organizmu (9). Wprowadzenie systemiczne sirna do zwierz¹t naczelnych okaza³o siê skuteczne i bezpieczne, co daje nadziejê na podobny efekt u ludzi. irmy biotechnologiczne rozpoczê³y lub planuj¹ rozpoczêcie badañ klinicznych leków opartych na technologii RNAi (tab. 8). Badania dotycz¹ terapii chorób wirusowych jak i wieloczynnikowych. Dotychczas prace badawcze obejmuj¹ pierwsz¹ fazê badañ klinicznych. Kilka firm skupia siê na terapii degeneracji plamki ó³tej (ang. age-related macular degeneration, AMD) poprzez inhibicjê ekspresji genu VEG (ang. vascular endothelial growth factor). Obecnie w stanie nieuleczalnym AMD jest 1.65 milionów Amerykanów (57). Acuity Pharmaceuticals sugeruje, e na œwiecie w roku 2013 na AMD bêdzie chorowaæ 11 milionów ludzi (57). Badania przeprowadzone na grupie 129 pacjentów wskazuj¹, e wstrzykniêty do oka Bevasiranib redukuje wzrost naczyñ krwionoœnych, co nieznacznie poprawia wzrok (57). Przy niskich dawkach efekt utrzymywa³ siê przez kilka miesiêcy, przy wy- szych o wiele d³u ej. Nie obserwowano szkodliwych efektów ubocznych z wyj¹tkiem przewidywanej opuchlizny i stanu zapalnego w miejscu wstrzykniêcia leku (57). Niewykluczone, e Bevasiranib jak i inne podobne terapeutyki bêd¹ stosowane ³¹cznie z lekami przeciwnowotworowymi, które tak e blokuj¹ efekty VEG. Pierwsze wyniki badañ klinicznych wydawa³y siê zgodne z teori¹. Pod wp³ywem leku dochodzi³o do efektywnej redukcji rozmiarów nowotworów oraz iloœci cz¹stek wirusowych u pacjentów (56). Dok³adna analiza wyników wykazuje, e uzyskane rezultaty spowodowane by³y raczej wzrostem produkcji interferonu przez uk³ad immunologiczny w odpowiedzi na obcy RNA, ni specyficznym wyciszeniem docelowych genów (56). 154 Neuroskop 2006, nr 8

Aspekty komercyjne RNAi Od czasu opisania istoty RNAi pod koniec ubieg³ego wieku, technologia ta zosta³a szybko zaadaptowana w laboratoriach badawczych. Interferencja RNA w odró nieniu od innych metod terapeutycznych wykorzystuje naturalne elementy maszynerii komórkowej. sirna w swym dzia³aniu przypominaj¹ katalizatory jedna cz¹steczka mo e wyciszyæ wiele cz¹steczek mrna. Zapewnia to wysok¹ efektywnoœæ dzia³ania. Od 1998 roku roczna liczba publikacji na temat RNAi wzros³a z kilkunastu do kilkuset (31). Aby RNAi by³o skuteczn¹ metod¹ terapeutyczn¹, nale y przezwyciê yæ trudnoœci natury technicznej oraz finansowej, co oznacza produkcjê leku przy racjonalnych kosztach (56). Interferencja RNA nie zosta³a jeszcze wykorzystana jako metoda terapeutyczna, ale ju teraz technologie RNAi przynosz¹ du e zyski. Rynek produktów opartych na RNAi w tym sirna, oligonukleotydy RNA i wektory DNA, koduj¹ce sirna przyniós³ dochód w roku 2003 w wysokoœci 38 milionów dolarów (dane wed³ug ront Line Strategic Consulting, San Meteo, USA) (31) (ryc. 4). Rozmiary rynku odzwierciedlaj¹ czas zaadaptowania danej techniki. Pierwsz¹ opracowan¹ metod¹ by³y oligonukleotydy RNA, nastêpnie techniki oparte o wektory. Wzglêdnie nowy obszar stanowi lecznictwo, obejmuj¹ce zastosowanie RNAi do odkrywania nowych leków. Przewiduje siê, e dochód zwi¹zany z technologi¹ RNAi bêdzie systematycznie wzrasta³, osi¹gaj¹c w 2008 roku 185 milionów dolarów. Szacuje siê, e technologia RNAi obejmie oko³o 10% rynku leków, co oznacza miliardy dolarów zysków. Pomimo tego, e zastosowanie RNAi budzi nadzieje w kilku przypadkach, wielu obserwatorów twierdzi, e nie przejd¹ one pomyœlnie prób klinicznych i nie zostan¹ zatwierdzone w USA przez DA przed rokiem 2008 lub, co bardziej prawdopodobne, przed 2013 (31). Odkrycie mo liwoœci zastosowania interferencji RNA jako technologii terapeutycznej silnie zaanga owa³o przemys³. W badania RNAi w³¹czy³o siê ju ponad 100 firm (66). Czêœæ z nich dostarcza odczynniki i rozwi¹zania metodyczne niezbêdne do wykonania doœwiadczeñ, reszta to firmy biotechnologiczne lub farmaceutyczne poszukuj¹ce komercyjnych zastosowañ RNAi (tab. 9). Tabela 9. irmy biotechnologiczne wykorzystuj¹ce technologiê RNAi (31). irma Data Za³o yciele Technologia Zakres dzia³añ za³o enia i doradcy Acuity 2002 Michael Tolentino i Samuel RNAi przeciwko Leki przeciwko starczemu Pharmaceuticals Reich (Univerity czynnikowi wzrostu zwyrodnieniu plamki ( iladelfia, USA) of Pennsylvania) œródb³onka naczyñ i retinopatii cukrzycowej w chorobach oczu Alnylam Holding 2002 Phil Sharp (MIT), David Terapeutyczne zastoso- Leki przeciwko chorobom Company Bartel (The Whitehead), wanie RNA dostarczo- wirusowym, nowotworowym, (Cambridge, USA) Paul Schimmel (Scripps nego do komórek metabolicznym, chorobom 2003, fuzja Institute), Tom Tushl i doros³ych ssaków centralnego uk³. Alnylam (Rockefeller University) nerwowego i chorobom i Ribopharma AG i Phillip Zamore (U. Mass autoimmunogennym Medical School), Roland Kreutzer i Stefan Limmer (za³o yciele Ribopharma) SR Pharma 1998 Zwi¹zana z Ribozyme Wy³¹czna licencja Leki przeciwnowotworowe, (Berlin, Niemcy) Pharmaceuticals (obecnie na odkryte cele analizy œcie ek Sirna Therapeutics) dla RNAi firmy Sirna i zatwierdzanie celów oraz technologie zatwierdzone Avocel 2003 Mark Kay Wy³¹czna licencja Leki przeciwko (Sunnyvale, USA) (Stanford University) na ekspresjê RNAi przewlek³ej ó³taczce u ssaków z pominiê- typu B i C ciem embrionów (Stanford Univeristy) oraz wspó³-wy³¹czna licencja na dostarczanie RNAi do ssaków z pominiêciem embrionów Neuroskop 2006, nr 8 155

irma Data Za³o yciele Technologia Zakres dzia³añ za³o enia i doradcy Benitec 1997 Qeensland Department RNAi kierowane przez Leki przeciwko nowotwo- (Queensland, of Primary Industries DNA (ang. DNA-directed rom, chorobom Australia) RNAi, ddrnai) autoimmuno-gennym, HIV/AIDS i przewlek³ym chorobom wirusowym Cenix 1999 Christophe Echeverri, Zastosowanie RNAi Projektowanie na zamówie- BioScience Pierre Gonczy, Anthony na skalê genomow¹ nie bibliotek RNAi (Dresden, Hyman (European na du ¹ skalê Niemcy) Molecular biology, (proponowane przez Heidelberg, Niemcy; Ambion), odkrywanie Max Planck Labolatory, i zatwierdzanie celów Dresden, Niemcy) CytRx 2002 uzja z Global Genomics, Licencja U Masss Leki przeciwko oty³oœci, (Los Angeles, zmiana zainteresowañ Medical School cukrzycy typu 2 USA) firmy na RNAi na wyciszanie genów oraz stwardnienie w przypadku specyfi- zanikowe boczne cznych chorób Devgen 1997 Thieryy Bogaert (MRC, Biblioteka RNAi Leki przeciwko chorobom (Ghent, Cambridge, Wlk. Bryt.), C. elegans na skalê metabolicznym Belgia) Michael Hengartner genomow¹ i centralnego uk³. (University of Zurich) nerwowego Intradigm 2001 Martin Woodle Dostarczanie genów Leki przeciwko (Rockville, (Novartis, Cambridge, oraz wektory terapii nowotworom USA) USA) genowej rozbudowywane w Genetic Therapy z u yciem RNAi (przedsiêbiorstwo zale ne Novartis) Nucleonics 2001 C. Satishchandran Ekspresyjny d³ugi Leki na podstawie (malvern, i Catherine Pachuk interferuj¹cy RNA interferuj¹cego RNA USA) (Thomas Jefferson (ang. expressed long Univerity, iladelfia, USA) interfering RNA, eirna) Polgen 2000 David Glover (University Identyfikacja celów Cele nowotworowe (Cambridge, of Cambridge, Cambridge, zwi¹zanych z cyklem i szlaki; fenotypowa Wlk. Bryt.), Wlk. Bryt.) komórkowym z badañ charakteryzacja po wy³¹wydzia³ przesiewowych genomu czeniu genu i u yciu Cyclacel (Dundee, z u yciem RNAi w liniach ma³ych inhibitorów Wlk. Bryt.) komórkowych cz¹steczkowych u Drosophila Sequitur (Natick, 1996 Tod Woolf, Craig Zastrze ona tajemnicza Leki przeciwko USA) ( irma Mello (U. Mass technologia RNAi niewydolnoœci zosta³a nabyta Medical School) (ang. stealth w¹trobowej, RSV w listopadzie oraz Richard Wagner RNAi technology) (ang. respiratory 2003 przez firmê (Phylos, Lexington, syncytial virus), Invitrogen USA) astmie i rakowi (Carlsbad, USA) piersi 156 Neuroskop 2006, nr 8