ALLOPRZECIWCIAŁA ANTY-HLA W NOWOCZESNEJ DIAGNOSTYCE TRANSPLANTACYJNEJ Zastosowanie w doborze immunologicznym do przeszczepu nerki Hanna Zielińska Laboratorium Immunologii Klinicznej, Transplantacyjnej i Hematologii ogii Uniwersyteckie Centrum Kliniczne w Gdańsku 1
Obecna Transplantacyjna diagnostyka immunologiczna przed przeszczepieniem nerki PRA-CDC co 3 miesiące Dobór HLA locus A, B, DR Próba krzyżowa CM-CDC (FCXM u zimmunizowanych?) Brak możliwości przeszczepu biorcy z powtórzoną niezgodnością!!!...? Przeciwciała anty-hla dawcy (MM) tylko u 10% biorców Punkty za immunizację: PRA 50-79%: 7 pkt PRA >80%: przeszczep obligatoryjny Brak diagnostyki posttransplantacyjnej
BADANIE STOPNIA ZIMMUNIZOWANIA - DZIŚ PRA /metodą CDC/ Zalety Panel odzwierciedla fenotyp HLA regionu (vpra też) Poziom detekcji odzwierciedlający reakcję alloprzeciwciał in vivo (główna zaleta CM, wykluczenie odrzutu nadostrego) Selektywne wykrywanie alloprzeciwciał wiążących dopełniacz (flow wykrywa IgG) Wady Wynik badania ściśle uzależniony od panelu (zmienność odsetku PRA pochodną zmienności panelu?) Problem pacjentów nowozgłoszonych (obserwacja) NISKA CZUłOŚĆ NA POZIOMIE CM-CDC (pacjenci do retransplantacji, w trakcie terapii, leki, monitorowanie po tx) Wykrywamy tylko przeciwciała anty-hla klasa I Fałszywie (+) r-cje od IgM.
Screening: LABScreenMixed Wynik (-) Wynik (+) Powtótka co 6 tyg. (około 60%) LABScreen PRA kl. I i/lub II Proponowany algorytm badawczy monitorowania immunizacji PRA 1-80 % PRA > 80 % (17 pacjentów) Powtórka co 6 tyg Single Antigen Programy HS
PROBLEM IMMUNIZACJI CHORYCH ~ 20% Oczekujących cych (~ 500 osób, PRA>50: 100 osób) Dostęp p do przeszczepu zimmunizowanych: [PRA>10%] ~15% przeszczepów w od zmarłych dawców, w, [PRA>80%] ~ 3% [wg UNOS 2007] Czas oczekiwania (Poltransplant,, 2009r) Niezimmunizowani: : ~ 2 lata 8,5 m-cam Zimmunizowani PRA [80-100%]: 6 lat, 11 m-cy Prawie 2x krótszy czas przeżycia przeszczepu 5
PROBLEM IMMUNIZACJI CHORYCH - koszty Czas oczekiwania - aspekt finansowy Niezimmunizowani: 33 miesiące Zimmunizowani [HS] PRA [80-100%]: 83 miesiące Koszt miesięcznej dializy 1 osoby: 400 złz x 3(tyg) x 4 = 4800 złz Koszt dializy HS: 83 miesiące x 4800 zł z = 398 400 złz Koszt nie HS: 33 m-ce x 4800 zł z = 158 400 złz Różnica: 240 000 złz ~20 pacjentów: 240 tys. x 20 = 4 mln 800 tys. złz Brak środków w na diagnostykę??? 6
Algorytm badawczy Zimmunizowani [PRA>0%, min 2x]: Określenie grupy ryzyka z danym dawcą => badania: FCXM, FlowC4d Wysokozimmunizowani [cpra>80% = PRA-CDC >50%?] I. Efekty wdrożenia programów dla wysokozimmunizowanych na świecie II. Praktyka: Identyfikacja aloprzeciwciał anty-hla: testy typu Single Antigen podstawy, różnice z PRAScreen 7
ZIMMUNIZOWANI (PRA( PRA-CDC > 0% min. 2x) Próba krzyżowa z wykorzystaniem cytometru przepływowego miernikiem ryzyka ostrego odrzucania Przyjęcie obligatoryjnego (-) wyniku FCXM nie miałoby sensu z uwagi na wyłączenie z szansy transplantacji 28% biorców, u których w 1-szym roku graft funkcjonuje dobrze, bez incydentów AR.ale 8
ZIMMUNIZOWANI Próba krzyżowa z wykorzystaniem cytometru przepływowego miernikiem ryzyka ostrego odrzucania OSTRE ODRZUCANIE ok. 20-30% W grupie pacjentów z (+) FCXM dochodzi dwukrotnie częś ęściej do odrzucania naczyniowego (n=455): 28,9% z (+) FCXM vs. 12,6% z (-) FCXM; Roczne przeżycie przeszczepu 10% niższe (84% vs. 94%) Ilham M.A. et.al.: Clinical significance of a positive flow crossmatch on the outcomes of cadaveric renal transplants. Transplant. Proc. 2008; 40(6):1839-43 9
1995-2005 6% n=688 n=18 440 12% 5,2% n=733 n=24 429 7,8% T-B+ 1,8%%; 6,5% T-B+ 2,4%%; 5,3% 10
Lityczność przeciwciał [C4d]FlowPRA 11
Zimmunizowani: wnioski Diagnostyka AR: wzrost kreatyniny następuje dopiero przy obniżeniu o połowę wartości GFR i aż 1/3 potwierdzonych histologicznie epizodów AR w pierwszych trzech miesiącach przebiega subklinicznie, tzn. przy prawidłowych wartościach kreatyniny, stąd (+) FCXM może stanowić niezależny czynnik ryzyka ostrego odrzucania (AR) wskazując grupę, która najbardziej skorzysta z indukcji (+) FCXM wiąże się ze zwiększonym ryzykiem przewlekłego odrzucania 12
Wysokozimmunizowani PRA > 80% I. Efekty wdrożenia programów dla wysoko zimmunizowanych na świecie II. Identyfikacja aloprzeciwciał anty-hla: testy typu Single Antigen podstawy, różnice z PRAScreen 13
Farmakologiczne Biologiczne Algorytm Emory USA, UNOS HLA-matchmaker z AM Programme (ET-KIDNEY ALLOCATION SYSTEM), FAMHS (Find Acceptable Mischmatches for Highly Sensitized Patients), Barcelona British Transplantation Society Inne: paired donor exchange, proxy donation 14
EMORY ALGORITHM FlowPRA Identyfikacja alloprzeciwciał Swoistości (odpowiedniki MM) wprowadzane do bazy danych UNET HLA dawcy porównywane z bazą UNET => 0 MM => kwalifikacja wytypowanego biorcy do transplantacji (tzw. wirtualny CM) Cross-match (FCXM T, B) w ośrodku przeszczepiającym cym 15
EMORY ALGORITHM Dostęp p do przeszczepu zimmunizowanych (PRA>30%): 25% vs.. 12% w tym samym czasie w UNOS n=220 tx zimmunizowanym,, 5 lat Czas przeżycia przeszczepu (5 lat): PRA>30%: 69% vs.. 70% w grupie niezimmunizowanych PRA>80%: brak statystycznie znamiennej różnicyr Schemat immunosupresji identyczny jak w grupie nie obarczonej ryzykiem 16
Eurotransplant AMP (Acceptable ( Mischmatch Program) + HLAMatchmaker vpra Kryteria włączenia: 1. Wynik testu PRA > 85% stwierdzony co najmniej dwukrotnie w teście virtual PRA + potwierdzona lityczność przeciwciał w klasycznym PRA-CDC z panelem 50 populacji limfocytów) 2. Wykluczenie obecności autoprzeciwciał anty-hla u biorcy (próba autologiczna) oraz przeciwciał klasy IgM (test mikrolimfocytotoksyczny PRA z dodatkiem DTT) 3. Dobór w zakresie HLA-A,B,C,DR,DQ http://etrl.eurotransplant.nl/cms/index.php?page=amprogram 17
Programy dla pacjentów w wysoko zimmunizowanych Eurotransplant Określenie akceptowalnych niezgodności (Acceptable Mismstch) przez ETRL: 1. Analiza HLA dawców z panelu PRA z (-) reakcjami w PRA-CDC 2. Testy typu Single Antigen 3. Program HLA-Matchmaker www.matchmaker.net HLA pacjenta (biorcy): A24, 31; B27, 51; DR4, 8 AM: A25, 26; B44; DR 9 HLA potencjalnych dawców (test PRA) A25, 31; B27, 51; DR4, 8 A26, 31; B27, - ; DR4, 8 A25, 26; B44, 51; DR4, 9 A24, 26; B27, 51; DR4, 8 A24, 25; B27, 51; DR4, 8 A24, 31; B44, 51; DR4, - A24, 31; B27, 44; DR4, 8 A25, 31; B44, 51; DR4, 8 A25, 31; B44, 51; DR4, 9 A25, 31; B44, 51; DR8, 9 Standards for Histocompatibility Testing, wersja 5.6, kwiecień 2008; punkt G 3.110 Akredytacja EFI lub ASHI 18
Virtual PRA 19
ET: Acceptable Mischmatch Program Dostęp p do przeszczepu W pierwszym roku przeszczepiono 68 z 129 wysoko zimmunizowanych. W tym 57 z 68 pacjentów otrzymało nerkę z programu ET-AMP (średnia oczekiwania 9,7 miesięcy, w tym większość znalazła odpowiedniego dawcę w pierwszych sześciu miesiącach). W oparciu o klasyczne zasady ET-KAS, dokonano 11-tu transplantacji (średnia oczekiwania 18,6 miesięcy). 20
ET: Acceptable Mischmatch Program Czas przeżycia przeszczepu 21
ET: AMP + HLAMatchmaker Zwyczajowo stopień doboru mierzony ilością niezgodnych z dawcą antygenów HLA-A, B, DR (0-6 MM: mismatch) Dlaczego obserwuje się tak duży rozrzut w funkcjonowaniu nerek o 5-6 MM u biorców przeszczepu? http://www.hlamatchmaker.net/ 22
http://www.hlamatchmaker.net/ ET: HLAMatchmaker Algorytm doboru pary na poziomie analizy podobieństwa epitopów (antygenowość + immunogenność), nie antygenów. Każdy antygen HLA przedstawiony w postaci ciągu krótkich sekwencji peptydowych (EAA: eplets amino acid), opisujących regiony polimorficzne zdolne do indukcji powstawania przeciwciał HLA-A2 23
ET: HLAMatchmaker Rodzaj wytwarzanych przez biorcę przeciwciał zależy od jego własnych HLA Każda nerka jest inaczej immunogenna względem danego biorcy o takiej samej liczbie niezgodnych HLA http://www.hlamatchmaker.net/ 24
HLAMatchmaker Polimorficzne epitopy HLA-B51(5) Immunogenność HLA-B51dawcy dla haplotypu biorcy: HLA-A2, 68; HLA-B27, 44 HLA-A2, 68; HLA-B35, 44 HLA-A2, 24; HLA-B7, 8 α1 peptyd α2 α2 α1 β2m α3 25
Immunogenność. Czy są różnice w immunogenności HLA-B8? Biorca 1: HLA-A2,A30; B18,B27; Cw2,Cw4 Biorca 2: HLA-A2,A31; B42,B53; Cw2,Cw7 26
Biorca 1: HLA-A2,30; A2,30; B18, 27; Cw2,w4 82 90 105 107 127 131 138 142 144 147 149 151 156 158 A02 lrg A S W K R T T tkh W aah ahv L A A30 lrg A S G N R T I tqr W aar arw L A B18 lrg A P G N S T I tqr W aar arv L A B27 llr A P G N S T I tqr W aar arv L A Cw2 lrg A P G N R T I tqr W aar are W A Cw4 lrg D P G N R T I tqr W aar are R A Donor HLA B8 lrg A P G N R T I tqr W aar arv D A 163 166 171 177 180 184 186 193 199 207 246 248 253 A02 T Ew Y Et Q A K Av A S A V Q A30 T Ew Y Et Q P K Pi A G A V E B18 T Ew H Et Q P K Pi A G A V E B27 E* Ew Y Et Q P K Pi A G A V E Cw2 E* Ew Y Et Q Eh K Pv A G A V E Cw4 T Ew Y Et Q Eh K Pv A G A V E Donor HLA B8 T Ew Y Dt E P K Pi A G A V E 27
Biorca 1: HLA-A2,30; A2,30; B18, 27; Cw2,w4 Patient HLA 9 12 14 17 41 45 56 62 66 70 74 76 80 A02 A*0201 F sv R gr A Me G Ge rkv ahs H Vd gtl A30 A*3001 S sv R gs A Me R Qe rnv aqs D Vd gtl B18 B*1801 H sv R GR A Te G Rn qis tnt Y Es rnl B27 B*2705 H sv R gr A Ee G Re qic aka D Ed rtl Cw2 Cw*0202 Y av R sr A Ge G Re qky rqa D Vn rnl Cw4 Cw*0401 S sv W gr A Ge G Re qky rqa ad Vn rnl Donor HLA B8 B*0801 D am R gr A Ee G Rn qif tnt D Es rnl Biorca 1: względem HLA-B8 ma 6 niezgodnych tripletów 28
Transplantation. 2007 Apr 27;77(8):1236-9. THE NUMBER OF AMINO ACID TRIPLET DIFFERENCES BETWEEN PATIENT AND DONOR IS PREDICTIVE FOR THE ANTIBODY REACTIVITY AGAINST MISMATCHED HUMAN LEUKOCYTE ANTIGENS 29
Biorca 2: HLA-A2, 31; B42, 53; Cw2, w7 HLA-B8 nie jest niezgodnością dla biorcy nr 2 30
HLAMatchmaker a pacjenci HS: Przykład: Pacjent PRA=94% o genotypie HLA-A24,-;B38,35;Cw4,-. PFD na znalezienie dawcy wynoszą PFD=0,007% (1 na 14000 dawców bez ryzyka immunologicznego). Zastosowanie aplikacji HLAMatchmaker w połączeniu z PRA-CDC (panel 50-dawców o znanych HLA), PFD zwiększa do 0,115% (1 na 870 dawców). źródło: Transpl. Vol. 75, 889-897, No. 6, 2003 31
HLAMatchmaker korzyści: Możliwość określenia najmniej immunogennej pary dawca biorca Określenie dodatkowych, akceptowalnych niezgodności dla zimmunnizowanych pacjentów Ograniczanie liczby zimmunizowanych po przeszczepie Poprawa przeżycia przeszczepu Pacjenci zgłoszeni do retransplantacji: Możliwość przeszczepiania z powtórzonym MM 32
Wysokozimmunizowani Efekty programów dla wysoko zimmunizowanych wdrożone na świecie Programy skierowane głównie do pacjentów wysoko zimmunizowanych (HS) celem: Poprawy dostępu do przeszczepu Wydłużenia czasu przeżycia przeszczepu 33
II. IDENTYFIKACJA ALLOPRZECIWCIAŁ w praktyce Grupy testów serii LABScreen Screening PRA Single Antigen HLA-A2 PE anty- human IgG HLA-B7 HLA-A2 HLA-A24 HLA-B27 HLA-B44 HLA-Cw1 HLA-Cw5 34
Screening: LABScreenMixed Wynik (-) Wynik (+) Powtótka co 6 tyg. (około 60%) LABScreen PRA kl. I i/lub II Proponowany algorytm badawczy monitorowania immunizacji PRA 1-80 % PRA > 80 % (17 pacjentów) Powtórka co 6 tyg Single Antigen Programy HS
IDENTYFIKACJA ALLOPRZECIWCIAŁ 20 µl surowicy 5µl beadsów klasa I i /lub klasa II (lub wariant combo) Inkubacja 30 min, RT 3x płukanie + PE-anty IgG, 30 min RT Luminex 2x płukanie
Zielony laser oznacza ilość analitu Czerwony laser wykrywa i identyfikuje mikrokulkę, badany analit 37
IDENTYFIKACJA ALLOPRZECIWCIAŁ Single Antigen Rozdzielczość => Ponad 155 specyficzności klasy I, II Patient Typing Abs Produced A*0302 A*0301 A*2403 A*2402 Sandra Rosen-Bronson, Ph.D; Georgetown University; OLI Visuals, 2003 DRB1*1337 DRB1*1301 Carol Pancoska, Ph.D, DIP; The Sharing Network; OLI Visuals, 2003
HLA Fusion Software kalkulacja wyników w dla alloprzeciwciał
NBG Ratio = Normalized Background ratio [Sample bead#n - Sample bead#nc (001)] [LSNC bead#n - LSNC bead#nc (001)] Normalization by Subtraction
122.07 39.02 121.31 147.12 = 1.661
Zasada kwalifikacji reakcji (+/-) NBG (normalized background ratio) dla wariantu LS-NC (alternate BG) NBG > 1,6: pozytywne. NBG pomiędzy 1.2-1.5 = szary kolor NBG < 1.2: negatywne Wszystkie beadsy muszą być negatywne aby kwalifikowały się jako (-) Nie wszystkie beadsy z danym Ag muszą być (+) aby kwalifikować alloswoistość jako obecną.
SPOSÓB OKREŚLANIA SPECYFICZNOŚCI PRZEZ OPROGRAMOWANIE EPITOPE ALGORITHM w wariancie LABScreenPRA
Wstęp Ogon (Tail analysis) powinien być traktowany jako wstęp do właściwej analizy specyficzności obecnych w surowicy, ma jednak podstawy teoretyczne. Algorytm wykorzystywany w OLI rozwinął się podczas 8th International Histocompatibility Workshop : Formuła statystyczna odpowiednia do analizy wieloswoistych surowic (opracowanie na podstawie analogii z panelami komórkowymi)
TAIL ANALYSIS Częstości antygenów obecnych na mikrosferach = częstościom w populacji (odzwierciedlenie panelu) np. HLA-A2 vs. HLA-A66 dlatego Alloprzeciwciała anty-a2, A1, A3 lub Cw są oceniane bardziej restrykcyjnie, wg algorytmu R-value (nie wg [% positive] czy [Stranght]) R-value. (Rvalue= Χ²/N gdzie Χ²=N[(ad-bc)-N/2]²/[(a+b)(c+d)(a+c)(b+d)]) gdzie (a)=rreal positive, (b)=false positive, =false negative, (d)=true negative.
Algorytm naśladuje manualne kreowanie ogona => 61 surowic: wykryto łącznie 166 specyficzności alloab, 136 wykryto poprawnie (zgodność 83%). (Potwierdzenie na single antigen) Nie ma w 100% poprawnego algorytmu poliklonalna odpowiedź, wysokie miana: testy typu single antigen.
Przykład 1 (Cz. M) PRA (panel 43): 27% Prawdopodobne źródła immunizacji: ciąż ąże (brak przetoczeń) 1. Screen: klasa I (+++) klasa II (++) => 2. Identyfikacja: Alloprzeciwciała anty-hla klasa I, II (mix, wskazana analiza single antigen)
ANALIZA ALLOPRZECIWCIAŁ KLASA I
KLASA I CREG A1,11,9(23,24)
WYNIK: silna reakcja (MFI 10-14 tys) z antygenami HLA kl. I PRA: 25 % (reakcja pozytywna w 25% analizowanych beadsów) SWOISTOŚCI POZYTYWNIE REAGUJĄCYCH AG: HLA A 23(9), 24(9)
ANALIZA ALLOPRZECIWCIAŁ KLASA II
WYNIK: silna reakcja (MFI 8-15 tys) z antygenami HLA kl. II PRA: 26 % (reakcja pozytywna w 26% analizowanych beadsów) SWOISTOŚCI POZYTYWNIE REAGUJĄCYCH AG: HLA DR 7, 9 (Ostrożnie z całą grupą CREG DR4,7,9 )
RODZAJ ODPOWIEDZI HUMORALNEJ A. mono swoisty
RODZAJ ODPOWIEDZI HUMORALNEJ A. poli swoisty korzyści: określenie akceptowalnych antygenów
Dziękuję za uwagę 58