1.1. Właściwości i funkcja wołowej β-laktoglobuliny (LGB)

1. Wstęp 1.1. Właściwości i funkcja wołowej β-laktoglobuliny (LGB) Laktoglobuliny to niewielkie białka globularne występujące w serwatkowej frakcji mleka (Lucena i wsp., 2006). Zidentyfikowano je w mleku wielu ssaków, m. in. krowy, bawoła, kozy, owcy, osła, delfina, świni, konia, psa, kota, kangura oraz pawiana (Sawyer & Kontopidis, 2000). W ludzkim mleku nie wykryto obecności endogennej β-laktoglobuliny (Haenlein, 2004, Rachagani i wsp., 2006). Wołowa β-laktoglobulina jest białkiem należącym do rodziny lipokalin. Lipokaliny to grupa niewielkich białek ludzkich, zwierzęcych i roślinnych o masie ok. 18 20 kda (Bugos i wsp., 1998, Åkerstrom i wsp., 2000, Charron i wsp., 2005). Białka z rodziny lipokalin (ang. lipocalins) wraz z awidynami (ang. avidins) oraz białkami wiążącymi kwasy tłuszczowe (ang. Fatty Acids Binding Proteins, FABPs) można zaliczyć do większej rodziny białek nazwanej kalcynami (ang. calycins) (Flower, 1996, Brrat 2000). 1.1.1. Występowanie i funkcje fizjologiczne LGB Jedną z najlepiej scharakteryzowanych pod względem właściwości fizykochemicznych laktoglobulin jest wołowa β-laktoglobulina (LGB). Białko to zostało wyizolowane w 1934 roku z mleka krowiego przez A. H. Palmera (Palmer, 1934). Stężenie LGB w krowim odtłuszczonym mleku wynosi zwykle ok. 2 4 g/l (Farrell i wsp., 2004). W przyrodzie LGB występuje w postaci wielu izoform. Zidentyfikowano m. in. odmiany A, B, C, D, E, F, G, H, I, J oraz W (Qin i wsp., 1998). Najpowszechniejsze są warianty A i B laktoglobuliny różniące się sekwencją aminokwasową w dwóch pozycjach: 64 i 118 (Asp/Gly i Val/Ala) (Godovac-Zimmermann i wsp., 1996, Uchrinova et. al., 2000). Odmiany A i B różnią się też nieznaczne stabilnością cieplną, rozpuszczalnością w wodzie i zdolnościami do asocjacji (Oliveira i wsp., 2001). Fizjologiczna funkcja wołowej β-laktoglobuliny nie została jednoznacznie określona (Kontopidis i wsp., 2004). Przypuszcza się, że białko to bierze udział w transporcie kwasów tłuszczowych lub retinolu w przewodzie pokarmowym cieląt (Cho i wsp., 1994, Puyol i wsp., 1995, Ragona i wsp., 2000, Riihimäki i wsp., 2008). LGB 1

może być także zaangażowana w metabolizm retinolu i kwasów tłuszczowych (Pérez & Calvo 1995, Puyol i wsp., 1995). Inne badania wskazują, że LGB bierze udział w regulowaniu aktywności enzymatycznej lipaz (Pérez i wsp., 1992). Możliwe jest także, że LGB utraciła swoje pierwotne funkcje w toku ewolucji, a jej obecność w mleku ma znaczenie tylko odżywcze (Sawyer i wsp., 1998). 1.1.2. Oligomery LGB Monomer LGB jest zbudowany ze 162 reszt aminokwasowych. Masa pojedynczego łańcucha polipeptydowego izoformy B laktoglobuliny wynosi ok. 18300 Da (Panick i wsp., 1999). W zależności od temperatury, stężenia białka, soli oraz ph, laktoglobulina może tworzyć różne formy oligomeryczne (Sakurai i wsp., 2001, Gottschalk i wsp., 2003). Punkt izoelektryczny laktoglobuliny wynosi ok. 5,2 (Lin i wsp., 2001). LGB zachowuje swoją natywną strukturę w szerokim zakresie ph (Timasshef i wsp., 1966). W ph pomiędzy 2 a 3, w nieobecności soli, białko występuje w formie monomerycznej (Fogolari i wsp., 1998, Sakurai i wsp., 2001). W ph pomiędzy 3,7 i 5,2 laktoglobulina odwracalnie asocjuje w oktamery (największe stężenie przy ph ~ 4,7). W temperaturze 8 C lub 15 C i przy stężeniu niższym niż 1 mm LGB może tworzyć też tetramery i heksamery (Gottschalk i wsp., 2003). W fizjologicznych warunkach (ph ok. 7,0) i przy stężeniach soli > 50 µm LGB występuje w formie dimerycznej (Uchrinova et. al., 2000, Gottschalk i wsp., 2003). W ph powyżej 8,0 równowaga zaczyna przesuwać się w kierunku monomerów (Verheul i wsp., 1999). Wzrost ph do ok. 11 powoduje denaturację alkaliczną białka, chociaż niektóre doniesienia sugerują, że nieodwracalne rozfałdowanie LGB zachodzi już w ph równym 9.0 (Casal i wsp., 1988, Taulier & Chalikian, 2001). 1.1.3. Struktura przestrzenna wołowej β-laktoglobuliny Struktura wołowej β-laktoglobuliny została wyznaczona przy pomocy metod NMR (Kuwata i wsp., 1998, Kuwata i wsp., 1999, Uhrínová i wsp., 2000, Oliveira i wsp., 2001) oraz krystalografii rentgenowskiej (Brownlow i wsp., 1997, Qin i wsp., 1998, Qin i wsp., 1999, Adams i wsp., 2005, Vijayalakshmi i wsp., 2007). Jak wykazały te badania, głównym elementem strukturalnym białka jest β-baryłka zwana często 2

Badania strukturalne oddziaływań β-laktoglobuliny ze związkami o działaniu biologicznym kielichem (ang. calyx) (Kontopidis i wsp., 2002) przez co wołowa laktoglobulina została zakwalifikowana do rodziny lipokalin (Koistinen i wsp., 1999, Sawyer & Kontopidis 2000, Flower i wsp., 2000). Charakterystyczną cechą strukturalną lipokalin jest β-baryłka stanowiąca sztywne rusztowanie cząsteczki (Skerra, 2000). Zbudowana jest ona zwykle z 8 (do 10) wstęg antyrównoległego arkusza β (Skerra 2000, Grzyb i wsp. 2006), a dostęp do jej wnętrza (zazwyczaj hydrofobowego) regulowany jest za pomocą ruchomych pętli (Brownlow i wsp., 1997). β-baryłka LGB zbudowana jest z 8-niciowego antyrównoległego arkusza β (Rysunek 1.1), podzielonego na dwie przeciwległe części, utworzone przez β-wstęgi oznaczane A H i E H (Kontopidis i wsp., 2004), dziewiąta nić I położona poza baryłką bierze udział w tworzeniu dimeru (Sakurai i Goto, 2002). Baryłka otoczona jest przez elastyczne pętle AB, CD, EF oraz GH (Rysunek 1.2) (Jameson i wsp., 2002). pętla CD Trp61 pętla AB pętla EF α-helisa pętla AB C-koniec N-koniec I C119 H pętla GH C-koniec A G F N-koniec H C106 G E C121 pętla GH D C C160 B A B F Trp19 Trp61 C66 C E pętla CD D Trp19 pętla EF A. B. Rysunek 1.1. Struktura wołowej laktoglobuliny (PDB ID: 3NPO). (A, B) Na rysunku zaznaczono wstęgi A-I arkusza β oraz pętle AB, CD, EF i GH otaczające wejście do baryłki. Na rysunku zaznaczono także pozycje reszt Trp i Cys. W cząsteczce LGB znajduje się też α-helisa (reszty 129 141), położona po zewnętrznej stronie β-baryłki (Kontopidis i wsp., 2002), inne krótkie α-helisy oraz helisy 310 zlokalizowane w rejonie pętli AB oraz we fragmentach N- i C-końcowych (Qin i wsp., 1998, Uhrínová i wsp., 2000) (Rysunek 1.1). W cząsteczce LGB znajduje się pięć reszt cysteiny, z których cztery zaangażowane są w tworzenie dwóch mostków disiarczkowych (Cys66 Cys160 oraz Cys106 Cys119) stabilizujących strukturę (Rysunek 1.1). W monomerze białka obecne 3

są też dwie reszty tryptofanu, Trp19 ukryty w rdzeniu białka oraz Trp61 znajdujący się na pętli CD. Powstanie dimeru laktoglobuliny następuje w wyniku asocjacji monomerów za pośrednictwem β-wstęgi I (Rysunek 1.2) w czym główną rolę odgrywają wiązania wodorowe tworzące się pomiędzy atomami łańcucha głównego należącymi do reszt 146 150 (Sakurai i Goto, 2002, Adams i wsp., 2006). W procesie tym biorą też udział reszty z pętli AB. pętla GH Trp19 B C D F E pętla EF G A H pętla AB wstęga I wstęga I pętla AB H A G pętla EF E F D C B B Trp19 Ser150 Leu149 Arg148 Ile147 Ile147 Arg148 Leu149 Ser150 A. pętla GH B. Rysunek 1.2. Struktura dimeru LGB. Podjednostki dimeru oddziałują ze sobą głównie za pomocą wiązań wodorowych, tworzących się z udziałem atomów należących do reszt 147 150 zlokalizowanych na β-wstędze I. 1.1.4. Przejście Tanforda Jedną z najważniejszych właściwości LGB jest zdolność do wiązania w β-baryłce hydrofobowych ligandów (Kontopidis i wsp., 2002) zależna od ph, którego wartość determinuje konformację ruchomej pętli EF, zamykającej i otwierającej dostęp do baryłki (Qin i wsp., 1998, Ragona i wsp., 2003). Zjawisko odwracalnej zmiany konformacyjnej pętli EF zależne od ph, zostało nazwane od nazwiska współodkrywcy przejściem Tanforda (ang. Tanford transition) (Tanford i wsp., 1959). Przejście Tanforda zachodzi w ph ok. 7.0 i jest prawdopodobnie wywoływane protonowaniem reszty Glu89, która charakteryzuje się anomalnym pk a, wynoszącym ok. 7,3 7,5 (Qin i wsp., 1998, Sakurai i Goto, 2006). Struktury krystaliczne LGB wyznaczone w ph 6,2 i 7,1, które różną się konformacją pętli EF wykazały, że w ph 6,2 sprotonowana reszta Glu89 tworzy wiązanie wodorowe z resztą Ser110, co utrzymuje 4

Badania strukturalne oddziaływań β-laktoglobuliny ze związkami o działaniu biologicznym pętlę w pozycji zamykającej dostęp do baryłki (Rysunek 1.3). W ph 7,1, ta sama pętla ma konformację otwartą umożliwiającą wnikanie liganda do wnętrza baryłki (Qin i wsp., 1998). Nowsze badania wskazują, że zmiana konformacyjna w rejonie pętli EF jest prawdopodobnie poprzedzona zmianami strukturalnymi zachodzącymi w rejonie pętli GH, które pojawiają się w ph nieco niższym niż 7.0 (Sakurai i Goto, 2006). Zamknięta pętla EF jest stabilizowana siecią wiązań wodorowych powstających pomiędzy Glu108 i Asn109 z pętli GH oraz Glu89 i Asn90 z pętli EF ale możliwe, że do stabilizacji takiej konformacji przyczyniają się także reszty Leu87, Ser110, and Ser116 (Fogolari i wsp., 2005). Przy wzroście ph powyżej 7,0 zmiana konformacyjna w rejonie pętli GH, powoduje rozluźnienie i w konsekwencji zerwanie wiązań wodorowych stabilizujących zamkniętą konformację pętli EF. Wywołuje to zmianę położenia łańcuchów bocznych reszt Glu89 oraz Asn90 i otwieranie pętli EF (Sakurai i Goto, 2006). pętla EF F G H pętla EF A F E G H A F H A E E B B ph = 6,2 G B C C C D D D ph = 7,1 ph = 8,2 Rysunek 1.3. Struktury krystaliczne LGB w wyznaoczne różnych warunkach ph. Na rysunku zaznaczono pozycję pętli EF regulującej dostęp do β-baryłki. Struktura w ph = 6,2 (PDB ID: 3BLG) z pętlą EF w zamkniętej konformacji, struktury w ph = 7,1 oraz w ph = 8,2 z pętlą EF w otwartej konformacji. Postuluje się także, że zmiany konformacyjne zachodzące w obrębie pętli EF mogą nie tylko regulować dostęp do baryłki (Rysunek 1,3) ale zamknięta pętla EF może także chronić przed degradacją niewielkie ligandy związane wewnątrz baryłki, np. w czasie ich transportu przez żołądek (Uhrínová i wsp., 2000). 5

1.1.5. Formy krystaliczne LGB Kryształy wołowej β-laktoglobuliny otrzymywano na przełomie lat 30-tych i 40-tych XX wieku (Crowfoot i Riley, 1938, Crowfoot, 1941) jednak jakość tych kryształów a także stosowane wówczas metody badawcze pozwoliły tylko na określenie ich symetrii oraz liczby cząsteczek w jednostce asymetrycznej (Sawyer i wsp., 1999). Pierwsze niskorozdzielcze, niekompletne modele struktury LGB zostały opublikowane ok. 20 lat później (Aschaffenburg i wsp., 1965). Następnie rozwiązano rombowe, trójskośne i trygonalne struktury LGB z rozdzielczością 6,00 Å (Green i wsp., 1979). Ujawniły one, że głównym elementem strukturalnym białka jest arkusz β. Średniorozdzielcza rombowa struktura LGB (2,80 Å) została opublikowana w 1986 roku i ujawniła, że wołowa β-laktoglobulina ma strukturę bardzo podobną do białka wiążącego retinol (Papitz i wsp., 1986). Rok później opublikowano trygonalną strukturę LGB wyznaczoną z rozdzielczością 2,50 Å (Monaco i wsp., 1987). Obie struktury opublikowane w latach 80-tych XX wieku zawierały jednak poważne błędy ze względu na brak gęstości elektronowej dla reszt od 30 do 65 (Sawyer i wsp., 1999). W latach 90-tych XX wieku i na początku XXI wieku rozwiązano kompletne struktury formy trójskośnej (162 reszty), rombowej (152 reszty, brak odcinka N- końcowego) i trygonalnej (162 reszty) laktoglobuliny z rozdzielczościami 1,80 Å; 2,10 Å i 2,24 Å (Brownlow i wsp., 1997, Oliveira i wsp., 2001, Qin i wsp., 1998). Obecnie w bazie PDB zdeponowanych jest kilkanaście struktur LGB, wyznaczonych w różnych warunkach ph i siły jonowej. [...] W Tabeli 1.1 zestawiono zdeponowane dotychczas w PDB struktury laktoglobuliny, ich symetrie oraz warunki ph w jakich je otrzymano. Tabela 1.1. Struktury krystaliczne wołowej laktoglobuliny zdeponowane w PDB, ich symetria oraz ph (lub jego zakres) w którym je otrzymano. symetria PDB ID ph P1 1BEB 6,50 P2 1 2 1 2 2Q39 7,40 P2 1 2 1 2 1 2AKQ, 2R56 5,20 5,50 C222 1 2Q2M, 1B8E, 1QG5, 2Q2P, 1UZ2 7,40 7,90 P3 2 21 2BLG, 1GX9, 1BSY, 1BSO, 2GJ5, 1B0O, 3BLG, 1GXA, 1GX8, 1BSQ 6,20 8,20 6

1.2. Kompleksy LGB z ligandami Wołowa LGB, jak większość białek z rodziny lipokalin, wiąże ligandy we wnętrzu β-baryłki, stanowiącej centralne miejsce wiązania ligandów (Kontopidis i wsp., 2002). Hydrofobowe ligandy są wiązane przez LGB z bardzo dużym powinowactwem, ale niską specyficznością (Konuma i wsp., 2007). Obecnie w PDB zdeponowane są dwie średniorozdzielcze struktury kompleksów LGB z kwasem palmitynowycm (PDB ID: 1GXA, 2,35 Å; PDB ID: 1B0O, 2,50 Å) różniące się pozycją grupy karboksylowej liganda oraz jedna struktura kompleksu LGB z kwasem 12-bromododekanowym (PDB ID: 1BSO, 2,23 Å), a także struktura z retinolem (PDB ID: 1GX8, 2,40 Å) oraz kwasem retinowym (PDB ID: 1GX9, 2,34 Å) a także struktura kompleksu LGB z witaminą D 3 (PDB ID: 2GJ5, 2,40 Å). W literaturze opisane zostały też struktury kompleksu LGB z cholesterolem i witaminą D 2 (Kontopidis i wsp., 2004) jednak struktury te nie zostały zdeponowane w PDB. 1.2.1. Wiązanie kwasów tłuszczowych do LGB Wołowa laktoglobulina ma zdolność wiązania nasyconych i nienasyconych kwasów tłuszczowych o różnej długości łańcucha węglowodorowego. Za naturalne ligandy LGB uważa się kwasy tłuszczowe i retinol, które wykazują najwyższe powinowactwo do tego białka (Kontopidis i wsp., 2002). Oddziaływanie LGB z tymi grupami związków zostało bardzo dobrze opisane w literaturze, chociaż niektóre dane dotyczące np. stałych wiązania białko-ligand, są bardzo rozbieżne. Brakuje też wielu danych strukturalnych, opisujących w szczegółowy sposób oddziaływanie LGB z tymi grupami związków. Większość badań wskazuje, że monomer LGB wiąże jedną cząsteczkę kwasu tłuszczowego, jednak niektóre sugerują wyższą stechiometrię wiązania (Spector & Fletcher, 1970, Zimet & Livney, 2009). Do laktoglobuliny świeżo wyizolowanej z mleka przyłączone są różne typy lipidów m.in. kwasy tłuszczowe (Puyol i wsp., 1995, Pérez i wsp., 1992). Substancje te obecne są w mleku krowim w różnej postaci i ilościach. W mleku wykrywa się obecność kwasów tłuszczowych zawierających od 4 do 20 atomów węgla w cząsteczce (Mottram & Evershed, 2001, Jensen, 2002, Soyeurt & Gengler, 2008). Najwyższą 7

zawartość notuje się dla kwasów zawierających 16 lub 18 atomów węgla w łańcuchu węglowodorowym (Månsson, 2008), do których LGB ma najwyższe powinowactwo (Frapin i wsp., 1993). Mleko krowie zawiera też znaczne ilości witamin rozpuszczalnych w tłuszczach, takich jak retinol (witamina A) i α-tokoferol (witamina E) (Bergamo i wsp., 2003), które też mogą być wiązane do LGB. Początkowo sądzono, że LGB podobnie do albuminy może wiązać kwasy tłuszczowe zawierające od 12 do 18 atomów węgla w cząsteczce. Powinowactwo LGB do tych ligandów maleje w szeregu: kwas palmitynowy (C16:0) > stearynowy (C18:0) > oleinowy (C18:1) > laurynowy (C12:0) (Spector & Fletcher, 1970). Kolejne badania wykazały, że LGB może wiązać kwasy zawierające w cząsteczce od 12 do 20 atomów węgla, ustalono też, że powinowactwo do kwasów maleje w kolejności: kwas palmitynowy (C16:0) > stearynowy (C18:0) > mirystynowy (C14:0) > arachidowy (C20:0) > laurynowy (C12:0). Te same badania wykazały, że LGB nie wiąże krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, które zawierają 10 (kwas kaprynowy) i 8 (kwas kaprylowy) atomów węgla w łańcuchu alifatycznym (Frapin i wsp., 1993). Opublikowana później praca (Collini i wsp., 2003) donosiła niejednoznacznie, że kwasy te mogą wiązać się do białka, ale z niskim powinowactwem i małą specyficznością. LGB wiąże także, wiele nienasyconych kwasów tłuszczowych m.in. te, które mają duże znaczenie dla prawidłowego funkcjonowania organizmu człowieka lub mają potencjalne działanie lecznicze. Wśród nich znajdują się, np. kwasy linolowy (C18:2) i linolenowy (C18:3) (Frapin i wsp., 1993), kwas cis-parinarowy (C18:4) (Zsila i wsp., 2002), dokozaheksaenowy (C22:6) (DHA) (Zimet i wsp., 2009) oraz sprzężony kwas linolowy (CLA) (C18:2) (Considine i wsp., 2007). Zauważono też, że LGB wykazuje nieco wyższe powinowactwo do naturalnych kwasów tłuszczowych, mających wiązania podwójne w konformacji cis niż do kwasów z wiązaniami w konformacji trans (Frapin i wsp., 1993). 1.2.2. Kompleksy LGB z retinolem i jego pochodnymi Wysokie powinowactwo LGB do kwasów tłuszczowych i retinoidów jest prawdopodobnie wiązane z fizjologicznymi funkcjami laktoglobuliny. Przypuszcza się, że białko to uczestniczy w metabolizmie tych związków u młodych krów (Kushibiki i wsp., 2001). 8

Początkowo uważano, że LGB może wiązać tylko kwasy tłuszczowe. Pierwsze doniesienia na temat oddziaływania tego białka z retinolem pojawiły się w 1972 roku (Futterman & Heller, 1972). Dzięki późniejszym badaniom zauważono podobieństwo strukturalne oraz homologię sekwencyjną pomiędzy LGB a białkiem wiążącym retinol (ang. RBP, Retinol Binding Protein) (Papiz i wsp., 1986). Obecnie wiadomo, że monomer laktoglobuliny ma zdolność do wiązania jednej cząsteczki retinolu w β-baryłce (Fugate & Song, 1980, Dufour & Haertlé, 1990, Cho i wsp., 1994, Kontopidis i wsp., 2002). Badania strukturalne oraz badania przeprowadzone w roztworze, wykazały również, że LGB wiąże też pochodne retinolu, np. kwas retinowy (Dufour i wsp., 1991, Kontopidis i wsp., 2002), octan retinolu (Dufour i wsp., 1991) oraz inne związki z tej grupy, np. jonony (Dufour i wsp., 1990, Guichard i Langourieux, 2000, Jouenne i Crouzet, 2000, Jung i Ebeler, 2003) i β-karoten (Dufour i Haertlé, 1991). LGB ma wyższe powinowactwo do kwasu palmitynowego niż do retinolu, gdyż kwas palmitynowy wypiera retinol z β-baryłki o czym świadczą eksperymenty przeprowadzone w roztworze (Wu i wsp., 1999) oraz eksperymenty polegające na kokrystalizacji laktoglobuliny z równomolowymi ilościami kwasu palmitynowego i retinolu. Wykazały one, że w takich warunkach otrzymywano kompleks LGB z kwasem palmitynowym, a nie z retinolem (Kontopidis i wsp., 2002). 1.2.3. Inne znane ligandy LGB Chociaż LGB wykazuje największe powinowactwo do kwasów tłuszczowych (Spector i Fletcher, 1970, Frapin i wsp., 1993) i retinolu (Fugate i Song, 1980, Cho i wsp., 1994, Kontopidis i wsp., 2002), to może ona tworzyć kompleksy także z innymi związkami znacznie różniącymi się budową i właściwościami. Do związków, które wiązane są z niższym powinowactwem niż kwasy tłuszczowe i retinol należą różne klasy lipidów. Poza kwasami tłuszczowymi, LGB może oddziaływać z cząsteczkami fosfolipidów (Martins i wsp., 2008, Jobichen i wsp., 2009), triacylogliceroli (Smith i wsp., 1983) oraz z cholesterolem (Wang i wsp., 1997, Kontopidis i wsp., 2004). Białko ma także zdolność wiązania witamin rozpuszczalnych w tłuszczach, np. witaminy D 2 (erogokalcyfeol) (Wang i wsp., 1997), witaminy D 3 (cholekalcyferol) (Yang i wsp., 2008) oraz witaminy E (tokofeol) (Liang i wsp., 2010). Laktoglobulina ma też zdolność do wiązania związków alifatycznych, w tym estrów (Pelletier i wsp., 1998), ketonów (Andriot i wsp., 2000), węglowodorów (Wishnia & Pinder, 1966) czy kwasów alkanosulfonowych (Busti i wsp., 2005). 9

LGB może wiązać także różnorodne substancje pochodzenia roślinnego. Wśród nich można wyróżnić związki z grupy alkaloidów używane jako przyprawy np. piperynę (Zsila i wsp., 2005), kurkuminę (Mohammadi i wsp., 2009) i kapsaicynę (Yang i wsp., 2003) oraz roślinne związki fenolowe o zróżnicowanej strukturze (w tym flawonoidy) często działające jako antyutleniacze, np. kwercetynę, kwas ferulowy czy reswratrol (Liang i wsp., 2008, Riihimäki i wsp., 2008). Inną klasą związków, które mogą oddziaływać z laktoglobuliną są porfiryny oraz ich pochodne (Dufour i wsp., 1990). Laktoglobulina może także tworzyć kompleksy z syntetycznymi związkami chemicznymi (Sawyer i wsp., 1998) takimi jak detergenty np. SDS (Lamiot i wsp., 1994, Creamer, 1995) czy barwniki, np. błękit bromofenolowy (Colen, 1970, Waissbluth i Grieger, 1973). Wykazano, że LGB może wiązać różne klasy cząsteczki leków, w tym leki antydepresyjne, np. chloropromazynę (Bhattacharyya & Das, 2001), flourochinolony o działaniu antybakteryjnym, takie jak np. norfloksacyna i lewofloksacyna (Eberini i wsp., 2006, Eberini i wsp., 2008), leki stosowane w terapii nowotworów, np. elliptycynę (Dodin i wsp., 1990, Dufour i wsp., 1992) oraz różne klasy leków słabo rozpuszczalnych w wodzie, m.in. flurbiprofen, fluwastatynę, sulindac oraz fluoksetynę (Barbiroli i wsp., 2010). 1.2.4. Miejsca wiązania ligandów w cząsteczce LGB Głównym miejscem wiązania hydrofobowych ligandów jest β-baryłka (Qin i wsp., 1998, Wu i wsp., 1999, Kontopidis i wsp., 2002) ale w cząsteczce LGB istnieją także inne miejsca, w których mogą wiązać się ligandy (Yang i wsp., 2008, Wu i wsp., 1999, Narayan & Berliner 1997, Fogolari i wsp., 2000). Jedno z nich, zostało zidentyfikowane w strukturze krystalicznej kompleksu LGB z witaminą D 3 (Yang i wsp., 2008) na powierzchni cząsteczki (Rysunek 1.4), w rowku pomiędzy α-helisą, wstęgą I oraz C-końcowym fragmentem obejmującym reszty 136 149. Przypuszcza się, że kolejne miejsce wiążące może być zlokalizowane w okolicy głównej α-helisy, β wstęg G i H oraz N-końca (Wu i wsp., 1999). Postuluje się, że inne miejsce wiążące może utworzyć się także w okolicy N-końca, kiedy N-końcowy fragment łańcucha polipeptydowego zmienia konformację a odcinek zawierający reszty od 1 do 5 odsunie się od arkusza β dzięki zmianie konformacji Gln5. Taka 10

reorientacja łańcucha białkowego umożliwia dostęp do polarnych reszt Glu108, Lys135 i Lys138, które mogą oddziaływać z ligandami (Qin i wsp., 1998). C-koniec I ligand VD3 związany w centralnym miejscu wiążącym ligand VD3 związany w drugim miejscu wiążącym A H G F E N-koniec α-helisa Gln5 Rysunek 1.4. Struktura kompleksu LGB z ligandem - witaminą D 3, (kolor zielony) związanym w centralnym miejscu wiążącym oraz na powierzchni białka (Yang i wsp., 2008, PDB ID: 2GJ5). Postuluje się, ze inne potencjalne miejsce wiążące może znajdować się na N-końcu w rejonie Gln5 oraz pomiędzy α-helisą a β-wstęgą G oraz H i N-końcem (Wu i wsp., 1999). Mechanizm wiązania i uwalniania liganda z centralnego miejsca wiążącego LGB nie został dotychczas do końca poznany. Wiadomo, że wiązanie ligandów w baryłce uzależnione jest od ph, a główną rolę w tym procesie odgrywają prawdopodobnie niespecyficzne oddziaływania hydrofobowe (Konuma i wsp., 2007). Ligandy są uwalniane z β-baryłki w wyniku obniżania ph. Proces uwalniania liganda został częściowo opisany dla kwasu palmitynowego na podstawie badań NMR w roztworze (Ragona i wsp., 2000). Kwas palmitynowy jest silnie wiązany do białka w zakresie ph 5,9 8,4. Zauważono, że kwas ten zaczyna być uwalniany z β-baryłki, kiedy wartość ph spada poniżej 6,0. Postulowano bliżej nie zidentyfikowaną rolę pętli EF w mechanizmie uwalniania tego liganda z centralnego miejsca wiążącego. W tym procesie pewną rolę odgrywać mogą też oddziaływania elektrostatyczne (Ragona i wsp., 2000). [...] 1.3. Wykorzystanie białek z rodziny lipokalin 11

Białka z rodziny lipokalin mogą pełnić różne funkcje, ale zwykle odpowiedzialne są za transport małych hydrofobowych cząsteczek. Rola wielu z nich nie została dotychczas jednoznacznie wyjaśniona (Åkerstrom i wsp., 2000). Wiele lipokalin, zwłaszcza zwierzęcych, to silne alergeny wywołujące gwałtowną reakcję alergiczną u ludzi (Mäntyjärvi i wsp. 2000). W ludzkim organizmie również występuje szereg białek z tej grupy a znane są struktury ok. 10 z nich (Schleuber i Skerra, 2005, Schönfeld i wsp., 2009). Ze względu na swoje zdolności do wiązania hydrofobowych cząsteczek oraz niewielkie rozmiary, białka z rodziny lipokalin znalazły praktyczne zastosowanie. Wykorzystanie lipokalin jest możliwe ze względu na to, że są to małe białka o masie nie przekraczającej 20 kda w związku z tym mogą łatwo przenikać do tkanek. Naturalne lub zmodyfikowane lipokaliny, ze względu na swoje niewielkie masy cząsteczkowe są wydalane z organizmu w wyniku filtracji nerkowej, jeśli krążą w osoczu krwi w postaci monomerów. Ich czas półtrwania w osoczu jest niedługi można jednak stosować kilka technik przedłużających obecność tych białek w organizmie (Hohlbaum i Skerra, 2007). Lipokaliny są znacznie mniejsze niż stosowane często w naukach biologicznych i medycynie przeciwciała, których ekspresja in vitro jest bardziej skomplikowana ze względu na ich złożoną budowę (Hohlbaum i Skerra, 2007). Lipokaliny składają się z jednego łańcucha polipeptydowego, zazwyczaj nie są glikozylowane, co ułatwia ich produkcję w systemach prokariotycznych (Skerra, 2008). Naturalne, a także zmodyfikowane lipokaliny cechują się wysoką stabilnością (temperatury denaturacji powyżej 70 C). Białka te zawierają zwykle jeden lub dwa mostki disiarczkowe a często także jedną wolną resztę cysteiny. Wolna cysteina może być wykorzystywana do modyfikacji kowalencyjnych, jednak aby zapobiegać jej interakcjom z innymi białkami osocza zaleca się aby podczas modyfikacji zastępować ją resztą Ser (Skerra, 2008). Białka z rodziny lipokalin mają też specyficzną strukturę. Złożone są ze sztywnego rdzenia, jaki stanowi arkusz β tworzący β-baryłkę oraz otaczających ją elastycznych pętli. Podczas modyfikacji lipokalin, mutacje wprowadzane są zwykle w obrębie pętli, które ze względu na swoją elastyczność, łatwo adaptują się do wprowadzanych zmian. Z tego względu nawet rozległe zmiany w sekwencji naturalnej lipokaliny nie powodują znaczących zmian strukturalnych w całej cząsteczce gdyż jej struktura łatwo dostosowuje się do wprowadzanych mutacji (Korndörfer i wsp., 2003). 12

Lipokaliny są dobrze rozpuszczalne w wodzie, osoczu krwi i innych płynach tkankowych w stężeniach do 1,0 mg/ml (Hohlbaum i Skerra, 2007), większość z nich jest łatwo rozprowadzana w organizmie. Te cechy sprawiają, że lipokaliny mogą być wykorzystywane jako cząsteczki transportujące, wychwytujące aktywne biologicznie lub toksyczne związki lub białka tworzące kompleksy z receptorami (Hohlbaum & Skerra, 2007). Ze względu na zdolności do specyficznego rozpoznawania celów molekularnych, zbliżone do właściwości przeciwciał (ang. antibody), zmodyfikowane lipokaliny w analogii do nazwy antibody nazwano antykalinami (ang. anticalin) (Beste i wsp., 1999, Skerra, 2000). 1.3.1. Zmodyfikowane lipokaliny, czyli antykaliny Doniesienia na temat zmodyfikowanych białek z rodziny lipokalin pojawiły się stosunkowo niedawno. Pierwszą opisaną zmodyfikowaną lipokaliną było białko BBP (ang. Bilin Binding Protein), którego naturalnym ligandem jest bilina, będąca pochodną protoporfiryny (IX) (Huber i wsp., 1987, Andersen i wsp., 1998). Modyfikacje sekwencji BBP wprowadzano, m.in. tak aby uzyskać białka o powinowactwie do estrów kwasu ftalowego (Vogt i Skerra, 2004) barwników fluorescencyjnych lub związków o właściwościach leczniczych (Korndörfer i wsp., 2003, Korndörfer i wsp., 2003). Wprowadzając mutacje w 16 pozycjach łańcucha aminokwasowego BBP w obrębie elastycznych pętli oraz w β-baryłce, uzyskano zmodyfikowaną lipokalinę nazwaną FluA (Rysunek 1.5), która z wysokim powinowactwem wiązała fluoresceinę (Korndörfer i wsp., 2003). W wyniku modyfikacji tego samego białka, otrzymano także lipokalinę nazwaną DigA16, powstałą poprzez wprowadzenie mutacji w 17 pozycjach w łańcuchu aminokwasowym. Ta zmodyfikowana lipokalina była zdolna do wiązania digoksygeniny i digitoksygeniny z bardzo wysokim powinowactwem. Oba ligandy to glikozydy o działaniu nasercowym, które używane są także w biochemii do znakowania kwasów nukleinowych i białek (Korndörfer i wsp., 2003). [...] Kolejną poddaną modyfikacji lipokaliną było białko ludzkie tzw. ludzka lipokalina 2 (ang. human lipocalin 2), nazywana także lipokaliną neutrofilową związaną z żelatynazą (ang. neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NAGL). NAGL ma naturalne powinowactwo do sideroforów takich jak enterobaktyna, chelatujących jony żelaza (Abergel i wsp., 2008). Po mutacjach wprowadzonych w 15 pozycjach łańcucha aminokwasowego, białko to zyskało powinowactwo (Rysunek 1.6) do związku 13

Badania strukturalne oddziaływań β-laktoglobuliny ze związkami o działaniu biologicznym będącego pochodną kwasu DTPA (diethylenetriamine pentaacetic acid, DTPA), chelatującego jony metali ziem rzadkich: Y3+, Tb3+, Gd3+ oraz Lu3+, których izotopy radioaktywne są często używane w radioterapii i obrazowaniu biologicznym (Kim i wsp., 2009). A. B. E. C. D. Rysunek 1.6. Struktury krystaliczne wybranych antykalin. Struktura antykaliny Dig16A z cząsteczką (A) digoksygeniny (PDB ID: 1LKE) oraz (B) digitoksygeniny (PDB ID: 1LNM) związaną specyficznie wewnątrz baryłki β. (C) Struktura antykaliny FluA (PDB ID: 1NOS) z cząsteczką fluoresceiny związaną w β-baryłce. (D) Struktura kompleksu zmodyfikowanej ludzkiej lipokaliny 2 z cząsteczką liganda chelatującego jon Y3+ (PDB ID: 3DSZ). (E) Struktura kompleksu zmodyfikowanej ludzkiej lipokaliny 2 z zewnątrzkomórkowym fragmentem ludzkiego CTLA-4 (PDB ID: 3BX7). Modyfikując ludzką lipokalinę 2 stworzono także białko (Rysunek 1.6), które wykazuje powinowactwo do 4-antygenu związanego z cytotoksycznością limfocytów T (ang. cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4, CTLA-4, CD152). CTLA-4 w oddziaływaniu z innymi receptorami komórkowymi hamuje aktywację limfoctów T. Jego zablokowanie, np. poprzez związanie do niego zmodyfikowanej lipokaliny, powoduje, że aktywność limfocytów T nie słabnie, co może być wykorzystane w leczeniu infekcji, nowotworów oraz HIV (Schönfeld i wsp., 2009). Trwają także prace (Skerra, 2008) nad lipokaliną, która wiąże się do czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (ang. Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF), 14

pośredniczącego w tworzeniu i wzroście sieci naczyń krwionośnych, m.in. w guzach nowotworowych. Związanie VEGF do lipokaliny, może spowodować zahamowanie wzrostu naczyń krwionośnych, co może być wykorzystane w leczeniu nowotworów i zapobieganiu przerzutom (Skerra, 2008). Obecnie antykalina wiążąca VEGF jest w pierwszej fazie badań klinicznych 1. 1.3.2. LGB jako nowy typ transportera molekularnego Wołowa β-laktoglobulina, lipokalina będąca składnikiem mleka spożywczego i jego przetworów, stanowi naturalny komponent diety człowieka i nie jest toksyczna. Białko to ze względu na swoją strukturę i właściwości fizykochemiczne, podobne do tych którymi cechują się inne modyfikowane lipokaliny (Rozdział 1.3), może zostać zmodyfikowane i wykorzystane w podobny sposób co było również postulowane wcześniej (Wolf i Brett 2000, Muresan i wsp., 2001, Zsila i wsp., 2005, Liang i wsp., 2008, Barbiroli i wsp., 2010). LGB posiada także szereg dodatkowych właściwości, m. in. zachowuje swoją strukturę w niskim ph, zbliżonym do ph żołądka (Reddy i wsp., 1988, Guo i wsp., 1995, Kinekawa & Kitabatake, 1998) i w tych warunkach jest odporna na trawienie enzymami żołądkowymi (Reddy i wsp., 1988). Podatność na takie trawienie wzrasta jednak w miarę wzrostu ph (Guo i wsp., 1995, Creamer i wsp., 2004). Na uwagę zasługuje też fakt, że LGB wprowadzana wraz ze spożywanym mlekiem krowim do organizmu, nie zostaje całkowicie strawiona, a ślady jej niezdegradowanej formy można znaleźć w osoczu krwi (Lovegrove i wsp., 1993) a także w mleku kobiet karmiących (Fukushima i wsp., 1997, Vadas i wsp., 2001). Laktoglobulina może być wytwarzana w eukariotycznych (np. Pichia pastoris) systemach ekspresji (Invernizzi i wsp., 2004, Nouaille i wsp., 2005) a najnowsze prace dowodzą, że z powodzeniem można ją też produkować w prostszych systemach prokariotycznych (Panniah i wsp., 2010). Mimo licznych cech predysponujących LGB do modyfikacji i potencjalnego zastosowania w medycynie, laktoglobulina posiada także wady. Podobnie do innych lipokalin jest alergenem (oznaczanym jako Bos d 5), może więc wywoływać reakcje alergiczne u niektórych osób (Restani i wsp., 1999, Mäntyjärvi i wsp., 2000). Badania strukturalne wykazały, że za oddziaływania z immunoglobulinami klasy E, biorącymi 1 informacja pochodzi od producenta antykalin, http://www.pieris-ag.com/news-events/recent-news.php 15

udział w reakcji alergicznej, odpowiadają aminokwasy zlokalizowane w obrębie β-wstęg A, B, C i D oraz w pobliżu C-końca i we fragmencie pętli poprzedzającym największą α-helisę (Niemi i wsp., 2007). Problem alergenności białka mógłby prawdopodobnie zostać wyeliminowany poprzez mutacje wprowadzane w rejonach odpowiedzialnych za oddziaływanie z przeciwciałami. Zmodyfikowana LGB może znaleźć potencjalne zastosowanie do wychwytywania toksycznych związków z organizmu, np. trucizn, toksyn czy przedawkowanych leków lub do wyłapywania nadmiaru cholesterolu czy innych steroidów z płynów ustrojowych. LGB mogłaby też służyć jako związek ułatwiający wprowadzanie do organizmu trudno rozpuszczalnych leków. Inne potencjalne zastosowanie to wiązanie cząsteczek produkowanych w nadmiernych ilościach przez organizm, takich jak mediatorów stanu zapalnego, np. tromboksanów, leukotrienów czy prostaglandyn a w niektórych wypadkach hormonów lub peptydów sygnałowych. 1.3.3. Wpływ wybranych mutacji na strukturę LGB Obecnie opisanych zostało kilka zmutowanych form LGB, jednak mutacje wprowadzane w białku miały na celu zbadanie jego właściwości a nie zmianę specyficzności wiązania ligandów. W PDB zdeponowana jest struktura krystaliczna białka będącego chimerą wytworzoną z wołowej i końskiej laktoglobuliny (Tsuge i wsp., 2010, PDB id: 3KZA) oraz struktura mutanta C121S wołowej LGB (Jayat i wsp., 2004). Struktura mutanta C121S jest niemal identyczna ze strukturą naturalnej LGB, mutacja wprowadzona w łańcuchu białkowym spowodowała jedynie zmianę zachowania białka. W odróżnieniu od naturalnej LGB mutant C121S nie ulega nieodwracalnej agregacji w wysokiej temperaturze ma też mniejszą stabilność termiczną, niższą odporność na czynniki redukujące oraz wykazuje większą wrażliwość na trawienie pepsyną (Jayat i wsp., 2004). Zamiana Cys121 na inne reszty alaninę lub walinę podobnie jak mutacja C121S, powoduje obniżenie stabilności strukturalnej mutantów C121A i C121V objawiającej się większą podatnością na denaturację mocznikiem (Yagi i wsp., 2003). Inne znane warianty LGB to mutanty K70M, K141M, F136A, W19A. Wykazywały one zmniejszone lub zwiększone powinowactwo do retinolu w stosunku do naturalnej LGB (Cho i wsp., 1994), jednak żadna z tych mutacji nie była wprowadzana w rejonie centralnego miejsca wiążącego. 16

Sprawdzano też, jak mutacje w cząsteczce LGB wpływają na stałą dimeryzacji białka. W tym celu stworzono szereg wariantów LGB mających mutacje wprowadzone w rejonie pętli AB: D33A, D28A, D33R, R40M, R40D, R40E, wstęgi I arkusza β H146P, R148A, R148P, S150P oraz w pozycjach A34S A34T R40K W61G W61R (Sakurai i wsp., 2002). Widma CD dla białek mających mutacje wprowadzane w tych rejonach łańcucha aminokwasowego, wskazywały, że ich struktura jest niemal identyczna ze strukturą naturalnej LGB (Sakurai i wsp., 2002). Powyższe dane wskazują, że laktoglobulina nie była poddawana wcześniej próbom większych systematycznych modyfikacji, które wpływałby na specyficzność wiązania ligandów przez to białko. Właściwości fizykochemiczne oraz struktura laktoglobuliny sprawiają, że LGB wydaje się być obiecującym kandydatem na nowy typ transportera molekularnego, który specyficznie będzie wiązał i przenosił związki bioaktywne. 1.3.4. Systemy ekspresji LGB Produkcja zmodyfikowanych wariantów białka wymaga opracowania prostego, powtarzalnego protokołu ekspresji i oczyszczania laktoglobuliny oraz użycia systemu ekspresyjnego, które będzie pozwalał na otrzymywanie dużych ilości poprawnie sfałdowanego białka. Dotychczas laktoglobulinę produkowano głównie w eukariotycznych systemach ekspresji (Tabela 1.4) chociaż w ostatnich latach pojawiły się doniesienia na temat produkcji w systemach bakteryjnych poprawnie zwiniętego białka w ilościach odpowiednich do badań strukturalnych (Ariyaratne i wsp., 2002, Ponniah i wsp., 2010). Jedna z metod ekspresji rozpuszczalnego białka w bakteriach E. coli polega na koekspresji laktoglobuliny z bakteryjną izomerazą wiązań disiarczkowych DsbC, która jest jednym z enzymów kluczowym dla poprawnego fałdowania białek bakteryjnych wydzielanych do peryplazmy (Banaszak i wsp., 2004). Stwierdzono, że koekspresja laktoglobuliny z DsbC w bakteriach E. coli znacznie zwiększa ilość poprawnie sfałdowanego i rozpuszczalnego białka, posiadającego poprawnie utworzone mostki disiarczkowe (Ponniah i wsp., 2010). Bakteryjna cytoplazma jest środowiskiem redukującym, a przez to nie sprzyja tworzeniu wiązań disiarczkowych, do których wymagane jest utlenienie grup SH cysteiny. Wykorzystanie do ekspresji szczepów bakteryjnych posiadających mutacje w genach kodujących tioredoksynę (trxb) i reduktazę glutationu (gor) sprzyja utlenianiu grup tiolowych cysteiny i wytwarzaniu 17

wiązań disiarczkowych w bakteryjnej cytoplazmie (Bessette i wsp., 1999). Wprowadzenie izomerazy wiązań disiarczkowych DsbC zapobiega tworzeniu przypadkowych wiązań disiarczkowych pomiędzy resztami cysteiny. W odpowiednich szczepach bakteryjnych, np. Origami przy udziale izomerazy DsbC można produkować rozpuszczalną formę laktoglobuliny, która jak potwierdziły badania NMR ma poprawną strukturę trzeciorzędową (Ponniah i wsp., 2010). Tabela 1.4. Wybrane systemy ekspresji wołowej β-laktoglobuliny. system ekspresji eukariotyczne systemy ekspresji forma otrzymywanego białka Pichia pastoris białko rozpuszczalne, niespecyficznie glikozylowane 1 białko rozpuszczalne 2 Saccharomyces cerevisiae białko rozpuszczalne 3 białko rozpuszczalne 4 prokariotyczne systemy ekspresji Escherichia coli białko nierozpuszczalne, niepoprawnie sfałdowane 5 białko rozpuszczalne produkowane jako białko fuzyjne z tioredoksyną 6 białko rozpuszczalne koekspresja z izomerazą DsbC 7 Lactobacillus casei białko rozpuszczalne, ekspresja w obecności staphylococcal nuclease 8 1 Kim i wsp., 1997, 2 Denton i wsp., 1998, 3 Totsuka i wsp. (1998), 4 Katakura i wsp. (1999), 5 Chatel i wsp. (1999), 6 Ariyaratne i wsp., 2002, 7 Ponniah i wsp., 2010, 8 Hazebrouck i wsp., 2007. 18

19