Praca oryginalna Original Article

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2014; 50(1): 5-13 Praca oryginalna Original Article Ocena limfocytów regulatorowych T Foxp3 + z ekspresją receptora CCR5 i produkcji wybranych cytokin przez efektorowe limfocyty T u chorych na astmę oskrzelową przy użyciu wielokolorowej cytometrii przepływowej Evaluation of the Foxp3 + regulatory T lymphocytes expressing surface CCR5 receptor and the production of selected cytokines by effector T lymphocytes in patients with bronchial asthma using multi-color flow cytometry Mateusz Bobrowski 1, Łukasz Kraszula 1, Makandjou-Ola Eusebio 1, Maciej Kupczyk 2, Piotr Kuna 2, Mirosława Pietruczuk 1 1 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, II Katedra Chorób Wewnętrznych, Uniwersytet Medyczny w Łodzi 2 Klinika Chorób Wewnętrznych, Astmy i Alergii, II Katedra Chorób Wewnętrznych, Uniwersytet Medyczny w Łodzi Streszczenie Wprowadzenie. W przebiegu astmy limfocyty T regulatorowe CD4 + CD25 + Foxp3 + uczestniczą w utrzymywaniu kontroli pomiędzy odpowiedzią pro- i przeciwzapalną. Cel: W pracy oceniano odsetki limfocytów T regulatorowych Foxp3 + z ekspresją receptora CCR5 i limfocytów T efektorowych oraz produkcję wybranych cytokin u osób chorych na astmę. Badano także korelację pomiędzy poszczególnymi ocenianymi parametrami. Materiały i metody. Do badania zakwalifikowano 48 chorych z rozpoznaną astmą (25 z astmą ciężką i 23 z astmą umiarkowaną-łagodną). Grupę kontrolną stanowiło 25 osób zdrowych. Przy wykorzystaniu wielokolorowej cytometrii przepływowej oceniano immunofenotyp i produkcję cytokin przez regulatorowe i efektorowe limfocyty T. Wyniki. Wykazano znamienne obniżenie odsetka limfocytów T regulatorowych oraz zwiększenie odsetka limfocytów T efektorowych w zależności od ciężkości astmy. Zaobserwowano statystycznie istotny wzrost odsetka limfocytów T regulatorowych z ekspresją receptora chemokinowego CCR5 u osób chorych na astmę ciężką w porównaniu do osób chorych na astmę umiarkowaną-łagodną i grupy kontrolnej. Stwierdzono, że odsetek limfocytów T regulatorowych CCR5 + o profilu cytokinowym IL-10 + jest statystycznie znamiennie obniżony u chorych na astmę w porównaniu do grupy kontrolnej. Wykazano statystycznie istotnie niższą produkcję IL-4 przez limfocyty T efektorowe w grupie osób chorych na astmę umiarkowaną-łagodną w porównaniu do grupy kontrolnej. Wnioski. Wzrost odsetka populacji limfocytów T efektorowych i obniżenie odsetka populacji limfocytów T regulatorowych jak i produkcji IL-10, może być jedną z przyczyn zaburzenia równowagi w odpowiedzi pro i przeciwzapalnej u chorych na astmę oskrzelową niezależnie od jej ciężkości. Summary Introduction. CD4+CD25 + Foxp3 + regulatory T (Treg) cells are essential for maintaining a balance between pro and antiinflammatory responses especially in asthma. Aim of the study. We examined the percentage of Foxp3+Treg cells expressing surface chemokine receptors CC5 and cytokine production by effector T lymphocytes (Teff) in patients with asthma. We also examined a correlation between the evaluated parameters. Material and methods. The study included 48 patients with asthma (25 with severe and 23 with mild to moderate asthma). The control group comprised 25 healthy volunteers. The production of cytokines in Treg and Teff lymphocytes was evaluated using multicolor flow cytometry. 5

Results. We showed a statistically significant reduction in the percentage of Treg cells and an increase in the percentage of Teff cells which correlates with the severity of asthma. Moreover, we showed a significant increased expression of CCR5 in patients with severe asthma compared with mild-moderate asthma and controls. We also found that IL-10 production by itregfoxp3 + CCR5 + was significant lower in patients with severe and mild-moderate asthma than in controls. IL-4 production by Teff cells was significantly lower in mild-moderate asthma than in healthy subjects. Conclusions: The increased percentage of Teff cells and the decreased percentage of Treg cells and IL-10 production in patients with asthma, may be one cause of imbalance in pro- and anti-inflammatory response in asthma, regardless of its severity. Słowa kluczowe: astma, limfocyty Treg, limfocyty Teff, CCR5 Key words: asthma, Treg cells, Teff cells, CCR5 Wstęp Astma jest jedną z najczęstszych przewlekłych, zapalnych chorób dróg oddechowych, w którym uczestniczą liczne komórki oraz produkowane przez nie mediatory [1]. Ze względu na alarmujące dane epidemiologiczne oraz niezadowalające efekty terapeutyczne w leczeniu astmy wciąż poszukuje się nowych możliwości leczenia astmy poprzez poznawanie mechanizmów nadzorujących układ immunologiczny i próbę jego modulacji [2]. Duże nadzieje budzą limfocyty T regulatorowe. Stanowią one heterogenną populację komórek odpowiedzialnych za indukcję i rozwój obwodowej tolerancji na własne antygeny, a tym samym zapewniają homeostazę układu immunologicznego [3]. Ze względu na ontogenezę wśród limfocytów T CD4 + wyróżnia się naturalne limfocyty regulatorowe (ntreg) powstające w grasicy o podstawowym immunofenotypie opisywanym jako CD4 + CD25 high CD127 low Foxp3 + oraz generowane na obwodzie indukowane limfocyty regulatorowe (itreg) o immunofenotypach - CD4 + CD25 high Foxp3 +, CD4 + CD25 - IL- 10 + IL-4 - (Tr1), CD4 + TGF-β + (Th3) [4]. Wykazano, że komórki te mogą pełnić działanie supresorowe na komórki efektorowe uczestniczące w reakcji zapalnej poprzez hamowanie ich aktywacji, proliferacji, różnicowania i/lub funkcji. Aktywność limfocytów Treg jest związana z pośrednim wytwarzaniem cytokin przeciwzapalnych, tj. TGF-β (transformujący czynnik wzrostu β) i interleukiny 10 lub poprzez bezpośredni kontakt z komórką docelową [3, 5]. Uważa się, że zaburzenia liczebności i/lub funkcji limfocytów regulatorowych T mogą odgrywać istotną rolę w patomechanizmie chorób zapalnych, autoimmunizacyjnych, alergicznych czy zakaźnych [6]. Wiadomo, że odpowiednia lokalizacja limfocytów Treg jest niezbędna do prawidłowego ich działania, a zaburzenia w migracji Treg mogą być przyczyną osłabienia właściwości supresyjnych in vivo. W migracji limfocytów regulatorowych, do miejsca zapalenia kluczową rolę odgrywają chemokiny i ich receptory. Limfocyty regulatorowe T wykazują na powierzchni ekspresję receptorów CCR4, CCR5, CCR6, CCR7 i CCR8 [7, 8]. W badaniach nad limfocytami T regulatorowymi z niedoborem receptora CCR5 prowadzonych na myszach, wykazano stłumione właściwości supresyjne i nadmierną odpowiedź układu immunologicznego. CCR5 jest jednym z receptorów beta-chemokin, będącym integralnym białkiem błonowym osadzonym strukturą siedmiu alfa helis. Naturalnymi ligandami dla receptora CCR5 są CCL5 (RANTES), CCL3 (MIP- 1α) i CCL4 (MIP-1β), których wzrost ekspresji jest obecny w nabłonku dróg oddechowych i w komórkach mięśni gładkich u chorych na astmę [9]. Ostatnie badania wykazały, że rozwój ciężkiej postaci astmy wiąże się istotnie z wyższym stężeniem chemokin CCL2, CCL3 i CCL5, a także wzrostem interleukiny 5 (IL-5) w popłuczynach oskrzelowo płucnych, w porównaniu do chorych z łagodniejszą formą astmy. W badaniach prowadzonych na limfocytach CD4 + CD25 high Foxp3 + wykazano również, że ekspresja receptora CCR5 na ich powierzchni ma kluczowe znaczenie w ograniczeniu stanu zapalnego o profilu cytokinowym Th1 w chorobach z autoagresją w przebiegu infekcji bakteryjnej [10]. Szereg ludzkich chorób autoimmunologicznych wykazuje zaburzoną odpowiedź komórek T, w których aktywność limfocytów T efektorowych (Teff) jest niedostatecznie kontrolowana za pomocą naturalnych i indukowanych limfocytów, co prowadzi do ich aktywacji i różnicowania [11]. Wśród limfocytów Teff wyróżniamy m.in. limfocyty pomocnicze typu 1 i 2 (Th1 i Th2) o immunofenotypie TCRαβ + CD3 + CD4 + CD25 low CD69 high, które odgrywają istotną rolę w regulacji swoistej odpowiedzi immunologicznej. Limfocyty Th1 i Th2 różnią się spektrum wydzielanych cytokin i funkcją efektorową, a ponadto działają względem siebie synergistycznie [12]. IFN-γ - główna cytokina produkowana przez limfocyty Th1, znosi produkcję IgE i eozynofilię, a w modelach zwierzęcych egzogenne podawanie IFN-γ może spowodować zahamowanie alergicznego zapalenia dróg oddechowych. Z kolei limfocyty Th2 - dominująca pula limfocytów u alergików, charakteryzują się wzmożoną produkcją IL-4, IL-5, IL-9 i IL-13 [13, 14]. Odgrywają one istotną rolę w utrzymywaniu określonego poziomu antygenowo specyficznych przeciwciał IgE i eozynofili, migracji komórek zapalnych do miejsc objętych zapaleniem, wzmożonej produkcji śluzu i obniżenia progu dla skurczu mięśni gładkich, czyli zmian które mogą zainicjować i utrzymywać kluczowe patofizjologiczne cechy astmy. Wydaje się więc, że przekierowanie odpowiedzi w kierunku limfocytów Th1 pomogłoby złagodzić skutki chorób alergicznych, w tym astmy [13]. Dzięki wzajemnej modulacji odpowiedzi immunologicznej przez limfocyty T regulatorowe i efektorowe celem zaprezentowanych badań była ocena odsetka limfocytów i iden- 6

tyfikacja markerów odpowiedzialnych za ich funkcję (Treg - IL-10 i Teff - IL-4, IFN-γ) oraz receptora chemokinowego CCR5 na powierzchni limfocytów Treg u chorych na astmę ciężką i astmę umiarkowaną-łagodną w porównaniu do osób zdrowych. W przedstawionych badaniach oceniano również korelację pomiędzy produkcją IL-10 i ekspresją receptora CCR5 w limfocytach regulatorowych T Foxp3 +, a produkcją cytokin (IL-4, IFN-γ) w limfocytach T efektorowych u osób zakwalifikowanych do wyżej wymienionych grup. Materiały i metody Do badania zakwalifikowano 48 chorych z rozpoznaną astmą oskrzelową (w tym 25 z ciężką i 23 z umiarkowaną-łagodną postacią choroby). Grupę kontrolną stanowiło 25 zdrowych ochotników. Z badania wyłączono osoby palące tytoń i chorych w niestabilnym stanie klinicznym. Na podstawie historii chorób zebrano dane demograficzne i kliniczne (Tabela I). Średnia wieku w grupie kontrolnej była w podobnym przedziale jak u chorych na astmę. Rozpoznanie astmy oskrzelowej potwierdzono na podstawie wywiadu i zmienności obturacji dróg oddechowych, zgodnie z powszechnie akceptowanymi zaleceniami GINA 2008 [15]. Stopień ciężkości choroby oceniono zgodnie z definicją użytą w badaniach grupy ENFUMOSA [16]. Chorzy zakwalifikowani do grupy z astmą ciężką wymagali stałego leczenia wysokimi dawkami sterydów wziewnych, (co najmniej 1600 μg/dobę budesonidu lub beklometazonu, 800 μg/dobę flutikazonu lub równoważnika). W przypadku przewlekłej doustnej sterydoterapii, wymagane dawki leków wynosiły 800 μg/dobę budesonidu lub beklometazonu, 400 μg/dobę flutikazonu lub równoważnika. Ponadto chorzy z astmą ciężką wymagali przewlekłej terapii β-mimetykiem lub doustną teofiliną, a w roku poprzedzającym włączenie do badania mieli, co najmniej jedno zaostrzenie choroby podstawowej. Chorzy z astmą umiarkowaną-łagodną otrzymywali wyłącznie glikokortykosteroidy wziewne (max 800 μg budesonidu lub odpowiednika na dobę) plus leczenie objawowe. Materiałem badanym była krew żylna pobrana na wersenian dwupotasowy (K 2 EDTA). Projekt badawczy uzyskał zgodę Komisji Bioetycznej przy Uniwersytecie Medycznym w Łodzi RNN/49/13/KE. Od każdego chorego 8 ml krwi żylnej nawarstwiano na 12 ml podłoża Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich). Komórki jednojądrzaste (PBMCs) wyizolowano przez wirowanie 2500 obrotów na minutę przez 30 minut w gradiencie gęstości. Bezwzględną liczbę, odsetek komórek, a także odsetek żywych, wyizolowanych komórek oznaczano analizatorem pentra DX 120. Czystość komórkowa pozwalająca na przystąpienie do etapu sortowania musiała być wyższa niż 80% limfocytów. Limfocyty CD4 + wyizolowano w procesie separacji negatywnej - procedura jednostopniowa (CD4 + CD25 + CD127 dim/- Regulatory T Cell Isolation Kit II, Miltenyi Biotec, Stany Zjednoczone). W pierwszym etapie wykonano pośrednie magnetyczne znakowanie limfocytów nie-cd4 + z mieszaniną przeciwciał skoniugowanych z biotyną (przeciwciała pierwszorzędowe) oraz przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko biotynie opłaszczonymi na mikro-perełkach (przeciwciała drugorzędowe). Przeciwciała inkubowano z komórkami 15 minut w 4 C. W kolejnym etapie magnetycznej separacji zawiesinę komórek przepuszczono przez kolumnę LD. Limfocyty CD4 + przepływały przez kolumnę LD i zostały zebrane do probówki natomiast wszystkie komórki niebędące limfocytami CD4 + pozostały na kolumnie. Czystość wysortowanej populacji limfocytów CD4 + sprawdzano, znakując komórki przeciwciałami anty-cd4 (95% ± 2,7 - średnia z odsetka komórek CD4 + i błąd standardowy) zgodnie z procedurą firmową (BD Bioscience), pomiaru dokonywano cytometrem przepływowym BD FACS CANTO II. Założono hodowle komórkowe z wysortowanych limfocytów CD4 +. Hodowle komórkową prowadzono na podłożu RPMI 1640, z dodatkiem 2mM glutaminy, 5% płodową surowicę wołową (FBS), 10mM HEPES, 100 U/ml penicyliny i streptomycyny przez 72 godziny w sterylnych płytkach w warunkach 37ºC, 5% CO 2. Wyindukowanie limfocytów T CD4 + wykonano przez stymulatory: Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3; 10ug/ml - klon UCHT1 (BD Pharmingen) Tabela I. Charakterystyka badanej grupy. *atopia zdefiniowana jako co najmniej jeden dodatni wynik (>3mm) w punktowym teście skórnym z panelem alergenów. Astma ciężka Astma umiarkowana-łagodna Liczebność 25 23 wiek (lata ± SD) 50 ± 13,5 42,5 ± 13,0 płeć (K:M) 13:12 12:11 czas trwania choroby (lata ± SD) 16,5 ± 8,2 11 ± 6,1 Atopia (%) * 86% 88% Alergeny Roztocza, kot, pies, pyłki drzew, pyłki traw. Roztocza, pyłki drzew, pyłki traw. FEV 1 (l) 2,3 ± 0,6 3,4 ± 0,7 FEV 1 (% predicted) 54% ± 15,6 90% ± 15,2 7

Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28; 1ug/ml - klon CD28.2 (BD Pharmingen) zarówno dla limfocytów Treg i Teff. W celu wyindukowania limfocytów T regulatorowych stosowano dodatkowo: Recombinant Human IL-10; 0,1 ug/ml (R&D System) Recombinant Human TGF-B1; 20ng/ml (R&D System) Po zakończeniu hodowli komórkowych oznaczano naturalne i indukowane limfocyty T regulatorowe o immunofenotypie CD4 + CD25 high CD127 low Foxp3 + wykazujących ekspresję receptora CCR5 i produkujących IL-10 oraz limfocyty T efektorowe o immunofenotypie TCRαβ + CD3 + CD4 + CD25 low CD69 high produkujących IL-4 lub IFN-γ. Oznaczanie ekspresji receptora powierzchniowego CCR5 wykonano w zawiesinie limfocytów Treg. Produkcję IL-10 przez limfocyty Treg oraz IL-4 lub IFN-γ przez limfocyty Teff oznaczano w cytoplazmie po wcześniejszej inkubacji tych komórek z brefeldyną (2ng/mL) (Sigma, Niemcy). Po upływie 5 godzin komórki utrwalono, permabilizowano i inkubowano 30 minut z przeciwciałami. (Tabela II). Ocenę immunofenotypu limfocytów Treg i Teff wykonano przy użyciu 8 kolorowego cytometru przepływowego BD FACS CANTO II. Barwienie powierzchniowe antygenów wykonano zgodnie z procedurą firmową (BD Bioscience). Do analizy zbierano od 10 000 15 000 odpowiednich limfocytów. Przykładowy obraz analizy cytometrycznej odsetka limfocytów regulatorowych przedstawiono na rycinie 1. Odsetek poszczególnych komórek odnosi się zawsze do ostatniej użytej bramki. Analiza statystyczna Uzyskane wyniki badań opracowano statystycznie, korzystając z programu STATISTICA 8.0 PL. Uzyskane wyniki weryfikowano pod względem normalności rozkładu przy użyciu testu Kołmogorowa-Smirnowa. Otrzymane wyniki przedstawiono jako mediany (Me) i zakresy kwartylowe (Q 1, Q 3 ). Ze względu na brak zgodności z rozkładem normalnym w poszczególnych seriach danych, do oceny statystycznej wyko- Tabela II. Przeciwciała monoklonalne zastosowane do oceny immunofenotypu subpopulacji naturalnych i indukowanych limfocytów regulatorowych T (n/itreg) i efektorowych limfocytów T (Teff). n/itreg Przeciwciało Fluorochrom Klon Producent anty-cd4 AmCyan SK3 BD anty-cd25 FITC M-A251 BD Pharmingen anty-cd127 PerCP-Cy5.5 A019D5 BioLegend anty-foxp3 V-450 236A/E7 BD Horizon IL - 10 PE JES3-19F1 BD Pharmingen anty-ccr5 APC-Cy7 2D7/CCR5 BD Pharmingen Teff Przeciwciało Fluorochrom Klon Producent anty-tcrαβ FITC T10B9.1A-31 BD Pharmingen anty-cd3 AmCyan SK7 BD Pharmingen anty-cd4 Pacifc Blue RPA-T4 BD Pharmingen anty-cd25 PE-Cy7 M-A251 BD Pharmingen anty-cd69 APC-Cy7 FN50 BD Pharmingen anty-il4 PerCP MP4-25D2 BioLegend anty-infγ APC 4S.B3 BD Pharmingen Rycina 1. Przykładowy obraz analizy cytometrycznej odsetka limfocytów regulatorowych o immunofenotypie CD4 + CD25 high CD127 low FoxP3 + CCR5 + przy użyciu 8-kolorowej cytometrii przepływowej: A - Populacja limfocytów CD4 + CD25 high, B - Populacja limfocytów CD4 + CD25 high z ekspresją CD127 low, C - Populacja limfocytów CD4 + CD25 high CD127 low z ekspresją Foxp3 +, D - Populacja limfocytów CD4 + CD25 high CD127 low- Foxp3 + z ekspresją CCR5 + ; (według wcześniej prowadzonych badań [42]). 8

rzystywano testy nieparametryczne. Test Kruskala- Wallis a użyto w celu porównania wielu grup niezależnych, natomiast test U Mann a-whitney a do porównywania dwóch grup niezależnych. Do analizy korelacji obliczano współczynnik rang Spearmana. Za poziom istotny statystycznie przyjęto wartości p 0,05. Wyniki Wykazano, że odsetek limfocytów regulatorowych T o immunofenotypie CD4 + CD25 high CD127 low FoxP3 + jest statystycznie istotnie mniejszy w grupie chorych na astmę ciężką i astmą umiarkowaną-łagodną, niż w grupie osób zdrowych. Nie wykazano statystycznie znamiennej różnicy w odsetku limfocytów Treg pomiędzy chorymi na astmę ciężką, a chorymi z astmą umiarkowaną-łagodną (Ryc. 2A). Wykazano statystycznie istotny wzrost limfocytów T regulatorowych z powierzchniową ekspresją receptora CCR5 w grupie osób chorych na astmę ciężką zarówno w porównaniu do osób chorych na astmę umiarkowaną-łagodną jak i w stosunku do grupy kontrolnej (Ryc. 2B). Wykazano statystycznie istotne obniżenie odsetka limfocytów Treg o immunofenotypie CD4 + CD25 high CD127 low FoxP3 + CCR5 + i o profilu cytokinowym IL-10 + pomiędzy grupą osób chorych na astmę ciężką i astmę umiarkowaną-łagodną, a grupą osób zdrowych. Nie wykazano statystycznie znamiennej różnicy w odsetku limfocytów Treg CCR5 + produkujących IL-10 pomiędzy chorymi na astmę ciężką, a chorymi na astmę umiarkowaną-łagodną (Ryc. 2C). Wykazano, że odsetek limfocytów efektorowych Teff o immunofenotypie TCRαβ + CD3 + CD4 + CD25 low CD69 high jest statystycznie istotnie większy w grupie chorych na astmę ciężką jak i chorych na astmę umiarkowaną-łagodną w stosunku do grupy kontrolnej osób zdrowych. Nie wykazano statystycznie znamiennej różnicy w odsetku limfocytów Teff pomiędzy grupą osób chorych na astmę ciężką, a astmę umiarkowaną-łagodną (Ryc. 3A). Wykazano statystycznie znamienne obniżenie limfocytów T efektorowych o immunofenotypie TCRαβ + CD3 + CD4 + CD25 l ow CD69 high IL-4 + u chorych na astmę umiarkowaną-łagodną, w porównaniu do grupy kontrolnej. Nie wykazano takiej zależności u chorych na astmę ciężką w porównaniu do grupy kontrolnej. Stwierdzono jednak znamienną statystyczną istotność w odsetku limfocytów T efektorowych z produkcją IL-4 między chorymi na astmę ciężką, a umiarkowaną-łagodną (Ryc. 3B). Odsetek limfocytów T efektorowych o immunofenotypie TCRαβ + CD3 + CD4 + CD25 low CD69 high i o profilu cytokinowym IFN-γ + nie różni się statystycznie istotnie pomiędzy grupami badanymi (Ryc. 3C). W grupie chorych z astmą umiarkowaną-łagodną stwierdzono wysoką ujemną korelacją (r=-0,71; p=0,01) w limfocytach T regulatorowych pomiędzy ekspresją czynnika transkrypcyjnego FoxP3 +, a ekspresją receptora CCR5. W grupie osób chorych, zarówno na astmę ciężką (r=0,65; p=0,01) jak i na astmę umiarkowaną-łagodną (r=0,67; p=0,01) wykazano wysoką dodatnią korelację pomiędzy ekspresją czynnika transkrypcyjnego FoxP3 w limfocytach regulatorowych T, a produkcją IL-4 w limfocytach efektorowych. W grupie osób zdrowych wykazano wysoką dodatnią korelację (r=0,67; p=0,01) pomiędzy produkcją IL-10 przez limfocyty T regulatorowe, a produkcją IL-4 w limfocytach efektorowych. W grupie osób chorych na astmę umiarkowaną-łagodną (r=-0,74; p=0,001) i w grupie osób zdrowych (r=-0,67; p=0,01) stwierdzono ujemną korelację pomiędzy produkcją IL-10 przez limfocyty T regulatorowe, a produkcją IFN-γ Rycina 2. Różnice w odsetku limfocytów regulatorowych T u osób chorych na astmę ciężką, astmę umiarkowaną-łagodną i w grupie kontrolnej: A - o immunofenotypie CD4 + CD25 high CD127 low FoxP3 + ; B - o immunofenotypie CD4 + CD25 high CD127 low FoxP3 + CCR5 + ; C - o immunofenotypie CD4 + CD25 high CD127 low FoxP3 + CCR5 + IL-10 + ; D - legenda (Q1 - kwartyl dolny, Q3 - kwartyl górny, min - wartość minimalna, max - wartość maksymalna, mediana - wartość środkowa) 9

Rycina 3. Różnice w odsetku limfocytów efektorowych T u osób chorych na astmę ciężką, astmę umiarkowaną-łagodną i w grupie kontrolnej: A - o immunofenotypie TCRαβ + CD3 + CD4 + CD25 low CD69 high ; B - o immunofenotypie TCRαβ + CD3 + CD4 + CD25 low CD69 high IL-4 + ; C - o immunofenotypie TCRαβ + CD3 + CD4 + CD25 low CD69 high IFN-γ; D - legenda (Q1 - kwartyl dolny, Q3 - kwartyl górny, min - wartość minimalna, max - wartość maksymalna, mediana - wartość środkowa) w limfocytach T efektorowych. W grupie kontrolnej wykazano bardzo wysoką ujemną korelację (r=-0,9; p=0,00001) pomiędzy odsetkiem efektorowych limfocytów T z profilem cytokiny IFN-γ i odsetkiem Teff z produkcją IL-4. Dyskusja Podstawową funkcją limfocytów T regulatorowych (Treg) jest utrzymanie obwodowej tolerancji immunologicznej i supresja odpowiedzi immunologicznej. Wcześniejsze badania wykazały, że w przebiegu astmy, szczególnie jej ciężkiej postaci występuje zaburzona funkcja limfocytów Treg oraz niedostateczną kontrolę aktywności limfocytów T efektorowych (Teff) [17, 18]. Potwierdzeniem są wyniki zaprezentowanych badań, gdzie zarówno w grupie osób chorych na astmę ciężką jak i astmę umiarkowaną-łagodną wykazano znamienne zmniejszenie odsetka limfocytów Treg Foxp3 + oraz zwiększenie odsetka limfocytów Teff. Również inni badacze dokonali podobnych obserwacji. W badaniach Pietruczuk i wsp. [19] stwierdzono u osób chorych na astmę ciężką statystycznie istotne zmniejszenie zarówno liczby bezwzględnej jak i odsetka limfocytów regulatorowych T CD4 + CD25 high CD127 low z ekspresją jednego z czterech markerów powierzchniowych (Foxp3, GITR, CTLA-4, and FAS). Statystycznie istotne zmniejszenie ekspresji markerów Foxp3, CTLA-4 i FAS na limfocytach Treg stwierdzono także w grupie osób z astmą ciężką w porównaniu do chorych z astmą umiarkowaną-łagodną. W badaniach, Xue i wsp. [20] również stwierdzono obniżenie odsetka populacji limfocytów ntreg u pacjentów z astmą. Nie zawsze jednak wyniki badań są jednoznaczne. W badaniach przeprowadzonych przez Shi i wsp. [21] wynika, że nie istnieje różnica w liczbie naturalnych limfocytów Treg pomiędzy chorymi na astmę i grupą kontrolną, natomiast liczba limfocytów ntreg wzrasta w czasie zaostrzenia choroby. Zaburzenie równowagi limfocytów Treg do limfocytów Teff może być efektem niewłaściwie funkcjonujących mechanizmów kontroli ich różnicowania. Prawidłowy proces kontroli równowagi odpowiedzi immunologicznej polega na konsumpcji we wczesnej fazie aktywacji limfocytów Teff ich czynników wzrostu (m.in. IL-2) przez limfocyty Treg [22-24]. Ponadto limfocyty Treg mogą ograniczać zdolność samych limfocytów Teff do produkcji cytokin w późniejszej fazie ich aktywacji. Zaburzenie tej kontroli prowadzi do aktywacji i proliferacji limfocytów T efektorowych [23]. Wykazano ponadto, że supresja limfocytów T efektorowych może przebiegać na drodze zużycia innych poza IL-2 cytokin. W eksperymentach z udziałem myszy ze znokautowanym genem dla IL-2 stwierdzono, że dodanie do hodowli komórkowej cytokin kluczowych dla przeżycia Tregs tj. IL-4 czy IL-15 chroni komórki efektorowe przed apoptozą in vitro [17, 25]. Poza tym stosunek limfocytów Teff do Treg na początku fazy odpowiedzi immunologicznej jest wyższy, ponieważ limfocyty T efektorowe proliferują szybciej niż limfocyty T regu- 10

latorowe. Pomimo tego w miarę rozwoju odpowiedzi immunologicznej Tregs konsumują IL-2 i proliferują, równolegle powodując apoptozę zależnych od IL-2 limfocytów CD4 + uniemożliwiając im tym samym transformację w efektorowe limfocyty Th1, Th2 czy Th17 [26]. Dzięki temu hamują bezpośrednio produkcję interleukin, czyli podstawowych cytokin uczestniczących w odpowiedzi efektorowej w reakcji alergicznej [1, 27]. Objawy kliniczne astmy są wynikiem m.in. napływu licznych komórek do miejsca procesu zapalnego. Taka specyficzna migracja komórek możliwa jest dzięki obecności na ich powierzchni receptorów chemokinowych [28]. Migracja limfocytów T regulatorowych możliwa jest między innymi dzięki obecności na powierzchni komórki receptora CCR5, którego zmniejszenie ekspresji prowadzi do zaburzenia migracji i tym samym efektu supresyjnego limfocytów Treg [9, 29]. Badania prowadzone przez Picirillo wykazały, że ekspresja receptora chemokinowego CCR5 na limfocytach T regulatorowych bierze udział w ich migracji do miejsca procesu zapalnego podczas infekcji Leishmania major. Skutkuje to zahamowaniem odpowiedzi limfocytów T efektorowych i produkcji IFN-γ. Podobne wyniki uzyskano w badaniach nad chorobą przeszczep przeciwko gospodarzowi [30]. Z kolei w badaniach na myszach Moreira i wsp. [31] wykazali, że pozbawienie limfocytów T regulatorowych ekspresji receptora CCR5 skutkowało zmniejszeniem ich odsetka w miejscu procesu zapalnego i zahamowaniem rozwojowi przewlekłej grzybicy układowej wywoływanej przez Paracoccidioides brasiliensis. Natomiast przeniesienie limfocytów T regulatorowych CCR5 + od myszy typu dzikiego do myszy CCR5 -/- skutkowało hamowaniem efektorowych komórek pamięci i wzrostem zapalenia grzybicznego. W przedstawionych badaniach wykazano istotny statystycznie wzrost ekspresji receptora CCR5 w grupie osób chorych na astmę ciężką. Stwierdzono także ujemną korelację pomiędzy ekspresją receptora CCR5, a ekspresją czynnika transkrypcyjnego FoxP3 + na limfocytach Treg w grupie osób chorych na astmę umiarkowaną-łagodną. Wyniki te mogą świadczyć o tym, że podczas procesu zapalnego najważniejsza jest w pierwszej kolejności odpowiednia migracja limfocytów T regulatorowych. Dopiero po dotarciu limfocytów Treg do miejsca docelowego dochodzi do zwiększenia ekspresji czynnika transkrypcyjnego Foxp3 + poprzez działanie cytokin znajdujących się w środowisku zapalnym. Limfocyty Treg wykazują zdolność inhibicji limfocytów Th1 i Th2 m.in. na drodze mechanizmu zależnego od cytokin, takich jak: TGF-β czy IL-10 i/lub poprzez bezpośredni kontakt z komórką docelową [27, 32]. TGF-β może bezpośrednio oddziaływać na potencjalnie patogenne limfocyty efektorowe, blokując ich różnicowanie lub indukować w nich ekspresję Foxp3 i funkcje regulatorowe. Z kolei IL-10 bierze udział w kontroli odpowiedzi wrodzonej poprzez hamowanie lokalnej i systemowej akumulacji komórek biorących w niej udział oraz odgrywa rolę w powstawaniu subpopulacji limfocytów regulatorowych Tr1 [33, 34]. W prezentowanych badaniach wykazano istotne statystycznie zmniejszenie produkcji IL-10 w limfocytach Treg z ekspresją receptora CCR5, która korelowała z ciężkością astmy. Spadek poziomu wydzielanej cytokiny immunosupresyjnej potwierdza wcześniejsze wyniki zmniejszonego odsetka limfocytów Treg do Teff, co może prowadzić do zaostrzenia ciężkości astmy. Tak więc dynamika zmian poziomu sekrecji tej cytokiny wydaje się korelować z liczbą krążących limfocytów T regulatorowych w badanych grupach pacjentów chorych na astmę. Znaczenie IL-10 i TGF-β określono na modelach zwierzęcych. Myszy ze znokautowanym genem dla IL10 -/- i TGF-β -/- charakteryzowały się niekontrolowaną odpowiedzą immunologiczną i rozwijały szereg chorób zapalnych. Ponadto limfocyty regulatorowe T CD4 + CD25 + uzyskane w trakcie powyższych badań były mniej skuteczne niż naturalne limfocyty Tregs uzyskane od zdrowych zwierząt w zapobieganiu rozwoju choroby zapalnej jelit (IBD) [35]. Oprócz tego w badaniach wykorzystujących model nowotworów indukowanych UV i myszy IL10 -/- wykazano, że interleukina ta odgrywa kluczową rolę w supresji odpowiedzi mediowanej przez CD4 + CD25 + Tregs. Wydaje się więc, że IL-10 i TGF-β odgrywają istotną rolę w kontrolowaniu odpowiedzi komórkowej z udziałem Tregs [36]. Analizując powyższe dane wydawać by się mogło, iż próba odpowiedniej modulacji cytokin IL-10 i TGF-β do ich wyższego stężenia we krwi obwodowej mogłoby wpłynąć stymulująco na pełnienie przez limfocyty Treg swojej funkcji. Zwiększenie odsetka limfocytów Teff nie skutkowało wzrostem produkcji wewnątrzkomórkowego IFN-γ. Stwierdzono natomiast zmniejszenie produkcji IL-4 w limfocytach T efektorowych w grupie osób chorych na astmę ciężką i umiarkowaną-łagodną, która odpowiedzialna jest za różnicowanie limfocytów Th2 i dalszą polaryzację odpowiedzi immunologicznej, a także zmianę izotypu i produkcję IgE, immunoglobuliny kluczowej dla reakcji alergicznych [14]. Współczesne doniesienia naukowe wskazują, że regulatorowe limfocyty T mogą negatywnie regulować geny np. kodujące łańcuch α receptora dla IL-7 (CD127) czy geny takich cytokin jak IL-2, IL-4 i IFN-γ poprzez czynnik transkrypcyjny Foxp3 [37]. W badaniach in vitro przeprowadzonych przez Bollinger i wsp. [38] wykazano, że limfocyty Treg hamują wydzielanie charakterystycznych dla odpowiedzi typu Th1 cytokin IFN-γ, IL-2 i TNF-α, natomiast nie wpływają na syntezę IL-4, IL-6, IL-10 czy IL-17A. Tak więc zaburzenie liczby krążących limfocytów Treg może wpływać na wydzielanie profilu cytokinowego limfocytów T efektorowych. Ponadto w kontroli stanu zapalnego towarzyszącego astmie uczestniczą przyjmowane leki jak np. glukokortykoidy, których udział polega na hamowaniu nadekspresji cytokin tj. IL-1, IL-6, TNF-α, IFN-γ, a także w regulacji genów innych cytokin jak IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-13, GMCSF i TGF-β [39]. U osób zdrowych istnieje harmonijna równowaga pomiędzy aktywnością limfocytów Th1 i Th2, aktywność limfocytów Th1 hamuje aktywność limfocytów Th2 i odwrotnie. Głównym zadaniem limfocytów Th1 jest ich udział w reakcjach odpowiedzi komórkowej, tj. w infekcjach wirusowych, pier- 11

wotniakowych czy nowotworowych. Z kolei limfocyty Th2 odgrywają kluczową rolę w reakcjach typu humoralnego. Za reakcje alergiczne odpowiedzialne są m.in. interleukina 4 (IL- 4) oraz interferon gamma (IFN-γ), produkowane przez limfocyty T pomocnicze (IFN-γ przez limfocyty Th1, natomiast IL-4 przez komórki Th2) [25, 40]. Porównując produkcję IL-4 i IFN-γ przez limfocyty T efektorowe w grupie osób zdrowych potwierdzono ich ujemną korelację i działanie synergistyczne. Nie stwierdzono korelacji w grupach chorych na astmę. Wśród osób z chorobami alergicznymi równowaga Th1/ Th2 jest przesunięta w kierunku limfocytów Th2. Teoria ta jednak bywa dyskusyjna. Istnieją doniesienia wskazujące, że przewaga limfocytów Th1 wpływa na zaostrzenie astmy, natomiast podwyższony poziom Th2, między innymi w robaczycach zmniejsza ryzyko zaostrzeń [41]. W chwili obecnej dostępna jest duża ilość doniesień dotyczących funkcji limfocytów T regulatorowych i efektorowych w przebiegu astmy. Jednak mimo wielu badań nie udało się w pełni wytłumaczyć zależności między zaburzeniami immunologicznymi, a stanem klinicznym pacjenta. Wydaje się jednak, że brak równowagi pomiędzy dwoma subpopulacjami limfocytów Treg o właściwościach przeciwzapalnych i Teff IL-4 + /IFN-γ o właściwościach prozapalnych wpływa na nasilenie przebiegu procesu zapalnego, co znalazło odzwierciedlenie w przedstawionych wynikach. Praca finansowana w ramach finansowania badań młodych pracowników nauki i studentów studiów doktoranckich z konta 502-03/1-095-05/502-14-112. Piśmiennictwo 1. Choi MS, Park S, Choi T, et al. Bee venom ameliorates ovalbumin induced allergic asthma via modulating CD4+CD25+ regulatory T cells in mice. Cytokine 2013; 61: 256-265. 2. Kraszula Ł, Makandjou-Ola E, Kupczyk M i wsp. Wykorzystanie wielokolorowej cytometrii przepływowej do identyfikacji markerów czynnościowych limfocytów ntreg u chorych na ciężką astmę oskrzelową. Pneumonol Alergol Pol 2012; 80: 389-401. 3. Corthay A. How do regulatory T cells work? Scand J Immunol 2009; 70: 326-336. 4. Geginat J, Paroni M, Facciotti F, et al. The CD4-centered universe of human T cell subsets. Semin Immunol 2013; 25: 252- -262. 5. Pflugfelder SC, Corrales RM, de Paiva CS. T helper cytokines in dry eye disease. Exp Eye Res 2013; 117: 118-125. 6. Miyara M, Gorochov G, Ehrenstein M, et al. Human FoxP3+ regulatory T cells in systemic autoimmune diseases. Autoimmun Rev 2011; 10: 744-755. 7. Koelink PJ, Overbeek SA, Braber S, et al. Targeting chemokine receptors in chronic inflammatory diseases: an extensive review. Pharmacol Ther 2012; 133: 1-18. 8. Zhou F, Ciric B, Zhang GX, et al. Immune tolerance induced by intravenous transfer of immature dendritic cells via up-regulating numbers of suppressive IL-10(+) IFN-gamma(+)-producing CD4(+) T cells. Immunol Res 2013; 56: 1-8. 9. Yurchenko E, Tritt M, Hay V, et al. CCR5-dependent homing of naturally occurring CD4+ regulatory T cells to sites of Leishmania major infection favors pathogen persistence. J Exp Med 2006; 203: 2451-2460. 10. Soler DC, Sugiyama H, Young AB, et al. Psoriasis patients exhibit impairment of the high potency CCR5(+) T regulatory cell subset. Clin Immunol 2013; 149: 111-118. 11. Zhou Q, Hu Y, Howard OM, et al. In vitro generated Th17 cells support the expansion and phenotypic stability of CD4(+) Foxp3(+) regulatory T cells in vivo. Cytokine 2014; 65: 56-64. 12. Nakagome K, Nagata M. Pathogenesis of airway inflammation in bronchial asthma. Auris Nasus Larynx 2011; 38: 555-563. 13. Murdoch JR, Lloyd CM. Chronic inflammation and asthma. Mutat Res 2010; 690: 24-39. 14. McGee HS, Agrawal DK. TH2 cells in the pathogenesis of airway remodeling: regulatory T cells a plausible panacea for asthma. Immunol Res 2006; 35: 219-232. 15. Bateman ED, Hurd SS, Barnes PJ, et al. Global strategy for asthma management and prevention: GINA executive summary. Eur Respir J 2008; 31: 143-178. 16. The ENFUMOSA cross-sectional European multicentre study of the clinical phenotype of chronic severe asthma. European Network for Understanding Mechanisms of Severe Asthma: Eur Respir J 2003; 22: 470-477. 17. Hall BM, Tran GT, Verma ND, et al. Do Natural T Regulatory Cells become Activated to Antigen Specific T Regulatory Cells in Transplantation and in Autoimmunity? Front Immunol 2013; 4: 208. 18. Zhou X, Li B, Fan H, et al. Control of regulatory T cells and T helper cells in human diseases: from bench to bedside. J Mol Cell Biol 2013; 5: 210-211. 19. Pietruczuk M, Eusebio M, Kraszula L i wsp. Phenotypic characterization of ex vivo CD4+CD25highCD127low immune regulatory T cells in allergic asthma: pathogenesis relevance of their FoxP3, GITR, CTLA-4 and FAS expressions. J Biol Regul Homeost Agents 2012; 26: 627-639. 20. Xue K, Zhou Y, Xiong S, et al. Analysis of CD4+ CD25+ regulatory T cells and Foxp3 mrna in the peripheral blood of patients with asthma. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci 2007; 27: 31-33. 21. Shi HZ, Qin XJ. CD4CD25 regulatory T lymphocytes in allergy and asthma. Allergy 2005; 60: 986-995. 22. Thornton AM, Donovan EE, Piccirillo CA, et al. Cutting edge: IL-2 is critically required for the in vitro activation of CD4+CD25+ T cell suppressor function. J Immunol 2004; 172: 6519-6523. 23. Vercoulen Y, Wehrens EJ, van Teijlingen NH, et al. Human regulatory T cell suppressive function is independent of apoptosis induction in activated effector T cells. PLoS One 2009; 4:e7183. 24. Ma A, Xiong Z, Hu Y, et al. Dysfunction of IL-10-producing type 1 regulatory T cells and CD4(+)CD25(+) regulatory T cells in a mimic model of human multiple sclerosis in Cynomolgus monkeys. Int Immunopharmacol 2009; 9: 599-608. 25. Verbist KC, Wang R, Green DR. T cell metabolism and the immune response. Semin Immunol 2012; 24: 399-404. 26. Pandiyan P, Zheng L, Ishihara S, et al. CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells induce cytokine deprivation-mediated apoptosis of effector CD4+ T cells. Nat Immunol 2007; 8: 1353-1362. 27. Schmitt EG, Williams CB. Generation and function of induced regulatory T cells. Front Immunol 2013; 4: 152. 28. Mabuchi T, Chang TW, Quinter S, et al. Chemokine receptors in the pathogenesis and therapy of psoriasis. J Dermatol Sci 2012; 65: 4-11. 29. Wysocki CA, Jiang Q, Panoskaltsis-Mortari A, et al. Critical role for CCR5 in the function of donor CD4+CD25+ regulatory T cells during acute graft-versus-host disease. Blood 2005; 106: 3300-3307. 30. Piccirillo CA. Regulatory T cells in health and disease. Cytokine 2008; 43: 395-401. 31. Moreira AP, Cavassani KA, Massafera Tristao FS, et al. CCR5- dependent regulatory T cell migration mediates fungal survival and severe immunosuppression. J Immunol 2008; 180: 3049- -3056. 32. Burchell JT, Strickland DH, Stumbles PA. The role of dendritic 12

cells and regulatory T cells in the regulation of allergic asthma. Pharmacol Ther 2010; 125: 1-10. 33. O Garra A, Vieira PL, Vieira P, et al. IL-10-producing and naturally occurring CD4+ Tregs: limiting collateral damage. J Clin Invest 2004; 114: 1372-1378. 34. Stewart CA, Metheny H, Iida N, et al. Interferon-dependent IL- 10 production by Tregs limits tumor Th17 inflammation. J Clin Invest 2013; 123: 4859-4874. 35. Loser K, Apelt J, Voskort M, et al. IL-10 controls ultravioletinduced carcinogenesis in mice. J Immunol 2007; 179: 365- -371. 36. Workman CJ, Szymczak-Workman AL, Collison LW, et al. The development and function of regulatory T cells. Cell Mol Life Sci 2009; 66: 2603-2622. 37. Wu Y, Borde M, Heissmeyer V, et al. FOXP3 controls regulatory T cell function through cooperation with NFAT. Cell 2006; 126: 375-387. 38. Bollinger T, Bollinger A, Naujoks J, et al. The influence of regulatory T cells and diurnal hormone rhythms on T helper cell activity. Immunology 2010; 131: 488-500. 39. Liberman AC, Druker J, Perone MJ, et al. Glucocorticoids in the regulation of transcription factors that control cytokine synthesis. Cytokine Growth Factor Rev 2007; 18: 45-56. 40. Luckheeram RV, Zhou R, Verma AD, et al. CD4(+)T cells: differentiation and functions. Clin Dev Immunol 2012; 2012: 925135. 41. Siwiec J, Zaborowski T, Jankowska O i wsp. Ocena równowagi limfocytów Th1/Th2 oraz ekspresji receptorów dla lipopolisacharydu u chorych na astmę. Pneumonol Alergol Pol 2009; 77: 123-130. 42. Kraszula L, Eusebio M, Kupczyk M, i wsp. The use of multi-color flow cytometry for identification of functional markers of ntregs in patients with severe asthma. Pneumonol Alergol Pol 2012; 80: 389-401. Adres do korespondencji: mgr Mateusz Bobrowski Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, II Katedra Chorób Wewnętrznych, Uniwersytet Medyczny w Łodzi 90-153 Łódź, ul. Kopcińskiego 22 tel. +48 42 6776981, faks +48 42 6782833 e-mail: mati.bobrowski@wp.pl Zaakceptowano do publikacji: 22.03.2014 13