10. ODSALANIE I ZATĘŻANIE ROZTWORU BIAŁKA W PROCESIE FILTRACJI STYCZNEJ Opracował: Wojciech Piątkowski I. WPROWADZENIE Filtracja jest metodą oczyszczania mieszanin ciekłych i zawiesin, która wykorzystuje różnice w wielkości rozdzielanych cząstek. Używana jest szczególnie w operacjach oddzielania substancji stałych od rozpuszczalnika jak również do separacji składników mieszanin rozpuszczonych w roztworze oraz do wymiany rozpuszczalnika w roztworze danej substancji. W tym procesie stosowane są różnego rodzaju membrany (bibuły, tkaniny, polimery itp.), które posiadają pory o odpowiedniej wielkości. Gdy mieszanina poddawana filtracji napotyka na drodze swojego przepływu membranę, cząstki, które są mniejsze od porów membrany przechodzą przez nią (np. cząsteczki rozpuszczalnika) zaś cząstki, które są większe zostają zatrzymane na membranie. Proces może być prowadzony przy przepływie stycznym lub prostopadłym do membrany. I.1. Filtracja styczna W filtracji stycznej (ang. TFF Tangential Flow Filtration) przepływ strumienia zasilającego odbywa się równolegle do powierzchni membrany. Schemat procesu przedstawiono na rys. 1. Takie rozwiązanie, w porównaniu z przepływem prostopadłym, powoduje mniejsze ryzyko zatykania porów membrany przez filtrowane cząstki. Umożliwia to prowadzenie procesu bez konieczności okresowej zmiany kierunku przepływu, jak również nie powoduje szybkiego wzrostu oporów przepływu. Wadą tego procesu jest stosunkowo niska prędkość przepływu strumienia filtratu. Można ją poprawić przez zwiększenie parcia na membranę, lecz jest to ograniczone wytrzymałością ciśnieniową membrany. Dzięki zastosowaniu przepływu stycznego cząstki osiadające na membranie są porywane przez strumień retentatu i membrana ulega samooczyszczaniu. Ma to wpływ na możliwy czas ciągłej pracy membrany charakteryzowany przez ilość przefiltrowanej cieczy jak na rys. 2. Małe nachylenie krzywej na prezentowanym wykresie świadczy o możliwości dłużej pracy membrany. 83
Rys. 1. Schemat aparatu do filtracji stycznej wraz z kierunkami przepływu poszczególnych strumieni [1]. Filtrat/Permeat Zasilanie Retentat Filtrat/Permeat Przepływ filtratu/permeatu Przetworzona objętość Rys. 2. Po lewej: przekrój przez membranę w czasie przepływu stycznego. Po prawej: spadek przepływu filtratu wywołany zmniejszeniem sprawności membrany w czasie procesu [1]. I.2. Zatężanie rozcieńczonych roztworów W procesie zatężania rozcieńczonych roztworów zwiększamy stężenie głównego składnika próbki. Wykorzystywana przy tym membrana musi posiadać pory odpowiednio mniejsze od rozmiarów składnika kluczowego tak, aby został on zatrzymany w strumieniu 84
retentatu. Cząstki mniejsze od porów membrany np. cząsteczki rozpuszczalnika próbki, przechodzą przez membranę i są obecne w strumieniu filtratu patrz rys. 3. Rys. 3. Zatężanie próbki w procesie ultrafiltracji [2]. Zatężanie prowadzi się do osiągnięcia żądanych wartości stężenia składnika kluczowego w próbce. Należy przy tym zwrócić uwagę na możliwość wystąpienia krystalizacji w zatężanym roztworze. Również wzrost lepkości roztworu jest niepożądany i może powodować znaczny wzrost ciśnienia w układzie i utrudnić przechodzenie roztworu przez membranę. Przy wysokich oporach przepływu proces musi być prowadzony przy mniejszej prędkości przepływu, aby nie przekroczyć wytrzymałości membrany. I.3. Odsalanie roztworów diafiltracja W procesie diafiltracji roztworów można zmniejszyć siłę jonową filtrowanego roztworu (odsalanie) lub wymienić rozpuszczalnik na inny (np. na bufor o innym ph). Proces polega na ciągłym lub okresowym dodawaniu do filtrowanego roztworu odpowiedniego rozpuszczalnika: wody, buforu lub roztworu soli. W tym samym czasie odbierany jest filtrat, w którym znajduje się rozpuszczalnik pierwotny. Retentat zawierający składnik kluczowy jest zawracany do zbiornika zasilającego. Dla procesu okresowego po odebraniu określonej objętości filtratu ( DV na rys. 4) dodawana jest kolejna porcja 85
rozpuszczalnika. Kilkukrotny dodatek nowego rozpuszczalnika sprawia, że stopniowo zastępuje on rozpuszczalnik pierwotny [3]. Rys. 4. Schemat procesu diafiltracji, czyli następujących po sobie etapów rozcieńczania i zatężania próbki z użyciem membrany, DV objętość diafiltracji (startowa V próbki ) [3]. II. CEL ĆWICZENIA Celem ćwiczenia jest przedstawienie zastosowania filtracji stycznej z użyciem membran do odsolenia i zatężenia roztworu białka w skali semi preparatywnej. III. CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA Ćwiczenie obejmuje zapoznanie się z obsługą aparatu filtracyjnego, przeprowadzenie diafiltracji roztworu białka oraz analizę próbek po procesie. III.1. Aparatura doświadczalna i odczynniki Ćwiczenie wykonywane jest przy pomocy aparatu do filtracji stycznej Minim II (firmy Pall Life Sciences) schematycznie przedstawionym na rys. 5. Składa się on z: jednostki sterującej z panelem kontrolnym na ekranie LCD, pompy perystaltycznej o przepływie 6 100 rpm (ok. 12 200 cm 3 /min), membrany Minimate (firmy Pall Life Sciences), maksymalne ciśnienie pracy 4 bar, trzech mierników ciśnienia i jednego miernika temperatury, zaworu regulującego ciśnienie w układzie przez zmianę natężenia przepływu retentatu, 86
kompletu rurek z trójdrożnymi zaworami, zbiornika na filtrowany roztwór o pojemności 500 cm 3 z mieszadłem magnetycznym. Rys. 5. Schemat aparatury do filtracji z użyciem membrany [1]. W ćwiczeniu używane są następujące odczynniki: 50 mm bufor fosforanowy ph=7 sporządzony przez rozpuszczenie odpowiedniej naważki fosforanu disodu w wodzie i doprowadzenie kwasem fosforowym do ph=7, 1,7 M siarczan amonu rozpuszczony w buforze fosforanowym surowym, badane białko np. hemoglobina z krwi bydlęcej, czystość 90%, (firmy Fluka). III.2. Metodyka badań Zbadanie przepuszczalności wody przez membranę (NWP) (na podst. [4]) Mierzymy objętościowe natężenie przepływu filtratu (V, cm 3 /min) dla odpowiedniego ciśnienia transmembranowego (TMP bar) przy zamkniętym zaworze na retentacie. Uwaga! Nie wolno przekroczyć maksymalnego ciśnienia pracy dla danej membrany (4 bar). NWP = 600,, A powierzchnia pracująca membrany: 50 cm2. 87
Zbadanie objętości całkowitej aparatury Mierzymy objętość V c cieczy (wody) zawartej w rurkach i w membranie. Odbieramy ciecz do cylindra miarowego ze strumienia retentatu (przy zamkniętym filtracie) i przy opróżnionym zbiorniku zasilającym. Wypełnienie aparatu buforem Przed rozpoczęciem filtracji wypełniamy aparat (rurki i membranę) odpowiednim roztworem, który zapewni stabilność i rozpuszczalność składnika kluczowego. Dla białek może być to bufor fosforanowy ph=7. Sporządzenie roztworu białka Sporządzamy pierwotny roztwór białka: Rozpuszczalnik: 20% (V/V) roztwór soli 1,7 M (NH 4 ) 2 SO 4 w buforze ph=7. Rozpuszczamy odpowiednią naważkę białka w zadanej objętości rozpuszczalnika. Proces ultrafiltracji Zatężanie Wlewamy roztwór białka do zbiornika. Przy zamkniętym filtracie ustawiamy zawór na retentacie na wylot z układu i włączamy pompę przy ustalonym przepływie. Spuszczamy objętość równą V c i natychmiast przełączamy zawór na retentacie tak, aby jego strumień był zawracany do zbiornika. Otwieramy strumień filtratu i zbieramy go do cylindra miarowego. Obserwując wskazania ciśnienia (max 4 bar) przykręcamy zacisk na retentacie w celu zwiększenia przepływu filtratu. Proces prowadzimy do uzyskania kilka razy mniejszej objętości w zbiorniku niż na początku (krotność zatężenia). Cały czas monitorujemy wskazania ciśnienia w układzie. Odsalanie Po odebraniu określonej objętości filtratu wlewamy taką samą objętość buforu ph=7 do zbiornika. Proces prowadzimy dalej do uzyskania wcześniejszego zatężenia (tej samej objętości filtratu). Powtarzamy operacje dodawania buforu i zatężania aż do uzyskania żądanego stopnia odsolenia. Zakończenie procesu W końcowej fazie diafiltracji w celu uzyskania zatężonego produktu nie dodajemy już nowej porcji buforu. Zamykamy zawór filtratu i prowadzimy recykl samego retentatu przez kilka minut. Następnie odbieramy produkt do momentu spuszczenia prawie całej zawartości 88
zbiornika. Dolewamy do zbiornika objętość buforu równą całkowitej objętości aparatury (V c ) i przepuszczamy przez system odbierając retentat. Płuczemy aparaturę w buforze a następnie w wodzie. Po zakończeniu pracy wypełniamy układ 20% etanolem. Zbadanie próbek białka Otrzymane próbki zatężonego i odsolonego białka oznaczamy na detektorach chromatografu stosując przepływ przez bypass, tzn. przez, krótką i cienką kapilarę, która kieruje badaną próbkę bezpośrednio na detektor UV i detektor konduktometryczny. Wskazania detektorów w funkcji czasu tworzą piki odpowiednio absorbancji i przewodnictwa badanej próbki. Białka silnie absorbują promieniowanie UV o długości fali 280 nm. Stąd pole powierzchni obszaru pod pikiem absorbancji badanej próbki charakteryzuje masę zawartego w niej białka. Stężenie białka w analizowanych roztworach obliczane jest przez porównanie pól piku badanego i piku wzorca, którym jest roztwór o znanym stężeniu danego białka w buforze. Przewodnictwo badanych próbek jest mierzone przez detektor konduktometryczny chromatografu. Pole pod pikiem przewodnictwa dla danej próbki charakteryzuje zawarte w niej stężenie soli. Stopień odsolenia białka określamy przez porównanie piku przewodnictwo próbki po filtracji z pikiem przewodnictwa dla roztworu białka przed filtracją. Z uzyskanych pików chromatograficznych obliczamy stężenie białka oraz stopień jego odsolenia po procesie diafiltracji. IV. OPRACOWANIE I DYSKUSJA WYNIKÓW POMIARÓW Otrzymane wyniki w postaci chromatogramów należy odpowiednio opracować tj. skorygować linię bazową, usunąć zbędne dane, czyli wskazania detektora oscylujące wokół poziomu linii bazowej oraz opisać osie i krzywe (rys. 6). Dla każdego piku należy policzyć pole powierzchni pod krzywą i na tej podstawie, porównując ze wzorcem, określić stężenie białka i zawartość soli w badanych próbkach. 89
Rys. 6. Przykładowy wykres porównawczy absorbancji białka przed i po procesie. Wyniki obliczeń można przedstawić w formie tabeli: Badana próbka Pole powierzchni pod pikiem Stężenie białka po przeliczeniu, g/dm 3 wzorzec surówka koncentrat W dyskusji wyników należy odnieść się do uzyskanych wartości stężeń i na tej podstawie ocenić wyniki osiągnięte w doświadczeniu. Można też podać wady i zalety przeprowadzonego procesu, zamieścić własne spostrzeżenia i uwagi. Należy zwrócić szczególną uwagę na przyczyny ewentualnych rozbieżności wyników z planem doświadczenia. Można również podać propozycje zmian, które poprawią przebieg doświadczenia w przyszłości. V. LITERATURA [1] Scientific & Technical Report, Introduction to Tangential Flow Filtration for Laboratory and Process Development Applications, Larry Schwartz, Kevin Seeley, Pall Life Sciences, PN 33213 [2] Scientific & Technical Report, Diafiltration: A Fast, Efficient Method for Desalting, or Buffer Exchange of Biological Samples, Larry Schwartz, Pall Life Sciences, PN 33289 [3] Scientific & Technical Report, Desalting and Buffer Exchange by Dialysis, Gel Filtration or Diafiltration, Larry Schwartz, Pall Life Sciences, PN 33290 [4] Care & Use Procedure, Minimate TFF Capsule, Pall Life Sciences, PN 88227 90