WPŁYW METANOLU NA PROCES BIOSYNTEZY KWASU CYTRYNOWEGO Z SACHAROZY PRZEZ ASPERGILLUS NIGER

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych nr 584, 2016, 23 31 WPŁYW METANOLU NA PROCES BIOSYNTEZY KWASU CYTRYNOWEGO Z SACHAROZY PRZEZ ASPERGILLUS NIGER Ewelina Dymarska 1,2, Jerzy Jan Pietkiewicz 2 1 Uniwersytet Ekonomiczny we Wrocławiu 2 Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Witelona w Legnicy Streszczenie. Na przebieg hodowli Aspergillus niger i szybkość biosyntezy kwasu cytrynowego metodą wgłębną wpływa wiele czynników, m.in. rodzaj źródła węgla i jego stężenie, rodzaj i stężenie jonów metali występujących w podłożach hodowlanych oraz morfologia grzybni. Wpływ czynników stymulujących proces biosyntezy kwasu cytrynowego był dotąd szeroko badany. Alkohole o małej masie cząsteczkowej, jak metanol, etanol oraz n-propanol, mogą stymulować proces produkcji kwasu cytrynowego. Celem pracy było określenie wpływu alkoholu metylowego na biosyntezę kwasu cytrynowego w wgłębnych hodowlach okresowych Aspergillus niger PD-66 w podłożu syntetycznym z sacharozą. Przeprowadzono dwie serie badań, w których do podłoża hodowlanego dodawano alkohol metylowy w ilościach 2, 3, 4, i 5% obj. W pierwszej serii badań alkohol metylowy dodawano do sterylnego podłoża przed rozpoczęciem hodowli, natomiast w drugiej serii w 45. godzinie hodowli. Analiza wyników badań wykazała, że alkohol metylowy wpływa negatywnie na efektywność biosyntezy kwasu cytrynowego w całym zakresie stosowanych stężeń niezależnie od momentu wprowadzenia go do podłoża fermentacyjnego. Obniżenie efektywności procesu wynikało przede wszystkim z toksycznego oddziaływania metanolu na wzrost grzybni. Słowa kluczowe: Aspergillus niger, kwas cytrynowy, metanol, hodowla okresowa, biosynteza WSTĘP Kwas cytrynowy jest powszechnie stosowany w przemyśle spożywczym, chemicznym i farmaceutycznym. Jego globalna produkcja w 2010 roku wyniosła ponad 1,8 mln ton. Występuje on w tkankach roślinnych i zwierzęcych. Dla organizmów żywych jest Adres do korespondencji Corresponding author: Ewelina Dymarska, Uniwersytet Ekonomiczny we Wrocławiu, Instytut Chemii i Technologii Żywności, Zakład Mikrobiologii i Biosyntezy, ul. Komandorska 118-120, bud. H, 53-345 Wrocław, e-mail: ewelina.dymarska@ue.pl

24 E. Dymarska, J.J. Pietkiewicz niezbędny w szeregu reakcji cyklu Krebsa, w którym następuje oksydacja węglowodanów do ditlenku węgla i wody z uwolnieniem energii [Fiume i in. 2012]. Kwas cytrynowy obecny jest głównie w owocach cytrusowych: cytrynach (4 8%), grejpfrutach (1,2 2,1%), pomarańczach (0,6 1,0%), mandarynkach (0,4 1,2%), a także w ananasach, truskawkach, malinach i porzeczkach [Dziezak 2003]. Przemysłowo kwas cytrynowy jest otrzymywany z udziałem grzybów Aspergillus niger w hodowlach wgłębnych oraz w hodowlach w podłożach stałych. Szczepy Aspergillus niger charakteryzują się dużą wydajnością produkcji oraz homofermentatywnością biosyntezy kwasu cytrynowego [Pietkiewicz 2002, Papagianni 2007, Dhillon i in. 2013]. Efektywność procesu biosyntezy kwasu cytrynowego zależy od wielu czynników, m.in. właściwości zastosowanego szczepu oraz doboru optymalnych parametrów bioprocesu. W celu uzyskania dużej wydajności procesu biosyntezy kwasu cytrynowego wprowadzane są do podłoży stymulatory bioprocesu. Do potencjalnych stymulatorów fermentacji cytrynowej należą alkohole o małej masie cząsteczkowej, jak alkohole metylowy, etylowy i n-propylowy [Haq i in. 2003]. Alkohol metylowy w przeciwieństwie do etanolu nie jest asymilowany przez Aspergillus niger i nie ulega konwersji do acetylo-coa, będącego prekursorem cyklu Krebsa. Alkohol metylowy dodany do podłoży hodowlanych hamuje wzrost grzybni i zarodnikowanie, zmniejsza zużycie substratu, zwiększa przepuszczalność błony komórkowej, a także wpływa na aktywność syntazy cytrynianiowej oraz akonitazy [Leśniak 1974, Pazouki i in. 2000, Barrington i in. 2008]. Celem pracy było określenie wpływu metanolu na proces biosyntezy kwasu cytrynowego z sacharozy przez szczep Aspergillus niger PD-66 we wgłębnych hodowlach okresowych prowadzonych w kolbach na wstrząsarce. MATERIAŁ I METODY W badaniach stosowano szczep Aspergillus niger PD-66 pochodzący z Kolekcji Czystych Kultur Katedry Biotechnologii Żywności Uniwersytetu Ekonomicznego we Wrocławiu. Podłoże hodowlane używane w badaniu zawierało w swoim składzie [g dm 3 ]: sacharozę 150,0; NH 4 NO 3 2,0; KH 2 PO 4 0,2; MgSO 4 7H 2 O 0,2 i wodę wodociągową [Pietkiewicz 2002]. Kwasowość czynną regulowano przez dodatek wodnego roztworu HCl o stężeniu 0,5 mol dm 3 i ustalono na poziomie 3,0. Podłoże sterylizowano w temperaturze 121 C przez 30 min. Do schłodzonego podłoża dodawano około 10 cm 3 przygotowanego inokulum, tak aby stężenie konidiów wynosiło 10 5 cm 3. Hodowle prowadzono przez 15 dni w temperaturze 30 C, w kolbach stożkowych o pojemności 500 cm 3 wypełnionych 150 cm 3 podłoża, umieszczonych we wstrząsarko-inkubatorze GFL 3033 przy prędkości wstrząsania 200 obr min 1. Stężenie suchej substancji biomasy grzybni oznaczono metodą wagową. Stężenie kwasu cytrynowego oznaczano metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Stosowano chromatograf Perkin Elmer wyposażony w detektor UV-VIS CE przy długości fali 210 nm. W analizach zastosowano kolumnę Knauer Eurokat H65 utrzymywaną w temperaturze 60 C w termostacie Corabid Type KB 5506. Prędkość przepływu fazy Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

Wpływ metanolu na proces biosyntezy kwasu cytrynowego... 25 mobilnej ustalono na poziomie 0,6 cm 3 min 1 z zastosowaniem wody do HPLC jako fazy wymywającej. Do oceny przebiegu hodowli obliczono następujące parametry kinetyczne: średnią szybkość objętościową wzrostu biomasy (R X ), średnią szybkość objętościową biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego (R P ), średnią szybkość właściwą biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego (Q P ), wydajność biosyntezy biomasy w stosunku do wprowadzonego substratu (Y X/S ), wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego (Y P/S ), współczynnik efektywności biosyntezy (K ef ) [Pietkiewicz 2002]. Do wykonania obliczeń i prezentacji danych zastosowano pakiet Excel Microsoft Office 2011. Analizę statystyczną wyników wykonano z wykorzystaniem środowiska GNU R wersja 3.1.0. Za poziom istotności statystycznej przyjęto p <0,01. Do stwierdzenia czy między badanymi grupami występują istotnie statystyczne różnice wykorzystano test nieparametryczny Kruskala Wallisa. W celu sprawdzenia między którymi grupami występują różnice statystyczne wykonano analizę post hoc z wykorzystaniem testu Tukeya. WYNIKI I DYSKUSJA Podstawowe parametry kinetyczne obrazujące przebieg hodowli Aspergillus niger PD-66 w podłożu bez dodatku alkoholu metylowego przedstawiono na rysunku i w tabeli 1. Analiza przebiegu hodowli Aspergillus niger PD-66 w podłożu bez dodatku metanolu wykazała stopniowy wzrost stężenia kwasu cytrynowego, którego maksymalny poziom został osiągnięty w 14. dobie hodowli (126,0 g dm 3 ). Końcowe stężenie biomasy w podłożu wyniosło 11,5 g dm 3. Średnia całkowita wydajność kwasu cytrynowego w stosunku do wprowadzonej sacharozy wynosiła 84,0% (m/m), średnia szybkość właściwa (Q P ) i objętościowa (R P ) biosyntezy kwasu cytrynowego wyniosły odpowiednio 0,0029 g g 1 h 1 i 0,362 g dm 3 h 1, a współczynnik efektywności biosyntezy K ef = 30,4. P [g dm-3]; Y p/s [%] 140,00 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 0,400 0,350 0,300 0,250 0,200 0,150 0,100 0,050 0,000 Rp [g dm-3 h-1] Czas [h] Rys. Fig. P Yp/s Rp Przebieg zmian stężenia kwasu cytrynowego (P), wydajności (Y P/S ) oraz szybkości biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego (R P ) w czasie wgłębnej hodowli okresowej Aspergillus niger PD-66 w podłożu bez dodatku metanolu Time course of changes of citric acid concentration (P), yield (Y P/S ) and volumetric rate (R P ) of citric acid biosynthesis in submerged batch culture of Aspergillus niger PD-66 without addition of methanol nr 584, 2016

26 E. Dymarska, J.J. Pietkiewicz Tabela 1. Podstawowe parametry kinetyczne charakteryzujące biosyntezę kwasu cytrynowego we wgłębnych hodowlach okresowych przez Aspergillus niger PD-66 w podłożu bez dodatku alkoholu metylowego Table 1. Kinetic parameters of citric acid biosynthesis in submerged batch culture of Aspergillus niger PD-66 without addition of methanol Symbol Jednostka Parametr Wartości t h czas trwania hodowli 348 S 0 g dm 3 początkowe stężenie cukru w podłożu 150,0 XK g dm 3 końcowe stężenie biomasy w podłożu 11,5 RX g dm 3 h 1 średnia szybkość objętościowa wzrostu biomasy 0,036 PK g dm 3 końcowe stężenie jednowodnego kwasu cytrynowego w podłożu 126,0 RP g dm 3 h 1 średnia szybkość objętościowa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego 0,362 QP g g 1 h 1 średnia szybkość właściwa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego 0,029 YX/S % (m/m) wydajność biosyntezy biomasy 8,4 YP/S % (m/m) wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego 84,0 K ef współczynnik efektywności biosyntezy 30,4 W hodowlach prowadzonych bez dodatku metanolu grzybnia Aspergillus niger rosła głównie w postaci kuleczek o średnicy 1 2 mm oraz kłaczków o długości 1 2 mm. W pierwszym etapie badano wpływ alkoholu metylowego, na proces biosyntezy kwasu cytrynowego, dodawanego w ilości 2, 3, 4 i 5% obj. do sterylnego podłoża przed rozpoczęciem hodowli grzybów. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 2. Przeprowadzona analiza statystyczna wyników wykazała istotny wpływ dodatku alkoholu metylowego na proces biosyntezy kwasu cytrynowego w podłożach z sacharozą. Alkohol metylowy dodany do podłoża hodowlanego przed rozpoczęciem hodowli negatywnie wpływał na efektywność procesu biosyntezy kwasu cytrynowego w całym zakresie stosowanych stężeń. Najwyższe stężenie jednowodnego kwasu cytrynowego (98,0 g dm 3 ) w podłożach z dodanym alkoholem metylowym osiągnięto, stosując dawkę 2% obj., a wydajność procesu biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego w stosunku do wprowadzonej sacharozy (Y P/S ) wynosiła 65,3%. Stężenie kwasu cytrynowego w podłożu zmniejszało się wraz ze wzrostem stężenia alkoholu metylowego, osiągając 48,7 g dm 3 przy 5% dawce metanolu. Alkohol metylowy hamował wzrost grzybni. Zawartość biomasy w podłożu malała wraz ze wzrostem stężenia metanolu, osiągając przy dawce 5% wartość 7,64 g dm 3, a przy dodatku metanolu w ilości 2 4% następowała niewielka redukcja zawartości biomasy. W podłożach zawierających alkohol metylowy dodany w ilości od 2 do 4% pleśń Aspergillus niger rosła w postaci rozproszonych strzępek i drobnych kuleczek tworzących puszystą grzybnię. Przy 5% dodatku alkoholu metylowego powstawały kuliste agregaty grzybni o średnicy około 4 mm. W drugim etapie badań określano wpływ alkoholu metylowego dodawanego w ilości 2, 3, 4 i 5% obj. w 45. godzinie hodowli. Wyniki badań wpływu dawki alkoholu metylowego wprowadzonej do podłoża hodowlanego w 45. godzinie hodowli na biosyntezę kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger PD-66 przedstawiono w tabeli 3. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

Wpływ metanolu na proces biosyntezy kwasu cytrynowego... 27 Tabela 2. Parametry kinetyczne charakteryzujące biosyntezę kwasu cytrynowego we wgłębnych hodowlach okresowych Aspergillus niger PD-66 przy różnych stężeniach metanolu dodanego na początku hodowli Table 2. Kinetic parameters of citric acid biosynthesis in submerged batch cultures of Aspergillus niger PD-66 with different concentration of methanol added at the beginning of the cultivation Symbol Jednostka Parametr Dawka metanolu [%] 0 2 3 4 5 t h czas trwania hodowli 348 348 348 348 348 S 0 g dm 3 początkowe stężenie cukru w podłożu 150,0 150,0 150,0 150,0 150,0 X K g dm 3 końcowe stężenie biomasy w podłożu 12,48 11,88 11,08 11,06 7,64 R X g dm 3 h 1 średnia szybkość objętościowa wzrostu biomasy 0,036 0,034 0,032 0,034 0,022 P K g dm 3 końcowe stężenie jednowodnego kwasu cytrynowego w podłożu 126,0 98,0 72,8 69,0 48,7 R P g dm 3 h 1 średnia szybkość objętościowa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego 0,362 0,282 0,209 0,198 0,140 Q P g (g 1 h 1 ) średnia szybkość właściwa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego 0,029 0,024 0,019 0,017 0,018 Y X/S % (m/m) wydajność biosyntezy biomasy 8,4 7,9 7,4 7,8 5,1 Y P/S % (m/m) wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego 84,0 65,3 48,5 46,0 32,4 K ef współczynnik efektywności biosyntezy 30,4 18,4 10,2 9,1 4,5 Tabela 3. Parametry kinetyczne charakteryzujące biosyntezę kwasu cytrynowego we wgłębnych hodowlach okresowych Aspergillus niger PD-66 przy różnych stężeniach alkoholu metylowego dodanego w 45. godzinie hodowli Table 3. Kinetic parameters of citric acid biosynthesis in submerged batch cultures of Aspergillus niger PD-66 with different concentration of methanol added at 45 hours of the cultivation Symbol Jednostka Parametr Dawka metanolu [%] 0 2 3 4 5 t h czas trwania hodowli 348 348 348 348 348 S 0 g dm 3 początkowe stężenie cukru w podłożu 150,0 150,0 150,0 150,0 150,0 X K g dm 3 końcowe stężenie biomasy w podłożu 8,72 9,60 8,72 6,60 5,48 R X g dm 3 h 1 średnia szybkość objętościowa wzrostu biomasy 0,025 0,028 0,025 0,019 0,016 P K g dm 3 końcowe stężenie jednowodnego kwasu cytrynowego w podłożu 115,2 70,0 23,8 14,4 8,4 R P g dm 3 h 1 średnia szybkość objętościowa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego 0,331 0,201 0,068 0,041 0,024 Q P g (g 1 h 1 ) średnia szybkość właściwa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego 0,038 0,021 0,008 0,006 0,004 Y X/S % (m/m) wydajność biosyntezy biomasy 8,7 9,6 5,8 4,4 3,7 Y P/S % (m/m) wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego 76,8 46,7 15,9 9,6 5,6 K ef współczynnik efektywności biosyntezy 25,4 9,4 1,1 0,4 0,1 nr 584, 2016

28 E. Dymarska, J.J. Pietkiewicz Analiza statystyczna wyników wykazała istotny wpływ dodatku alkoholu metylowego na proces biosyntezy kwasu cytrynowego w podłożach z sacharozą, jednak alkohol metylowy dodany do podłoża w 45. godzinie hodowli wyraźnie negatywnie oddziaływał na przebieg bioprocesu. Największą wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego w stosunku do sacharozy (Y P/S ) (46,7%) osiągnięto, stosując małą dawkę alkoholu metylowego (2%). Dodatek metanolu w ilości od 3 do 5% znacząco zmniejszał efektywność procesu. Stężenie jednowodnego kwasu cytrynowego w podłożu malało wraz ze wzrostem stężenia alkoholu metylowego i wyniosło 70 g dm 3 przy 2% dodatku metanolu, natomiast przy największej 5% dawce tylko 8,4 g dm 3. Alkohol metylowy dodany w 45. godzinie hodowli w ilości 2% sprzyjał przyrostowi biomasy, natomiast dodany do podłoża w ilości od 4 do 5% wyraźnie hamował wzrost grzybni. Dodatek 5% alkoholu spowodował zmniejszenie zawartości grzybni o około 60% w stosunku do jej zawartości w próbie kontrolnej. Dodatek alkoholu metylowego wpływał na kształtowanie morfologii grzybni Aspergillus niger PD-66. Przy dawce 2% sprzyjał tworzeniu grzybni w postaci kuleczek o średnicy około 1 mm, a przy dodatku w ilościach od 3 do 5% grzybnia przybierała postać luźnej zawiesiny. Uzyskane w ramach tych badań wyniki, dotyczące wpływu stężenia i różnego momentu wprowadzenia metanolu do podłoża hodowlanego na proces biosyntezy kwasu cytrynowego, wykazały, że w podłożach syntetycznych zawierających sacharozę jako źródło węgla alkohol metylowy wywiera toksyczny wpływ na syntezę biomasy grzybni; hamuje on wzrost grzybni, a w konsekwencji powoduje obniżenie efektywności bioprocesu. Szczep Aspergillus niger PD-66 produkował kwas cytrynowy z największą szybkością w podłożach nie zawierających alkoholu metylowego. Dawka alkoholu metylowego w ilości od 2 do 4% toksycznie oddziaływała na wzrost biomasy, redukując jej ilość w nieznacznym stopniu. Podobnych wniosków dostarcza praca Roukas i Kotzekidou [1997], w której dodatek od 1 do 4% alkoholu metylowego nie ograniczał w znacznym stopniu wzrostu grzybni. Przy dawce 5% alkohol metylowy znacząco ograniczał wzrost biomasy. Również El-Holi i inni [2004], badając wpływ dodatku metanolu w podłożach zawierających sacharozę i serwatkę, zauważyli, że dawki metanolu powyżej 5% powodują znaczne ograniczenie wzrostu biomasy. Wyniki uzyskane w badaniach prezentowanych w tej pracy wykazały, że alkohol metylowy dodany do podłoży z sacharozą negatywnie oddziałuje na efektywność bioprocesu, powodując redukcję biosyntezy kwasu cytrynowego wraz ze wzrostem jego stężenia. Wyraźnie większą redukcję ilości uzyskanego kwasu cytrynowego odnotowano, gdy alkohol metylowy dodawano w 45. godzinie hodowli. Dawka 5% alkoholu metylowego dodana w 45. godzinie hodowli spowodowała 14-krotne zmniejszenie ilości kwasu cytrynowego w stosunku do próby kontrolnej. Ta sama ilość alkoholu dodana przed rozpoczęciem hodowli powodowała około dwukrotny spadek ilości kwasu cytrynowego. Do podobnych wniosków doszedł Rugsaseel i inni [1996], którzy w celu określenia roli metanolu w stymulowaniu procesu biosyntezy kwasu cytrynowego, przeprowadzili badania z udziałem mutantów szczepu Aspergillus niger, charakteryzujących się zaburzeniami syntezy białek. Autorzy wykazali, że dodatek metanolu do podłoży syntetycznych powodował ograniczenie produkcji kwasu cytrynowego oraz wzrostu grzybni wraz ze zwiększaniem stężenia metanolu w podłożu. Mutanty charakteryzowały się większą wy- Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

Wpływ metanolu na proces biosyntezy kwasu cytrynowego... 29 dajnością procesu bez obecności metanolu. Z kolei szczep rodzicielski więcej kwasu cytrynowego wytwarzał hodowany w podłożach z dodatkiem 2% metanolu. Stąd wniosek, że wydajność procesu biosyntezy kwasu cytrynowego w środowisku z metanolem zależy od cech osobniczych stosowanych drobnoustrojów. Mechanizm oddziaływania metanolu na biosyntezę kwasu cytrynowego zarówno w podłożach syntetycznych, jak i naturalnych nie został do końca wyjaśniony. Przeprowadzone doświadczenia wykazały, że alkohol metylowy w podłożach z sacharozą, szczególnie zastosowany w dużych dawkach, znacznie obniża efektywność bioprocesu. Prawdopodobnie wynika to z faktu, że alkohol metylowy zaburza procesy metaboliczne oraz wzrost biomasy, co skutkuje obniżeniem produkcji kwasu cytrynowego. Powoduje on również zaburzenia w syntezie białek komórkowych we wczesnych etapach hodowli [Rugsaseel i in. 1996, Nadeem i in. 2010]. Alkohol metylowy wpływa na przepuszczalność błon komórkowych, czego przyczyną mogą być zmiany w składzie fosfolipidów i trójgliceroli [Podgórski 2002]. Według Jernejec i innych [1990] fosfolipidy odgrywają istotną rolę w regulacji przepuszczalności błon dla kwasu cytrynowego. Alkohol metylowy może zaburzać kształtowanie się struktury grzybni poprzez efekt chelatowania jonów metali takich jak jony miedzi (II), które odgrywają istotną rolę w regulowaniu zawartości kwasów tłuszczowych glikolipidów i fosfolipidów [Benuzzi i Segovia 1996]. Przedstawione w pracy wyniki potwierdzają, że alkohol metylowy wpływa na zmniejszenie akumulowanego kwasu cytrynowego, oddziałując toksycznie na wzrost grzybni. Twierdzeniu temu przeczą badania udowadniające pozytywny wpływ metanolu na biosyntezę kwasu cytrynowego w podłożach syntetycznych. W badaniach Maddox i innych [1986] metanol w podłożach syntetycznych, zawierających galaktozę jako źródło węgla, wywoływał efekt toksyczny poprzez ograniczenie wzrostu grzybni i zmniejszenie zużycia substratu, ale równocześnie zwiększał wydajność procesu produkcji kwasu cytrynowego. Ponadto alkohol metylowy hamował aktywność dehydrogenazy 2-oksyglutarowej, co pociągało za sobą zwiększenie akumulacji kwasu cytrynowego. Również Yaykaşlı i inni [2005] dowodzą, że alkohol metylowy w procesie biosyntezy przy użyciu unieruchomionych konidiów Aspergillus niger w podłożach z sacharozą przyczynia się do zwiększenia produkcji kwasu cytrynowego. Większość dostępnych danych literaturowych donosi o pozytywnym wpływie niższych stężeń alkoholu metylowego na wydajność procesu produkcji kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger w podłożach naturalnych, charakteryzujących się małą czystością, np. w podłożach melasowych [Moyer 1953b, Roukas i Kotzekidou 1997, Podgórski 2002, Haq i in. 2003, Ashraf i in. 2004, Nadeem i in. 2010, Kareem 2010, Shetty 2015]. Stymulujący wpływ alkoholu metylowego dodanego do podłoży naturalnych wynika z ograniczenia negatywnego oddziaływania na proces biosyntezy zawartych w podłożu jonów metali, takich jak: mangan, żelazo i cynk, na które szczepy Aspergillus niger wykazują dużą wrażliwość. Alkohol metylowy natomiast zwiększa tolerancję Aspergillus niger na zawartość jonów żelaza, manganu oraz cynku występujących w podłożach [Moyer 1953a]. Alkohol metylowy powoduje zmiany w normalnej ścieżce metabolizmu węglowodanów, zwiększając zdolności glikolityczne, a w konsekwencji akumulację kwasu cytrynowego. W podłożach naturalnych stymuluje produkcję kwasu cytrynowego, wpływając na wzrost grzybni oraz zmianę składu lipidów ściany komórkowej [Shetty 2015]. nr 584, 2016

30 E. Dymarska, J.J. Pietkiewicz WNIOSKI Wyniki przeprowadzonych badań pozwalają stwierdzić, że alkohol metylowy w podłożach syntetycznych, zawierających sacharozę jako źródło węgla, okazał się czynnikiem negatywnie wpływającym na wydajność i szybkość biosyntezy kwasu cytrynowego we wgłębnych hodowlach okresowych Aspergillus niger PD-66. Obniżenie ilości produkowanego kwasu cytrynowego było wynikiem toksycznego oddziaływania alkoholu metylowego na przyrost oraz morfologię biomasy grzybni. LITERATURA Ashraf H., Rehman A., Haq I., 2004. Effect of alcohols on the production of citric acid by Aspergillus niger using solid state fermentation. J. Food Technol. 2, 1, 1 3. Barrington S., Kim J.W., 2008. Response surface optimization of medium components for citric acid production by Aspergillus niger NRRL 567 grown in peat moss. Bioresource Technol. 99, 2, 368 377. Benuzzi D.A., Segovia R.F., 1996. Effect of the copper concentration on citric acid productivity by an Aspergillus niger strain. Appl. Biochem. Biotech. 3, 61, 393 397. Dhillon G.S., Brar S.K., Kaur S., Verma M., 2013. Bioproduction and extraction optimization of citric acid from Aspergillus niger by rotating drum type solid-state bioreactor. Ind. Crop Prod. 41, 78 84. Dziezak J.D., 2003. Acids. Properties and determination. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. Institute of Food Research, Norwich, UK, Elsevier. El-Holi M.A., Al-Delaimy S., 2004. Citric acid production from whey with sugars and additives by Aspergillus niger. Afr. J. Biotechnol. 2, 10, 356 359. Fiume M., Heldreth B., 2012. Final report. On the safety assessment of citric acid, inorganic citrate salts, and alkyl citrate esters as used in cosmetics. Pobrane z: http://www.cir-safety.org/ sites/default/files/citric032012fr.pdf. Haq I.U., Ali S., Qadeer M., Iqbal J., 2003. Stimulatory effect of alcohols (methanol and ethanol) on citric acid productivity by a 2-deoxy D-glucose resistant culture of Aspergillus niger GCB-47. Bioresource Technol. 86, 3, 227 233. Jernejec K., Cimerman A., Vendramin M., Perdih A., 1990. Lipids of a citric-acid-producing Aspergillus niger strain grown in copper- and in manganese-supplemented media. Appl. Microbiol. Biot. 32, 6, 699 703. Kareem S.O., Akpan I., Alebiowu O.O., 2010. Production of citric acid by Aspergillus niger using pineapple waste. Malays J. Microbiol. 6, 2, 161 166. Leśniak W., 1974. Przydatność niektórych substancji jako stymulatorów w procesie fermentacji wgłębnej kwasu cytrynowego. Prace Naukowe Wyższej Szkoły Ekonomicznej We Wrocławiu 52, 74, 49 61. Maddox I.S., Hossain M., Brooks J.D., 1986. The effect of methanol on citric acid production from galactose by Aspergillus niger. Appl. Microbiol. Biot. 23, 3, 205 205. Moyer A.J., 1953a. Effect of alcohols on the mycological production of citric acid in surface and submerged culture. I. Nature of the alcohol effect. Appl. Microbiol. 1, 1, 1 6. Moyer A.J., 1953b. Effect of alcohols on the mycological production of citric acid in surface and submerged culture. II. Fermentation of crude carbohydrates. Appl. Microbiol. 1, 1, 7 13. Nadeem A., Syed Q., Baig S., Irfan M., Nadeem M., 2010. Enhanced production of citric acid by Aspergillus niger m-101 using lower alcohols. Turk. J. Biochem. 35, 1, 7 13. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

Wpływ metanolu na proces biosyntezy kwasu cytrynowego... 31 Papagianni M., 2007. Advances in citric acid fermentation by Aspergillus niger: Biochemical aspects, membrane transport and modeling. Biotechnol. Adv. 25, 244 263. Pazouki M., Felse P.A., Sinha J., Panda T., 2000. Comparative studies on citric acid production by Aspergillus niger and Candida lipolytica using molasses and glucose. Bioprocess Eng. 22, 4, 353 361. Pietkiewicz J.J., 2002. Biosynteza kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger w warunkach jedno- i wielostopniowych hodowli ciągłych. Prace Naukowe Akademii Ekonomicznej we Wrocławiu. Monografie i Opracowania 927/100. Podgórski W., 2002. Kształtowanie aktywności oddechowej i kwasotwórczej Aspergillus niger podczas produkcji kwasu cytrynowego w podłożach z melasą trzcinową. Prace Naukowe Akademii Ekonomicznej We Wrocławiu. Monografie i Opracowania 914/144. Roukas T., Kotzekidou P., 1997. Pretreatment of date syrup to increase citric acid production. Enzyme Microb. Tech. 21, 4, 273 276. Rugsaseel S., Kirimura K., Usami S., 1996. Citric acid accumulation by cycloheximide sensitive mutant strains of Aspergillus niger. Appl. Microbiol. Biot. 45, 1 2, 28 35. Shetty V.G., 2015. Production and optimization of citric acid by Aspergillus niger using molasses and corncob. Int. J. Pharm. Sci. 7, 5, 152 157. Yaykaşlı K.O., Demirel G., Yaţar A., 2005. Influence of alcohols on citric acid production by Aspergillus niger A-9 entrapped in polyacrylamide gels. J. Food Eng. 70, 4, 518 522. EFFECT OF METHANOL ON CITRIC ACID BIOSYNTHESIS FROM SUCROSE BY ASPERGILLUS NIGER Summary. Several factors influence the course of the Aspergillus niger culture and the rate of citric acid biosynthesis in submerged culture. Amongst them are the kind of carbon source and its concentration, type and concentration of metal ions present in the culture media and the mycelium morphology. The stimulating effect of the factors on the citric acid biosynthesis has been studied extensively. Low molecular weight alcohols, such as methanol, ethanol and n-propanol can stimulate the biosynthesis of citric acid. The aim of the study was to evaluate the effect of methyl alcohol on citric acid biosynthesis in submerged batch culture by Aspergillus niger PD-66 in synthetic medium with sucrose. Two series of tests were conducted in which the methyl alcohol was added to the culture medium in amounts of 2, 3, 4, 5% (v/v). In the first series of tests methyl alcohol was added to the sterile medium before the start of the culture, while in other after period of 45 hours of culture run. Analysis of the results showed that the methyl alcohol gives negative effect on the efficiency of biosynthesis of citric acid over the range of concentrations used. This was observed regardless of the time when alcohol was added to the fermentation medium. The efficiency reduction of the process was primarily due to the toxic effects of the methanol on the formation of mycelium. Key words: Aspergillus niger, citric acid, methanol, batch culture, biosynthesis nr 584, 2016