Spis treści 1. ZASTOSOWANIE 2. WSKAZANIA 3. STRESZCZENIE I OBJAŚNIENIA 4. ZASADA DZIAŁANIA PROCEDURY 5. ODCZYNNIKI 6 OSTRZEŻENIA DLA UŻYTKOWNIKÓW

PLATELIA ASPERGILLUS Ag 96 TESTÓW 62794 Test Platelia Aspergillus Ag jest immunoenzymatycznym mikropłytkowym testem typu kanapkowego do wykrywania antygenu galaktomannanowego grzyba Aspergillus w próbkach surowicy oraz próbkach popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL). Spis treści 1. ZASTOSOWANIE 2. WSKAZANIA 3. STRESZCZENIE I OBJAŚNIENIA 4. ZASADA DZIAŁANIA PROCEDURY 5. ODCZYNNIKI 6 OSTRZEŻENIA DLA UŻYTKOWNIKÓW 7. PRZESTROGI DLA UŻYTKOWNIKÓW 8. PRZYGOTOWYWANIE I PRZECHOWYWANIE ODCZYNNIKÓW 9. POBIERANIE PRÓBKI 10. PROCEDURA 11. KONTROLA JAKOŚCI (KRYTERIA WIARYGODNOŚCI) 12. INTERPRETACJA WYNIKÓW 13. OGRANICZENIA PROCEDURY 14. WARTOŚCI OCZEKIWANE 15. OKREŚLONA CHARAKTERYSTYKA DZIAŁANIA 16. BIBLIOGRAFIA 1

1- ZASTOSOWANIE Test Platelia Aspergillus Ag jest immunoenzymatycznym mikropłytkowym testem typu kanapkowego do wykrywania antygenu galaktomannanowego kropidlaka (Aspergillus) w próbkach surowicy pacjentów dorosłych i pediatrycznych oraz próbkach popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL). Platelia Aspergillus Ag to test, który stosowany z innymi procedurami diagnostycznymi, jak hodowla mikrobiologiczna, badanie histologiczne próbek pobranych podczas biopsji oraz wyniki badania radiograficznego może być używany jako pomoc w diagnozowaniu aspergilozy inwazyjnej. 2- WSKAZANIA Test Platelia Aspergillus Ag jest immunoenzymatycznym mikropłytkowym testem typu kanapkowego do wykrywania antygenu galaktomannanowego kropidlaka (Aspergillus) w próbkach surowicy pacjentów dorosłych i pediatrycznych oraz próbkach popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL). Platelia Aspergillus Ag to test, który stosowany z innymi procedurami diagnostycznymi, jak hodowla mikrobiologiczna, badanie histologiczne próbek pobranych podczas biopsji oraz wyniki badania radiograficznego może być używany jako pomoc w diagnozowaniu aspergilozy inwazyjnej. 3- STRESZCZENIE I OBJAŚNIENIA Zakażenia grzybem Aspergillus zwykle zaczynają się rozwijać w płucach jako punkcie wejścia wskutek wdychania zarodników grzyba Aspergillus, występujących w środowisku. Formy inwazyjne, których wzrost występowania zaobserwowano w ciągu ostatnich 10 lat, są odpowiedzialne za większość najpoważniejszych infekcji. Występują głównie u pacjentów z neutropenią (będącą skutkiem leczenia przeciwnowotworowego) oraz u pacjentów leczonych immunosupresantami (po przeszczepach, głównie szpiku kostnego) i kortykosterydami 10. Grzyba Aspergillus rzadko udaje się wyizolować wykonując posiew z krwi. Diagnoza jest często oparta na niespecyficznych metodach diagnostycznych lub wynikach badań radiologicznych (objawy kliniczne, tomografia komputerowa, badanie radiologiczne klatki piersiowej itp.) Test na wykrycie rozpuszczalnego antygenu galaktomannanowego w surowicy wydaje się metodą serologiczną 9, 12, 24, 53, 61. pomocną w diagnozowaniu aspergilozy inwazyjnej Ponadto wykazano, że w przypadku biorców narządów miąższowych wykrywanie antygenu galaktomannanowego w popłuczynach oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) jest pomocne w diagnozowaniu aspergilozy inwazyjnej u takich pacjentów 8,17,19. 4- ZASADA DZIAŁANIA PROCEDURY 44 Test Platelia Aspergillus Ag to jednostopniowy immunoenzymatyczny mikropłytkowy test typu kanapkowego, który wykrywa galaktomannan w surowicy ludzkiej i popłuczynach oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL). Test wykorzystuje szczurze przeciwciała monoklonalne EBA-2 przeciwko galaktomannanowi grzyba Aspergillus, które zostały scharakteryzowane w poprzednich badaniach 26, 45. Przeciwciała monoklonalne są stosowane (1) do pokrywania studzienek mikropłytki i do wiązania antygenu oraz (2) do wykrywania antygenu związanego z sensybilizowaną mikropłytką (odczynnik pełniący rolę koniugatu: przeciwciała monoklonalne sprzężone z peroksydazą). Próbki surowicy lub popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) są podgrzewane w obecności EDTA w celu oddzielenia kompleksów immunologicznych oraz strącenia białek, które mogą zakłócić przeprowadzanie testu 25. Podgrzane próbki i koniugat są przelewane do studzienek pokrytych przeciwciałami monoklonalnymi i poddawane inkubacji. W obecności antygenu galaktomannanowego powstaje kompleks: przeciwciało monoklonalne - galaktomannan - przeciwciało monoklonalne / peroksydaza. Paski są przemywane w celu usunięcia substancji niezwiązanych. Następnie dodaje się roztwór substratu, który reaguje z kompleksami związanymi w studzience, przybierając barwę niebieską. Reakcja enzymatyczna zostaje zatrzymana poprzez dodanie kwasu, który powoduje zmianę barwy z niebieskiej na żółtą. Absorbancja (gęstość ) próbek i surowic kontrolnych jest określana za pomocą spektrometru ustawionego na długość fali 450 i 620/630 nm. 5- ODCZYNNIKI Platelia Aspergillus Ag: nr produktu 62794 (96 testów) Przechowywać zestaw w temperaturze 2-8 C. Przed użyciem należy pozwolić wszystkim odczynnikom na osiągnięcie temperatury pokojowej (18-25 C). Natychmiast po użyciu należy z powrotem umieścić wszystkie odczynniki w temperaturze 2-8 C. Umieścić niezużyte paski/płytki w futerale i zamknąć go. Nie usuwać środka osuszającego. Po rozcieńczeniu można przechowywać roboczy roztwór do płukania przez 14 dni w temperaturze 2-30 C. Wszystkie odczynniki należy zużyć w ciągu 8 tygodni od otwarcia. Odczynniki są dostarczane w ilościach wystarczających na wykonanie 96 badań w maksymalnie 9 partiach. 2

R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R9 R10 Element Zawartość Ilość Microwell Strip Plate Concentrated Washing Solution Negative Control Serum Cut-off Control Serum Positive Control Serum Conjugate Sample Treatment Solution Chromogen:TMB Solution Stopping Solution Mikropłytka: - 96 studzienek (12 pasków po 8 studzienek każdy) pokrytych przeciwciałami przeciwko galaktomannanowi - Płytki z paskami oznaczone 85 Skoncentrowany roztwór do płukania (20x): - Bufor Tris NaCl (ph 7,4) - 2% Tween 20 - Konserwant: <1,5% ProClin TM 300 Ujemna surowica kontrolna: - Ujemna surowica ludzka - Ujemna surowica dla przeciwciał anty-hiv1, anty-hiv2, anty-hcv i HBs Ag - Konserwant: <1,5% ProClin TM 300 Surowica kontrolna dla punktu odcięcia: - Surowica ludzka zawierająca galaktomannan - Ujemna surowica dla przeciwciał anty-hiv1, anty-hiv2, anty-hcv i HBs Ag - Konserwant: <1,5% ProClin TM 300 Dodatnia surowica kontrolna: - Surowica ludzka zawierająca galaktomannan - Ujemna surowica dla przeciwciał anty-hiv1, anty-hiv2, anty-hcv i HBs Ag - Konserwant: <1,5% ProClin TM 300 Koniugat (gotowy do użytku): - Monoklonalne przeciwciała przeciwkogalaktomannanowi / znaczone peroksydazą - Konserwant: <1,5% ProClin TM 300 Roztwór do rozcieńczania próbki (gotowy do użytku): - roztwór kwaśny EDTA Chromogen: roztwór TMB (gotowy do użytku): - 3,3,5,5 - czterometylobenzydyna (<0,1%) - H 2 O 2 (<1,0 %) Roztwór zatrzymujący reakcję (gotowy do użytku): - roztwór 1 N kwasu siarkowego (H 2 SO 4 ) 1 Płytka / 12 x 8 studzienek 1 x 70 ml 2 x 1,7 ml 2 x 1,7 ml 2 x 1,7 ml 1 x 8 ml 1 x 13 ml 1 x 28 ml 1 x 28 ml Plate sealers - Samoprzylepne kawałki folii do mikropłytek 1 x 8 uszczelniaczy Uwaga: TMB (3,3,5,5 czterometylobenzydyna) jest nierakotwórczym i niemutagennym chromogenem peroksydazy. 6- OSTRZEŻENIA DLA UŻYTKOWNIKÓW 1. Wyłącznie do diagnostycznego użytku in vitro. 2. Wyłącznie do użytku profesjonalnego. 3. Nie zaleca się używania niniejszego testu z próbkami innymi niż surowica ludzka i popłuczyny oskrzelikowo-pęcherzykowe (BAL). 4. Dodatnia surowica kontrolna, surowica kontrolna dla punktu odcięcia i ujemna surowica kontrolna są produkowane z ludzkiej surowicy, która została zbadana i wykazano, że nie reaguje na HBsAg ani przeciwciała HIV-1, HIV-2 i HCV przy stosowaniu testów z oznaczeniem CE. Wszystkie odczynnik należy jednak traktować tak, jakby istniała możliwość przeniesienia przez nie infekcji. Wszystkie badania powinny być przeprowadzane zgodnie z normą OSHA Patogeny przenoszone drogą krwi, poziom biobezpieczeństwa 2, lub innymi właściwymi praktykami biobezpieczeństwa. 5. Należy nosić odzież ochronną, w tym kitel laboratoryjny, osłonę oczu/twarzy i jednorazowe rękawiczki (zaleca się syntetyczne, nielateksowe rękawiczki) oraz traktować odczynniki z zestawu oraz próbki pobrane od pacjentów zgodnie z wymaganymi dobrymi praktykami laboratoryjnymi. Po przeprowadzeniu badania starannie umyć ręce. 6. Nie wciągać materiałów do pipety ustami. 7. Nie palić tytoniu, nie pić ani nie jeść w miejscach, gdzie są używane próbki czy odczynniki z zestawu. 8. Unikać rozlewania próbek i roztworów. 9. Miejsca, w których nastąpiło rozlanie materiału biologicznego niezawierającego kwasów, należy starannie wytrzeć używając skutecznego środka odkażającego. Środki odkażające, których można użyć (poniższa lista jest niewyczerpująca) to 10% wybielacz (0,5% roztwór podchlorynu sodu), 70% etanol lub 0,5% preparat Wescodyne Plus. Materiały używane do oczyszczania miejsc, w których nastąpiło rozlanie mogą wymagać usuwania jako odpady stanowiące zagrożenie dla organizmów żywych. UWAGA: Nie umieszczać w autoklawie roztworów zawierających wybielacz. 10. Rozlaną ciecz o odczynie kwaśnym należy wchłonąć (wytrzeć) lub zneutralizować dwuwęglanem sodu, a następnie spłukać i wytrzeć to miejsce do sucha; jeśli ciecz zawierała substancję stanowiącą zagrożenie dla organizmów żywych, przetrzeć to miejsce jednym z odkażających środków chemicznych. 3

11. Wszelkie próbki i materiały używane podczas przeprowadzania testu należy usuwać, jakby zawierały czynnik zakaźny. Chemiczne odpady laboratoryjne oraz odpady stanowiące zagrożenie dla organizmów żywych należy traktować i usuwać zgodnie z wszelkimi przepisami lokalnymi, regionalnymi i krajowymi. 12. UWAGA: Poniżej zamieszczamy listę potencjalnych zagrożeń chemicznych, jakie mogą stwarzać niektóre elementy zestawu (patrz punkt 5 - ODCZYNNIKI): Xi - Drażniący UWAGA: Zgodnie z wymaganiami przepisów UE i USA, niektóre odczynniki zawierają ProClin TM 300 < 1,5%. R43 : Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą. S23-24-37-60: Nie wdychać pary/rozpylonej cieczy. Unikać zanieczyszczenia skóry. Nosić odpowiednie rękawice ochronne. Produkt i opakowanie usuwać jako odpad niebezpieczny. Zgodnie z wymaganiami przepisów prawnych w Stanach Zjednoczonych informujemy, że zatrzymujący reakcję roztwór 1 N kwasu siarkowego (H 2 SO 4 ) działa bardzo drażniąco lub żrąco na skórę, zależnie od ilości i czasu kontaktu; dłuższy czas kontaktu może powodować uszkodzenie oczu, łącznie z trwałym pogorszeniem wzroku. W razie kontaktu z oczami natychmiast spłukać dużą ilością wody i zasięgnąć porady lekarskiej. Przechowywać z dala od silnych zasad i czynników redukujących; nie wlewać wody ani wybielacza do tego składnika. Odpady tego materiału są uważane za kwaśne odpady niebezpieczne, jeśli jednak dopuszczają to przepisy lokalne, regionalne, krajowe lub międzynarodowe, mogą zostać zneutralizowane do ph 6-8 i usunięte jako odpady bezpieczne, wymaga to jednak szkolenia i wyposażenia. 13. Karta charakterystyki bezpieczeństwa materiału (MSDS) jest dostępna na żądanie. C-Produkt żrący 7- PRZESTROGI DLA UŻYTKOWNIKÓW 1. ZAMROŻONA SUROWICA LUB POPŁUCZYNY OSKRZELIKOWO-PĘCHERZYKOWE (BAL) PRZECHOWYWANE W NIEZNANYCH WARUNKACH MOGĄ DAWAĆ FAŁSZYWIE DODATNIE WYNIKI Z POWODU SKAŻENIA GRZYBAMI I/LUB BAKTERIAMI. 2. Nie używać zestawów ani odczynników z zestawu po podanej na nich dacie przydatności. 3. Nie mieszać odczynników z innych zestawów o różnych numerach partii, z wyjątkiem roztworu do płukania (R2, etykieta*: 20x koloru zielonego), chromogenu (R9, etykieta*: TMB koloru turkusowego) i roztworu zatrzymującego reakcję (R10, etykieta*:1n koloru czerwonego), pod warunkiem, że odczynniki te są identyczne i w danym badaniu używana jest ta sama seria. *na etykiecie fiolki UWAGA: Roztwór do płukania (R2, etykieta* barwy zielonej 20x) nie może być mieszany z roztworem do płukania (R2, etykieta* barwy błękitnej 10x) dostarczanym z zestawami odczynników Bio-Rad. *na etykiecie fiolki 4. Przed użyciem należy odczekać co najmniej 30 minut, aby pozwolić odczynnikom osiągnąć temperaturę pokojową. 5. Przed użyciem wymieszać starannie każdy z odczynników. 6. Przez przygotowaniem roboczego roztworu do płukania wymieszać starannie skoncentrowany roztwór do płukania (R2), dokładając starań, by uniknąć skażenia mikrobiologicznego. 7. Nie przeprowadzać testu w obecności reaktywnych oparów (kwasów, zasad i aldehydów) lub kurzu, które mogą wpłynąć na aktywność enzymatyczną koniugatu. 8. Przy pipetowaniu ręcznym surowic kontrolnych i próbek używać indywidualnych końcówek pipety, by nie skazić materiału jednej próbki drugą. 9. Aby zapewnić wystarczające oczyszczenie studzienek, należy wykonać zalecaną liczbę cykli mycia i sprawdzić, czy wszystkie studzienki zostały całkowicie opróżnione. Nie należy przeprowadzać mycia ręcznie. 10. Nie wolno dopuścić do wyschnięcia mikropłytek po zakończeniu cyklu mycia a przed wprowadzeniem odczynników. 11. Nie wolno używać tego samego naczynia do koniugatu i roztworu substratu. 12. Roztwory koniugatu i chromogenu TMB nie mogą stykać się z metalem ani jonami metali. 13. Podczas przechowywania czy inkubacji nie należy narażać roztworu chromogenu TMB na działanie silnego światła. Roztwory chromogenu nie mogą mieć kontaktu z odczynnikami utleniającymi. 14. Unikać kontaktu roztworu zatrzymującego reakcję z odczynnikami utleniającymi. Roztwór zatrzymujący reakcję nie może stykać się z metalem ani jonami metali. 15. Używać czystych, materiałów (probówek, końcówek, pojemników itp.) w celu zminimalizowania prawdopodobieństwa skażeniem zarodnikami grzyba Aspergillus znajdującymi się w środowisku. Ponieważ galaktomannan jest termostabilny, sterylizacja stosowanych materiałów nie gwarantuje braku skażenia galaktomannanem. Optymalne są materiały apirogenne, ale można używać materiałów standardowych pod warunkiem zachowania odpowiednich środków ostrożności. 16. Należy ograniczać kontakt roztworów (surowice, popłuczyny oskrzelikowo-pęcherzykowe (BAL), roztwór do rozcieńczania próbki, koniugat) i otwartych pojemników (płytki, probówki, pipety) z powietrzem. 17. Nie wlewać niezużytego koniugatu z powrotem do oryginalnego pojemnika. 18. Roztwór chromogenu TMB musi być bezbarwny. Barwa błękitna po rozcieńczeniu oznacza, że odczynnik jest skażony i nie należy go używać. Należy go wylać i przygotować świeży odczynnik. 4

8- PRZYGOTOWYWANIE I PRZECHOWYWANIE ODCZYNNIKÓW Płytka z paskami mikrostudzienek (R1) Każda ramka zawierająca 12 pasków jest zapakowana w futerał ochronny. Przeciąć opakowanie za pomocą nożyczek tuż poniżej łączenia. Otworzyć opakowanie ochronne i wyjąć ramkę. Umieścić ramkę zawierającą niezużyte paski z powrotem w oryginalnym opakowaniu ochronnym. Dokładnie, ponownie zamknąć i przechowywać w temperaturze +2-8 C. Po otwarciu opakowania próżniowego paski przechowywane w temperaturze +2-8 C w starannie zamkniętym, oryginalnym opakowaniu, zachowują stabilność przez 8 tygodni. Sprawdzić obecność środka osuszającego. Roboczy roztwór do płukania (R2) Przygotować roboczy roztwór do płukania zgodnie z potrzebami, dodając jedną część skoncentrowanego roztworu do płukania (R2) do 19 części dejonizowanej lub destylowanej wody. Roboczy roztwór do płukania można przechowywać przez 14 dni w temperaturze 2-30 C. Należy przygotowywać wystarczającą ilość roboczego roztworu do płukania, by wykonać partię (80 ml na jeden pasek: 4 ml R2 + 76 ml wody destylowanej). Po otwarciu skoncentrowany roztwór do płukania przechowywany w temperaturze +2-30 o C, przy braku zanieczyszczeń pozostanie stabilny do upływu daty przydatności oznaczonej na etykiecie. Ujemna surowica kontrolna (R3), surowica kontrolna dla punktu odcięcia (R4) i dodatnia surowica kontrolna (R5) Surowice kontrolne muszą być podgrzewane z roztworem kwaśnym EDTA (R7) tak, jak próbki pobrane od pacjentów, by służyły także za monitor podgrzewania. Po otwarciu odczynniki te, przechowywane w temperaturze +2-8 C, pozostają stabilne przez 8 tygodni, przy braku zanieczyszczeń. Koniugat (R6), roztwór do rozcieńczania próbki (R7), roztwór: chromogenu TMB (R9) Odczynniki te są gotowe do użytku. Po otwarciu odczynniki te, przechowywane w temperaturze +2-8 C, pozostają stabilne przez 8 tygodni, przy braku zanieczyszczeń. Roztwór zatrzymujący reakcję (R10) Ten odczynnik jest gotowy do użytku. Po otwarciu odczynnik ten, przechowywany w temperaturze +2-8 C pozostaje stabilny do upływu daty przydatności oznaczonej na etykiecie, przy braku zanieczyszczeń. 9- POBIERANIE PRÓBKI Test ten wykonuje się z surowicy lub popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL). I. SUROWICA Próbki krwi należy pobrać zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi. Próbki surowicy nie mogą być skażone zarodnikami grzybów ani bakteriami. Przewozić i przechowywać próbki w szczelnych probówkach, bez kontaktu z powietrzem. Zamknięte próbki można przechowywać w temperaturze 2-8 C przez maksymalnie 5 dni przed przystąpieniem do testu. Po pierwszym otwarciu próbki można ją przechowywać w temperaturze 2-8 C przez 48 godzin przed przystąpieniem do testu. W razie potrzeby dłuższego przechowywania można przechowywać surowicę w temperaturze -70 C. Próbki surowicy można poddawać maksymalnie 4 cyklom zamrażania/rozmrażania. Wcześniej zamrożone próbki powinny być po rozmrożeniu dokładnie zmieszane przed przystąpieniem do testu. Na wyniki nie mają wpływu próbki zawierające 20 mg/l bilirubiny, próbki lipemiczne zawierające odpowiednik 2 g/l oleiny (trójglicerydu) lub próbki zhemolizowane zawierające 165 mg/l hemoglobiny. Nie badano interferencji związanych z nadmiarem albuminy. Nie usuwać składników dopełniacza z surowicy. II. POPŁUCZYNY OSKRZELIKOWO-PĘCHERZYKOWE (BAL) Próbki popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) należy pobrać zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi. Próbki popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) muszą być pobierane w sterylnej solance i mogą być badane jako próbki surowe (w takiej postaci, w jakiej zostały pobrane) lub jako supernatant otrzymany z odwirowanej próbki (po wirowaniu z prędkością 10 000 obr./min przez 10 minut) przed poddaniu próbki procedurze zgodnie z punktem 10. Próbki popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) nie mogą być skażone zarodnikami grzybów ani bakteriami. Przewozić i przechowywać próbki w szczelnych probówkach, bez kontaktu z powietrzem. Po pierwszym otwarciu próbki można przechowywać w temperaturze 2-8 o C maksymalnie przez 24 godziny. W przypadku potrzeby dłuższego przechowywania można przechowywać próbki popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) zamrożone w temperaturze -20 C lub niższej maksymalnie przez 5 miesięcy. Próbki popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) można poddawać maksymalnie 4 cyklom zamrażania/rozmrażania. Wcześniej zamrożone próbki powinny być po rozmrożeniu dokładnie zmieszane przed przystąpieniem do testu. 10- PROCEDURA Dostarczane materiały Patrz punkt ODCZYNNIKI. 5

Wymagane materiały, które nie znajdują się w zestawie 1. Woda destylowana lub dejonizowana do rozcieńczania skoncentrowanego roztworu do płukania. 2. Papier chłonny. 3. Rękawiczki jednorazowego użytku. 4. Okulary ochronne. 5. Podchloryn sodu (wybielacz) i wodorowęglan sodu. 6. Pipety lub multipipety, regulowane lub stałe, do odmierzania i nalewania objętości 50 µl, 100 µl, 300 µl i 1000 µl. 7. 1,5 ml polipropylenowe probówki do wirówki z hermetycznymi korkami, wytrzymujące temperaturę do 120 C (blok grzejny) lub 100 C (kąpiel we wrzącej wodzie). - Zakrętki i probówki: probówki stożkowe 1,5 ml, Bio-Rad nr kat. 224-0100 lub odpowiednik. LUB - Probówki z wieczkiem: probówki do badań mikrobiologicznych EZ, 1,5 ml, Bio-Rad nr kat. 223-9480 lub odpowiednik. - Zamknięcia do mikroprobówek (w Stanach Zjednoczonych: Fischer Scientific nr kat. NC9346739) lub odpowiednik, poza Stanami Zjednoczonymi: VWR nr katalogowy 6054001 lub odpowiednik). Zamknięcia te szczelnie zamykają probówki z wieczkiem uniemożliwiając otwarcie wieczek podczas zmian temperatury i ciśnienia i umożliwiają łatwe wyjmowanie probówek z bloku grzejnego lub łaźni we wrzącej wodzie. 8. Stołowa wirówka laboratoryjna do polipropylenowych probówek o pojemności 1,5 ml zdolna osiągać przyspieszenie 10 000 g (Brinkman nr kat. 22-36-280-1 lub VWR Scientific nr kat. 20901-051 lub odpowiednik). 9. Jeśli do podgrzewania surowicy / popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) używany jest blok grzejny: - Blok grzejny. Zalecane są następujące modele bloków grzejnych: - Pojedynczy blok grzejny: Grant nr kat. QBD-1L - poza Stanami Zjednoczonymi: Grant nr kat. QBD1 rozprowadzany przez VWR pod numerem kat. 460-0074) - Podwójny blok grzejny: Grant nr kat. QBD-2L - poza Stanami Zjednoczonymi: Grant nr kat. QBD2 rozprowadzany przez VWR pod numerem kat. 460-0076) - Blok dla bloków grzejnych: oba bloki grzejne (QBD-1L, QBD1 i QBD-2L, QBD2) muszą być używane z blokiem Grant nr kat. QB-E1 rozprowadzanym poza Stanami Zjednoczonymi przez VWR pod numerem kat. 460-8517 Jeśli do podgrzewania surowicy / popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) używana jest łaźnia wodna: - Okrągły, pływający stelaż do mikrowirówek na zlewki o pojemności 1 l (w Stanach Zjednoczonych: VWR Scientific nr kat. 60986-100 lub Nalgene nr kat. 5974-1015 lub odpowiednik). - Kąpiel we wrzącej wodzie, 100 C. 10. Vortex. 11. Inkubator do mikropłytek, temp. 37 ± 1 C. 12. Półautomatyczna lub automatyczna płuczka do mikropłytek. 13. Czytnik mikropłytek wyposażony w filtry 450 nm i 620/630 nm. Uwagi proceduralne W przypadku każdej serii należy przetestować surowice kontrolne: ujemną, dodatnią i punktu odcięcia w celu weryfikacji wyników. Postępowanie w przypadku surowicy/popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) Wszystkie surowice kontrolne: ujemna (R3), punktu odcięcia (R4) i dodatnia (R5) muszą być przetworzone w tym samym czasie, co próbki surowicy/popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL): 1. Nalać pipetą 300 µl każdej badanej surowicy/popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) i surowicy kontrolnej do osobnych probówek polipropylenowych o pojemności 1,5 ml. 2. Dodać do każdej probówki 100 µl roztworu do rozcieńczania próbki (R7). 3. Wymieszać starannie zawartość probówek energicznie mieszając lub użyć wirówki, dokładnie wymieszać zawartość. Zamknąć szczelnie probówkę, by uniemożliwić jej otwarcie podczas podgrzewania. 4. Opcja z blokiem grzejnym: Podgrzewać probówki przez 6 minut w bloku grzejnym w temperaturze 120 C. Probówki można umieszczać w bloku dopiero po osiągnięciu wymaganej temperatury(*). LUB Opcja z łąźnią wodną W razie używania łaźni wodnej: podgrzewać probówki przez 3 minuty w temperaturze 100 C (*). Probówki można umieszczać w łaźni wodnej dopiero po osiągnięciu wymaganej temperatury. 5. Ostrożnie wyjąć gorące probówki z bloku grzejnego lub łaźni wodnej i umieścić je w wirówce. Wirować probówki z przyspieszeniem 10 000 x g przez 10 minut. Supernatant jest używany do wykrywania antygenu galaktomannanowego. 6. Poddać supernatant testowi korzystając z poniższej procedury. Po przygotowaniu supernatant może zostać wyjęty i przechowywany w temperaturze 2-8 C do 48 godzin przed przystąpieniem do testu. Jeśli wyniki analizy wskazują, że koniecznie jest powtórzenie testów, należy przygotować do testu inną składową próbki. (*) Zasadnicze znaczenie dla uwieńczonego sukcesem przeprowadzenie testu ma ścisłe stosowanie wymaganej temperatury i czasu przetwarzania, jak również stosowanie zalecanych materiałów. Nie wolno polegać na odczycie temperatury podawanym przez urządzenie, należy sprawdzić, czy temperatura jest zgodna ze specyfikacją za pomocą skalibrowanego termometru umieszczonego w probówce zawierającej olej mineralny: konieczne jest osiągnięcie temperatury 120 C w probówce w bloku grzejnym i 100 C w łaźni z wrzącą wodą. 6

Procedura testu immunoenzymatycznego Należy bezwzględnie przestrzegać sugerowanej procedury. Konieczne jest przestrzeganie dobrych praktyk laboratoryjnych. 1. Przed użyciem należy odczekać co najmniej 30 minut, aby pozwolić odczynnikom osiągnąć temperaturę pokojową (+18-25 C). 2. Przygotować roboczy roztwór do płukania. 3. Przygotować tabelę opisującą badane próbki surowicy/ popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) i surowic na mikropłytce. Użyć jednej studzienki na ujemną surowicę kontrolną (R3), dwóch studzienek na surowicę kontrolną dla punktu odcięcia (R4) i jednej studzienki na dodatnią surowicę kontrolną (R5). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R5 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R3 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 4. Wyjąć uchwyt do płytek i paski z mikrostudzienkami (R1) z opakowania na płytki. Płytki, które nie będą używane, włożyć do opakowania wraz ze środkiem osuszającym i zamknąć ponownie futerał. 5. Wymieszać zawartość butelki z koniugatem (R6) odwracając butelkę przed użyciem. Dodać 50 µl koniugatu (R6) do każdej studzienki. Następnie dodać 50 µl przetworzonej surowicy / supernatantu z popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) do każdej studzienki, zgodnie z powyższym schematem. Nie dodawać próbek surowicy / popłuczyn oskrzelikowopęcherzykowych (BAL) do studzienek przed wlaniem koniugatu. 6. Nakryć płytkę samoprzylepnym uszczelniaczem do płytek, lub w inny sposób, by zapobiec parowaniu, upewniając się, że cała powierzchnia jest zakryta i wodoszczelna. 7. Inkubować mikropłytkę w suchym inkubatorze do mikropłytek przez 90 ± 5 minut w temperaturze 37 C (± 1 C). 8. Zdjąć uszczelniacz do płytek. Wessać zawartość wszystkich studzienek do pojemnika na odpady (zawierającego podchloryn sodu). Umyć płytkę 5 razy w płuczce do mikropłytek (używając 800 µl roboczego roztworu do płukania). Po ostatnim myciu obrócić mikropłytkę i delikatnie postukać w papier chłonny, by usunąć pozostałości cieczy. 9. Szybko dolać 200 µl roztworu chromogenu TMB (R9) do każdej studzienki, unikając narażania zestawu na kontakt z jasnym światłem. 10. Inkubować mikropłytkę w ciemności w temperaturze pokojowej (+18-25 C) przez 30 ± 5 minut. Podczas tego etapu inkubacji nie używać folii samoprzylepnej. 11. Dodać 100 µl roztworu zatrzymującego reakcję (R10) do każdej studzienki, stosując tę samą kolejność dodawania roztworu chromogenu TMB. Dobrze wymieszać. 12. Dokładnie wytrzeć spód każdej płytki. 13. Odczytać gęstość optyczną dla każdej studzienki przy 450 nm (filtr odniesienia: 620/630 nm). Odczyt mikropłytek musi zostać przeprowadzony w ciągu 30 minut od dodania roztworu zatrzymującego reakcję. 11- KONTROLA JAKOŚCI (KRYTERIA WIARYGODNOŚCI) Surowica kontrolna dla punktu odcięcia: każdej surowicy kontrolnej dla punktu odcięcia musi mieć wartość 0,300 i 0,800. Dodatnia surowica kontrolna: dla dodatniej surowicy kontrolnej musi być większy niż 1,50. I = dodatniej surowicy kontrolnej (R5) Wartość średniej gęstości optycznej surowicy kontrolnej dla punktu odcięcia > 1,50 Ujemna surowica kontrolna: dla ujemnej surowicy kontrolnej musi być mniejszy niż 0,40. ujemnej surowicy kontrolnej (R3) I = Wartość średniej gęstości optycznej surowicy kontrolnej dla punktu odcięcia < 0,40 Niespełnienie opisanych powyżej kryteriów wiarygodności przez którąkolwiek surowicę kontrolną skutkuje nieważnością testu i nie należy przekazywać wyników dotyczących danej próbki od pacjenta. Operator może podjąć decyzję o powtórzeniu testu po dokonaniu oceny procedury lub skontaktować się z producentem w celu uzyskania pomocy. W razie podjęcia decyzji o powtórzeniu testu należy w powtórnym teście użyć innej składowej tej samej próbki. 7

Przykładowe obliczenia: Absorbancja próbki (gęstość ) ujemnej surowicy kontrolnej (R3) 0,116 surowicy kontrolnej dla punktu odcięcia (R4) 0,513 0,533 dodatniej surowicy kontrolnej (R5) 1,834 Obliczenia Wartość średniej gęstości optycznej surowicy kontrolnej dla punktu odcięcia Aby obliczyć średnią wartość gęstości optycznej surowicy kontrolnej punktu odcięcia (R4), dodać do siebie wartości gęstości optycznej testu powtórzonego surowicy kontrolnej dla punktu odcięcia i podzielić wynik przez 2: (0,513 + 0,533) 2 = 0,523 ujemnej surowicy kontrolnej Aby obliczyć wskaźnik dla ujemnej surowicy kontrolnej, podzielić gęstość optyczną ujemnej surowicy kontrolnej przez średnią gęstość optyczną surowicy kontrolnej dla punktu odcięcia: 0,116 I = = 0,22 0,523 dodatniej surowicy kontrolnej Aby obliczyć wskaźnik dla dodatniej surowicy kontrolnej, podzielić gęstość optyczną dodatniej surowicy kontrolnej przez średnią gęstość optyczną surowicy kontrolnej dla punktu odcięcia: 1,834 I = = 3,51 0,523 Wiarygodność W powyższym przykładzie: Każda wartość gęstości optycznej surowicy kontrolnej dla punktu odcięcia jest 0,300 i 0,800, co oznacza, że wynik dla surowicy kontrolnej dla punktu odcięcia jest prawidłowy. dla ujemnej surowicy kontrolnej jest < 0,40 co oznacza, że wynik dla ujemnej surowicy kontrolnej jest wiarygodny. dla dodatniej surowicy kontrolnej jest < 1,50 co oznacza, że wynik dla dodatniej surowicy kontrolnej jest wiarygodny. Serię badań opisaną w przykładzie można uznać za wiarygodną, gdyż wyniki spełniają kryteria wiarygodności dla każdej surowicy kontrolnej. 12- INTERPRETACJA WYNIKÓW Obecność lub nieobecność antygenu galaktomannanowego w badanej próbce określa się obliczając wskaźnik dla każdej próbki pacjenta. (I) to wartość gęstości optycznej próbki podzielona przez średnią gęstość optyczną studzienek zawierających surowicę kontrolną dla punktu odcięcia. Obliczanie średniej wartości gęstości optycznej dla surowicy kontrolnej dla punktu odcięcia: Dodać wartości gęstości optycznej dwóch studzienek zawierających surowicę kontrolną dla punktu odcięcia (R4) i podzielić sumę przez 2. Obliczanie wskaźnika (I) dla każdej badanej próbki: Obliczyć następujący współczynnik dla każdej badanej próbki: I = próbki Wartość średniej gęstości optycznej surowicy kontrolnej dla punktu odcięcia Interpretacja dla surowicy / popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) o wskaźniku < 0,50: Surowicę / popłuczyny oskrzelikowo-pęcherzykowe o wskaźniku < 0,50 uznaje się za ujemne pod względem występowania antygenu galaktomannanowego. Uwaga: Wynik ujemny może wskazywać, że wynik pacjenta kształtuje się poniżej poziomu wykrywalności testu. Wyniki ujemne nie wykluczają zdiagnozowania aspergilozy inwazyjnej. Jeśli wynik jest ujemny, a podejrzewa się występowanie choroby, zaleca się powtórzenie testu. 8

Interpretacja dla surowicy / popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) o wskaźniku 0,50 Surowicę / popłuczyny oskrzelikowo-pęcherzykowe (BAL) o wskaźniku 0,50 uznaje się za dodatnie pod względem występowania antygenu galaktomannanowego. W przypadku wszystkich pacjentów o wyniku dodatnim zaleca się powtórzenie badania z nowej składowej tej samej próbki (surowica/bal). Uwaga: Wartość absorbancji niższa niż 0,000 może wskazywać na błąd procedury lub urządzenia, który należy podać ocenie. Wynik jest nieważny i próbka musi zostać zbadana ponownie. Zaleca się regularne badania przesiewowe (dwa razy w tygodniu) próbek surowicy pacjentów o wysokim ryzyku, w celu zwiększenia czułości i wczesnego wykrycia w razie wyniku dodatniego. Uwaga: Test Platelia Aspergillus Ag ma służyć jako pomoc w diagnozowaniu aspergilozy inwazyjnej. Wyniki dodatnie uzyskane za pomocą testu Platelia Aspergillus Ag należy rozpatrywać w połączeniu z innymi procedurami diagnostycznymi, jak hodowla mikrobiologiczna, badanie histologiczne próbek pobranych podczas biopsji oraz wyniki badania radiograficznego. Przykładowe obliczenia: Absorbancja próbki (gęstość ) ujemnej surowicy kontrolnej (R3) 0.116 surowicy kontrolnej dla punktu odcięcia (R4) 0.513 0.533 dodatniej surowicy kontrolnej (R5) 1.834 Próbka pobrana od pacjenta nr 1 0.134 Próbka pobrana od pacjenta nr 2 0.436 Próbka pobrana od pacjenta nr 3 1.196 Obliczenia Przykładowe obliczenia dotyczące określania wiarygodności badań kontrolnych można znaleźć w punkcie dotyczącym kontroli jakości (kryteria wiarygodności). Wartość średniej gęstości optycznej surowicy kontrolnej dla punktu odcięcia Aby obliczyć średnią wartość gęstości optycznej surowicy kontrolnej punktu odcięcia (R4), dodać do siebie wartości gęstości optycznej testu powtórzonego surowicy kontrolnej dla punktu odcięcia i podzielić wynik przez 2: (0,513 + 0,533) 2 = 0,523 Próbka pobrana od pacjenta nr 1 Aby obliczyć wskaźnik dla próbki pobranej od pacjenta nr 1, podzielić gęstość optyczną próbki pobranej od pacjenta nr 1 przez średnią gęstość optyczną surowicy kontrolnej dla punktu odcięcia: 0,134 I = = 0,26 0,523 W tym przykładzie próbka pobrana od pacjenta nr 1 daje wynik ujemny, gdyż wskaźnik 0,26 jest < 0,50. Próbka pobrana od pacjenta nr 2 Aby obliczyć wskaźnik dla próbki pobranej od pacjenta nr 2, podzielić gęstość optyczną próbki pobranej od pacjenta nr 2 przez średnią gęstość optyczną surowicy kontrolnej dla punktu odcięcia: 0,436 I = = 0,83 0,523 W tym przykładzie próbka pobrana od pacjenta nr 2 daje wynik dodatni, gdyż wskaźnik 0,83 0,50. Próbka pobrana od pacjenta nr 3 Aby obliczyć wskaźnik dla próbki pobranej od pacjenta nr 3, podzielić gęstość optyczną próbki pobranej od pacjenta nr 3 przez średnią gęstość optyczną surowicy kontrolnej dla punktu odcięcia: 1,196 I = = 2,29 0,523 W tym przykładzie próbka pobrana od pacjenta nr 3 daje wynik dodatni, gdyż wskaźnik 2,29 0,50. Opis interpretacji wyników dodatnich znajduje się w punkcie 12. 13- OGRANICZENIA PROCEDURY 1. Ujemny wynik testu z próbki surowicy i/lub popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) nie wyklucza zdiagnozowania aspergilozy inwazyjnej. Próbki pobrane od pacjentów zagrożonych aspergilozą inwazyjną powinny być badane dwa razy w tygodniu. 2. Podczas badania próbek na obecność antygenu galaktomannanowego z użyciem testu Platelia Aspergillus Ag należy przestrzegać procedury i zasad interpretacji wyników. Zaleca się, by użytkownik zestawu przed przeprowadzeniem testu dokładnie zapoznał się z ulotką dostarczaną z opakowaniem. W szczególności należy starannie przestrzegać procedury w przypadku pipetowania próbek i odczynników, mycia płytek i czasu inkubacji. 9

3. Dodanie próbki lub odczynnika w sposób niezgodny z procedurą może skutkować fałszywie ujemnym wynikiem testu. W razie klinicznego podejrzenia aspergilozy inwazyjnej lub błędu proceduralnego należy powtórzyć badanie dodatkowych próbek. 4. Możliwe jest skażenie ujemnej próbki pobranej od pacjenta materiałem z dodatniej surowicy kontrolnej / próbki pobranej od pacjenta, jeśli zawartość jednej studzienki przeleje się do innej z powodu nieostrożnego obchodzenia się z mikropłytką lub stosowania niewłaściwej techniki pipetowania przy dodawaniu odczynników. 5. Nie oceniano skuteczności testu Platelia Aspergillus Ag w przypadku próbek pobranych od noworodków. Europejskie źródła informują o występowaniu większej liczby fałszywie dodatnich wyników w przypadku próbek pobranych od populacji noworodków 13, 15, 33, 44. 6. Test Platelia Aspergillus Ag może wykazywać obniżone wykrywanie galaktomannanu u pacjentów z przewlekłą chorobą ziarniniakową i zespołem Joba 56, 57. 7. Współistniejące stosowanie działającego aktywnie na pleśni leczenia przeciwgrzybiczego u pacjentów z aspergilozą inwazyjną może powodować zmniejszoną czułość testu Platelia Aspergillus Ag 30. 8. Nie przeprowadzono oceny testu Platelia Aspergillus Ag w przypadku stosowania próbek osocza lub innych rodzajów próbek, jak mocz czy płyn mózgowo-rdzeniowy. 9. Nie określono wydajności testu Platelia Aspergillus Ag dla odczytu ręcznego i/lub określania wyniku metodą wizualną. 10. Inne rodzaje grzybów, jak Penicillium, Alternaria Paecilomyces, Geotrichum i Histoplasma wykazują reaktywność z monoklonalnymi przeciwciałami szczurzymi EBA-2 stosowanymi w badaniu służącym do wykrywania galaktomannanu grzyba Aspergillus. Należy uwzględnić histoplazmozę na obszarach endemicznych, w tym niektórych regionach Stanów Zjednoczonych 35, 49, 58. 11. Reaktywność krzyżowa próbek popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) z Mycoplasma pneumoniae czy środkami znieczulającymi/smarującymi używanymi do znieczulania przełyku/gardła przy pobieraniu próbki nie była oceniana. 12. Wyniki dodatnie przy braku objawów klinicznych: Należy je rozpatrywać w odniesieniu do wczesnego wykrycia antygenu galaktomannanowego w surowicy czy popłuczynach oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) przed pojawieniem się objawów klinicznych czy radiologicznych. Dodatnie wyniki testów przy braku objawów klinicznych występują i wykazano, że zwykle oznaczają one wyniki prawdziwie dodatnie. W niektórych przypadkach jednak przy interpretacji wyniku testu należy wziąć pod uwagę szczególne czynniki: a. Istnieją doniesienia o dodatnich wynikach testu mimo braku objawów klinicznych, szczególnie u małych dzieci 43. Choć w niektórych przypadkach można uzasadnić wynik rzeczywistym występowaniem antygenówaspergillus, większość tych przypadków można uznać za wyniki fałszywie dodatnie 7. b. Udowodniono występowanie galaktofuranozy w różnych produktach żywnościowych, w szczególności zbożach, produktach zbożowych i deserach o konsystencji kremu 1, 27. W przeciwieństwie do ludzkiego mleka, w mleku humanizowanym mogą często występować wysokie stężenie galaktomannanu 13. Przy interpretacji wyników w przypadku antygenemii u małych dzieci, oraz ogólnie u pacjentów ze zmienioną barierą jelitową należy więc wziąć pod uwagę czynniki związane z dietą 6, 13. Każdy przypadek dodatniej antygenemii, której nie towarzyszą objawy kliniczne, powinien być w przypadku tej populacji interpretowany szczególnie ostrożnie. c. Istnieją doniesienia o dodatnich wynikach testu na obecność galaktomannananu u pacjentów otrzymujących piperacylinę/tazobaktam. Istnieją także doniesienia, że w przypadku niektórych partii leku piperacyliny/tazobaktamu uzyskano dodatni wynik testu na obecność antygenu galaktomannanowego. Zatem dodatnie wyniki testów u pacjentów przyjmujących piperacylinę/tazobaktam powinny być interpretowane ostrożnie i potwierdzone za pomocą innych metod diagnostycznych. Informowano także o wykryciu galaktomannanu w niektórych partiach preparatu amoksycyliny z kwasem klawulanowym do podawania pozajelitowego. Należy zatem wziąć pod uwagę leczenie półsyntetycznymi antybiotykami ß-laktamowymi przy interpretacji testu 1, 3, 31. Ponieważ jednak test Platelia Aspergillus Ag może wykrywać antygen galaktomannanowy na długo przed wystąpieniem objawów klinicznych czy radiologicznych, nie można wykluczyć występowania aspergilozy inwazyjnej. Należy więc uważnie obserwować pacjentów leczonych piperacyliną/tazobaktamem, u których odnotowano wynik dodatni. d. Dodatnie wyniki przy braku objawów klinicznych mogą występować w przypadku pacjentów przyjmujących produkty zawierające galaktomannan, pozajelitowo lub doustnie (w razie zmian bariery jelitowej). Obecność galaktomannanu w tych produktach można często wyjaśnić stosowaniem procesu fermentacji opartej na mikroorganizmach należących do królestwa grzybów. Wynik dodatni może jednak nie wystąpić w przypadku danego pacjenta, jeśli stężenie egzogennego galaktomannanu w surowicy nie osiągnie czy nie przekroczy progu wykrywalności testu. A zatem, jeśli odnotowano podejrzany wynik dodatni w razie niewystępowania innych objawów klinicznych, zaleca się zbadanie produktów przyjmowanych przez pacjenta, a w szczególności ich procesów produkcyjnych i pochodzenia stosowanych surowców 14, 40, 48. 13. Istnieją doniesienia o uzyskaniu w kilku badaniach dodatnich wyników na obecność galaktomannanu w surowicy i popłuczynach oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) w powiązaniu z preparatem PLASMA-LYTE 14, 40. Należy zatem uwzględnić to przy interpretacji wyników testu u pacjentów otrzymujących preparat PLASMA-LYTE. 14. Wyniki testu Platelia Aspergillus Ag w próbkach popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) u pacjentów bez niedoboru odporności należy zatem interpretować ostrożnie. 36 15. Wyniki zbliżone do wartości współczynnika odcięcia (0,5) powinny być interpretowane ostrożnie i być poparte innymi dowodami klinicznymi, radiologicznymi lub laboratoryjnymi, gdyż w interpretacji wyniku badania wykrywającego aspergilozę inwazyjną nie jest dopuszczalna tzw. szara strefa. 16. Ponadto wyniki testu immunoenzymatycznego Platelia Aspergillus w próbkach popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) w zakresie wartości 0,5-1,0 mają niższą dodatnią wartość predykcyjną niż wyniki testów dla próbek BAL o wartości > 1,0, dlatego też wyniki z zakresu wartości 0,5-1,0 powinny być weryfikowane i poparte innymi dowodami klinicznymi, radiologicznymi czy laboratoryjnymi występowania aspergilozy inwazyjnej. 10

14- WARTOŚCI OCZEKIWANE I. SUROWICA Oczekiwana częstość występowania aspergilozy inwazyjnej różni się w populacji pacjentów; istnieją doniesienia o wartościach 10, 16 5-20% W badaniach klinicznych prowadzonych na pacjentach pediatrycznych (wiek 21 lat) w Stanach Zjednoczonych oraz na pacjentach dorosłych w Ameryce Północnej uzyskano podane poniżej wyniki. A- Pacjenci pediatryczni Przeprowadzono badanie kliniczne na łącznej liczbie 1954 próbek surowicy pobranych od 129 pacjentów pediatrycznych (wiek 21 lat) z niedoborami odporności obciążonych wysokim ryzykiem aspergilozy inwazyjnej (AI) oraz pacjentów, u których zdiagnozowano stwierdzoną lub prawdopodobną aspergilozę inwazyjną w trzech ośrodkach badawczych w Stanach Zjednoczonych w celu określenia charakterystyki działania testu Platelia Aspergillus Ag. Rozkład wartości wskaźnika w tych populacjach przedstawiono na poniższych wykresach: Pacjenci pediatryczni, u których zdiagnozowano brak aspergilozy inwazyjnej (populacja kontrolna) Zbadano łącznie 1625* próbek surowicy pobranych od 108 pacjentów pediatrycznych z niedoborami odporności w trzech ośrodkach badawczych w Stanach Zjednoczonych w celu określenia charakterystyki działania testu Platelia Aspergillus Ag. Rozkład wartości wskaźnika dla próbek przedstawiono na poniższym wykresie: Rysunek 1 Liczba Number próbek of surowicy Sera 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 584 0-0.1 0.1-0.2 805 145 0.2-0.3 0.3-0.4 0.4-0.5 Rozkład wartości wskaźnika dla surowicy z Distribution of the Serum Index Value from the pediatrycznej Pediatric populacji Control kontrolnej Population (N=1625) (N=1625) 50 16 6 2 2 0.5-0.6 0.6-0.7 0.7-0.8 2 Index 1 2 0.8-0.9 0.9-1.0 1.0-1.1 0 1 1 1.1-1.2 1.2-1.3 1.3-1.4 0 1.4-1.5 >1.5 8 *Uwaga: z badania wyłączono 80 próbek, od 4 pacjentów z grupy kontrolnej z dodatnim wynikiem badania na obecność antygenu galaktomannanowego w związku z leczeniem piperacyliną/tazobaktamem (Zosyn ). Pacjenci pediatryczni, u których zdiagnozowano aspergilozę inwazyjną Wykres punktowy przedstawia wyniki badania na obecność galaktomannanu w 249 próbkach surowicy pobranych od 17 pacjentów biorących udział w badaniu, u których zdiagnozowano stwierdzoną lub prawdopodobną aspergilozę zgodnie z definicjami EORTC/NIAID. Nie oczekiwano, że każda próbka surowicy od każdego pacjenta da wynik dodatni. Oczekiwana częstość występowania aspergilozy inwazyjnej różni się w populacji pacjentów; istnieją doniesienia o wartościach 5-20% 10, 24. występowania dla tego badania wyniósł 13,6%. Rysunek 2 Index > 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 Stwierdzona Pediatric Proven/ aspergiloza Probable w populacji Aspergillosis: pediatrycznej Distribution Rozkład of wskaźnika Index/ u pacjentów Pediatric pediatrycznych Patient (N=17) (N=17) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Liczba Patient pacjentów Number 11

B. Dorośli pacjenci Przeprowadzono badanie kliniczne na łącznej liczbie 1724 próbkach surowicy pobranych od 172 pacjentów po przeszczepie szpiku kostnego i pacjentów z białaczką, u których zdiagnozowano aspergilozę inwazyjną lub nie, w trzech ośrodkach badawczych w Ameryce Północnej w celu określenia charakterystyki działania testu Platelia Aspergillus Ag. Rozkład wartości wskaźnika w tych populacjach przedstawiono na poniższych wykresach. Pacjenci dorośli, u których zdiagnozowano brak aspergilozy inwazyjnej (populacja kontrolna) Zbadano łącznie 1262 próbek surowicy pobranych od 143 pacjentów po przeszczepie szpiku kostnego i chorujących na białaczkę, w trzech ośrodkach badawczych w Ameryce Północnej, za pomocą testu Platelia Platelia Aspergillus Ag. Rozkład wartości wskaźnika przedstawiono na poniższym wykresie. Rysunek 3 Liczba Number próbek of surowicy Sera 800 700 600 500 400 300 200 100 0 420 0-0.1 0.1-0.2 662 107 40 Rozkład wartości Distribution wskaźnika of the Serum dla surowicy Index Value pobranej fromod dorosłej the Adult populacji Control kontrolnej Population (N=1262) 0.2-0.3 0.3-0.4 0.4-0.5 14 5 4 0.5-0.6 0.6-0.7 0.7-0.8 4 Index 0 1 0.8-0.9 0.9-1.0 1.0-1.1 0 0 1 0 1.1-1.2 1.2-1.3 1.3-1.4 0 4 1.4-1.5 >1.5 Dorośli pacjenci, u których zdiagnozowano aspergilozę inwazyjną Ten wykres punktowy przedstawia wyniki badania na obecność galaktomannanu w 462 próbkach surowicy pobranych od 29 pacjentów biorących udział w badaniu, u których zdiagnozowano stwierdzoną lub prawdopodobną aspergilozę zgodnie z definicjami EORTC/NIAID. Nie oczekiwano, że każda próbka surowicy od każdego pacjenta da wynik dodatni. Oczekiwana częstość występowania aspergilozy inwazyjnej różni się w populacji pacjentów; istnieją doniesienia o wartościach 5-20% 10, 24. występowania dla tego badania wyniósł 16,9%. Rysunek 4 Index > 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 Stwierdzona Adult Proven/ aspergiloza Probable Aspergillosis: w populacji dorosłych Distribution Rozkład of wskaźnika Index/ u pacjentów Adult Patient dorosłych (N=29) (N=29) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Patient Liczba Number pacjentów 12

Poniższy wykres przedstawia odpowiednio przykłady pacjenta odpowiednio bez objawów ani oznak klinicznych aspergilozy inwazyjnej (ujemny wynik testu na obecność grzyba Aspergillus) oraz pacjenta z potwierdzoną lub prawdopodobną aspergilozą inwazyjną (dodatni wynik testu na obecność grzyba Aspergillus). Rysunek 5 Pacjent z wynikiem ujemnym Index CONTROL Pacjent PATIENT kontrolny 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 10 20 30 40 50 60 Days Dni Rysunek 6 Pacjent z wynikiem dodatnim Index PROVEN Pacjent INVASIVE ze stwierdzoną ASPERGILLOSIS aspergilozą PATIENT inwazyjną 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 10 20 30 40 50 60 Dni Days II. POPŁUCZYNY OSKRZELIKOWO-PĘCHERZYKOWE (BAL) W Stanach Zjednoczonych przeprowadzono dwa badania na łącznej liczbie 449 próbek popłuczyn oskrzelikowopęcherzykowych (BAL) pobranych od 178 biorców po przeszczepach narządów miąższowych oraz biorców po przeszczepach płuc z aspergilozą inwazyjną lub nie, w celu określenia charakterystyki działania zestawu testu Platelia Aspergillus Ag w przypadku próbek popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL). 403 próbek popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) pochodziło od 167 pacjentów, którym przeszczepiono narządy miąższowe lub płuca, a u których nie zdiagnozowano aspergilozy inwazyjnej. Przeprowadzono dodatkowo analizę retrospektywną BAL od 99 pacjentów hematologicznych z grupy podwyższonego ryzyka z poza USA. W grupie tej było 58 pacjentów ze stwierdzoną aspergilozą. Poniższa tabela ukazuje rozkład wartości wskaźnika dla łącznej liczby 403 próbek popłuczyn oskrzelikowopęcherzykowych (BAL) pobranych od 167 pacjentów z populacji kontrolnej. Oczekiwane wartości dla próbek popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) pobranych od pacjentów po przeszczepach narządów miąższowych i płuc, u których nie stwierdzono aspergilozy inwazyjnej, przedstawiono w poniższej tabeli. Wyniki przedstawiono dla biorców narządów z podziałem na uzyskaną kolonizację pleśnią lub jej brak. Tabela 1 Wartości oczekiwane według próbki Połączone wyniki dla biorców narządów miąższowych i płuc bez zdiagnozowanej aspergilozy inwazyjnej N =403 popłuczyny oskrzelikowo-pęcherzykowe (BAL) Diagnoza N Wynik dodatni (%) Wynik ujemny (%) Próbki kontrolne bez kolonizacji 341 11/341 (3,2%) 330/341 (96,8%) Próbki kontrolne z kolonizacją 62 12/62 (19,4%) 50/62 (80,6%) Razem próbki kontrolne 403 23/403 (5,7%) 380/403 (94,3%) Oczekiwane wartości dla próbek popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) pobranych od pacjentów po przeszczepach narządów miąższowych i płuc, u których nie stwierdzono aspergilozy inwazyjnej, przedstawiono w poniższej tabeli z podziałem na rodzaj przeszczepu. 13

Tabela 2 Wartości oczekiwane według próbki Połączone wyniki dla biorców narządów miąższowych i płuc bez zdiagnozowanej aspergilozy inwazyjnej z podziałem na rodzaj przeszczepu N =403 popłuczyny oskrzelikowo-pęcherzykowe (BAL) Rodzaj przeszczepu N Wynik dodatni (%) Wynik ujemny (%) Serce 28 3/28 (10,7%) 25/28 (89,3%) Nerka 25 3/25 (12,0%) 22/25 (88,0%) Wątroba 23 1/23 (4,3%) 22/23 (95,7%) Płuco 327 16/327 (4,9%) 311/327 (95,1%) Razem próbki kontrolne 403 23/403 (5,7%) 380/403 (94,3%) Wartości oczekiwane wyznaczono w 41 próbkach BAL pacjentów hematologicznych bez aspergilozy. Wyniki przedstawiono poniżej Tabela 3 Wartości oczekiwane według próbki Pacjenci hematologiczni bez aspergilozy N =41 popłuczyny oskrzelikowo-pęcherzykowe (BAL) Diagnoza N Wynik dodatni (%) Wynik ujemny (%) próbki kontrolne 41 8/41 (19.5%) 33/41 (80.5%) 15- OKREŚLONA CHARAKTERYSTYKA DZIAŁANIA A- ODTWARZALNOŚĆ a) Odtwarzalność badania dla surowicy Zmienność pozaseryjną i wewnątrzseryjną dla testu Platelia Aspergillus Ag określono w badaniu, przy użyciu panelu 6 zgrupowanych próbek surowicy (jedna ujemna, jedna nisko dodatnia, dwie dodatnie i dwie wysoce dodatnie) uzyskanych w trzech ośrodkach badań klinicznych w Ameryce Północnej. Każdy z 6 elementów paneli był poddany testowi trzykrotnie (x3) w 3 różne dni, z użyciem jednej partii, w dwóch ośrodkach (łączna liczna testów powtórzonych w każdym ośrodku = 9). Każdy z 6 elementów paneli był poddany testowi dwukrotnie (x2) w 3 różnych dniach, z użyciem jednej partii, w trzecim ośrodku (łączna liczna testów powtórzonych w trzecim ośrodku = 6). Jeden (1) operator wykonał wszystkie testy precyzji w każdym ośrodku. Dane były analizowane zgodnie z normami Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) (dawniej National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)). Średnia gęstość, średnia wartość wskaźnika, odchylenie standardowe (OS), procentowy współczynnik zmienności (%CV), z precyzją w obrębie cyklu (wewnątrzseryjną) i ośrodka (pozaseryjną) dla każdego elementu panelu w każdym ośrodku zilustrowano poniżej w następujących tabelach. 14