METYLACJA GENÓW rrna W TKANKACH KALUSOWYCH PSZENICY

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: 23-30 METYLACJA GENÓW rrna W TKANKACH KALUSOWYCH PSZENICY GraŜyna Dąbrowska 1, Wioletta Zubek-Rzeplińska 2, Anna Goc 1, Magdalena Szechyńska-Hebda 3, Maria Filek 3 1 Zakład Genetyki, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu 2 Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Oddział w Bydgoszczy 3 Instytut Fizjologii Roślin im. F. Górskiego PAN w Krakowie Wstęp Ekspresja genów u organizmów eukariotycznych zaleŝy przede wszystkim od dostępności DNA dla czynników transkrypcyjnych. Metylacja DNA uwaŝana jest za jeden z głównych mechanizmów odpowiadających za kontrolę ekspresji genów poprzez modulowanie struktury chromatyny. Epigenetyczne zmiany ekspresji genu odbywają się bez zmiany sekwencji DNA, mogą być wywołane na skutek kowalencyjnego dodania grupy metylowej do cytozyny w DNA [ATTWOOD i in. 2002; FREITAG, SELKER 2005]. Z końcem lat siedemdziesiątych ubiegłego wieku metylacja DNA została rozpoznana jako waŝny element epigenetyczny, który pozytywnie koreluje z transkrypcyjnym wyciszeniem genów, takich jak transpozony, a takŝe tych kodujących sekwencje występujące w wielu kopiach [COSTELLO, PLASS 2001]. W eukariotycznych genomach waŝną klasę genów o sekwencjach powtórzeniowych stanowią transkrypty kodujące rybosomalne RNA (rrna) połoŝone w regionie organizatora jąderka - NOR (ang. nucleolus organizer regions) [WOO, RICHARDS 2008]. Geny kodujące rrna są genami metabolizmu podstawowego. Poziom ich ekspresji jest rozmaity i zaleŝy od tkanki. W tkankach realizujących cykl komórkowy, intensywnie syntetyzujących białka (np. merystemy, wczesne stadia rozwoju zarodka, bielma i liścienie w rozwijających się nasionach), jąderka są znacznych rozmiarów, kilkakrotnie większe niŝ w tkankach stałych, charakteryzujących się niskim poziomem translacji. Następnie wykazano, Ŝe rozmiary jąderek zaleŝą od aktywności transkrypcyjnej rrna, która z kolei jest skorelowana z metylacją w obszarze promotora i nietranskrybowanych sekwencjach międzygenowych. W czasie podziału komórki istnieje ogromne zapotrzebowanie na syntezę rrna, kiedy to musi powstać kilka setek tysięcy nowych rybosomów [SARDANA i in. 1993]. Celem pracy było porównanie metylacji genów rrna w nieregenerujących i regenerujących tkankach kalusowych Triticum vulgare, uzyskanych zarówno z zarodków, jak i kwiatostanów. Materiał i metody Nasiona pszenicy ozimej odmiany Kamila otrzymano ze Stacji Oceny Odmian

24 G. Dąbrowska i inni w Węgrzcach. Siewki wernalizowano 9 tygodni, w sterylnych pojemnikach z perlitem w temperaturze 5 C, przy 8-godzinnym fotoperiodzie i natęŝeniu napromieniowania kwantowego 100 µmol(quantum) m -2 s -1. Siewki przenoszono do wazonów z mieszaniną gleby:torfu:piasku (3:2:1; v/v/v) i umieszczano w szklarni w temperaturze 20/17 C (dzień/noc) w 16 h fotoperiodzie i natęŝeniu napromieniowania kwantowego około 400 µmol(quantum) m -2 s -1. Po około 4 tygodniach wzrostu fragmenty źdźbeł ścinano na wysokości pomiędzy pierwszym kolankiem a 4 cm powyŝej kolanka. Fragmenty te zawierały młode kwiatostany o wielkości około 1 cm. Ziarniaki z zarodkami zbierano po 60 dniach wegetacji, w fazie dojrzałości mlecznej (14 dni po pojawieniu się pylników). Fragmenty roślin sterylizowano 10 minut w 70% etanolu oraz 15 minut w 10% roztworze Domestosu, po czym czterokrotnie płukano sterylną wodą dejonizowaną [MARCIŃSKA i in. 2001]. Eksplanty, tj. kwiatostany (10 mm) i zarodki (1,5 mm) izolowano z fragmentów roślin w warunkach sterylnych i wykładano na poŝywkę stymulującą indukcję kalusa, tj. MS o składzie wg MURASHIGE i SKOOG [1962]. Izolacja kwasów nukleinowych i przygotowanie sond molekularnych DNA genomowe przygotowano z tkanek kalusowych, uzyskanych z zarodków i kwiatostanów pszenicy przy uŝyciu metody opisanej przez DOYLE, DOYLE [1987]. Wyizolowane DNA genomowe poddano działaniu dwóm izoschizomerów - enzymów restrykcyjnych: MspI wraŝliwy na metylację zewnętrznej cytozyny w sekwencji CCGG; HpaII wraŝliwy na metylację cytozyny w sekwencji CCGG oraz enzymu EcoRI. DNA plazmidowe zawierające fragmenty genów 18S rrna grochu [JORGENSEN i in. 1987] i 25S rrna pszenicy [GERLACH, BEDBROOK 1979] wyizolowano metodą lizy alkalicznej [SAMBROOK i in. 1989a]. Uzyskane DNA plazmidowe traktowano enzymami restrykcyjnymi EcoRI i HindIII w celu przygotowania sond molekularnych. Produkty trawienia rozdzielano w 1% Ŝelu agarozowym, a uzyskane DNA wstawek wyizolowano metodą mroŝeniową [SAMBROOK i in. 1989b]. Hybrydyzacja Southern DNA genomowe trawione odpowiednio enzymami EcoRI, HpaII i MspI, rozdzielano elektroforetycznie w 0,8% Ŝelu agarozowym i przenoszono na membranę nylonową siłami kapilarnymi skierowanymi w dół [KOETSIER i in. 1993] i hybrydyzowano z sondami molekularnymi kodującymi 18S i 25S rrna (fot. 1 i 2). DNA sond molekularnych wyznakowano radioizotopowo metodą random priming [FEINBERG, VOGELSTEIN 1983]. Membrany po hybrydyzacji umieszczano w kasecie z kliszą rentgenowską w celu wizualizacji wyników hybrydyzacji. Na podstawie krzywej kalibracyjnej wyznaczonej na papierze półlogarytmicznym dla poszczególnych fragmentów markera DNA λ/hindiii (Fermentas) określono długość hybrydyzujących fragmentów DNA genomowego. Wyniki i dyskusja Metylacja DNA moŝe odgrywać istotną rolę u roślin i zwierząt, u roślin specyficznie dotyczy transpozonów, a u zwierząt zarówno transpozonów, jak i eksonów

METYLACJA GENÓW rrna... 25 [RABINOWICZ i in. 2003]. Od kilkunastu lat naukowcy zajmujący się procesem embriogenezy, starają się poznać mechanizmy tego procesu, róŝnice pomiędzy komórkami embriogennymi i nieembriogennymi na poziomie molekularnym oraz markery, na podstawie których moŝna będzie określić przebieg morfogenezy na wczesnych etapach [KOZŁOWSKA i in. 1994]. Embriogeneza somatyczna przez długi czas była uwaŝana za drogę rozwoju roślin uzyskanych z kultur in vitro, która nie wywołuje zmienności wśród regenerantów. Jednak dziś po wielu badaniach istnieje szereg dowodów na to, Ŝe w somatycznych komórkach kultur in vitro, w których została zaindukowana embriogeneza, dochodzi do epigenetycznych zmian ekspresji genów [WRÓBLEWSKI 1994]. LO SCHIAVO i in. [1989] stwierdzili, Ŝe metylacja de novo oraz fala demetylacji DNA określa specyficzny wzór metylacji podczas gametogenezy i embriogenezy u roślin. Badania przeprowadzone przez PARAKASH i in. [2003] wykazały, Ŝe tworzeniu pędów bocznych z eksplantów liści petunii towarzyszy metylacja specyficznych genów. Na ogół tkanki, w których dany gen ulega ekspresji, zawierają mniej mc w porównaniu z tkankami, w których dany gen jest nieaktywny [PALMGREN i in. 1991]. W wyniku indukcji embriogenezy poziom 5-metylocytozyny in vitro w tkankach embriogennych marchwi gwałtownie obniŝał się, aby w późniejszych stadiach wzrosnąć. PEDRALI-NOY i in. [2003] wykryli u marchwi specyficzne inhibitory metylotransferaz DNA, których obecność, podobnie jak obecność 5-azaC, hamowała embriogenezę komórek embriogennych. Inhibitory wykryto teŝ u ryŝu i tytoniu, ale o mniejszej aktywności niŝ u marchwi. W przeciwieństwie do tych badań stwierdzono, Ŝe u marchwi zarówno dedyferencjacja komórek podczas tworzenia kalusa z wycinków hypokotyla, jak i powstawanie w zawiesinach komórkowych wysoce zorganizowanych struktur, jakimi są zarodki somatyczne, towarzyszy zwiększenie poziomu metylacji DNA. Wydaje się zatem, Ŝe u marchwi brak jest bezpośredniego związku między wiekiem i stadium róŝnicowania tkanek a poziomem metylacji ich DNA [za OLSZEWSKA, SAKOWICZ 1991]. W naszych badaniach stosując dwa enzymy restrykcyjne, róŝniące się wraŝliwością na metylację cytozyny, podjęliśmy próbę określenia stopnia zmetylowania DNA oraz skorelowania potencjalnych róŝnic metylacji sekwencji 18S rrna oraz 25S rrna z procesem regeneracji. Dla wszystkich analizowanych tkanek kalusowych zdolnych do regeneracji i nieulegających regeneracji, uzyskanych z zarodków i kwiatostanów, w przypadku hybrydyzacji z DNA 18S rrna dla trawienia enzymem niewraŝliwym na metylację EcoRI, stwierdzono hybrydyzację fragmentów: 2300, 2000, 1200, 900 par zasad (pz). Natomiast przy trawieniu enzymem MspI stwierdzono hybrydyzację do fragmentów: 1800, 1300, 700, 500 pz. Przeprowadzono takŝe hybrydyzację do DNA genomowego trawionego jednocześnie enzymami HpaII i EcoRI i podobnie jak przy trawieniu enzymem HpaII, uzyskano hybrydyzację do fragmentu powyŝej 5000 pz. Dla trawienia enzymami MspI i EcoRI otrzymano hybrydyzację do fragmentów wielkości: 1500, 1000, 900, 800, 500, 300 pz (dane niepokazane). Sonda molekularna 25S rrna we wszystkich badanych wariantach, dla trawienia enzymem HpaII hybrydyzowała do fragmentu wielkości 23000 pz. Zaobserwowano hybrydyzację do fragmentów: 6500 2500, 2300, 1200, 700, 500 pz w przypadku trawienia enzymem MspI. Dla DNA trawionego enzymami EcoRI i HpaII otrzymano hybrydyzację do fragmentu o wielkości 23000 pz. Natomiast w przypadku trawienia enzymami MspI i EcoRI stwierdzono hybrydyzację do fragmentów: 4000, 1800, 1000, 800, 700, 500 i 200 pz (dane niepokazane).

26 G. Dąbrowska i inni Fot. 1. A. Zdjęcie w świetle UV genomowego DNA pszenicy wybarwionego bromkiem etydyny, rozdzielonego w 1% Ŝelu agarozowym. M marker, DNA faga λ trawione HindIII; ścieŝki 1-12 DNA genomowe trawione: EcoRI (ścieŝki 1-4), HpaII (5-8), MspI (9-12); DNA wyizolowano z: kalusa regenerującego otrzymanego z kwiatostanów (ścieŝki 1, 5, 9), kalusa nieregenerującego otrzymanego z kwiatostanów (ścieŝki 2, 6, 10), kalusa regenerującego otrzymanego z zarodków (ścieŝki 3, 7, 11), kalusa nieregenerującego otrzymanego z zarodków (ścieŝki 4, 8, 12). B. Autoradiogram hybrydyzacji z sondą molekularną: 18S rrna Photo 1. A. UV-light photo of triticum genomic DNA in 1% agarose gel labeled with ethidium bromide. M marker λ digested with HindIII; lanes 1-12 genomic DNA digested with: 1-4 EcoRI, 5-8 HpaII, 9-12 MspI; DNA was isolated from: 1, 5, 9 regenerating callus originated from inflorescences; 2, 6, 10 non-regenerating callus originated from inflorescences; 3, 7, 11 regenerating callus originated from embryos; 4, 8, 12 non-regenerating callus originated from embryos. B. Autoradiograph from the hybridization with molecular probe of 18S rrna Wyniki trawienia enzymem EcoRI (fot. 1A i 2A, ścieŝki 1-4) wskazują na to, Ŝe otrzymane DNA ulega restrykcji. Trawienie drugim z enzymów - MspI (fot. 1B i 2B, ścieŝki 9-12) uwidoczniło duŝą ilość fragmentów restrykcyjnych, co wskazuje na duŝą ilość sekwencji CCGG i/lub C m CGG w badanym DNA. Fragmentów restrykcyjnych było tak duŝo, Ŝe wyniki trawienia uwidaczniały się na Ŝelu w postaci smugi, która uniemoŝliwiała rozróŝnienie wielkości fragmentów. DNA kalusa pszenicy było oporne na trawienie enzymem HpaII (fot. 1A, 1B i 2A, 2B, ścieŝki 5-8) i nie stwierdzono Ŝadnych róŝnic pomiędzy badanymi wariantami poszczególnych tkanek.

METYLACJA GENÓW rrna... 27 Fot. 2. A. Zdjęcie w świetle UV genomowego DNA pszenicy wybarwionego bromkiem etydyny, rozdzielonego w 1% Ŝelu agarozowym. M marker, DNA faga λ trawione HindIII; ścieŝki 1-12 DNA genomowe trawione: EcoRI (ścieŝki 1-4), HpaII (5-8), MspI (9-12); DNA wyizolowano z: kalusa regenerującego otrzymanego z kwiatostanów (ścieŝki 1, 5, 9), kalusa nieregenerującego otrzymanego z kwiatostanów (ścieŝki 2, 6, 10), kalusa regenerującego otrzymanego z zarodków (ścieŝki 3, 7, 11), kalusa nieregenerującego otrzymanego z zarodków (ścieŝki 4, 8, 12). B. Autoradiogram hybrydyzacji z sondą molekularną 25S rrna Photo 2. A. UV-light photo of triticum genomic DNA in 1% agarose gel labeled with ethidium bromide. M marker λ digested with HindIII; lanes 1-12 genomic DNA digested with: 1-4 EcoRI, 5-8 HpaII, 9-12 MspI; DNA was isolated from: 1, 5, 9 regenerating callus originated from inflorescences; 2, 6, 10 non-regenerating callus originated from inflorescences; 3, 7, 11 regenerating callus originated from embryos; 4, 8, 12 non-regenerating callus originated from embryos. B. Autoradiograph from the hybridization with molecular probe of 25S rrna Podobne wyniki jak w naszych badaniach uzyskali MORRISH i VASIL [1989] metodą HPLC, stwierdzili oni porównywalny poziom metylacji kalusa embriogennego i nieembriogennego. Autorzy wnioskują, Ŝe utrata kompetencji embriogennej nie jest powiązana ze znacznymi zmianami metylacji, choć nie wyklucza to zmian we wzorcu metylacji specyficznych genów. Natomiast TCHORBADJIEVA i PANTCHEV [2004] przy uŝyciu enzymów restrykcyjnych wykazali, Ŝe kalus embriogenny Dactylis glomerata L. ma wyŝszy poziom metylacji niŝ wyprowadzony z tego samego genotypu i w tych samych warunkach hodowlanych kalus nieembriogenny. Porównanie obrazów genomowego DNA wszystkich badanych wariantów trawionego HpaII i MspI wskazuje na większą podatność DNA na działanie enzymu MspI. PoniewaŜ enzymy HpaII i MspI róŝnią się wraŝliwością na metylację środkowej cytozyny, to wyniki trawienia restrykcyjnego świadczą o znacznym poziomie metylacji DNA uzyskanym z tkanek kalusa kwiatostanów i zarodków zarówno regenerujących, jak i nieregenerujących.

28 G. Dąbrowska i inni Wydaje się, Ŝe badania zmian metylacji cytozyn w obrębie sekwencji promotora, a nie samej sekwencji cdna genów rrna, mogłoby dostarczyć istotnych danych umoŝliwiających powiązanie ekspresji tych genów z poziomem zmetylowania ich sekwencji. Wnioski 1. Otrzymane wyniki badań metylacji sekwencji CCGG metodą Southern w obrębie genów rrna tkanek kalusa otrzymanego z róŝnych eksplantów pszenicy potwierdzają dane literaturowe dotyczące metylacji rrna innych roślin. 2. Sekwencja rrna w tkankach kalusowych pszenicy jest metylowana. 3. Porównując tkanki kalusowe uzyskane z kwiatostanów i zarodków nie stwierdzono róŝnic w poziomie metylacji genów rrna. Literatura ATTWOOD J.T., YUNG R.L., RICHARDSON B.C. 2002. DNA methylation and the regulation of gene transcription. Cell Mol. Life Sci. 59: 241-257. COSTELLO J.F., PLASS C. 2001. Methylation matters. J. Med. Genet. 38: 285-303. DOYLE J.J., DOYLE J.L. 1987. Isolation of DNA from fresh plant tissue. Focus 12: 13-15. FEINBERG A.P., VOGELSTEIN B. 1983. A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity. Anal. Biochem. 132: 6-13. FREITAG M., SELKER E.U. 2005. Controlling DNA methylation: many roads to one modification. Curr. Opin. Genet. Dev. 15: 1-9. GERLACH W.L., BEDBROOK J.R. 1979. Cloning and characterization of ribosomal RNA genes from wheat and barley. Nucl. Acids Res. 7: 1869-1885. JORGENSEN R.A., CUELLAR R.E., THOMPSON W.F., KAVANAGH T.A. 1987. Structure and variation in ribosomal RNA genes of pea. Plant Mol. Biol. 8: 3-12. KOETSIER P.A., SCHORR J., DOERFLER W. 1993. A rapid optimizer protocol for downward alkaline southern blotting of DNA. BioTechniques 15: 260-262. KOZŁOWSKA W., RYBCZYŃSKI J.J. 1994. Somatyczna embriogeneza u traw i zbóŝ. Prace Ogrodu Botanicznego PAN 5/6: 131-138. LO SCHIAVO F., PITTO L., GINLIANO G., TORTII G., NUTRI-RONCHI V., MARAZZITI D., VER- GARO R., ORSELLI S., TEZZI M. 1989. DNA methylation of embryogenic carrot cell cultures and its variations as caused by mutation, differentiation, hormones and hypomethylating drugs. Theor. Appl. Genet. 77: 325-331. MARCIŃSKA I., SZECHYŃSKA-HEBDA M., BIESAGA-KOŚCIELNIAK J., FILEK M. 2001. Applicability of Polish winter wheat (Triticum aestivum L.) cultivars to long-term in vitro culture. Cereal Res. Comm. 29: 127-134. MORRISH F.M., VASIL I.K. 1989. DNA Methylation and embryogenic competence in leaves and callus of napiergrass (Pennisetum purpureum Schum.). Plant Physiol. 90: 37-40. MURASHIGE T., SKOOG F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.

METYLACJA GENÓW rrna... 29 OLSZEWSKA M., SAKOWICZ T. 1991. Metylacja DNA u roślin. Post. Biol. Kom. 4: 253-262. PALMGREN G., MATTSON O., OKKELS F.T. 1991. Specific levels of DNA methylation in various tissues, cell lines, and cell types of Daucus carota. Plant Physiol. 95: 174-178. PEDRALI-NOY G., BERNACCHIA G., DO ROSARIO ALVELOS M., CELLA R. 2003. Daucus carota cells contain specific DNA methyltransferase inhibitors that interfere with somatic embryogenesis. Plant Biol. 5: 383-392. PRAKASH A.P., KUSH A., LAKSHMANAN P., KUMAR P.P. 2003. Cytosine methylation occurs in a CDC48 homologue and a MADS-box gene during adventitious shoot induction in Petunia leaf explants. J. Exp. Bot. 54: 1361-1371. RABINOWICZ P.D., PALMER L.E., MAY B.P., HEMANN M.T., LOWE S.W., MCCOMBIE W.R., MARTIENSSEN R.A. 2003. Genes and transposons are differentially methylated in plants, but not in mammals. Genome Res. 13: 2658-2664. SAMBROOK J., FRITSCH E.F., MANIATIS T. 1989a. Molecular cloning: a laboratory manual. Wydanie 2. Cold Springer Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York: 1.38-1.39. SAMBROOK J., FRITSCH E.F., MANIATIS T. 1989b. Molecular cloning: a labolatory manual. Wydanie 2. Cold Springer Harbor Labolatory Press, Cold Spring Harbor, New York: 10.30-6.31. SARDANA R., ODELL M., FLAVELL R. 1993. Correlation between the size of the intergenic regulatory region, the status of cytosine methylation of rrna genes and nucleolar expression in wheat. Mol. Gen. Genet. 236: 155-162. TCHORBADJIEVA M.I., PANTCHEV I.Y. 2004. DNA methylation and somatic embryogenesis of orchardgrass (Dactylis glomerata L.). Bulg. J. Plant Physiol. 30: 1-3. WOO H.R., RICHARDS E.J. 2008. Natural variation in DNA methylation in ribosomal RNA genes of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 8: 92. WRÓBLEWSKI T.A. 1994. Process of somatic embryogenesis-detailed characteristics. Post. Biol. Kom. 4: 11-32. Skróty: 5-mC 5-metylocytozyna HPLC wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa; High Performance Liquid Chromatography Słowa kluczowe: Triticum vulgare, kultury in vitro, metylacja, rrna Streszczenie Poziom metylacji DNA u roślin jest modyfikowany podczas rozwoju i róŝnicowania. Przeprowadzone badania miały na celu zbadanie poziomu metylacji cytozyny w sekwencjach kodujących rrna. Materiał do badań stanowiły tkanki kalusowe regenerujące i nieregenerujące otrzymane z niedojrzałych kwiatostanów oraz zarodków pszenicy. DNA genomowe trawiono enzymami HpaII i MspI, róŝniącymi się wraŝliwością na metylację rozpoznawanej sekwencji CCGG. Zastosowano metodę

30 G. Dąbrowska i inni hybrydyzacji Southern dla uwidocznienia fragmentów hybrydyzujących do sond molekularnych 18S rrna grochu oraz 25S rrna pszenicy. Wyniki hybrydyzacji potwierdzają, Ŝe cytozyny w rrna w tkankach kalusowych regenerujących i niezdolnych do regeneracji otrzymane z niedojrzałych kwiatostanów oraz zarodków pszenicy są zmetylowane. Nie wykazano róŝnic w poziomie metylacji pomiędzy poszczególnymi badanymi tkankami kalusowymi. METHYLATION OF rrna GENES IN CALLUS TISSUE OF WHEAT GraŜyna Dąbrowska 1, Wioletta Zubek-Rzeplińska 2, Anna Goc 1, Magdalena Szechyńska-Hebda 3, Maria Filek 3 1 Nicolas Copernicus University, Department of Genetics, Toruń 2 Institute of Plant Breeding and Acclimatization, Research Division in Bydgoszcz 3 Institute of Plant Physiology, Polish Academy of Sciences, Kraków Key words: wheat, in vitro cultures, methylation, rrna Summary Methylation level of DNA changes during plant development and differentiation. This study was undertaken to determinate methylocytosine in the sequence encoding rrna. As an experimental system, the regenerating and non-regenerating callus originated from immature inflorescences and embryos was used. The genomic DNA was digested with HpaII and MspI, different in their sensitivity to methylation of the CCGG sequence. Southern hybridization was carried out with molecular probe of bean 18S rrna and triticum 25S rrna. Results confirmed that the cytosines in rrna of regenerating and non-regenerating callus originated from immature inflorescences and embryos are methylated. The differences in the methylation level of various tissues were not detected. Dr GraŜyna Dąbrowska Zakład Genetyki Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej Uniwersytet Mikołaja Kopernika ul. Gagarina 9 87-100 TORUŃ e-mail: browsk@uni.torun.pl