ZAWARTO ZWI ZKÓW FENOLOWYCH W RÓ NYCH STADIACH ROZWOJOWYCH Galanthus elwesii HOOK. W KULTURACH in vitro

Transkrypt

1 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: ZAWARTO ZWI ZKÓW FENOLOWYCH W RÓ NYCH STADIACH ROZWOJOWYCH Galanthus elwesii HOOK. W KULTURACH in vitro Anna Bach 1, Bo ena Pawłowska 1, Katarzyna Hura 2 1 Katedra Ro lin Ozdobnych, Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołł taja w Krakowie 2 Katedra Fizjologii Ro lin, Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołł taja w Krakowie Wst p Zwi zki fenolowe stanowi liczn i niezwykle ró norodn pod wzgl dem strukturalnym grup produktów naturalnych wyst puj cych w wiecie ro linnym. Flawonoidy i inne zwi zki fenolowe pełni wa n rol w czasie rozwoju ro liny oraz bior udział w systemach obronnych przeciwdziałaj cych chorobom, szkodnikom i ró nego rodzaju stresom, na które nara one s ro liny. Wiele zwi zków fenolowych to antyoksydanty, które mog hamowa powstawanie mutacji i procesów kancerogennych w komórkach [CASTELLUCCIO i in. 1995; HORBOWICZ, KOTLI SKA 1998; HORBOWICZ 2000; LYNCH i in. 2001; VINCENT i in. 2005]. nie yczki (Galanthus sp.) s cenionymi w kwiaciarstwie i obj tymi ochron gatunkow, ro linami cebulowymi, które ze wzgl du na zawarto galantaminy s wykorzystywane w kuracji przeciw chorobie Alzheimera. Pochodz ca z Azji Mniejszej nie yczka Elwesa (Galanthus elwesii) stanowi jedn z najwa niejszych ozdobnych ro lin cebulowych eksportowanych z Turcji do Europy Zachodniej. Tradycyjny wegetatywny sposób rozmna ania nie yczek z cebul przybyszowych jest powolny i mało wydajny. Jednym ze sposobów zwi kszenia wydajno ci rozmna ania jest zastosowanie metody in vitro z u yciem po ywek stałych i płynnych, a szczególnie kultur bioreaktorowych [CANTLIFFE 2001; TIPIRDAMAZ i in. 2000; BACH i in. 2003; TILLY- MANDY i in. 2006]. Celem przeprowadzonych bada było okre lenie zawarto ci zwi zków fenolowych w ró nych tkankach nie yczek, rozmna anych drog organogenezy i somatycznej embriogenezy. Materiał i metody W przeprowadzonych do wiadczeniach do namna ania nie yczek Elwesa (Galanthus elwesii HOOK.) drog organogenezy i somatycznej embriogenezy zastosowano po ywki o składzie podstawowym wg MURASHIGE i SKOOG (MS) [1962], zawieraj ce 3% sacharozy, o ph 5,8. Do formowania cebul przybyszowych wykorzystano po ywki stałe wzbogacone w 0,1-1 M BA (6-benzyloaminopuryna) i 0,1-1 M IAA (kwas indolilo-3-octowy). Eksplantatmi wyj ciowymi były cebule przybyszowe, białe, o rednicy 2 mm, posiadaj ce jeden lub dwa li cie, pochodz ce z kolekcji in vitro Katedry Ro lin Ozdobnych UR w Krakowie. Co 4 tygodnie dokonywano pasa u materiału ro linnego

2 14 A. Bach, B. Pawłowska, K. Hura na wie e po ywki, a całkowity czas trwania kultury wynosił 28 tygodni (6 pasa y). Okre lono procent eksplantatów formuj cych cebule przybyszowe, liczb cebul przybyszowych na eksplantat oraz obserwowano pojawianie si li ci i korzeni. Do indukcji somatycznej embriogenezy na łuskach cebulowych nie yczki Elwesa u yto po ywki zawieraj cej 25 M Picloramu i 1 M BAP. Namna anie kalusa embriogenicznego zachodziło w bioreaktorze typu air-lift (naczynie o pojemno ci 250 ml) z mieszaniem pneumatycznym. Kultury były prowadzone metod okresowodolewow (fed batch culture) z całkowit wymian po ywki co 10 dni, ogólny czas 1 cyklu kultury wynosił 40 dni. Inokulum stanowił kalus embriogeniczny, a stosunek masy tkanki do obj to ci po ywki wynosił odpowiednio: 1:30, 1:15 lub 1:10 (5, 10 lub 15 g kalusa w 150 ml po ywki). W do wiadczeniu badano tak e wpływ po ywki o podwy szonym st eniu sacharozy (6%) na namna anie kalusa embriogenicznego. Dla testowanych po ywek prowadzono kultur kontroln na po ywce stałej. Obliczano współczynnik wzrostu GV kalusa (wg wzoru GV=m k m p /m k, gdzie: m k - masa ko cowa, m p - masa pocz tkowa). Po zako czeniu do wiadczenia kalus wyj to z bioreaktora i umieszczono na po ywce pozbawionej regulatorów wzrostu, w celu uzyskania somatycznych zarodków. Wszystkie kultury trzymano w ciemno ci, w temperaturze 25 C i wilgotno ci wzgl dnej 70-80%. Dodatkowo okre lono zawarto suchej masy w kalusie embriogenicznym. Materiał ro linny odwa ono po 0,5 g w trzech powtórzeniach dla ka dej kultury bioreaktorowej i suszono w temperaturze 60 C do uzyskania stałej masy. W zregenerowanym materiale ro linnym analizowano zawarto zwi zków fenolowych. Uzyskane cebule były dzielone na: cz rodkow (łuski wewn trzne z p kiem) oraz łuski zewn trzne. Wykonano tak e analiz zwi zkow enolowych w li ciach uformowanych w kulturach in vitro. Kontrol stanowiła tkanka pobrana z ro lin rosn cych w gruncie (li cie, pi tka, łuski cebulowe). Zawarto zwi zków fenolowych oznaczono tak e w kalusie embriogenicznym namna anym na ró nych po ywkach w bioreaktorze oraz w zarodkach somatycznych zregenerowanych z kalusa. Materiał ro linny przechowywano w temperaturze 30 C do czasu przeprowadzenia analizy. W celu przeprowadzenia analizy zawarto ci zwi zków fenolowych, 250 mg tkanki ro linnej zagotowano w 1 cm 3 80% etanolu, a nast pnie homogenizowano w tym e samym roztworze etanolu. Ekstrakt wirowano przy 3000 g przez 20 minut. Otrzymany supernatant zawieraj cy wyekstrahowane zwi zki fenolowe rozcie czano wod destylowan i dodawano do roztworu pomiarowego zawieraj cego 25% Na 2 CO 3 i odczynnik Folin-Ciocalteau a [SINGLETON, ROSSI 1965]. Po 20 minutach inkubacji mierzono absorbancj przy długo ci fali 760 nm. Całkowit zawarto fenoli obliczono z krzywej kalibracyjnej sporz dzonej w oparciu o roztwory kwasu chlorogenowego i przeliczano na zawarto fenoli w wie ej masie tkanki ( g g -1 wie ej masy). Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej. Zastosowano metod statystyczn kombinowan w układzie niezale nym dwuczynnikowym, z uwzgl dnieniem poziomu istotno ci =0,05, a przy porz dkowaniu danych korzystano z testu Duncana. Wyniki i dyskusja nie yczka Elwesa (Galanthus Elwesii HOOK.) posiada najbardziej okazałe kwiaty spo ród wszystkich nie yczek i nale y do najcenniejszych wiosennych ro lin cebulowych, wykorzystywanych w kwiaciarstwie. Ponadto mo e by wykorzystywana w przemy le farmakologicznym, poniewa zawiera cenne czynne alkaloidy: galantamin, likoryn i nivalin. Tradycyjny, wegetatywny sposób rozmna ania

3 ZAWARTO ZWI ZKÓW FENOLOWYCH W RÓ NYCH STADIACH nie yczek z cebul przybyszowych jest powolny, a ro liny rozmna ane z nasion nie powtarzaj cech ro lin matecznych. Na temat kultur in vitro nie yczek Elwesa istniej w literaturze tylko nieliczne dane [TIPIRDAMAZ 1999; 2003; TIPIRDAMAZ i in. 2000; TILLY- MANDY i in. 2006]. Zastosowana metoda rozmna ania nie yczek Elwesa drog organogenezy pozwoliła na uzyskanie p ków przybyszowych i cebul na 94,6% eksplantatów. W czasie kolejnych pasa y rozwijały si w cebule przybyszowe (tab. 1). Na jednym eksplantacie na po ywce zawieraj cej 1 M BA i 0,1 M IAA uformowało si rednio 2,3 sztuk cebul, które po 28 tygodniach kultury osi gn ły redni mas 217 mg. Natomiast na po ywce, gdzie proporcja u ytych regulatorów wzrostu była odwrotna, powstało 2,1 sztuk cebul na eksplantat, o redniej masie 192 mg. 42,9% uformowanych na po ywce z 1 M IAA cebul ukorzeniało si. Pocz wszy od 20 tygodnia uprawy obserwowano wyrastanie li ci ze rodka cebul (tab. 1). TILLY-MANDY i in. [2006] uzyskali najwi kszy współczynnik rozmna ania dobrej jako ci cebul przybyszowych, u nie yczki Elwesa i przebi niegu Flore Pleno na po ywce zawierajacej 0,5 M BA i 0,5 M IBA. Tabela 1; Table 1 Organogeneza nie yczki Elwesa na po ywkach z IAA i BA w cyklu 28-tygodniowym Elwes snowdrop organogenesis in the media with IAA and BA in 28-weeks cycle Regulatory wzrostu Plant growth regulators ( M) % eksplantatów z cebulami; % explants with bulbs Formowanie cebul Bulb formation liczba/1 eksplantat no./explant rednia masa average weight (g) Formowanie korzeni Root formation % ukorzenionych % rooting rednia liczba average number Formowanie li ci Leaf formation % cebul z li mi % bulbs with leaves rednia liczba average number 1 BA+0,1 IAA 96,3 a* 2,3 a 0,217 a 17,1 a 0,4 a 64,8 a 1,1 a 1 IAA+0,1 BA 92,9 a 2,1 a 0,192 a 42,9 b 1,3 b 70,5 a 1,3 a * a, b... rednie oznaczone tymi samymi literami nie ró ni si mi dzy sob istotnie; means designated with the same letter do not significantly differ Metoda mikrorozmna ania w po ywkach płynnych mo e słu y do znacznego podwy szenia współczynnika rozmna ania ro lin cebulowych oraz skróci okres potrzebny do wprowadzenia nowej odmiany do produkcji ogrodniczej [MALIK 2008]. U ycie po ywki płynnej zawieraj cej Picloram zwi kszyło współczynnik namna ania kalusa embriogenicznego, z którego rozwijały si zarodki somatyczne (tab. 2). Najwy szy współczynnik wzrostu kalusa GV (1,06-1,09) obserwowano po 40 dniach prowadzenia kultury, gdy g sto inokulum wynosiła 5 g kalusa w 150 ml po ywki (1:30), niezale nie od st enia sacharozy (3 lub 6%). Natomiast, gdy g sto pocz tkowa inokulum wynosiła 10 i 15 g w 150 ml po ywki (1:15, 1:10), współczynnik wzrostu GV był istotnie ni szy (0,69-0,80). Warto współczynnika wzrostu kalusa GV w do wiadczeniach kontrolnych prowadzonych na po ywkach stałych o tym samym składzie co w bioreaktorze, wynosiła 0,85. Jak podaje ZIV [2000], zbyt wysokie st enie cukru w po ywce mo e wpływa hamuj co na namna anie materiału ro linnego, wpływa za to dodatnio na zawarto suchej masy. W przeprowadzonych do wiadczeniach najwi ksz zawarto suchej masy zanotowano w kalusie embriogenicznym namna anym w bioreaktorze na po ywce z podwy szon do 6% zawarto ci sacharozy (tab. 2). Tabela 2; Table 2 Wpływ g sto ci inokulum i zawarto ci sacharozy w po ywce na somatyczn embriogenez

4 16 A. Bach, B. Pawłowska, K. Hura G sto inokulum Inoculum density nie yczki Elwesa Effect of inoculum density and sucrose content for Elwes snowdrop somatic embryogenesis St enie sacharozy; Sucrose concentration (%) GV Sucha masa Dry weight (%) Liczba zarodków somatycznych z 1 g kalusa; Number of somatic embryos from 1 g of callus 1:30 3 1,09 c 11,6 12,3 a 1:30 6 1,06 c 13,5 14,1 a 1:15 3 0,80 b 12,1 11,8 a 1:10 3 0,69 b 11,5 11,3 a Kontrola - po ywka stała Control solid medium 3 6 0,85 b 0,85 b 7,9 9,1 14,9 a 11,0 a GV =m k-m p/m k, gdzie: m k - masa ko cowa, m p - masa pocz tkowa; =m k-m p/m k, where: m k - final weight, m p - primary weight a, b... rednie oznaczone tymi samymi literami nie ró ni si mi dzy sob istotnie; means designated with the same letter do not significantly differ Z 1 g embriogenicznego kalusa przeniesionego na po ywk MS pozbawion regulatorów wzrostu w ci gu 4-tygodniowej kultury uzyskano od 11 do 14,9 sztuk zarodków somatycznych (tab. 2). Tkanki nie yczki Elwesa zawieraj wi cej kwasu p-hydroksybenzoesowego, a mniej kwasu waniliowego i felurowego [TUZEN, ODEMIR 2001]. Przeprowadzona analiza chemiczna wykazała ró n zawarto zwi zków fenolowych w zale no ci od stadium rozwojowego kultur nie yczki i warunków reprodukcji (rys. 1, 2). Uformowane na po ywkach stałych w procesie organogenezy cebule przybyszowe zawierały od 139 do 247 g fenoli na g wie ej masy tkanki. Cebule powstałe na po ywce z przewag cytokininy nad auksyn zawierały wi cej zwi zków fenolowych, ni cebule uformowane na po ywce, w której proporcja u ytych regulatorów wzrostu była odwrotna. Jednocze nie w cebulach powstałych na po ywce z przewag cytokininy nad auksyn w p kach wierzchołkowych i łuskach wewn trznych poziom fenoli był wy szy w porównaniu do zewn trznych łusek cebulowych i wynosił odpowiednio 247 do 126 g g -1 wie ej masy (rys. 1). Analiza chemiczna zawarto ci zwi zków fenolowych w kontrolnej cebuli pochodz cej z uprawy polowej wykazała najwy szy poziom tych zwi zków w pi tce (1723 g g -1 wie ej masy), a najni szy w łusce wewn trznej (rys. 1). Jest to zgodne z wynikami uzyskanymi przez MACLEOD [1976] oraz ZOBEL i BROWN [1990], którzy wykazali, e zawarto zwi zków fenolowych w li ciach zale y od stadium morfologicznego: w młodych li ciach poziom zwi zków fenolowych jest wy szy ni w li ciach starszych. Badanie zawarto ci zwi zków fenolowych w ró nych dzikich gatunkach Allium [HORBOWICZ, KOTLI SKA 1998], wykazały bardzo wysok zawarto tych zwi zków w suchych łuskach zewn trznych.

5 ZAWARTO ZWI ZKÓW FENOLOWYCH W RÓ NYCH STADIACH... 17

6 18 A. Bach, B. Pawłowska, K. Hura

7 ZAWARTO ZWI ZKÓW FENOLOWYCH W RÓ NYCH STADIACH Cebule uformowane na po ywkach z przewag cytokininy nad auksyn zawierały wi cej zwi zków fenolowych ni cebule z po ywek z odwrotn proporcj regulatorów wzrostu. 4. Poziom zwi zków fenolowych mo e by biologicznym markerem morfogenezy w kulturach ro lin rozmna anych technik in vitro. Literatura BACH A., WIDERSKI A., PAWŁOWSKA B Pigments as biological marker in the process of tulip regeneration in vitro. COST 843. Oviedo I BACH A., WARCHOŁ M., PAWŁOWSKA B Rozmna anie nie yczki Elwesa (Galanthus elwesi Hook.) w po ywkach płynnych. Folia Horticulturae. Suplement 2003/2: BERUTO M., CURIR P., DEBERGH P Callus growth and somatic embryogenesis in thalamus tissue of Ranunculus asiaticus L. cultivated in vitro: cytokinin effect and phenol metabolism. In Vitro Cell Dev. Biol-Plant 32: CANTLIFFE D.J Bioreaktor technology in plant cloning. Acta Horticulturae 560: CASTELLUCCIO C., PAGANGA G., MELIKIAN N., BOLWELL G.P., PRIDHAM J., SAMPSON J., RICE E.C Antioxidant potential of intermadiates in phenylpropanoid metabolism in higher plants. FEBS Lett. 368: HORBOWICZ M Wyst powanie, biosynteza i wła ciwo ci biologiczne flawonoli. Post. Nauk Rol. 2: HORBOWICZ M., KOTLI SKA T Zró nicowanie zawarto ci flawonoli w niektórych uprawnych i dzikich gatunkach z rodzaju Allium. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 463: LYNCH J.M., ZOBEL A.M., DIETRICH-SZÓSTAK Ekologiczne nast pstwa zwi kszonego promieniowania UV na przykładzie zwi zków fenolowych w Brassica oleracea, w: Biochemiczne oddziaływanie rodowiskowe. Oleszek W., Głowniak K., Leszczy ski B. Akademia Medyczna w Lublinie: MACLEOD A Volatile flavor compounds of the Cruciferae, w: The Biology and Chemistry of the Cruciferae. Vaughean J., Macleod B., Jones B.: Academic Press, London: MALIK M Comparison of different liquid/solid culture systems in the production of somatic embryos from Narcissus L. ovary explants. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 9: MURASHIGE T., SKOOG F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15: SINGLETON V.S., ROSSI J.A. JR Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagent. Amer. J. Enol. Viticult. 16: TILLY-MANDY A., JAMBOR-BENCZUR E., SZABO J Results with the micropropagation of Galanthus elwesii and Galanthus nivalis Flore Pleno. Acta Horticulturae 725: V International Symposium on In Vitro Culture and Horitcultural Breeding: TIPIRDAMAZ R Micropropagation of snowdrop (Galanthus ikariae Baker.): effects of different explant types, carbonhydrat sources and doses and ph Changes in the medium on the bulblet formation. Turkish Journal of Agriculture and Forestry 23

8 20 A. Bach, B. Pawłowska, K. Hura (Abstract). TIPIRDAMAZ R Rooting and acclimatization of in vitro micropropagated snowdrop (Galanthus ikariae Baker.) bulblets. Akadeniz Universitesi Ziraat Fakultesi Dergisi 16(2): TIPIRDAMAZ R., ELLIALTIOGLU S., CAKIRLAR H The micropropagation of snowdrop (Galanthus ikariae Baker.). Turkish Journal of Agriculture and Forestry 23: TUZEN M., ODEMIR M Chromatographic Determination of Phenolic Acids in Snowdrop by HPLC. Turkish Journal of Chemistry 27(1): VINCENT D., LAPIERRE C., POLLET B., CORNIC G., NEGRONI L., ZIVY M Water deficits affect caffeate O-methyltransferase lignifications, and related enzymes in maize leaves. A proteomic investigation. Plant Physiol. 137: ZIV M Bioreaktor Technology for Plant Micropropagation. Horticultural Reviews, Volume 24, Edited by Jules Janick. ZOBEL A.M., BROWN S.A Seasonal changes of furanocoumarin concentration in leaves Heracleum lanatum J. Chem. Ecol. 16: Słowa kluczowe: Galanthus elwesii, organogeneza, somatyczna embriogeneza, zwi zki fenolowe Streszczenie W przeprowadzonych do wiadczeniach do namna ania nie yczek Elwesa (Galanthus elwesii HOOK.) zastosowano po ywki o składzie podstawowym wg Murashige i Skoog (MS, 1962). Zawarto zwi zków fenolowych oznaczono w ró nych organach i tkankach nie yczek, uzyskanych drog organogenezy i somatycznej embriogenezy. Do formowania cebul przybyszowych na łuskach cebulowych wykorzystano po ywki stałe zawieraj ce 0,1-1 M BA i 0,1 1 M IAA. Do namna ania kalusa embriogenicznego u yto po ywki stałej lub płynnej w bioreaktorze typu air-lift, zawieraj cej 25 M Picloramu i 1 M BA. Stwierdzono ró n zawarto zwi zków fenolowych w zale no ci od stadium rozwojowego kultur nie yczki. Poziom zwi zków fenolowych w materiale ro linnym wydajnie rozmna anym w po ywkach płynnych był wy szy ni w wolniej rosn cym kalusie na po ywkach stałych. Wysoki poziom zwi zków fenolowych zanotowano w embriogenicznej, globularnej tkance kalusowej namna aj cej si intensywnie w bioreaktorze. Powstałe zarodki somatyczne miały 10-krotnie ni sz zawarto zwi zków fenolowych w porównaniu do kalusa embriogenicznego. Uformowane na po ywkach stałych w procesie organogenezy cebule przybyszowe zawierały od 139 do 247 g fenoli na g wie ej masy tkanki. Przy czym cebule powstałe na po ywce z przewag cytokininy nad auksyn zawierały wi cej zwi zków fenolowych w tkankach, ni cebule uformowane na po ywce, w której proporcja u ytych regulatorów wzrostu była przeciwna. Jednocze nie w p kach wierzchołkowych wewn trz cebuli poziom fenoli był wy szy w porównaniu do łusek cebulowych. THE LEVEL OF PHENOLIC COMPOUNDS AT VARIOUS DEVELOPMENTAL STAGES IN in vitro CULTURES OF Galanthus elwesii HOOK.

9 ZAWARTO ZWI ZKÓW FENOLOWYCH W RÓ NYCH STADIACH Anna Bach 1, Bo ena Pawłowska 1, Katarzyna Hura 2 1 Department of Ornamental Plants 2 Department of Plant Physiology, Agricultural University, Kraków Key words: Galanthus elwesii, organogenesis and somatic embryogenesis, phenolic compounds Summary In the present experiments, giant snowdrops (Galanthus elwesii HOOK.) were multiplied on the medium with basic composition described by Murashige and Skoog (MS, 1962). The contents of phenolic compounds were determined in different organs and tissues of the giant snowdrops obtained by organogenesis and somatic embryogenesis. Solid media containing M BA and M IAA were used for the formation of adventitious bulblets on bulb scales. Solid or liquid medium supplemented with 25 M Picloram and 1 M BA was used for multiplication of embryogenic callus in an air-lift bioreactor. Contents of phenolic compounds differed depending on the developmental stage of giant snowdrop cultures. Phenolic compound level in the plant material efficiently multiplied on the liquid media was higher than in the callus growing slower on solid media. High level of phenolic compounds was observed in embryogenic globular callus tissue intensively multiplied in a bioreactor. Somatic embryos formed in the culture had 10 times lower content of phenolic compounds as compared with embryogenic callus. Adventitious bulbs formed by organogenesis on the solid media contained from 139 to 247 g of phenols g -1 of fresh tissue weight. The bulbs developed on the medium supplemented with an excess of cytokinin over auxin contained more phenolic compounds in tissues than the bulbs formed on the media with an inverse proportion of growth regulators. The level of phenolic compounds in apical buds inside the bulbs was higher than in bulb scales. Prof. dr hab. Anna Bach Katedra Ro lin Ozdobnych Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołł taja al. 29 Listopada KRAKÓW robach@cyf-kr.edu.pl

10

11 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: METYLACJA GENÓW rrna W TKANKACH KALUSOWYCH PSZENICY Gra yna D browska 1, Wioletta Zubek-Rzepli ska 2, Anna Goc 1, Magdalena Szechy ska-hebda 3, Maria Filek 3 1 Zakład Genetyki, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu 2 Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Ro lin, Oddział w Bydgoszczy 3 Instytut Fizjologii Ro lin im. F. Górskiego PAN w Krakowie Wst p Ekspresja genów u organizmów eukariotycznych zale y przede wszystkim od dost pno ci DNA dla czynników transkrypcyjnych. Metylacja DNA uwa ana jest za jeden z głównych mechanizmów odpowiadaj cych za kontrol ekspresji genów poprzez modulowanie struktury chromatyny. Epigenetyczne zmiany ekspresji genu odbywaj si bez zmiany sekwencji DNA, mog by wywołane na skutek kowalencyjnego dodania grupy metylowej do cytozyny w DNA [ATTWOOD i in. 2002; FREITAG, SELKER 2005]. Z ko cem lat siedemdziesi tych ubiegłego wieku metylacja DNA została rozpoznana jako wa ny element epigenetyczny, który pozytywnie koreluje z transkrypcyjnym wyciszeniem genów, takich jak transpozony, a tak e tych koduj cych sekwencje wyst puj ce w wielu kopiach [COSTELLO, PLASS 2001]. W eukariotycznych genomach wa n klas genów o sekwencjach powtórzeniowych stanowi transkrypty koduj ce rybosomalne RNA (rrna) poło one w regionie organizatora j derka - NOR (ang. nucleolus organizer regions) [WOO, RICHARDS 2008]. Geny koduj ce rrna s genami metabolizmu podstawowego. Poziom ich ekspresji jest rozmaity i zale y od tkanki. W tkankach realizuj cych cykl komórkowy, intensywnie syntetyzuj cych białka (np. merystemy, wczesne stadia rozwoju zarodka, bielma i li cienie w rozwijaj cych si nasionach), j derka s znacznych rozmiarów, kilkakrotnie wi ksze ni w tkankach stałych, charakteryzuj cych si niskim poziomem translacji. Nast pnie wykazano, e rozmiary j derek zale od aktywno ci transkrypcyjnej rrna, która z kolei jest skorelowana z metylacj w obszarze promotora i nietranskrybowanych sekwencjach mi dzygenowych. W czasie podziału komórki istnieje ogromne zapotrzebowanie na syntez rrna, kiedy to musi powsta kilka setek tysi cy nowych rybosomów [SARDANA i in. 1993]. Celem pracy było porównanie metylacji genów rrna w nieregeneruj cych i regeneruj cych tkankach kalusowych Triticum vulgare, uzyskanych zarówno z zarodków, jak i kwiatostanów. Materiał i metody Nasiona pszenicy ozimej odmiany Kamila otrzymano ze Stacji Oceny Odmian

12 24 G. D browska i inni w W grzcach. Siewki wernalizowano 9 tygodni, w sterylnych pojemnikach z perlitem w temperaturze 5 C, przy 8-godzinnym fotoperiodzie i nat eniu napromieniowania kwantowego 100 mol(quantum) m -2 s -1. Siewki przenoszono do wazonów z mieszanin gleby:torfu:piasku (3:2:1; v/v/v) i umieszczano w szklarni w temperaturze 20/17 C (dzie /noc) w 16 h fotoperiodzie i nat eniu napromieniowania kwantowego około 400 mol(quantum) m -2 s -1. Po około 4 tygodniach wzrostu fragmenty d beł cinano na wysoko ci pomi dzy pierwszym kolankiem a 4 cm powy ej kolanka. Fragmenty te zawierały młode kwiatostany o wielko ci około 1 cm. Ziarniaki z zarodkami zbierano po 60 dniach wegetacji, w fazie dojrzało ci mlecznej (14 dni po pojawieniu si pylników). Fragmenty ro lin sterylizowano 10 minut w 70% etanolu oraz 15 minut w 10% roztworze Domestosu, po czym czterokrotnie płukano steryln wod dejonizowan [MARCI SKA i in. 2001]. Eksplanty, tj. kwiatostany (10 mm) i zarodki (1,5 mm) izolowano z fragmentów ro lin w warunkach sterylnych i wykładano na po ywk stymuluj c indukcj kalusa, tj. MS o składzie wg MURASHIGE i SKOOG [1962]. Izolacja kwasów nukleinowych i przygotowanie sond molekularnych DNA genomowe przygotowano z tkanek kalusowych, uzyskanych z zarodków i kwiatostanów pszenicy przy u yciu metody opisanej przez DOYLE, DOYLE [1987]. Wyizolowane DNA genomowe poddano działaniu dwóm izoschizomerów - enzymów restrykcyjnych: MspI wra liwy na metylacj zewn trznej cytozyny w sekwencji CCGG; HpaII wra liwy na metylacj cytozyny w sekwencji CCGG oraz enzymu EcoRI. DNA plazmidowe zawieraj ce fragmenty genów 18S rrna grochu [JORGENSEN i in. 1987] i 25S rrna pszenicy [GERLACH, BEDBROOK 1979] wyizolowano metod lizy alkalicznej [SAMBROOK i in. 1989a]. Uzyskane DNA plazmidowe traktowano enzymami restrykcyjnymi EcoRI i HindIII w celu przygotowania sond molekularnych. Produkty trawienia rozdzielano w 1% elu agarozowym, a uzyskane DNA wstawek wyizolowano metod mro eniow [SAMBROOK i in. 1989b]. Hybrydyzacja Southern DNA genomowe trawione odpowiednio enzymami EcoRI, HpaII i MspI, rozdzielano elektroforetycznie w 0,8% elu agarozowym i przenoszono na membran nylonow siłami kapilarnymi skierowanymi w dół [KOETSIER i in. 1993] i hybrydyzowano z sondami molekularnymi koduj cymi 18S i 25S rrna (fot. 1 i 2). DNA sond molekularnych wyznakowano radioizotopowo metod random priming [FEINBERG, VOGELSTEIN 1983]. Membrany po hybrydyzacji umieszczano w kasecie z klisz rentgenowsk w celu wizualizacji wyników hybrydyzacji. Na podstawie krzywej kalibracyjnej wyznaczonej na papierze półlogarytmicznym dla poszczególnych fragmentów markera DNA /HindIII (Fermentas) okre lono długo hybrydyzuj cych fragmentów DNA genomowego. Wyniki i dyskusja Metylacja DNA mo e odgrywa istotn rol u ro lin i zwierz t, u ro lin specyficznie dotyczy transpozonów, a u zwierz t zarówno transpozonów, jak i eksonów

13 METYLACJA GENÓW rrna [RABINOWICZ i in. 2003]. Od kilkunastu lat naukowcy zajmuj cy si procesem embriogenezy, staraj si pozna mechanizmy tego procesu, ró nice pomi dzy komórkami embriogennymi i nieembriogennymi na poziomie molekularnym oraz markery, na podstawie których mo na b dzie okre li przebieg morfogenezy na wczesnych etapach [KOZŁOWSKA i in. 1994]. Embriogeneza somatyczna przez długi czas była uwa ana za drog rozwoju ro lin uzyskanych z kultur in vitro, która nie wywołuje zmienno ci w ród regenerantów. Jednak dzi po wielu badaniach istnieje szereg dowodów na to, e w somatycznych komórkach kultur in vitro, w których została zaindukowana embriogeneza, dochodzi do epigenetycznych zmian ekspresji genów [WRÓBLEWSKI 1994]. LO SCHIAVO i in. [1989] stwierdzili, e metylacja de novo oraz fala demetylacji DNA okre la specyficzny wzór metylacji podczas gametogenezy i embriogenezy u ro lin. Badania przeprowadzone przez PARAKASH i in. [2003] wykazały, e tworzeniu p dów bocznych z eksplantów li ci petunii towarzyszy metylacja specyficznych genów. Na ogół tkanki, w których dany gen ulega ekspresji, zawieraj mniej mc w porównaniu z tkankami, w których dany gen jest nieaktywny [PALMGREN i in. 1991]. W wyniku indukcji embriogenezy poziom 5-metylocytozyny in vitro w tkankach embriogennych marchwi gwałtownie obni ał si, aby w pó niejszych stadiach wzrosn. PEDRALI-NOY i in. [2003] wykryli u marchwi specyficzne inhibitory metylotransferaz DNA, których obecno, podobnie jak obecno 5-azaC, hamowała embriogenez komórek embriogennych. Inhibitory wykryto te u ry u i tytoniu, ale o mniejszej aktywno ci ni u marchwi. W przeciwie stwie do tych bada stwierdzono, e u marchwi zarówno dedyferencjacja komórek podczas tworzenia kalusa z wycinków hypokotyla, jak i powstawanie w zawiesinach komórkowych wysoce zorganizowanych struktur, jakimi s zarodki somatyczne, towarzyszy zwi kszenie poziomu metylacji DNA. Wydaje si zatem, e u marchwi brak jest bezpo redniego zwi zku mi dzy wiekiem i stadium ró nicowania tkanek a poziomem metylacji ich DNA [za OLSZEWSKA, SAKOWICZ 1991]. W naszych badaniach stosuj c dwa enzymy restrykcyjne, ró ni ce si wra liwo ci na metylacj cytozyny, podj li my prób okre lenia stopnia zmetylowania DNA oraz skorelowania potencjalnych ró nic metylacji sekwencji 18S rrna oraz 25S rrna z procesem regeneracji. Dla wszystkich analizowanych tkanek kalusowych zdolnych do regeneracji i nieulegaj cych regeneracji, uzyskanych z zarodków i kwiatostanów, w przypadku hybrydyzacji z DNA 18S rrna dla trawienia enzymem niewra liwym na metylacj EcoRI, stwierdzono hybrydyzacj fragmentów: 2300, 2000, 1200, 900 par zasad (pz). Natomiast przy trawieniu enzymem MspI stwierdzono hybrydyzacj do fragmentów: 1800, 1300, 700, 500 pz. Przeprowadzono tak e hybrydyzacj do DNA genomowego trawionego jednocze nie enzymami HpaII i EcoRI i podobnie jak przy trawieniu enzymem HpaII, uzyskano hybrydyzacj do fragmentu powy ej 5000 pz. Dla trawienia enzymami MspI i EcoRI otrzymano hybrydyzacj do fragmentów wielko ci: 1500, 1000, 900, 800, 500, 300 pz (dane niepokazane). Sonda molekularna 25S rrna we wszystkich badanych wariantach, dla trawienia enzymem HpaII hybrydyzowała do fragmentu wielko ci pz. Zaobserwowano hybrydyzacj do fragmentów: , 2300, 1200, 700, 500 pz w przypadku trawienia enzymem MspI. Dla DNA trawionego enzymami EcoRI i HpaII otrzymano hybrydyzacj do fragmentu o wielko ci pz. Natomiast w przypadku trawienia enzymami MspI i EcoRI stwierdzono hybrydyzacj do fragmentów: 4000, 1800, 1000, 800, 700, 500 i 200 pz (dane niepokazane).

14 26 G. D browska i inni Fot. 1. A. Zdj cie w wietle UV genomowego DNA pszenicy wybarwionego bromkiem etydyny, rozdzielonego w 1% elu agarozowym. M marker, DNA faga trawione HindIII; cie ki 1-12 DNA genomowe trawione: EcoRI ( cie ki 1-4), HpaII (5-8), MspI (9-12); DNA wyizolowano z: kalusa regeneruj cego otrzymanego z kwiatostanów ( cie ki 1, 5, 9), kalusa nieregeneruj cego otrzymanego z kwiatostanów ( cie ki 2, 6, 10), kalusa regeneruj cego otrzymanego z zarodków ( cie ki 3, 7, 11), kalusa nieregeneruj cego otrzymanego z zarodków ( cie ki 4, 8, 12). B. Autoradiogram hybrydyzacji z sond molekularn : 18S rrna Photo 1. A. UV-light photo of triticum genomic DNA in 1% agarose gel labeled with ethidium bromide. M marker digested with HindIII; lanes 1-12 genomic DNA digested with: 1-4 EcoRI, 5-8 HpaII, 9-12 MspI; DNA was isolated from: 1, 5, 9 regenerating callus originated from inflorescences; 2, 6, 10 non-regenerating callus originated from inflorescences; 3, 7, 11 regenerating callus originated from embryos; 4, 8, 12 non-regenerating callus originated from embryos. B. Autoradiograph from the hybridization with molecular probe of 18S rrna Wyniki trawienia enzymem EcoRI (fot. 1A i 2A, cie ki 1-4) wskazuj na to, e otrzymane DNA ulega restrykcji. Trawienie drugim z enzymów - MspI (fot. 1B i 2B, cie ki 9-12) uwidoczniło du ilo fragmentów restrykcyjnych, co wskazuje na du ilo sekwencji CCGG i/lub C m CGG w badanym DNA. Fragmentów restrykcyjnych było tak du o, e wyniki trawienia uwidaczniały si na elu w postaci smugi, która uniemo liwiała rozró nienie wielko ci fragmentów. DNA kalusa pszenicy było oporne na trawienie enzymem HpaII (fot. 1A, 1B i 2A, 2B, cie ki 5-8) i nie stwierdzono adnych ró nic pomi dzy badanymi wariantami poszczególnych tkanek.

15 METYLACJA GENÓW rrna Fot. 2. A. Zdj cie w wietle UV genomowego DNA pszenicy wybarwionego bromkiem etydyny, rozdzielonego w 1% elu agarozowym. M marker, DNA faga trawione HindIII; cie ki 1-12 DNA genomowe trawione: EcoRI ( cie ki 1-4), HpaII (5-8), MspI (9-12); DNA wyizolowano z: kalusa regeneruj cego otrzymanego z kwiatostanów ( cie ki 1, 5, 9), kalusa nieregeneruj cego otrzymanego z kwiatostanów ( cie ki 2, 6, 10), kalusa regeneruj cego otrzymanego z zarodków ( cie ki 3, 7, 11), kalusa nieregeneruj cego otrzymanego z zarodków ( cie ki 4, 8, 12). B. Autoradiogram hybrydyzacji z sond molekularn 25S rrna Photo 2. A. UV-light photo of triticum genomic DNA in 1% agarose gel labeled with ethidium bromide. M marker digested with HindIII; lanes 1-12 genomic DNA digested with: 1-4 EcoRI, 5-8 HpaII, 9-12 MspI; DNA was isolated from: 1, 5, 9 regenerating callus originated from inflorescences; 2, 6, 10 non-regenerating callus originated from inflorescences; 3, 7, 11 regenerating callus originated from embryos; 4, 8, 12 non-regenerating callus originated from embryos. B. Autoradiograph from the hybridization with molecular probe of 25S rrna Podobne wyniki jak w naszych badaniach uzyskali MORRISH i VASIL [1989] metod HPLC, stwierdzili oni porównywalny poziom metylacji kalusa embriogennego i nieembriogennego. Autorzy wnioskuj, e utrata kompetencji embriogennej nie jest powi zana ze znacznymi zmianami metylacji, cho nie wyklucza to zmian we wzorcu metylacji specyficznych genów. Natomiast TCHORBADJIEVA i PANTCHEV [2004] przy u yciu enzymów restrykcyjnych wykazali, e kalus embriogenny Dactylis glomerata L. ma wy szy poziom metylacji ni wyprowadzony z tego samego genotypu i w tych samych warunkach hodowlanych kalus nieembriogenny. Porównanie obrazów genomowego DNA wszystkich badanych wariantów trawionego HpaII i MspI wskazuje na wi ksz podatno DNA na działanie enzymu MspI. Poniewa enzymy HpaII i MspI ró ni si wra liwo ci na metylacj rodkowej cytozyny, to wyniki trawienia restrykcyjnego wiadcz o znacznym poziomie metylacji DNA uzyskanym z tkanek kalusa kwiatostanów i zarodków zarówno regeneruj cych, jak i nieregeneruj cych.

16 28 G. D browska i inni Wydaje si, e badania zmian metylacji cytozyn w obr bie sekwencji promotora, a nie samej sekwencji cdna genów rrna, mogłoby dostarczy istotnych danych umo liwiaj cych powi zanie ekspresji tych genów z poziomem zmetylowania ich sekwencji. Wnioski 1. Otrzymane wyniki bada metylacji sekwencji CCGG metod Southern w obr bie genów rrna tkanek kalusa otrzymanego z ró nych eksplantów pszenicy potwierdzaj dane literaturowe dotycz ce metylacji rrna innych ro lin. 2. Sekwencja rrna w tkankach kalusowych pszenicy jest metylowana. 3. Porównuj c tkanki kalusowe uzyskane z kwiatostanów i zarodków nie stwierdzono ró nic w poziomie metylacji genów rrna. Literatura ATTWOOD J.T., YUNG R.L., RICHARDSON B.C DNA methylation and the regulation of gene transcription. Cell Mol. Life Sci. 59: COSTELLO J.F., PLASS C Methylation matters. J. Med. Genet. 38: DOYLE J.J., DOYLE J.L Isolation of DNA from fresh plant tissue. Focus 12: FEINBERG A.P., VOGELSTEIN B A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity. Anal. Biochem. 132: FREITAG M., SELKER E.U Controlling DNA methylation: many roads to one modification. Curr. Opin. Genet. Dev. 15: 1-9. GERLACH W.L., BEDBROOK J.R Cloning and characterization of ribosomal RNA genes from wheat and barley. Nucl. Acids Res. 7: JORGENSEN R.A., CUELLAR R.E., THOMPSON W.F., KAVANAGH T.A Structure and variation in ribosomal RNA genes of pea. Plant Mol. Biol. 8: KOETSIER P.A., SCHORR J., DOERFLER W A rapid optimizer protocol for downward alkaline southern blotting of DNA. BioTechniques 15: KOZŁOWSKA W., RYBCZY SKI J.J Somatyczna embriogeneza u traw i zbó. Prace Ogrodu Botanicznego PAN 5/6: LO SCHIAVO F., PITTO L., GINLIANO G., TORTII G., NUTRI-RONCHI V., MARAZZITI D., VER- GARO R., ORSELLI S., TEZZI M DNA methylation of embryogenic carrot cell cultures and its variations as caused by mutation, differentiation, hormones and hypomethylating drugs. Theor. Appl. Genet. 77: MARCI SKA I., SZECHY SKA-HEBDA M., BIESAGA-KO CIELNIAK J., FILEK M Applicability of Polish winter wheat (Triticum aestivum L.) cultivars to long-term in vitro culture. Cereal Res. Comm. 29: MORRISH F.M., VASIL I.K DNA Methylation and embryogenic competence in leaves and callus of napiergrass (Pennisetum purpureum Schum.). Plant Physiol. 90: MURASHIGE T., SKOOG F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15:

17 METYLACJA GENÓW rrna OLSZEWSKA M., SAKOWICZ T Metylacja DNA u ro lin. Post. Biol. Kom. 4: PALMGREN G., MATTSON O., OKKELS F.T Specific levels of DNA methylation in various tissues, cell lines, and cell types of Daucus carota. Plant Physiol. 95: PEDRALI-NOY G., BERNACCHIA G., DO ROSARIO ALVELOS M., CELLA R Daucus carota cells contain specific DNA methyltransferase inhibitors that interfere with somatic embryogenesis. Plant Biol. 5: PRAKASH A.P., KUSH A., LAKSHMANAN P., KUMAR P.P Cytosine methylation occurs in a CDC48 homologue and a MADS-box gene during adventitious shoot induction in Petunia leaf explants. J. Exp. Bot. 54: RABINOWICZ P.D., PALMER L.E., MAY B.P., HEMANN M.T., LOWE S.W., MCCOMBIE W.R., MARTIENSSEN R.A Genes and transposons are differentially methylated in plants, but not in mammals. Genome Res. 13: SAMBROOK J., FRITSCH E.F., MANIATIS T. 1989a. Molecular cloning: a laboratory manual. Wydanie 2. Cold Springer Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York: SAMBROOK J., FRITSCH E.F., MANIATIS T. 1989b. Molecular cloning: a labolatory manual. Wydanie 2. Cold Springer Harbor Labolatory Press, Cold Spring Harbor, New York: SARDANA R., ODELL M., FLAVELL R Correlation between the size of the intergenic regulatory region, the status of cytosine methylation of rrna genes and nucleolar expression in wheat. Mol. Gen. Genet. 236: TCHORBADJIEVA M.I., PANTCHEV I.Y DNA methylation and somatic embryogenesis of orchardgrass (Dactylis glomerata L.). Bulg. J. Plant Physiol. 30: 1-3. WOO H.R., RICHARDS E.J Natural variation in DNA methylation in ribosomal RNA genes of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 8: 92. WRÓBLEWSKI T.A Process of somatic embryogenesis-detailed characteristics. Post. Biol. Kom. 4: Skróty: 5-mC 5-metylocytozyna HPLC wysokoci nieniowa chromatografia cieczowa; High Performance Liquid Chromatography Słowa kluczowe: Triticum vulgare, kultury in vitro, metylacja, rrna Streszczenie Poziom metylacji DNA u ro lin jest modyfikowany podczas rozwoju i ró nicowania. Przeprowadzone badania miały na celu zbadanie poziomu metylacji cytozyny w sekwencjach koduj cych rrna. Materiał do bada stanowiły tkanki kalusowe regeneruj ce i nieregeneruj ce otrzymane z niedojrzałych kwiatostanów oraz zarodków pszenicy. DNA genomowe trawiono enzymami HpaII i MspI, ró ni cymi si wra liwo ci na metylacj rozpoznawanej sekwencji CCGG. Zastosowano metod

18 30 G. D browska i inni hybrydyzacji Southern dla uwidocznienia fragmentów hybrydyzuj cych do sond molekularnych 18S rrna grochu oraz 25S rrna pszenicy. Wyniki hybrydyzacji potwierdzaj, e cytozyny w rrna w tkankach kalusowych regeneruj cych i niezdolnych do regeneracji otrzymane z niedojrzałych kwiatostanów oraz zarodków pszenicy s zmetylowane. Nie wykazano ró nic w poziomie metylacji pomi dzy poszczególnymi badanymi tkankami kalusowymi. METHYLATION OF rrna GENES IN CALLUS TISSUE OF WHEAT Gra yna D browska 1, Wioletta Zubek-Rzepli ska 2, Anna Goc 1, Magdalena Szechy ska-hebda 3, Maria Filek 3 1 Nicolas Copernicus University, Department of Genetics, Toru 2 Institute of Plant Breeding and Acclimatization, Research Division in Bydgoszcz 3 Institute of Plant Physiology, Polish Academy of Sciences, Kraków Key words: wheat, in vitro cultures, methylation, rrna Summary Methylation level of DNA changes during plant development and differentiation. This study was undertaken to determinate methylocytosine in the sequence encoding rrna. As an experimental system, the regenerating and non-regenerating callus originated from immature inflorescences and embryos was used. The genomic DNA was digested with HpaII and MspI, different in their sensitivity to methylation of the CCGG sequence. Southern hybridization was carried out with molecular probe of bean 18S rrna and triticum 25S rrna. Results confirmed that the cytosines in rrna of regenerating and non-regenerating callus originated from immature inflorescences and embryos are methylated. The differences in the methylation level of various tissues were not detected. Dr Gra yna D browska Zakład Genetyki Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej Uniwersytet Mikołaja Kopernika ul. Gagarina TORU browsk@uni.torun.pl

19 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: WPŁYW CYTOKININ I TDZ NA NAMNA ANIE LILIOWCA in vitro ORAZ NA ZAWARTO W GLOWODANÓW I CHLOROFILU W P DACH Eleonora Gabryszewska, El bieta W grzynowicz-lesiak, Ludwika Kawa- Miszczak, Justyna Góraj, Marian Saniewski Zakład Fizjologii i Morfogenezy Ro lin Ozdobnych, Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa im. Szczepana Pieni ka w Skierniewicach Wst p Liliowce jako ro liny ozdobne i u ytkowe były znane w Chinach przed tysi cem lat, gdzie spo ywano je jako warzywo oraz stosowano w lecznictwie. Pierwsze gatunki dzikie liliowca zostały sprowadzone do Europy najprawdopodobniej w XVI wieku [ZELTER 2001]. Dzi ki pracom hodowlanym, obok tradycyjnych kolorów kwiatów barwy ółtej i pomara czowej, pojawiły si odmiany o szerokiej gamie barw i interesuj cych kształtach. Gatunki liliowca rozmna a si poprzez nasiona, natomiast odmiany mo na rozmna a tylko wegetatywnie przez podział ro lin. Ta metoda mno enia jest mało wydajna dla odmian pochodz cych z najnowszej hodowli, gdzie współczynnik rozmna ania wynosi 1-2. W zwi zku z mał efektywno ci tradycyjnego mno enia od wielu lat prowadzone s prace nad rozmna aniem in vitro. W Stanach Zjednoczonych, gdzie liliowce ciesz si najwi ksz popularno ci, odmiany liliowca rozmna ane s in vitro na skal masow przy pomocy standardowej metody, której podstawy opracował MEYER [1976]. W Instytucie Sadownictwa i Kwiaciarstwa od kilku lat prowadzone s prace nad rozmna aniem liliowca in vitro [GABRYSZEWSKA i in. 1999; LEMA SKA, GABRYSZEWSKA 1999; 2000, 2002]. W metodzie opracowanej w ISK jako eksplantaty inicjalne stosowane s fragmenty p ków kwiatowych, co ma bardzo du e znaczenie w przypadku mno enia pojedynczych ro lin pochodz cych z hodowli [LEMA SKA i in. 2001]. Pobranie eksplantatu z p ka kwiatowego nie uszkadza ro liny i pozwala j zachowa w uprawie. Nie jest to mo liwe w przypadku izolowania p ków wegetatywnych. Zwi kszenie wydajno ci mno enia liliowca uzyskano przez zastosowanie mieszaniny cytokinin (BAP, 2iP, kinetyna) i tidiazuronu (TDZ) w po ywce do namna ania p dów. Podczas wzrostu i rozwoju ro lin in vitro wiele czynników wpływa na akumulacj i metabolizm endogennych w glowodanów. S to zarówno czynniki rodowiska, regulatory wzrostu, jak i faza rozwojowa ro liny lub eksplantatu. Wzrost poziomu sacharozy w po ywce powodował zwi kszenie ilo ci i wielko ci ziaren skrobi w chloroplastach u Rosa multiflora [CAPELLADES i in. 1991], sprzyjał akumulacji skrobi w cebulach Nerine [VISHNEVETSKY i in. 1997], zwi kszał zawarto endogennej sacharozy, glukozy i fruktozy w p dach Hosta tokudama [GOLLAGUNTA i in. 2004]. U kilku gatunków Dioscorea rozmna anych in vitro, wzrost st enia BAP i sacharozy w po ywce wpływał na akumulacj cukrów [CHU, FIGUEIREDO-RIBEIRO 2002]. Natomiast w p dach Hosta tokudama nie obserwowano wpływu BAP na zawarto endogennych

20 32 E. Gabryszewska i inni w glowodanów [GOLLAGUNTA i in. 2004]. Specyficzne warunki rodowiskowe (w glowodany, wiatło, poziom azotu) i hormonalne (cytokininy, TDZ, GA 3 ) wyst puj ce in vitro mog tak e powodowa zaburzenia rozwoju chloroplastów i wpływa na produkcj chlorofilu [BRINT 1974; LEE i in. 1985; GENKOV i in. 1997; TRETYN 1998; MARTIN i in. 2002; ZENKTELER, BORKOWSKA 2002; DE OLIVEIRA i in. 2008]. Celem prezentowanych bada było porównanie wpływu ró nych cytokinin i TDZ zastosowanych pojedynczo lub w mieszaninie na namna anie p dów liliowca oraz na zawarto w glowodanów i chlorofilu w mno onych p dach. Materiał i metody Materiał ro linny stanowiły p dy przybyszowe wybranego klonu hodowlanego Hemerocallis hybrida pochodz ce z rozmna ania in vitro. Eksplantaty umieszczano na po ywce podstawowej MURASHIGE i SKOOGA [1962] zawieraj cej sacharoz w st eniu 30 g dm -3. Badano wpływ benzyloaminopuryny (BAP), kinetyny (KIN), 2- izopentyloadeniny (2iP) w st eniach 2 i 4 mg dm -3 oraz tidiazuronu (TDZ) w st eniu 0,03 i 0,06 mg dm -3. Stosowano równie ł czne podanie wymienionych cytokinin (BAP+2iP+kinetyna po 2 lub 4 mg dm -3 ) i TDZ (0,03 lub 0,06 mg dm -3 ). Kontrol stanowiły eksplantaty rosn ce na po ywce bez regulatorów wzrostu. W ka dej kombinacji było po 5 powtórze, powtórzeniem był słoik z 5 eksplantatami. Kultury rosły w fitotronie w warunkach nast puj cego o wietlenia 16 h/8 h (dzie /noc), w temperaturze 20 C. Po 6 tygodniach wzrostu oceniono liczb i długo p dów przybyszowych, liczb li ci i wie mas p dów. Próbki do analizy w glowodanów pobierano z 4 powtórze (kultury p dów w fazie namno enia) rosn cych na po ywkach o okre lonym wy ej składzie. Próbki te po zamro eniu i liofilizacji przechowywano w zamra arce w temperaturze 20 C. Zawarto w glowodanów (skrobia, sacharoza, glukoza, fruktoza) oznaczano metodami enzymatycznymi przy u yciu zestawu testów: testu sacharoza/d-glukoza/d-fruktoza; testu do oznaczania skrobi (Boehringer Mannheim GmbH Biochemicals, Niemcy). Próbki do analizy zawarto ci chlorofilu pobierano z 5 powtórze (kultury p dów w fazie namno enia) rosn cych na po ywkach o okre lonym składzie. Analiz zawarto ci chlorofilu a i b prowadzono na wie ym materiale, bezpo rednio po zako czeniu fazy namna ania. Zawarto chlorofilu w p dach liliowca oznaczano spektrofotometrycznie wg metody BRUINSMA [1963]. Wyniki do wiadcze opracowano statystycznie metod analizy wariancji. Do oceny istotno ci ró nic pomi dzy rednimi zastosowano test t-duncana przy poziomie istotno ci 5%. Wyniki Spo ród wszystkich cytokinin, zastosowanych pojedynczo w ni szych st eniach (2 mg dm -3 ), BAP najsilniej stymulowała powstawanie p dów przybyszowych (4,6 p dów/eksplantat), w porównaniu z kontrol (1,7 p dów/eksplantat), (rys. 1A, fot. 1A). Najsłabsz regeneracj p dów obserwowano w obecno ci ni szego st enia kinetyny lub 2iP. Przy ł cznym podaniu wszystkich cytokinin w ni szych st eniach (2 mg dm -3 ) i TDZ (0,03 mg dm -3 ), liczba p dów była podobna, jak na po ywce z BAP. Cytokininy i TDZ zastosowane w wy szych st eniach, zarówno dodane do po ywki pojedynczo, jak i ł cznie stymulowały powstawanie p dów, ale wzrost wydłu eniowy tych p dów był

21 WPŁYW CYTOKININ I TDZ NA NAMNA ANIE LILIOWCA słabszy lub podobny jak u eksplantatów kontrolnych (rys. 1C, fot. 1A, B). Niezale nie od st enia, wszystkie cytokininy dodane do po ywki pojedynczo lub ł cznie zwi kszały liczb li ci w porównaniu z kontrol. Najwi cej li ci (27,3) powstawało w obecno ci BAP (4 mg dm -3 ) oraz mieszaniny cytokinin i TDZ, zastosowanych w ni szych st eniach (rys. 1B). Na po ywce zawieraj cej mieszanin cytokinin w ni szych st eniach oraz na po ywce z BAP (2 mg dm -3 ) lub z TDZ (0,03 mg dm -3 ) wie a masa p dów była wi ksza ni na po ywce kontrolnej lub zawieraj cej pozostałe cytokininy (rys. 1D). Najwi ksz wie mas miały p dy rosn ce na po ywce zawieraj cej mieszanin cytokinin i TDZ w ni szych z zastosowanych st e. Natomiast wzrost st enia cytokinin i TDZ w mieszaninie ograniczał przyrost wie ej masy p dów. Najsłabszym przyrostem wie ej masy charakteryzowały si p dy rosn ce w obecno ci kinetyny lub 2iP.

22 34 E. Gabryszewska i inni * wie a masa - rednia masa 5 eksplantatów z jednego powtórzenia; fresh weight average weight of 5 explants from one replicate Rys. 1. Wpływ cytokinin (BAP, kinetyny, 2iP) i TDZ, podanych odzielnie lub w mieszaninie, na powstawanie p dów przybyszowych (A), liczb li ci (B), wzrost wydłu eniowy (C) i wie mas p dów (D) Hemerocallis hybrida mno onego in vitro; rednie oznaczone tymi samymi literami nie ró ni si istotnie wg testu t-duncana przy poziomie istotno ci p=0,05 Fig. 1. The influence of cytokinins (BAP, kinetyny, 2iP) and TDZ, added separetly or in the mixture, on the adventitious shoot formation (A), number of leaves (B), elongation of shoot (C) and fresh weight of shoots (D) of Hemerocallis hybrida propagated in vitro; means followed by the same letters do not differ significantly at p=0.05 according to Duncan s t-test P dy liliowca mno one w obecno ci obydwu st e TDZ, BAP oraz na poywkach z mieszanin cytokinin charakteryzowały si wysok zawarto ci glukozy (rys. 2B). Ł czne zastosowanie cytokinin i TDZ (w wy szych st eniach) ograniczało akumulacj skrobi, natomiast kinetyna (4 mg dm -3 ) zwi kszała jej zawarto w porównaniu z kontrol i pozostałymi cytokininami (rys. 2A). Zastosowane cytokininy nie wpływały istotnie na zawarto fruktozy, której poziom był podobny we wszystkich kombinacjach (rys. 2B). Natomiast zawarto sacharozy była na bardzo niskim poziomie i wyst powała ona jedynie w p dach mno onych w obecno ci kinetyny i 2iP (rys. 2B).

23 WPŁYW CYTOKININ I TDZ NA NAMNA ANIE LILIOWCA Rys. 2. Zawarto skrobi (A) oraz glukozy, fruktozy i sacharozy (B) w p dach Hemerocallis hybrida mno onych na po ywce MS zawieraj cej ró ne cytokininy; rednie oznaczone tymi samymi literami nie ró ni si istotnie wg testu t-duncana przy poziomie istotno ci p=0,05 oddzielnie dla ka dego cukru Fig. 2. The level of starch (A) and glucose, fructose and sucrose (B) in Hemerocallis hybrida shoots propagated on the MS medium containing different cytokinins; means followed by the same letters do not differ significantly at p=0.05 according to Duncan s t-test separately for each sugar

24 36 E. Gabryszewska i inni

25 WPŁYW CYTOKININ I TDZ NA NAMNA ANIE LILIOWCA... 37

26 38 E. Gabryszewska i inni Rys. 3. Zawarto chlorofilu a, b i a+b w p dach Hemerocallis hybrida mno onych na po ywce MS zawieraj cej ró ne cytokininy; rednie oznaczone tymi samymi literami nie ró ni si istotnie wg testu t-duncana przy poziomie istotno ci p=0,05 oddzielnie dla ka dego chlorofilu Fig. 3. The content of chlorophyll a, b and a+b in Hemerocallis hybrida shoots propagated on the MS medium containing different cytokinins; means followed by the same letters do not differ significantly at p=0.05 according to Duncan s t-test separately for each chlorophyll W fazie mno enia liliowca analizowano równie wpływ cytokinin i TDZ na zawarto chlorofilu a i b oraz a+b w p dach (rys. 3). Najwi ksz zawarto ci chlorofilu a, b oraz a+b charakteryzowały si p dy mno one w obecno ci ni szego st enia BAP (2 mg dm -3 ). Natomiast wzrost st enia tej cytokininy w po ywce ograniczał poziom chlorofilów w p dach. Tak e TDZ, dodany do po ywki w st eniu 0,03 mg dm -3, wpływał korzystnie na zawarto chlorofilu a i a+b. Podczas ł cznego stosowania cytokinin i TDZ, poziom chlorofilów w p dach nie ró nił si w zale no ci od stosowanych st e tych regulatorów wzrostu. Najmniejsz zawarto ci chlorofilów charakteryzowały si p dy mno one na po ywkach o wy szym st eniu 2iP (4 mg dm -3 ). Dyskusja i wnioski Zastosowanie mieszaniny cytokinin i TDZ, szczególnie w ni szych st eniach, korzystnie wpływało na regeneracj p dów przybyszowych na eksplantatach liliowca. Podobne działanie obserwowano po dodaniu BAP w st eniu 2 mg dm -3 do po ywki. Tak e u piwonii obserwowano stymulacj namna ania p dów po zastosowaniu mieszaniny cytokinin i TDZ [GABRYSZEWSKA 1998]. Jednak u tego gatunku zarówno adna z cytokinin (BAP, kinetyna, 2iP), jak i TDZ, podane oddzielnie nie stymulowały namna ania. W kulturach liliowca, BAP oraz mieszanina cytokinin z TDZ, wykazywały wysok aktywno nie tylko w procesie powstawania p dów przybyszowych, ale tak e sprzyjały wyrastaniu li ci i przyrostowi wie ej masy p dów. Wpływały równie na zawarto w glowodanów i chlorofilów w p dach. Głównym w glowodanem w p dach liliowca była glukoza, a w najmniejszych

27 WPŁYW CYTOKININ I TDZ NA NAMNA ANIE LILIOWCA ilo ciach wyst powała sacharoza. Tidiazuron podany pojedynczo i ł cznie z mieszanin cytokinin stymulował akumulacj glukozy. Wysok zawarto ci glukozy charakteryzowały si tak e p dy mno one w obecno ci samej benzyloaminopuryny. Z drugiej strony, mieszanina cytokinin i TDZ (w wy szych st eniach) ograniczała gromadzenie skrobi w p dach. Pozytywne działanie BAP na akumulacj cukrów stwierdzono u kilku gatunków Dioscorea rozmna anych in vitro, gdzie wzrost st enia BAP i sacharozy w po ywce powodował zwi kszenie poziomu cukrów rozpuszczalnych i skrobi [CHU, FIGUEIREDO-RIBEIRO 2002]. Podobnie jak u liliowca, glukoza i fruktoza były głównymi cukrami obecnymi w li ciach tych ro lin, a sacharoza wyst powała tylko u jednego gatunku Dioscorea olfersiana. W fazie powstawania p dów przybyszowych liliowca obserwowano zale no pomi dzy intensywno ci regeneracji a wysokim poziomem glukozy w p dach. Przy czym nale y zaznaczy, e obydwa te procesy były indukowane przez TDZ, BAP lub mieszanin cytokinin i TDZ. Zale no pomi dzy wzrostem zawarto ci glukozy lub/i fruktozy a intensywnym wzrostem i rozwojem obserwowano u innych gatunków mno onych in vitro. W kulturach kalusa ry u obserwowano korelacj pomi dzy wysokim poziomem glukozy a du zdono ci regeneracji p dów [HUANG, LIU 2002]. Szybkiemu wzrostowi zarodków somatycznych wierka towarzyszyła akumulacja glukozy i fruktozy, a tak e wysoka aktywno kwa nej i zasadowej inwertazy [IRAQI, TREMBLAY 2001]. Zawarto chlorofilów w p dach liliowca zale ała od rodzaju i st enia stosowanych cytokinin i TDZ. Benzyloaminopuryna (2 mg dm -3 ) najsilniej stymulowała akumulacj chlorofilu a, b i a+b w namno onych p dach liliowca. Tak e oddzielne podanie TDZ lub kinetyny i mieszaniny cytokinin z TDZ korzystnie wpływało na poziom chlorofilów w p dach. Podobne oddziaływanie BAP i TDZ na poziom chlorofilów obserwowano u go dzika szklarniowego rozmna anego in vitro [GENKOV i in. 1997]. Bardzo niskie st enia TDZ - 0,004 i 0,04 M powodowały taki sam wzrost zawarto ci chlorofilu a i b, jak BAP w st eniu 0,4 M. Natomiast zastosowanie TDZ w wy szym st eniu (0,4 M), takim samym jak BAP, bardzo silnie ograniczało akumulacj chlorofilów w li ciach go dzika. Równie u liliowca p dy mno one w obecno ci ni szego st enia TDZ (0,03 mg dm -3 ) zawierały nieznacznie wi cej chlorofilu a, ni przy jego wy szym st eniu (0,06 mg dm -3 ). Inne działanie TDZ stwierdzono u gatunku Annona glabra rozmna anego in vitro, gdzie hamował on ró nicowanie chloroplastów i akumulacj chlorofilu a [DE OLIVEIRA i in. 2008]. Natomiast BAP i kinetyna stymulowały rozwój chloroplastów, a BAP sprzyjała akumulacji chlorofilu a. Nale y doda, e ro liny mno one in vitro w obecno ci BAP miały wi ksz such mas podczas fazy aklimatyzacji w szklarni. Omawiane wyniki bada wskazuj na aktywne działanie BAP, TDZ oraz mieszaniny cytokinin z TDZ w tworzeniu si p dów przybyszowych liliowca in vitro. Wysoka zdolno regeneracji p dów pod wpływem tych regulatorów wzrostu zwi zana jest z du zawarto ci glukozy i z akumulacj chlorofilów w p dach. Na podstawie tych wyników mo na sformułowa zalecenia praktyczne. Zarówno stosowanie mieszaniny cytokinin (BAP, 2iP, kinetyna - po 2 mg dm -3 ) z TDZ (0,03 mg dm -3 ), jak i samej BAP (2 mg dm -3 ) korzystnie wpływa na powstawanie i wzrost p dów przybyszowych w fazie namna ania. Literatura BRINT R.E An analysis of the effects of gibberellic acid on tomato leaf growth. J.

28 40 E. Gabryszewska i inni Exp. Bot. 25: BRUINSMA J The quantitative analysis of chlorophyll A and B in plant extracts. Photochemistry and Photobiology 2: CAPELLADES M., LEMEUR R., DEBERGH P Effects of sucrose on starch accumulation and rate of photosynthesis in Rosa cultured in vitro. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 25: CHU E.P., FIGUEIREDO-RIBEIRO R.C.L Growth and carbohydrate changes in shoot cultures of Dioscorea species as influenced by photoperiod, exogenous sucrose and cytokinin concentrations. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 70: DE OLIVEIRA L.M., PAIVA R., DE SANTANA J.R.F., ALVES E., NOGUEIRA R.C., PEREIRA F.D Effect of cytokinins on in vitro development of autotrophism and acclimatization of Annona glabra L. In Vitro Cell. Dev. Biol. - Plant 44(2): GABRYSZEWSKA E The influence of cytokinins, thidiazuron, paclobutrazol and red light on shoot proliferation of herbaceous peony cv. Jadwiga in vitro. Jour. Fruit Ornam. Plant Res. 3-4: GABRYSZEWSKA E., LEMA SKA U., WOJTANIA A Rozmna anie bylin in vitro. Mat. ogólnopol. konf. Post p w rozmna aniu ro lin ozdobnych. AR w Krakowie, IX 1999: GENKOV T., TSONEVA P., IVANOVA I Effect of cytokinins on photosynthetic pigments and chlorophyllase activity in in vitro cultures of axillary buds of Dianthus caryophyllus L. J. Plant Growth Regul. 16: GOLLAGUNTA V., ADELBERG J.W., RIECK J., RAJAPAKSE N Sucrose concentration in liquid media affects soluble carbohydrates, biomass and storage quality of micropropagated hosta. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 77: HUANG W.L., LIU L.F Carbohydrate metabolism in rice during callus induction and shoot regeneration induced by osmotic stress. Bot. Bull. Acad. Sin. 43: IRAQI D., TREMBLAY F.M Analysis of carbohydrate metabolism enzymes and cellular contents of sugars and proteins during spruce somatic embryogenesis suggests a regulatory role of exogenous sucrose in embryo development. J. Exp. Bot. 52: LEE N., WETZSTEIN H.Y., SOMMER H.E Effect of quantum flux density on photosynthesis and chloroplast ultrastructure in tissue-cultured plantlets and seedling of Liquidambar styraciflua L. towards improved acclimatization and field survival. Plant Physiol. 78: LEMA SKA U., GABRYSZEWSKA E Rozmna anie liliowca in vitro. Materiały z konferencji Rozmna anie ro lin in vitro. Skierniewice, 14 IV 1999, Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa: LEMA SKA U., GABRYSZEWSKA E Rozmna anie liliowca in vitro. Zesz. Nauk. ISK 7: LEMA SKA U., GABRYSZEWSKA E Wpływ ABA i fluridonu na wzrost i rozwój eksplantatów Hemerocallis hybrida in vitro. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 488: LEMA SKA U., GABRYSZEWSKA E., JASI SKI A Ocena zdolno ci regeneracyjnej eksplantatów kwiatostanu liliowca (Hemerocallis hybrida hort.). Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 473: MARTIN T., OSWALD O., GRAHAM I.A Arabidopsis seedling growth, storage lipid mobilization, and photosynthetic gene expression are regulated by carbon: nitrogen availability. Plant Physiol. 128: MEYER M.M Propagation of daylilies by tissue culture. HortScience 11(5):

29 WPŁYW CYTOKININ I TDZ NA NAMNA ANIE LILIOWCA MURASHIGE T., SKOOG F A revised medium for rapid growth and bioasssays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: TRETYN A Podstawy strukturalno-funkcjonalne komórki ro linnej, w: Podstawy fizjologii ro lin. Red. Kopcewicz J., Lewak S. PWN, Warszawa: VISHNEVETSKY J., ZAMSKI E., ZIV M Bulb growth and carbohydrate metabolism in Nerine sarniensis cultured in vitro. Acta Hort. 447: ZELTER E Encyklopedia ro lin ogrodowych od A do Z. Bertlsmann Media Sp. z o.o. wiat Ksi ki, Warszawa: ZENKTELER E., BORKOWSKA B The photosynthetic status of in vitro strawberry shoots. Acta Hort. 567: Słowa kluczowe: Hemerocallis hybrida, rozmna anie in vitro, cytokininy, TDZ, zawarto w glowodanów i chlorofilów Streszczenie Badano wpływ cytokinin (BAP, 2iP, kinetin 2 mg dm -3, 4 mg dm -3 ) i TDZ (0,03 g dm -3 ; 0,06 mg dm -3 ), zastosowanych oddzielnie lub w mieszaninie, na regeneracj p dów przybyszowych, zawarto w glowodanów i chlorofilów w p dach liliowca. BAP, TDZ i mieszanina cytokinin z TDZ aktywniej wpływały na powstawanie p dów i ich wzrost, w porównaniu z kinetyn i 2iP. Analiza zawarto ci w glowodanów wykazała, e glukoza wyst puje w p dach liliowca w najwi kszej ilo ci. Zawarto fruktozy i skrobi była znacznie ni sza ni glukozy, a sacharoza wyst powała w bardzo małych ilo ciach tylko w p dach mno onych w obecno ci kinetyny i 2iP. W fazie powstawania p dów przybyszowych liliowca obserwowano zale no pomi dzy intensywno ci regeneracji a wysokim poziomem glukozy w p dach. Najwi ksz zawarto chlorofilów stwierdzono w p dach rosn cych w obecno ci BAP w st eniu 2 mg dm -3. Tak e oddzielne podanie TDZ lub kinetyny, jak i mieszaniny cytokinin z TDZ korzystnie wpływało na poziom chlorofilów w p dach. THE INFLUENCE OF CYTOKININS AND TDZ ON THE MULTIPLICATION OF DAYLILY in vitro AND ON THE CONTENT OF CARBOHYDRATES AND CHLOROPHYLL IN THE SHOOTS Eleonora Gabryszewska, El bieta W grzynowicz-lesiak, Ludwika Kawa-Miszczak, Justyna Góraj, Marian Saniewski Department of Physiology and Morphogenesis of Ornamental Plants, Research Institute of Pomology and Floriculture, Skierniewice Key words: Hemerocallis hybrida, propagation in vitro, cytokinins, TDZ, contents of carbohydrate and chlorophyll Summary The influence of cytokinins (BAP, 2iP, kinetin 2 mg dm -3, 4 mg dm -3 ) and TDZ (0.03 mg dm -3, 0.06 mg dm -3 ), added alone or in the mixture, on the regeneration and

30 42 E. Gabryszewska i inni growth of adventitious shoots, and on the carbohydrate and chlorophyll contents in the daylily shoots was investigated. BAP, TDZ and the mixture of cytokinins with TDZ stimulated the shoot formation and growth of daylily more actively than other cytokinins (kinetin, 2iP). The analysis of carbohydrate content revelated that glucose was the main soluble carbohydrate in the shoots. The level of glucose increased in the media with BAP, TDZ and mixture of cytokinins with TDZ. The content of fructose and starch was significantly lower than glucose. Sucrose was found in a very little amount only in the shoots growing on the medium with kinetin or 2iP. A positive correlation between a high level of glucose and the regeneration ability of shoots was observed. The application of BAP (lower concentration), TDZ, kinetin or the mixture of cytokinins with TDZ increased the chlorophyll content in the regenerated daylily shoot. Dr Eleonora Gabryszewska Pracownia Kultur Tkankowych Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa im. Szczepana Pieni ul. Pomologiczna SKIERNIEWICE eleonora.gabryszewska@insad.pl ka

31 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: UZYSKIWANIE RO LIN POPRZEZ WYWOŁYWANIE WTÓRNEJ EMBRIOGENEZY U ZARODKÓW ANDROGENETYCZNYCH MARCHWI Krystyna Górecka, Dorota Krzy anowska, Waldemar Kiszczak, Urszula Kowalska, Ryszard Górecki Instytut Warzywnictwa im. Emila Chroboczka w Skierniewicach Wst p Przez zastosowanie kultur pylnikowych mo na znacznie skróci czas potrzebny do wyprowadzenia linii homozygotycznych niezb dnych do hodowli miesza ców F 1. Otrzymane w kulturach pylnikowych zarodki s cennym materiałem, ale konieczne jest zregenerowanie z nich ro lin [GÓRECKA 1998]. Po ywka jest bardzo wa nym czynnikiem wpływaj cym na proces regeneracji zarodków androgenetycznych. Zwykle stosuje si po ywki o tym samym składzie makro- i mikroelementów oraz witamin, czyli o tej samej bazie co po ywki indukcyjne, jednak o mniejszej zawarto ci sacharozy i innych regulatorach wzrostu [W DZONY i in. 2009]. Zbyt długie przetrzymywanie zarodków na po ywce indukcyjnej, o wysokiej zawarto ci sacharozy i nieodpowiednim poziomie hormonów mo e zakłóci proces regeneracji [MÖLLERS, IQBAL 2009]. Stosowane s ró ne po ywki regeneracyjne: B5 [GAMBORG i in. 1968] polecana jest dla ro lin z rodzaju Brassica [KELLER, ARMSTRONG 1977; GÓRECKA 1998], ale te dla marchwi [ANDERSEN 1990]. Po ywk MS [MURASHIGE, SKOOG 1962] stosowali CHIANG i in. [1985] do regeneracji zarodków kapusty głowiastej, a MATSUBARA i in. [1995] i TYUKAVIN i in. [1999] do regeneracji zarodków androgenetycznych marchwi. Proces regeneracji zarodków androgenetycznych marchwi był przedmiotem zainteresowania naszego zespołu. Został on szczegółowo opisany w publikacji GÓRECKA i in. [2009a]. Niniejsza praca zawiera wyniki do wiadcze b d cych kontynuacj poprzednich bada. Celem ich było zbadanie wpływu genotypu i składu po ywki na efektywno regeneracji zarodków uzyskanych w kulturach pylnikowych marchwi. Materiał i metody Materiał do zało enia do wiadczenia stanowiły zarodki uzyskane w kulturach pylnikowych 4 odmian marchwi: HCM, Splendid F 1 ', Norbonne F 1 ', Feria F 1 '. Kultury pylnikowe prowadzono według metodyki opisanej w pracach GÓRECKIEJ i in. [2005a, b, 2009b]. Stosowano zmodyfikowan po ywk B5 [GAMBORG i in. 1968] zawieraj c 0,1 mg dm -3 2,4-D; 0,1 mg dm -3 NAA; L-glutamin w ilo ci 500 mg dm -3 ; L-seryn 100 mg dm -3 i sacharoz 100 g dm -3. Zarodki uzyskane w kulturach pylnikowych, około 2 tygodni po ich pojawieniu si przenoszono do probówek z po ywkami regeneracyjnymi (po 1 zarodku do probówki). Powtórzeniem była

32 44 K. Górecka i inni probówka. Liczba zarodków uzyskanych z kultur pylnikowych ka dej z badanych odmian marchwi była inna, st d ró ne liczby powtórze. W tabelach prezentowane s rednie. Skład po ywek był nast puj cy: 1) B5-1 [GAMBORG i in. 1968] bez hormonów, z dodatkiem 20 g dm -3 sacharozy, stosowana przez ANDERSENA i in. [1990], 2) MS-1 [MURASHIGE, SKOOG 1962] z dodatkiem 20 g dm -3 sacharozy i 0,5 g dm -3 w gla aktywnego, bez hormonów (stosowana przez KELLERA I ARMSTRONGA [1977] do regeneracji zarodków androgenetycznych kapusty głowiastej i brukselskiej), 3) MS-2 z dodatkiem 20 g dm -3 sacharozy, bez hormonów, stosowana przez TYUKAVINA i in. [1999] do regeneracji zarodków androgenetycznych marchwi. Zawarto sacharozy w po ywkach regeneracyjnych wzgl dem po ywki do indukcji androgenezy została pi ciokrotnie obni ona. Probówki z zarodkami umieszczano w pokoju wzrostowym, w temperaturze +20 C, przy 16 h fotoperiodzie o nat eniu napromieniowania 30 mol m -2 s -1. Wpływ po ywki badano na odmianie Feria F 1 '. Obserwowano po 5 probówek w ka dej kombinacji. Po 12 tygodniach przeprowadzono 1 pasa, a po 4 tygodniach nast pny. Podczas ka dego pasa u wykonywano obserwacje kultur, licz c otrzymane regeneraty i dziel c je na ró ne kategorie: grudki kalusa, zawi zki rozet, nieukorzenione rozety, kompletne ro liny typu siewka, ro liny zniekształcone (o zgrubiałych, zdeformowanych li ciach i łodygach), ro liny kalusuj ce. Wpływ odmiany na regeneracj zarodków androgenetycznych marchwi badano na po ywce B5-1. W celu uproszczenia i przyspieszenia procesu adaptacji ro lin androgenetycznych podj to prób wyjmowania ze szkła i wysadzania do podło y małych ro lin typu,,siewka otrzymanych przez konwersj zarodków w ci gu 12 tygodni kultury na po ywkach regeneracyjnych. Zastosowano 2 podło a: wełna mineralna hydrofilowa i hydrofobowa 1:10 (Fil:Fob 1:10) oraz podło e torf z piaskiem 1:1. Wysadzono po około 100 ro lin w ka dym podło u. Pojemniki z wysadzonymi ro linami umieszczono w pokoju wzrostowym w temperaturze +20 C przy fotoperiodzie 16 h. Dla utrzymania wysokiej wilgotno ci pojemniki z wysadzonymi ro linami przykrywano foli. Po upływie 1 miesi ca liczono ro liny, które prze yły i pojemniki przenoszono do tuneliku foliowego w szklarni. Wyniki i dyskusja Na po ywkach regeneracyjnych bez hormonów, z obni on zawarto ci sacharozy w pierwszych 4 tygodniach kultury obserwowano powstawanie wtórnych zarodków, które po upływie 8 tygodni zaczynały poprzez konwersj przekształca si w zawi zki rozet i przede wszystkim malutkie kompletne ro linki typu siewka (fot. 1). Po 12 tygodniach wi kszo kompletnych ro lin stanowiły ro liny typu siewka, a ich cz nadziemna była długo ci około 1,5 cm. TYUKAVIN i in. [1999] obserwowali powstawanie wtórnych zarodków z zarodków androgenetycznych marchwi, które jeszcze nie wydostały si z pylnika, a tak e podczas regeneracji na powstaj cych ro linach. U rzepaku tylko nieliczne androgenetyczne zarodki regeneruj bezpo rednio w ro liny, wi kszo tworzy wtórne zarodki na li cieniach i hipokotylu, z których regeneruj p dy [MÖLLERS, IQBAL 2009]. Badaj c wpływ ró nych po ywek na regeneracj zarodków odmiany Feria F 1 ' w ci gu 12 tygodni uzyskano tylko kompletne ro liny i to w bardzo podobnej ilo ci na ka dej z po ywek. Natomiast w drugim pasa u po 16 tygodniach od zało enia kultur na po ywce MS-2 uzyskano dwukrotnie mniej kompletnych ro lin, ni na po ywkach MS-1 i B5-1. W tym pasa u pojawiły si na po ywkach o bazie MS ro liny zniekształcone, nieukorzenione rozety oraz ro liny z kalusem. Z prezentowanych wyników mo na wyci gn wniosek, e najkorzystniejsz

33 UZYSKIWANIE RO LIN POPRZEZ WYWOŁYWANIE WTÓRNEJ EMBRIOGENEZY po ywk regeneracyjn do otrzymywania ro lin z zarodków androgenetycznych marchwi była po ywka B-1 niezawieraj ca hormonów (tab. 1). Ta sama po ywka była z powodzeniem stosowana do regeneracji ro lin z androgenetycznych zarodków papryki [KIM i in. 2008]. Jednak w przypadku regeneracji z zarodków androgenetycznych innych gatunków ro lin konieczne s dodatkowe składniki w po ywce. THIAN i in. [2004] uwa aj, e wyniki regeneracji androgenetycznych ro lin rzepaku mo na poprawi zwi kszaj c zawarto wapnia i witamin w po ywce regeneracyjnej. GIL-HUMANES i BARRO [2009] stwierdzili, e regeneracja ro lin z zarodków androgenetycznych z rodzaju Brassica była najefektywniejsza na po ywce B5 zawieraj cej kwas giberelinowy (GA 3 ). Do regeneracji p dów z androgenetycznych kalusów pomidora stosowano po ywk MS z zeatyn, a nast pnie do ukorzeniania 1/2 MS z obni on zawarto ci sacharozy [SEGUÍ- SIMARRO, NUEZ 2007]. Fot. 1. Photo 1. Ro liny marchwi typu siewka Carrot plants of seedling type

34 46 K. Górecka i inni Regeneracja z zarodków androgenetycznych marchwi na po ywce B5-1 przebiegała zale nie od genotypu. W przypadku ka dej odmiany obserwowano powstawanie ró nych struktur. Z zarodków odmiany Feria F 1 ' po 12 tygodniach uzyskano tylko kompletne ro liny. Rozety nieukorzenione obserwowano tylko w ród regenerantów odmiany Norbonne F 1 ', a formowanie grud kalusa u odmian Norbonne F 1 ' i Splendid

35 UZYSKIWANIE RO LIN POPRZEZ WYWOŁYWANIE WTÓRNEJ EMBRIOGENEZY F 1 '. Zawi zki rozet powstawały po 16 tygodniach tylko z zarodków androgenetycznych odmiany HCM (tab. 2). Du o wi ksze ró nice genotypowe wyst powały w regeneracji ro lin z zarodków androgenetycznych ziemniaka [ROKKA 2009] oraz pomidora [SEGUÍ-SIMARRO, NUEZ 2007], tylko z nielicznych genotypów udało si tym badaczom zregenerowa ro liny androgenetyczne. Obserwacje ro lin wysadzonych do podło y wykazały, e po 30 dniach yło 80% ro lin w podło u z wełny mineralnej i mniej ni 40% ro lin w podło u torfu z piaskiem w stosunku 1:1 (tab. 3). Ro liny w podło u Fil:Fob 1:10 nie rosły i nie rozwijały si, a w podło u torf z piaskiem 1:1 rozpocz ły wzrost i rozwój. Jednak e po przeniesieniu do szklarni ro liny zamarły. Była to pierwsza próba takiego przeprowadzania adaptacji ro lin androgenetycznych marchwi. Fakt, e prze yły one miesi c w pomieszczeniu wzrostowym, pozwala mie nadziej na powodzenie tego sposobu adaptacji. Wymagaj dopracowania szczegóły techniczne zwi zane z adaptacj ro lin do warunków szklarniowych, np. przedłu enie wzrostu w komorze fitotronowej czy wysadzanie ro lin bardziej rozwini tych. Wnioski 1. Zastosowanie po ywek regeneracyjnych bez hormonów, z obni on zawarto ci sacharozy pobudza zarodki do wtórnej embriogenezy. 2. Najkorzystniejsz po ywk regeneracyjn do otrzymywania ro lin z zarodków androgenetycznych marchwi w do wiadczeniu jest po ywka B-1 niezawieraj ca hormonów. 3. Regeneracja zarodków androgenetycznych marchwi na po ywce B5-1 przebiegała zale nie od odmiany. Literatura ANDERSEN S.B., CHRISTIANSEN I., FARESTVEIT B Carrot (Daucus carota L.): In vitro production of haploids and field trials, w: Biotechnology in agriculture and forestry. Vol. 12. Bajaj Y.P.S. (red.). Springer-Verlag Berlin Heidelberg: CHIANG M.S., FRECHETTE S., KUO C.G., CHONG C., DELAFIELD S.J Embryogenesis and haploid plant production from anther culture of cabbage (Brassica oleracea var. capitata L.). Can. J. Plant Sci. 65: GAMBORG O.L., MILLER R.A., OJIMA O Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cell. Exp. Cell Res. 50: GIL-HUMANES J., BARRO F Production of doubled haploids in Brassica, w: Advances in haploid production in higher plants. Touraev A., Forster B.P., Mochan Jain S. (red.). Springer Science + Business Media B.V.: GÓRECKA K Uzyskiwanie linii homozygotycznych kapusty głowiastej (Brassica oleracea L. var. capitata L.) przy pomocy kultur pylnikowych. Praca habilitacyjna nr 14, Instytut Warzywnictwa w Skierniewicach: 71 ss. GÓRECKA K., KRZY ANOWSKA D., GÓRECKI R. 2005a. The influence of several factors on the efficiency of androgenesis in carrot. J. Appl. Genet. 46(3): GÓRECKA K., KRZY ANOWSKA D., KISZCZAK W., GÓRECKI R. 2005b. Embryo induction in anther culture of Daucus carota L. Veg. Crops Res. Bul. 63: GÓRECKA K., KRZY ANOWSKA D., KISZCZAK W., KOWALSKA U. 2009a. Plant regeneration from carrot (Daucus carota L.) anther culture derrived embryos. A. Physiol. Plant. (w

36 48 K. Górecka i inni druku), (DOI: /s ). GÓRECKA K., KRZY ANOWSKA D., KISZCZAK W., KOWALSKA U., GÓRECKI R. 2009b. Carrot doubled haploids, w: Advances in haploid production in higher plants. Touraev A., Forster B.P., Mochan Jain S. (red.). Springer Science + Business Media B.V.: KELLER W.A., ARMSTRONG K.C Embryogenesis and plant regeneration in Brassica napus anther cultures. Can. J. Bot. 55: KIM M., JANG I.C., KIM J.A., PARK E.J., YOON M., LEE Y Embryogenesis and plant regeneration of hot pepper (Capsicum annuum L.) through isolated microspore culture. Plant Cell Rep. 27: MATSUBARA S., DOHYA N., MURAKAMI K., NISHIO T., DORE C Callus formation and regeneration of adventitious embryos from carrot, fennel and mitsuba microspores by anther and isolated microspore cultures. Acta Hort. 392: MÖLLERS C., IQBAL M.C.M Double haploids in breeding winter oilseed rape, w: Advances in haploid production in higher plants. Touraev A., Forster B.P., Mochan Jain S. (red.). Springer Science + Business Media B.V.: MURASHIGE T., SKOOG F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: ROKKA V.M Potato haploids and breeding, w: Advances in haploid production in higher plants. Touraev A., Forster B.P., Mochan Jain S. (red.). Springer Science + Business Media B.V.: SEGUÍ-SIMARRO J.M., NUEZ F Embryogenesis induction, callogenesis, and plant regeneration by in vitro culture of tomato isolated microspores and whole anthers. J. of Eksp. Bot.: THIAN H., YAO C.Y., SUN M.X High frequency conversion of microspore-derived embryos of Brassica napus cv. Topas by supplemental calcium and vitamins. Plant Cell, Tiss. and Org. Cult. 76: TYUKAVIN G.B., SHMYKOVA N.A., MANKHOVA M.A Cytological study of embryogenesis in cultured carrot anthers. Russ. J. of Plant Phys. 46(6): W DZONY M., FORSTER B.P., UR I., GOLEMIEC E., SZECHY SKA-HEBDA E., DUBAS E., GOŁ BIOWSKA G Progress in doubled haploid technology in higher plants, w: Advances in haploid production in higher plants. Touraev A., Forster B.P., Mochan Jain S. (red.). Springer Science + Business Media B.V.: Słowa kluczowe: kultury pylnikowe, marchew, odmiana, po ywka, regeneranty, wtórna embriogeneza Streszczenie Okre lono wpływ odmiany oraz po ywki na regeneracj ro lin z zarodków androgenetycznych marchwi. Badania prowadzono na zarodkach odmian HCM, Splendid F 1 ', Norbonne F 1 ', Feria F 1 '. Zbadano 3 po ywki: MS-1 z 0,5 g dm -3 w gla aktywnego i MS-2 oraz B5-1 bez hormonów zawieraj ce 20 g dm -3 sacharozy ka da. Cz uzyskanych po 12 tygodniach kultury, ro lin typu siewka wysadzano w podło y z wełny mineralnej oraz torfu i piasku (1:1) i umieszczono w pokoju fitotronowym. Po upływie 1 miesi ca liczono ro liny, które prze yły i przeniesiono do szklarni. Na po ywkach bez hormonów wyst piła wtórna embriogeneza. Pojedyncze

37 UZYSKIWANIE RO LIN POPRZEZ WYWOŁYWANIE WTÓRNEJ EMBRIOGENEZY zarodki androgenetyczne wytwarzały grudy zarodków wtórnych, które nast pnie przekształcały si w ro liny. Stosowana po ywka miała wpływ na proces regeneracji ro lin z zarodków androgenetycznych marchwi. W pierwszym pasa u uzyskano na wszystkich po ywkach tylko kompletne ro liny. W drugim pasa u pojawiły si na po ywkach o bazie MS ro liny zniekształcone, nieukorzenione rozety oraz ro liny z kalusem. Regeneracja zarodków androgenetycznych marchwi na po ywce B5-1 przebiegała zaleznie od odmiany. Z zarodków odmiany Feria F 1 ' otrzymano tylko kompletne ro liny, a z innych odmian równie rozety bez korzeni i grudy kalusa. Po 30 dniach od wysadzenia w podło u z wełny mineralnej prze yło 80% wysadzonych ro lin, a w podło u torf:piasek 1:1 około 40%. Ro liny w podło u z wełny mineralnej nie rosły, a w torfowo piaskowym podj ły wzrost. Ze wzgl du na to, e po przeniesieniu do szklarni ro liny zamierały, metoda wyprowadzania regenerantów ze szkła wymaga dopracowania CARROT PLANT REGENERATION WITH THE HELP OF ADVENTITIOUS EMBRYOGENESIS OF ANDROGENETIC EMBRYOS Krystyna Górecka, Dorota Krzy anowska, Waldemar Kiszczak, Urszula Kowalska, Ryszard Górecki Research Instytut of Vegetable Crops, Skierniewice Key words: anther cultures, carrot, cultivar, medium, regenerants, secondary embryos Summary The aim of presented research was the determination of cultivar and medium influence on plant regeneration from androgenetic embryos. The embryos obtained from anther cultures of four carrot cultivars ( HCM, Splendid F 1 ', Norbonne F 1 ', Feria F 1 ') comprised the material for the experiments. In conducted experiments three media were used: B5-B5-1 without hormones, MS-1 with 0.5 g dm -3 of active charcoal and MS-2 without hormones each of them contained 20 g dm -3 of sucrose. A part of seedling type plants obtained after 12 weeks of culture was planted in containers with mineral substrat or with peat and sand (1:1) placed in the growth room. After 1 month the survived plants were counted and containers were transfered into the greenhouse. Secondary embryogenesis phenomenon occured on the media without hormones. Androgenetic embryos produced clumps of secondary embryos which turned into complete plants after 12 weeks. The used media influenced the androgenetic carrot embryos regeneration. In the first passage only complete plants were obtained. In the second passage on media with MS base deformed plants, rosettes without roots and plants with callus appeared. Plant regeneration on B5-1 medium depended on the carrot cultivar. From androgenetic embryos of the cultivar Feria F 1 ' only complete plants were obtained, however, the rosettes without roots and callus clumps developed from embryos of other cultivars. After 30 days in mineral wool 80% plants were alive and in peat:sand about 40%. The plants in mineral wool did not grow, in peat:sand startet to grow. After transfering containers with plants into the greenhouse all plants died.

38 50 K. Górecka i inni Prof. dr hab. Krystyna Górecka Instytut Warzywnictwa im. Emila Chroboczka ul. Konstytucji 3 Maja 1/ SKIERNIEWICE kgoreck@inwarz.skierniewice.pl

39 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: EFFECTS OF PLANT EXTRACTS OF KNOWN ANTICANCER ACTIVITY ON THE TOTAL ANTIOXIDANT STATUS Agnieszka Gre Department of Biochemistry and Animal Physiology, Institute of Biology, Pedagogical University, Cracow Introduction In order to maintain internal homeostasis the cell has to keep an equilibrium between production and consumption of reactive oxygen species (ROS). However, under the stress conditions the level of ROS may increase drastically which can lead to significant injuries of cell structures known as the oxidative stress [BANDYOPADHYAY et al. 1999; BARTOSZ 2008]. This stress could be a factor stimulating the development of cancer cells [KENNEDY et al. 1995]. Many studies showed that anti-cancer drugs of natural origin decrease the production of COX-2 enzyme which takes part in the inflammation processes. The search for drugs of anti-oxidative properties concentrates on the isolation of new substances of plant origin or utilizes natural products already used in medicine [TSUDA et al. 2000]. Vinblastine, vincristine, paclitaxel and iscador belong to drugs most often applied in cancer chemotherapy. Vinblastine and vincristine are indole alkaloids of cytostatic action, found in myrtles (Vinca minor). Those alkaloids bind to the intercellular protein tubulin, which prevents spindle formation vital for the division of the cell (mitosis is stopped at the metaphase stage) [ASAI et al. 2000]. Paclitaxel, a terpene alkaloid, belonging to the group of taxoids, isolated from the bark of yew (Taxus brevifolia), belongs to phase-specific drugs (phase G2 and phase M). Its anti-mitotic action involves the inhibition of depolymerization of microtubules which prevents the separation of sister chromatides and their movement during cell division. Adverse effects on the mitosis process lead to the apoptosis of cancer cells [BLUM et al. 2001]. Among several biologically active substances in iscador (obtained from Viscum album) viscumins and viscotoxins seem to be of a major therapeutic importance. Viscumins belonging to lectins (ML-1, ML-2, ML-3) are glycoproteins of cytotoxic properties (they inhibit the transcription or translation), while viscotoxins (viscalbins), (Wa2, Wa3, Wb1) are peptides containing a carbohydrate part and a naphthyl ring [MENGS et al. 2002]. The aim of the presented experiments was to study the influence of plant extracts on the total antioxidant status of the organism which may constitute a natural barrier protecting the organism against cancer development. Material and methods Experiments were carried out on male mice of Swiss, of the average weight of g, kept under constant light conditions and fed standard diet with free access to water. Animals were divided into four groups: the control and three treated groups. The control mice received 100 l of physiological salts. The first treated group was administered 5 mg kg -1 of vincristine, the second - 5 mg kg -1 of paclitaxel, and the third

40 52 A. Gre - 10 mg kg -1 of iscador Qu. All injections (physiological salts, iscador Qu, vincristine and taxol) were made peritoneally. After 3, 6 and 24 hours since the injections the animals were anaesthetized and decapitated. Then, blood samples were collected from the neck artery. The total antioxidant status (TAS) was estimated in the serum with RANDOX Laboratories Ltd apparatus according to the instructions of the producer. In the TAS estimation method the antioxidants in the serum decrease the production of radicals in the reaction of ABTS (2,2-azino-bis-[3-ethylobenzthiazoline-6-sulphonic acid) with metmyoglobin and hydrogen peroxide (H 2 O 2 ). Statistical analysis was carried out with the Statistica program. Results During the experiments a statistically significant increase in TAS after the administration of iscador was observed in all treated groups in comparison with the control. Contrary, after the injection of vincristine and taxol a statistically significant decrease in TAS was found in comparison with the control. The biggest changes in the total antioxidant status were noticed after 6 hours since the injection of iscador, vincristine and taxol. Table 1; Tabela1 Total antioxidant status (TAS) in the serum after 3, 6 and 24 hours since the administration of iscador Qu, vincristine and taxol Całkowity status antyoksydacyjny (TAS) w surowicy krwi po 3, 6 i 24 godzinach od podania iscadoru Qu, winkrystyny i taksolu Group Grupa Control group - physiological salt; Grupa kontrolna - sól fizjologiczna I treated group - 3 hours after injection; I grupa do wiadczalna - 3 godziny od iniekcji II treated group - 6 hours after injection; II grupa do wiadczalna - 6 godzin od iniekcji III treated group - 24 hours after injection; III grupa do wiadczalna - 24 godziny od iniekcji average concentration of TAS; rednie st enie TAS (mmol dm -3 ) Iscador Qu Vincristine; Winkrystyna Taxol; Taksol % of changes % zmian average concentration of TAS; rednie st enie TAS (mmol dm -3 ) % of changes % zmian average concentration of TAS; rednie st enie TAS (mmol dm -3 ) % of changes % zmian 0.51 ± ± ± * ± ** ± * ± * ± * ± * ± * ± n.s. ± * ± Statistically significant at *p 0.001; **p 0.01; Statystycznie istotne przy *p 0,001; **p 0,01 n.s. differences not significant; ró nice nieistotne In the control group of animals the concentration of TAS was the lowest and amounted to 0.51 mmol dm -3. The highest statistically significant increase in TAS 63% - was observed after 6 hours since the administration of iscador Qu (0.83 mmol dm -3 ), (Table 1). However, after the injection of vincristine and taxol a decrease

41 EFFECTS OF PLANT EXTRACTS OF KNOWN ANTICANCER in the total antioxidant status was found in comparison with the control values. More specifically, after 6 hours since the injection of vincristine the decrease in TAS was the highest and amounted to 63%, after 3 hours 33% and after 24 hours since the treatment to 23% (Table 1). The injection of taxol caused the highest decrease in TAS 20% - also after 6 hours, and 12% after 3 hours in comparison with the control (Table 1). Discussion The presence of free radicals is necessary for many biological reactions. Under homeostasis conditions the intermediate oxygen species and other compounds of free radical nature are quickly neutralised and do not have adverse effects on the cell. The organism is equipped with many mechanisms, enzymatic and non-enzymatic, which block free radicals. Enzymatic systems such as catalase CAT, glutathione peroxidase GSH-Px, and the enzyme destroying hydroxyl radicals superoxide dysmutase SOD, are responsible for the destruction of hydrogen peroxide in the cell. The cell defense system is, additionally, supported by a low-molecular weight of non-enzymatic antioxidant compounds such as alfa-tocopherol, ascorbinian, reduced glutathione, betacarotene, retinol, selen, ubiquinones and flavonoids [BARTOSZ 2008]. Oxidative stress plays an important role in the pathogenesis of many diseases including cancer. Studies concerning the oxidoreductive properties of iscador revealed its strong antioxidant properties. It was shown that the substance neutralises reactive oxygen species in the cell are, among others, superoxide anion radical, hydroxyl radical, and nitrogen oxide. Iscador stimulates an increase in the level of intercellular antioxidant system. Cancer cells possess many mechanisms preventing apoptosis such as the superexpression of pro-life and antiapoptosis compounds or a decrease or lack of proapoptosis molecules. It is known now that in the cell there are, except from apoptosis, other ways of the transmission of a signal initiating the cell death. Multiple functions of iscador increase the chance that among its targets there will be one not blocked as a result of cancer transformation or acquired resistance. The chemopreventive properties of iscador are due to the inhibition of the transcription factor NF- B which participates in the expression of genes involved in the inflammation process. NF- B is often called an activator of the stress response in the cell because it regulates the expression of more than 150 genes involved in the survival, proliferation and response to stress conditions [SHISHODIA, AGGARWAL 2002]. A non-physiological, prolonged inflammation state could be, according to some researchers, the onset of cancer transformation. It was shown that NF- B regulates the expression of proteins involved in cancer transformation such as c- myc, interleukins: IL-1, IL-1, IL-6 i IL-8, IL-18, cycline D1, matrix metalloproteinase-2/9, epidermal growth factor receptor (EGFR), the mentioned above growth factor VEGF, cyclooxygenase-2 (COX-2) and proteins Bcl-2 and Bcl-xL [AGGARWAL et al. 2006]. Additionally, it was found that in many types of cancer cells, NF- B is constitutively active which can support its role in the development of cancer diseases [GORTER et al. 2003]. A number of commonly administered chemotherapeutic drugs such as taxol, doxorubicine, daunorubicine, etoposide, vincristine, vinblastine, cisplatin, AZT, camptothecine, and also therapeutic doses of gamma radiation, induce the expression of NF- B. Thus, compounds whose main role is to induce the death of cancer cells can, at the same time, activate the anti-apoptosis pathways with the participation of NF- B, which can lead to the induction of resistance to the applied therapy. If compounds of

42 54 A. Gre plant origin inhibit the activity of NF- B, and at the same time, the expression of genes regulated by this factor, it is possible to propose coupled therapy which would include, except from classic therapeutic drugs and radiotherapy, also chemopreventive compounds. Thus the application of iscador may sensitive cancer cells to cytostatics and enhance their action. In practice, it would lead to the decrease in the dose of chemotherapeutic drugs and at the same time diminish side effects of the therapy and probability of the oxidative stress induction. On the other hand, cancer therapy with vincristine or taxol induces the whole organism oxidative stress which interferes with the effectiveness of the treatment. This tendency was confirmed by the presented studies during which a decrease in the total antioxidant status was observed after 3, 6 and 24 hours since the injection of vincristine and taxol. Active oxygen species, lipid radicals, final products of lipid peroxidation [CONKLIN 2004] and active nitrogen forms [WEINSTEIN et al. 2000; ALDIERI et al. 2002] are mediators of the oxidative stress. Characteristic features of those mediators include proapoptosis action directed not only towards cancer cells but also towards normal cells. Most probably this lack of selectivity of the above mentioned substances is responsible for their toxicity and generation of reactive oxygen species. Conclusions 1. The application of iscador plant extract of anticancer activity resulted in the increase of the total antioxidant status (TAS) in the serum after 3, 6 and 28 hours since the injection. It can probably be explained by the high content of flavonoids in the extract. 2. Vincristine and taxol are drugs which activate the oxidative stress in the cell. During the experiments a decrease in the TAS concentration in all treated groups in comparison with the control was observed. References AGGARWAL B.B., SHISHODIA S., SANDUR S.K., PANDEY M.K., SETHI G Inflammation and cancer: how hot is the link? Biochem. Pharmacol. 72: ALDIERI E., BERGANDI L., RIGANTI C., COSTAMAGNA C., BOSIA A., GHIGO D Doxorubicin induces an increase of nitric oxide synthesis in rat cardiac cells that is inhibited by iron supplementation. Toxicol. Appl. Pharmacol. 185: ASAI M., MINAMI S., KOMUTA K., KIDO T Improvement in quality of life with vinorelbine as a single agent in two patients with recurrent lung cancer. Gan To Kagaku Ryoho 27: BANDYOPADHYAY U., DAS D., BANERJEE R.K Reactive oxygen species: oxidative damage and pathogenesis. Current Sci. 77: BARTOSZ G Druga twarz tlenu. PWN, Warszawa: 447 ss. BLUM W., AICHHOLZ R., RAMSTEIN P., KUHNOL J., BRUGGEN J., O REILLY T., FLORSHEIMER A In vivo metabolism of epothilone B in tumor-bearing nude mice: identification of three new epothilone B metabolites by capillary high-pressure liquid chromatography/mass spectrometry/tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass. Spectrom. 15:

43 EFFECTS OF PLANT EXTRACTS OF KNOWN ANTICANCER CONKLIN K.A Chemotherapy-associated oxidative stress: Impact on chemotherapeutic effectiveness. Integr. Cancer Ther. 3: GORTER R.W., JOLLER P., STOSS M Cytokine release of a keratinocyte model after incubation with two different Viscum album L. extracts. Am. J. Ther. 10: KENNEDY R.S., KONOK G.P., BOUNOUS G., BARUCHEL S., LEE T.D The use of a whey protein concentrate in the treatment of patients with metastatic carcinoma: a phase I-II clinical study. Anticancer Res. 15: MENGS U., GOETHEL D., LENG-PESCHLOW E Mistletoe extracts standardized to mistletoe lectins in oncology: review on status of preclinical research. Anticancer Res. 22: SHISHODIA S., AGGARWAL B.B Nuclear factorkappab activation: a question of life or death. J. Biochem. Mol. Biol. 35: TSUDA T., HORIO F., OSAWA T The role of anthocyanins as an antioxidant under oxidative stress in rats. BioFactors 13: WEINSTEIN D.M., MIHM M.J., BAUER J.A Cardiac peroxynitrite formation and left ventricular dysfunction following doxorubicin treatment in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 294: Key words: iscador, vincristine, taxol, antioxidant status Summary The formation of free radicals in stress reactions is one of the factors basic for many diseases including cancer. An important role in preparation and treatment of those diseases is attributed to components of antioxidative character which can be found in preparations of plant origin. Those compounds are not synthetized in human organism. Their administration in a diet is important for stimulating protective reactions of the organism against free radicals. Thus investigations were inaugurated aiming at analyzing the effect of plant origin preparations of antineoplastic character on the total antioxidative status of the organism. The effect of the following preparations was analyzed: iscador (water solution from mistletoe - Viscum album), taxol (preparation found in the type of Taxus - yew, e.g. in Taxus brevifolia, Taxus baccata), vinblastine and vincristine (from myrtles Vinca - Vinca minor, Vinca pubescens, Vinca erecta, Vinca herbacea, Vinca rosea = Catharanthus roseus). The obtained results showed that iscador caused a statistically significant increase in the total antioxidant status after 3, 6 and 24 hours after injection. However the greatest antioxidant effect has been associated with flavonoids. Flavonoids are most commonly known for their antioxidant activity. WPŁYW RO LINNYCH PREPARATÓW O ANTYNOWOTWOROWYM DZIAŁANIU NA CAŁKOWITY STATUS ANTYOKSYDACYJNY Agnieszka Gre Zakład Biochemii i Fizjologii Zwierz t, Instytut Biologii, Uniwersytet Pedagogiczny w Krakowie Słowa kluczowe: iscador, winkrystyna, taksol, status antyoksydacyjny Streszczenie

44 56 A. Gre Wytwarzanie wolnych rodników w reakcjach stresowych jest jednym z czynników le cych u podstaw wielu chorób w tym chorób nowotworowych. Znacz c rol w zapobieganiu oraz leczeniu tych chorób, przypisuje si składnikom o wła ciwo ciach antyoksydacyjnych, zawartym w preparatach pochodzenia ro linnego. Zwi zki te nie s syntetyzowane w organizmie ludzkim. Dostarczanie ich w diecie ma istotne znaczenie w stymulacji reakcji obronnych organizmu skierowanych przeciw wolnym rodnikom. St d podj to badania maj ce na celu prze ledzenie wpływu ro linnych preparatów o antynowotworowym działaniu na całkowity status antyoksydacyjny organizmu. Analizowano wpływ iscadoru (wodnego roztworu z jemioły pospolitej - Viscum album), taksolu (preparat wyst puje w rodzaju Taxus cis, np. w Taxus brevifolia, Taxus baccata), winblastyny i winkrystyny (wyst puje w barwinkach Vinca - Vinca minor, Vinca pubescens, Vinca erecta, Vinca herbacea, Vinca rosea = Catharanthus roseus) na całkowity status antyoksydacyjny, który wybrano jako metod słu c okre leniu przeciwutleniaj cych własno ci leków. W wyniku przeprowadzonych bada stwierdzono statystycznie istotny wzrost całkowitego statusu antyoksydacyjnego po 3, 6 i 24 godzinach od iniekcji iscadoru. Zastosowany test całkowitego statusu antyoksydacyjnego mo e stanowi dogodn metod pozwalaj c na przeprowadzenie bada porównawczych ró nych preparatów ro linnych o własno ciach antyutleniaj cych. Dr Agnieszka Gre Zakład Biochemii i Fizjologii Zwierz t Uniwersytet Pedagogiczny ul. Podbrzezie KRAKÓW agren@ap.krakow.pl

45 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: MIKROROZMNA ANIE Silene vulgaris Ewa Hanus-Fajerska, Alina Czura Katedra Botaniki, Wydział Ogrodniczy, Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołł taja w Krakowie Wst p Lepnica rozd ta Silene vulgaris (MOENCH) GARCKE z rodziny go dzikowatych (Caryophyllaceae JUSS.) jest ro lin pospolicie wyst puj c w Europie. Jednak ekotypy tego gatunku, porastaj ce gleby galmanowe, które w wyniku zmian mikroewolucyjnych wykształciły mechanizmy tolerancji na metale ci kie, nale do metalofitów fakultatywnych. Ro liny wykazuj ce odporno na zanieczyszczenia tego typu znajduj zastosowanie jako wa ny model w badaniach dotycz cych molekularnych mechanizmów tolerancji oraz sekwestracji pierwiastków metalicznych w obr bie tkanek i komórek. Z tego wzgl du stanowi bardzo cenny obiekt badawczy, wykorzystywany tak e w warunkach kultur in vitro. W sferze zainteresowa, pomi dzy licznymi gatunkami metalofitów, znajduj si tak e gatunki z rodzaju Silene [WIERZBICKA, PANUFNIK 1998; WIERZBICKA, ROSTA SKI 2002; DAL CORSO i in. 2005; JACK i in. 2005; ARNETOLI i in. 2008]. Na podstawie do wiadcze przeprowadzonych na powierzchni półki zbiornika odpadów poflotacyjnych składowanych po procesie flotacji rud cynku i ołowiu CIARKOWSKA i HANUS-FAJERSKA [2008] stwierdziły, e olkuski ekotyp lepnicy rozd tej jest przydatny zarówno do fitostabilizacji, jak i w celu bioremediacji tego typu podło y bezglebowych. Zatem aby umo liwi podwy szenie współczynnika rozmna ania, zaplanowano skorzystanie z mo liwo ci, jakie stwarzaj techniki mikropropagacji, rutynowo stosowane w procesie szybkiego mno enia warto ciowych odmian i miesza ców ro lin ogrodniczych. Celem przeprowadzonych eksperymentów była ocena zdolno ci morfogenetycznej kultur p dowych na po ywkach o zró nicowanym składzie. Materiał i metody Badaniom poddano kultury uzyskane z osobników populacji Silene vulgaris (MOENCH) GARCKE pochodz cych z murawy galmanowej wytworzonej na ponad stuletniej hałdzie zlokalizowanej w Bolesławiu (woj. małopolskie). Nasiona sterylizowano w 0,1% roztworze chlorku rt ci i wykładano na po ywk MS [MURASHIGE, SKOOG 1962] z dodatkiem 20 g dm -3 sacharozy i 8 g dm -3 agaru (Sigma Chemical Co., St Louis, MO). Eksplantaty pierwotne do uzyskania kultur p dowych stanowiły sterylne siewki. Na po ywk wykładano wierzchołkowe cz ci p dów wraz z li mi młodocianymi. Po ywk na tym etapie prowadzenia kultur sporz dzono w czterech kombinacjach (tab. 1).

46 58 E. Hanus-Fajerska, A. Czura

47 MIKROROZMNA ANIE Silene vulgaris 59 Po ywki zestalano 0,8% agarem. Kultur prowadzono w stałej temperaturze 24 C ±2, przy 16 h fotoperiodzie. Jako ródło wiatła stosowano monochromatyczne lampy o białej barwie wiatła. Nat enie promieniowania na poziomie kultury ro lin wynosiło 50 mol m -2 s -1. Ocena procesu mikrorozmna ania obejmowała obserwacje makroskopowe oraz dokumentacj fotograficzn. W trakcie ka dego pasa u przeprowadzonego co 4 tygodnie liczono p dy uzyskane z jednego eksplantatu i na tej podstawie ustalano warto współczynnika namna ania, przy czym zwracano szczególn uwag na obecno p dów szklistych. Do wiadczenia były wykonywane dwukrotnie, ka dorazowo w czterech powtórzeniach. Powtórzenie stanowiło sze eksplantatów wyło onych na 20 ml po ywki o ph=5,8. Do oceny statystycznej zastosowano jednoczynnikow analiz wariancji z wykorzystaniem testu F, przy prawdopodobie stwie p=0,05. Obliczenia wykonano przy pomocy programu STATISTICA 8.0. Wyniki U yte w do wiadczeniu próbki nasion Silene vulgaris pozyskane na glebach galmanowych z łatwo ci kiełkowały w warunkach aseptycznych. Po wyło eniu na po ywk proliferacyjn wszystkie eksplantaty podj ły wzrost, przy czym, jak to zobrazowano w tabeli 2, około 100% testowanej populacji formowało p dy. Fot. 1. Proliferuj ca kultura Silene vulgaris na po ywce Sl - zmodyfikowanej po ywce MS z dodatkiem 0,1 mg dm -3 IBA, 0,25 mg dm -3 BA i 30 g dm -3 sacharozy, w momencie zało enia i po 4 tygodniach Photo 1. Culture of Silene vulgaris proliferating on Sl medium - modified MS supplemented with 0.1 mg dm -3 IBA, 0.25 mg dm -3 BA and 30 g dm -3 sucrose, during the initiation and after 4 weeks Wszystkie zastosowane kombinacje po ywek okazały si odpowiednie na

48 60 E. Hanus-Fajerska, A. Czura pierwszym etapie kultury p dowej, co objawiało si bardzo zbli onym współczynnikiem namna ania obliczanym po 28 dniach kultury i wynosz cym w granicach od 8,09 do 9,38 (tab. 2). Jednak po przeniesieniu wszystkich uzyskanych p dów na po ywk o tym samym składzie nast piło wyra ne zró nicowanie zdolno ci morfogenetycznej kultur na poszczególnych po ywkach. Po ywka Sl, która zawierała obni on o połow zawarto cz ci składników mineralnych MS, lecz została wzbogacona o hydrolizat kazeiny, kwas askorbinowy i kwas cytrynowy, nie okazała si trafnie dobrana. W tej kombinacji uzyskano relatywnie nisk liczb p dów, w porównaniu do innych warunków do wiadczenia: 1215 versus (tab. 2). Nale y jednak doda, e wszystkie 1215 p dów było bardzo dobrej jako ci. Na tej po ywce nie obserwowano adnych oznak szklisto ci (fot. 1). Tabela 2; Table 2 Efekt mikropropagacji kultur p dowych Silene vulgaris przez okres dwóch miesi cy The effect of Silene vulgaris micropropagation during two month period Po ywka Medium Zawarto sacharozy Sucrose level (g dm -3 ) Rodzaj i zawarto PGR; PGR type and level (mg dm -3 ) Współczynnik namna ania po 28 dniach Micropropagation coefficient after 28 days Współczynnik namna ania po 56 dniach Micropropagation coefficient after 56 days Procent regeneruj cych eksplantatów Percentage of regenerating explants Liczba uzyskanych p dów The number of obtained shoots Le 30 0,1 NAA 0,5 BA 8,09 ±0,57 a* 11,58 ±0,41 c Le ,1 NAA 0,5 BA 9,38 ±0,65 a 10,26 ±066 bc 99, Sl 30 0,1 IBA 0,25 BA 9,08 ±1,36 a 5,58 ±2,53 a 98, Sp 15 0,1 IBA 0,5 BA 8,54 ±0,94 a 7,81 ±0,54 ab 99, * dla n=48 podano warto ci rednie i ± odchylenie standardowe; warto ci oznaczone t sam liter nie ró ni si istotnie, <0,05; for n=48 mean values and ± standard deviation are given; values indicated with the same letter are not significantly different, <0.05 Najwi ksz liczb p dów gotowych do ukorzeniania po przej ciu okresu elongacji uzyskano na po ywce MS z dodatkiem 0,1 mg dm -3 NAA, 0,5 mg dm -3 BA i 30 g dm -3 sacharozy (po ywka Le). Przedłu enie kultury do sze ciu miesi cy na po ywce o tym samym składzie, lecz z obni on o połow zawarto ci sacharozy, nie powodowało wyst pienia oznak starzenia w kulturach p dowych. Z tego wzgl du, je eli planowana jest długoterminowa kultura, zaleca si, aby zawarto sacharozy w po ywce proliferacyjnej wynosiła ok. 15 g dm -3. Na podstawie przeprowadzonych do wiadcze stwierdzono, e dla mikropropagacji Silene vulgaris zalecane jest zastosowanie pełnego zestawu soli, witamin i elaza wg MURASHIGE i SKOOGA [1962] ju po pierwszym miesi cu kultury. Dyskusja W ostatnich latach nast pił wzrost zainteresowania naturalnymi populacjami

49 MIKROROZMNA ANIE Silene vulgaris 61 ro lin, wykazuj cymi przystosowania do wzrostu na podło ach ska onych metalami ci kimi, tak e ze wzgl du na mo liwo ich zastosowania w technikach fitoremediacji. Wykorzystanie lokalnych gatunków czy podgatunków metalofitów do remediacji ska onych terenów jest równie korzystne ze wzgl du na brak konieczno ci wprowadzania do tego celu nowych, obcych dla ekosystemu, gatunków ro lin i równocze nie zachowanie puli genowej form galmanowych [WIERZBICKA, PANUFNIK 1998; ALVAREZ i in. 2003; PRASAD 2004; ARNETOLI i in. 2008]. W 2005 roku opublikowano protokół regeneracji po redniej ekotypu S. vulgaris pochodz cego z Plombeire w Belgii [JACK i in. 2005]. W celu indukcji p dów autorzy stosuj c po ywk MS z dodatkiem 0,5 mg dm -3 BA, 0,05 mg dm -3 NAA oraz 30 g dm -3 sacharozy po czterech tygodniach kultury uzyskali współczynnik namna ania w zakresie od 5,9 do 8,6. Wyniki eksperymentów przeprowadzonych na polskim materiale roslinnym s bardzo zbli one do tych warto ci. Nieco wy sze warto ci (8,09-9,38) mo na przypisa z jednej strony wy szemu poziomowi kwasu naftylooctowego u ytego w naszych do wiadczeniach, z drugiej za strony manifestowaniem si reakcji genotypowej wła ciwej zastosowanemu ekotypowi [GRODZI SKA i in. 2000; WIERZBICKA, ROSTA SKI 2002]. W przeprowadzonych badaniach znaczenie morfogenetyczne mo e by przypisane st eniu sacharozy w po ywce proliferacyjnej. Nie tylko rodzaj, ale i st enie cukrowców aplikowanych w po ywce mo e wywiera wpływ na procesy regeneracyjne kultur [BOGUNIA, PRZYWARA 1999]. Sacharoza, najcz ciej u ywana jako ródło w gla i energii, jest odpowiednim dla licznych gatunków substratem wykorzystywanym w całym szeregu szlaków metabolicznych, przy czym jej cz mo e by przez tkanki ro linne gromadzona, głównie na terenie apoplastu [BORKOWSKA, SZCZERBA 1991; ELKBIACH i in. 2002] i z tego wzgl du w celu jednoznacznej oceny efektu zastosowanych st e sacharozy konieczne b d dalsze badania. Oprócz bada mechanizmów molekularnych zwi zanych z cech tolerancji pierwiastków metalicznych czy mechanizmów ich detoksyfikacji, kultury S. vulgaris mog by równie wykorzystane w badaniach szlaków metabolicznych zwi zanych z biosyntez polisacharydów tworz cych zr b podło a ciany komórkowej, b d w celu badania koncentracji fitochelatyn w zró nicowanych populacjach [CLEMENS 2001; BARANOWSKA-MOREK 2003; GUNTER, OVODOV 2005; KANDZIORA i in. 2007]. Stanowi to istotn motywacj, aby kontynuowa prace eksperymentalne dotycz ce kultur in vitro tego gatunku. Wnioski 1. W celu inicjacji kultur p dowych z siewek Silene vulgaris mo na stosowa stosunkowo ubogie po ywki. 2. Po upływie miesi ca hodowli nale y stosowa pełny zestaw soli mineralnych, witamin i elaza z po ywki MS. 3. Długoterminowa kultura p dowa wymaga obni enia poziomu sacharozy w po ywce, aby nie dopu ci do efektu starzenia si kultur. Literatura ALVAREZ E., FERNANDEZ-MARCOS M.L., VAAMONDE C., FERNANDEZ-SANJURIO M.J Heavy metals in the dump of an abandoned mine in Galicia (NW Spain) and in the spontaneously occurring vegetation. Sci. Tot. Env. 313: ARNETOLI M., VOOIJS R., BOOKUM TEN W., GALARDI F., GONNELLI C., GABBRIELLI R., SCHAT

50 62 E. Hanus-Fajerska, A. Czura H., VERKLEIJ J.A.C Arsenate tolerance in Silene paradoxa does not rely on phytochelatin-dependent sequestration. Environ. Poll. 152: BARANOWSKA-MOREK A Ro linne mechanizmy tolerancji na toksyczne działanie metali ci kich. Kosmos Prob. Nauk Biol. 52/2: BOGUNIA H., PRZYWARA L Rola cukrowców w ro linnych kulturach in vitro. Wiad. Bot. 43/1: BORKOWSKA B., SZCZERBA J Influence of different carbon sources on invertase activity and growth of sourcherry (Prunus cerasus L.) shoot cultures. J. Exp. Bot. 42/7: CIARKOWSKA K., HANUS-FAJERSKA E Remediation of soil-free grounds contaminated by zinc, lead and cadmium with the use of metallophytes. Polish J. Environ. Stud. 17/5: CLEMENS S Molecular mechanisms of plant metal tolerance and homeostasis. Planta 212: DAL CORSO G., BORGATO L., FURINI A In vitro plant regeneration of the heavy metal tolerant and hyperacumulator Arabidopsis halleri (Brassicaceae). Plant Cell, Tiss. Organ Cult. 82: ELKBIACH M.L., LAMARTI A., ABDALI A., BADOC A Culture in vitro des bourgeons axillaires de ch ne - liege (Quercus suber L.). Bull. Soc. Pharm. Bourdeaux 141: GRODZI SKA K., KORZENIAK U., SZAREK-ŁUKASZEWSKA G., GODZIK B Colonization of zinc mine spoil in southern Poland - preliminary studies on vegetation, seed rain and seed bank. Fragm. Flor. Geobot. 45(1-2): GUNTER E.A, OVODOV Y.S Effect of calcium, phosphate and nitrogen on cell growth and biosynthesis of cell wall polysaccharides by Silene vulgaris cell culture. J. Biotechnol. 117/4: JACK E., ATANASOVA S., VERKLEIJ J.A Callus induction and plant regeneration in the metallophyte Silene vulgaris (Caryophyllaceae). Plant Cell, Tiss. Organ Cult. 80: KANDZIORA M., HEFLIK M., NADGÓRSKA-SOCHA A., CIEPAŁ R Synteza zwi zków bogatych w grupy - SH jako odpowied na podwy szone st enie metali ci kich u ro lin Silene vulgaris (Caryophyllaceae). Ochr. rod. Zas. Nat. 33: MURASHIGE T., SKOOG F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 15: PRASAD M.N.V Phytoremediation of metals in the environment for sustainable development. Proc. Indian Natn. Sci. Acad. 70/1: WIERZBICKA M., PANUFNIK D The adaptation of Silene vulgaris to growth on a calamine waste heap (S. Poland). Environ. Poll. 101: WIERZBICKA M., ROSTA SKI A Microevolutionary changes in ecotypes of calamine waste heap vegetation near Olkusz. A review. Acta Biol. Crac. Series Bot. 44: Słowa kluczowe: auksyny, cytokininy, sacharoza, regeneracja in vitro, metalofity Streszczenie W celu przyspieszenia reprodukcji osobników populacji Silene vulgaris pochodz cych z murawy galmanowej zlokalizowanej w Bolesławiu koło Olkusza oraz wywołania intensywnego wzrostu wegetatywnego uzyskanych ro lin, przeprowadzono do wiadczenie w warunkach in vitro. Na po ywce namno eniowej umieszczano siewki

51 MIKROROZMNA ANIE Silene vulgaris 63 uzyskane w warunkach sterylnych. Eksplantaty p dowe wykładano na zmodyfikowane po ywki MS, zró nicowane pod wzgl dem rodzaju i st enia cytokinin oraz auksyn, a tak e zawieraj ce ro ne st enia sacharozy. Po czterech tygodniach współczynnik mikrorozmna ania kultur wynosił 8,09-9,38, w zale no ci od składu po ywki. W celu inicjacji kultur p dowych mo na stosowa stosunkowo ubogie po ywki, jednak po upływie miesi ca nale y stosowa pełny zestaw soli mineralnych, witamin i elaza wg Murashige i Skooga. Długoterminowa kultura p dowa wymaga obni enia poziomu sacharozy aplikowanej w po ywce, aby nie dopu ci do efektu starzenia si organów. MICROPROPAGATION OF Silene vulgaris Ewa Hanus-Fajerska, Alina Czura Botany Department, Faculty of Horticulture, Agricultural University, Kraków Key words: auxins, cytokinins, sucrose, regeneration in vitro, metallophytes Summary In order to accelerate the reproduction system of Silene vulgaris specimens, originating from calamine flora in Bolesław near Olkusz, as well as to induce an intensive vegetative growth of plants, the experiment was undertaken using in vitro cultures. Seedlings obtained in aseptic conditions were isolated on the propagation media. Shoot explants were cultured on the MS medium, modified with regard to different type and level of cytokinins and auxins, as well as to various level of sucrose. After four weeks of culture the micropropagation coefficient ranged from , depending on the medium. An initiation of Silene shoot cultures is successful on relatively plain media, however, after a month of cultivation a complete set of MS minerals, vitamins and iron should be applied. Long-term shoot culture requires the reduction of sucrose level in the medium, in order to prevent aging of cultured organs. Dr in. Ewa Hanus-Fajerska Katedra Botaniki Wydział Ogrodniczy Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołł taja al. 29 Listopada KRAKÓW ehanus@ogr.ar.krakow.pl

52

53 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: SELECTION in vitro AND ACCUMULATION OF SELENIUM IN CELL LINES OF Trapeolum majus L. AND Arabis caucasica L. WITH ENHANCED TOLERANCE TO SELENATE 1 Edyta Kaczkowska, Marzena Wielanek, Maria Skłodowska Department of Plant Physiology and Biochemistry, University of Lodz, Łód Introduction Selenium is both an essential trace element and potential toxicant to human and animals. Low doses of Se were implicated in cancer prevention in mammals [RAYMAN 2002]. There is no unequivocal evidence that higher plants require Se and usually they have a low tolerance of it. The Se toxicity is thought, due to its chemical similarity to sulfur, to lead to its incorporation into Se amino acids and then proteins and other S compounds, whose functions are not equivalent to those of S analogues [HOPPER, PARKER 1999; SORS et al. 2005; ZHANG et al. 2006]. Both Se deficiency and toxicity occur worldwide, depending on the Se soil content. Plants can be used both as a dietary source of anti-carcinogenic organic selenocompounds and for phytoremediation of Secontaminated soils. Certain plants, the so-called secondary accumulators, normally produce a high concentration of S containing metabolites and after Se nutrition are able to incorporate even hundreds g Se g -1 of tissue in the form of nonproteinogenic and nontoxic organic selenocompounds [BA UELOS et al. 2005; LEDUC et al. 2006]. Selection of cell lines that differ substantially in Se tolerance and accumulation may be useful in physiological and molecular studies to give an insight into mechanisms underlying plant Se metabolism in order to manipulate Se content in plants [ZHANG et al. 2006]. We have already obtained suspension and transformed root cultures of Tropaeolum majus L. (Tropaeolaceae) and Arabis caucasica L. (Brassicaceae) capable of producing phenylalanine-derived glucotropaeolin (benzyl glucosinolate) and methionine-derived glucoiberverin (3-(methylthio)propyl glucosinolate), (Fig. 1). We also reported the ability of T. majus and A. caucasica hairy roots to accumulate high amounts of selenium both in biomass and in glucosinolate fractions [WIELANEK et al. 2008]. 1 This work was supported by the University of Łód Grant No. 506/819.

54 66 E. Kaczkowska, M. Wielanek, M. Skłodowska R S Glucose C N - OSO 3 Glucosinolate Glucotropaeolin Glucoiberverin R CH 2 CH 3 S (CH 2 ) 3 R C S N Isothiocyanate Fig. 1. Rys. 1. General structure of glucosinolate molecule and glucotropaeolin and glucoiberverin produced by T. majus and A. caucasica, respectively Wzór ogólny cz steczki glukozynolanów oraz glukotropeoliny i glukoiberweryny produkowanych odpowiednio przez T. majus i A. caucasica The aim of this work was to select cell lines of A. caucasica and T. majus with enhanced tolerance to selenate as well as lines sensitive to selenate. Taking into consideration the competitive sulfur and selenium uptake and assimilation by plants the selection was based on the media with different combination of sulfate/selenate concentration. The cell viability and the ability of the selected A. caucasica and T. majus lines to selenium accumulation in biomass and in glucosinolate fractions were compared. Material and methods Suspension cultures of T. majus and A. caucasica were grown in MS medium [MURASHIGE, SKOOG 1962] containing vitamin from B5 medium [GAMBORG et al. 1968], 3% (w/v) sucrose as well as 0.3 mg dm -3 6-benzylaminopurine and 1.3 mg dm -3 2,4- dichlorophenoxyacetic acid (ph 5.8), on a rotary shaker (120 rpm), at 24 C in the dark, and subcultured every 18 days. Selection and description of cell lines Cell suspension (3 cm 3 ) from the exponential phase of growth (10 th day of culture) were transferred on 0.8 % (w/v) agar MS media (25 cm 3 in 9 cm Petri dishes) containing 25 combinations of sulfate/selenate concentrations, as described in Table 1. In the media with reduced basic sulfate concentration (1.5 mm as MgSO 4 7H 2 O) Mg 2+ content was balanced to basic MS concentration with MgCl 2 6H 2 O. After 5 weeks of culture the efficiency of cell colonie formation was determined on the basis of a number and diameter of aggregates which were able to grow on the selective media. Aggregates arising on the media with selenate were described as lines with enhanced tolerance to Se 6+, and aggregates arising on the media without selenate were described as sensitive ones. All lines were described according to 3-element scheme: (I) species: T. - T. majus/a. - A. caucasica; (II) tolerance to Se 6+ : S - sensitive to Se 6+ /T - with enhanced tolerance to Se 6+ ; (III) sulfate/selenate ratio in selective media: S 6+ concentration (mm)/se 6+ concentration ( M). All cell aggregates from plates with the singular S 6+ /Se 6+ ratio were combined and transferred to the agar MS medium without selenate and subcultured 3 times every 5 weeks. Biomass growth of the selected lines was determined on the basis of fresh cell weight. Ratios of S 6+ /Se 6+ concentration in selective media Tabela 1; Table 1

55 SELECTION in vitro AND ACCUMULATION OF SELENIUM Stosunki st enia S 6+ /Se 6+ w podło ach selekcyjnych MgSO 4 7H 2O (mm) Na 2SeO 4 ( M) Selenate treatment and determination of cell viability 500 mg of cells of 4 lines of T. majus: T.S:1.5/0; T.T:1.5/100; T.S:1.125/0; T.T:1.125/100 as well as 4 lines of A. caucasica: A.S:1.5/0; A.T:1.5/100; A.S:1.125/0; A.T:1.125/100 were inoculated into 25 cm 3 of liquid MS medium containing 1.5 mm or 1.25 mm sulfate concentration according to the cell line. After 7 days of culture, cells were aseptically treated with aqueous selenate solutions (as Na 2 SeO 4, ph adjusted to 5.8) to obtain a final concentrations 100 M. The control cultures were treated in the same manner with sterile water (ph 5.8) instead of selenate. Ten days after the treatment T. majus and A. caucasica cell lines from 2 flasks were collected for analysis of cell viability and determination of selenium accumulated in cell biomass (dry weight) and in glucosinolate fractions. To avoid any potential loss of Se through volatilization dry weight was obtained after drying cells in an oven at 65 C until constant weight was reached. Cell viability was determined on the basis of TTC-reduction assay according to DE BLOCK and DE BROUWER [2002]. Percent of viability of the selenate-treated cells was calculated considering the A 485 value of the control cultures as 100%. Extraction of glucosinolate fraction Glucosinolates were extracted and purified according to the previously published protocol [WIELANEK, URBANEK 2006]. Briefly: glucosinolates were extracted with boiling 70% (v/v) methanol and purified on the alumina columns containing acidic aluminum oxide and eluted using 1% K 2 SO 4 (w/v) using SPE (solid phase extraction) system. To remove sulfate excess the eluates were combined with ethanol (1:1, v/v), centrifuged and evaporated under the reduced pressure. The residues containing glucosinolates (glucotropaeolin from T. majus and glucoiberverin from A. caucasica cells) were used for analysis of the Se content in glucosinolate fractions. Selenium analysis For the determination of Se accumulated in the cell biomass (Biomass-Se) dry cells were wet acid digested with the concentrated HNO 3 - H 2 O 2 (5:1, v/v) [DUMONT et al. 2006] using a closed microwave digestion system UniCleverII. To avoid Se loss from the samples microwave program was as follows: 5 min at Pa, C, 60% power output; 5 min at Pa, C, 80% power output; 15 min at C, Pa, 100% power output. For the determination of Se accumulated in glucosinolates (Gls-Se) total glucosinolate fractions obtained after purification on the alumina columns (see above) were wet digested as described above. The acid digests were subjected to analysis of Se following the fluorometric method [LEVESQUE, VANDETTE 1971]. Briefly: the reduction of Se 6+ into Se 4+ was achieved by heating of the digests with 6 M HCl at 90 C for 30 min. The formation

56 68 E. Kaczkowska, M. Wielanek, M. Skłodowska of 4,5-benzopiazselenol [selenite - 2,3-diaminonaphthalene (DAN) complex] was performed in the mixture (1:2:1 v/v/v/) of the digests+0.04 M EDTA+0.1% DAN in 0.1 M HCl (w/v) at 60 C for 30 min. 4,5-benzopiazselenol was extracted with cyclohexane and fluorescence was measured at =370 nm excitation/ =520 nm emission. Biomass- Se was expressed as % of Se added to the culture medium (% of medium Se), Gls-Se was expressed as % of Se added to the culture medium (% of medium Se) and as % of Se accumulated in the biomass (% of Biomass-Se) based on the calibration curve for selenite standard. The procedure was verified by analyses of the standard reference material CRM 402 (white clover, Se content 6.7 ± 0.25 g g -1 DW). The results presented in this work are the means of 3 independent experiments. Results and discussion To select cell lines of T. majus and A. caucasica with the enhanced both tolerance to selenate and ability to accumulate a high amount of selenium, cells from suspension cultures were transferred to agar media containing 0, 50, 100, 150 and 200 M sodium selenate. Since a competitive interaction between the S and Se uptake and the assimilation were found, especially when they are present as sulfate (S 6+ ) and selenate (Se 6+ ) [HOPPER, PARKER 1999], the sulfate concentration in the selective media were reduced from the 1.5 mm to 1.125, 0.75, 0.375, 0 mm (Tab. 1; Fig. 2 and 3). After 5 weeks of culture callus-like aggregates were formed. It was found that, in general, the decrease in number of aggregates was accompanied by an increasing concentration of selenate and decreasing content of sulfate in the selective medium. There were no aggregates able to grow in the presence of 200 M Se 6+ (data not shown). Aggregates arising on the media with selenate were considered as lines with enhanced tolerance to Se 6+ (T), and aggregates arising on the media without selenate were treated as sensitive to Se 6+ (S). In order to determine the growth potential of selected lines and to eliminate selenium accumulated during the selection, cell aggregates were transferred to the medium without selenate. After the first subculture of the selected lines on the media without Se 6+ the differences in their growth potential were found. Moreover all of the T. majus T lines (T.T:1.5/150; T.T:1.125/150; T.T:0.75/150; T.T:0.375/150; T.T:0/150) and three of the A. caucasica T lines (A.T:1.5/150; A.T:0.75/150; A.T:0/150) selected on the media with 150 M Se 6+ were not able to divide and continue further grow (Fig. 3). It is possible, that through a competitive interaction between S 6+ and Se 6+ [HOPPER, PARKER 1999] the uptake of selenium in cells cultured on the media with the increasing Se 6+ and decreasing S 6+ concentrations was so intensive that accumulation of selenium reached the level toxic to cells not only at the stage of culture on the selective media, but also during the subsequent subculture on Se 6+ -free medium. The inhibition of mitosis as a result of selenium toxicity was, for example, observed in the callus cultures of Astragalus species [ZIEBUR, SHRIFF 1971]. Among the A. caucasica and T. majus T lines the highest biomass increase, comparable on even higher than those of S lines, was detected in the cultures of T lines selected on the media with mm S 6+ and 100 M Se 6+ (A.T:1.125/100 and T.T:1.125/100), (Fig. 3). Although it was not apparent whether the enhanced tolerance of the selected A. caucasica and T. majus lines was the result of a stable change in genome or metabolic adaptation it was interesting to study their selenium tolerance and Se incorporation into the biomass and glucosinolate fractions. After two subsequent subcultures of the selected S and T lines on the medium without Se 6+ (data not shown) for further studies two A. caucasica and two T. majus T lines with the highest biomass growth and four corresponding with them S lines were chosen: A.S:1.5/0; A.T:1.5/100; A.S:1.125/0; A.T:1.125/100; T.S:1.5/0; T.T:1.5/100;

57 SELECTION in vitro AND ACCUMULATION OF SELENIUM T.S:1.125/0; T.T:1.125/100. The cells were transferred to the liquid media with the same sulfate content as during the selection or mm for lines A.S:1.5/0; A.T:1.5/100; T.S:1.5/0; T.T:1.5/100 and A.S:1.125/0; A.T:1.125/100; T.S:1.125/0; T.T:1.125/100, respectively. After 10 days of exposure to 100 M Se 6+, the viability analysis with the TTC-reduction assay showed great differences between both S and T lines, and A. caucasica and T. majus lines (Fig. 4). In comparison to the control cultures the viability of T. majus T.T:1.5/100 and T.T:1.125/100 lines decreased by about 50%, whereas the viability of T.S:1.5/0 and T.S: 1.125/0 lines decreased by about 70%. The A. caucasica lines, both S and T, were more tolerant to Se 6+ than T. majus ones, the A.S:1.5/0 and A.S:1.125/0 lines exhibited about 25% reduction of viability, whereas in A.T:1.5/100 and A.T:1.125/100 lines only about 5% reduction in viability was found (Fig. 4). aggregates: number/diameter (mm). agregaty: liczba/ rednica (mm) S 6+ =1.5 S 6+ =1.125 S 6+ =0.75 S 6+ =0.375 S 6+ = A. c. diameter of aggregates -T. m. diameter of aggregates A. c. rednica agragatów T. m. rednica agregatów - A. c. number of aggregates -T. m. number of aggregates A. c. liczba agregatów T. m. liczba agregatów Se 6+ (mm) Fig. 2. Rys. 2. The callus-like aggregates of A. caucasica and T. majus cells formed after 5 weeks of culture on the selective media Kalusowate agregaty komórek A. caucasica i T. majus uformowane po 5 tygodniach hodowli na podło ach selekcyjnych

58 70 E. Kaczkowska, M. Wielanek, M. Skłodowska 6 A. caucasica T. majus biomass (g FW); biomasa (g w.m.) /0 1.5/ /0 1.25/ /0 0.75/ / /100 0/0 0/100 selected lines of A. caucasica and T. majus w yselekcjonow ane linie A. caucasica i T. majus Fig. 3. Biomass of selected lines A. caucasica and T. majus after the 1 st subculture on medium without Se 6+ Rys. 3. Biomasa wyselekcjonowanych linii A. caucasica i T. majus po 1-szym pasa u na podło u bez Se 6+ T.T:1.5/100 A.T:1.5/100 T.S:1.5/0 A.S:1.5/0 T.T:1.125/100 A.T:1.125/100 T.S:1.125/0 A.S:1.125/ viability (% of control) ywotno (% kontroli) Fig. 4. Viability of selected lines of A. caucasica and T. majus 10 days after treatment with 100 M Se 6+ Rys. 4. ywotno wyselekcjonowanych linii A. caucasica i T. majus 10 dni po traktowaniu 100 M Se 6+

59 SELECTION in vitro AND ACCUMULATION OF SELENIUM T.T:1.5/100 A.T:1.5/100 T.S:1.5/0 A.S:1.5/0 T.T:1.125/100 A.T:1.125/100 T.S:1.125/0 A.S:1.125/ % of Se 6+ added to medium % Se 6+ dodanego do podło a Fig. 5. Se content in the biomass of selected lines of A. caucasica and T. majus 10 days after treatment with 100 M Se 6+ Rys. 5. Zawarto Se w biomasie wyselekcjonowanych linii A. caucasica i T. majus 10 dni po traktowaniu 100 M Se 6+ % of of Se6+ added to to medium - A. - caucasica A. % of Biomass-Se - A. - A. caucasica % of Se 6+ dodanego do podło a - A. caucasica % of of Se6+ added to to medium - T. - majus T. majus % Se biomasy - A. caucasica % of Biomass-Se - T. - T. majus % of Se 6+ dodanego do podło a - T. majus % Se biomasy - T. majus A.T:1.5/100 A.S:1.5/0 A.T:1.125/100 A.S:1.125/ % of Se 6+ added to medium/% of Biomass-Se % Se 6+ dodanego do podło a/% Se biomasy Fig. 6. Se content in the biomass and in glucosinolate fractions of selected lines of A. caucasica and T. majus 10 days after treatment with 100 M Se 6+ Rys. 6. Zawarto Se w biomasie i we frakcjach glukozynolanowych wyselekcjonowanych linii A. caucasica i T. majus 10 dni po traktowaniu 100 M Se 6+

60 72 E. Kaczkowska, M. Wielanek, M. Skłodowska The determination of Se content in the biomass (Biomass-Se) and in glucosinolate fraction (Gls-Se) showed a higher ability of A. caucasica S and T lines to accumulate Se in comparison to T. majus S and T lines (Fig. 5 and Fig. 6). No differences in efficiency of Se accumulation in the biomass were found between A. caucasica S and T lines, whereas the concentration of S 6+ in the medium influenced the Biomass-Se content. Ten days after 100 M Se 6+ treatment lines A.S:1.5/0 and A.T:1.150/100 cultured in the medium with 1.5 mm S 6+ accumulated in the biomass about 80% of Se 6+ added to the medium, whereas in lines A.S:1.125/0 and A.T:1.125/100 cultured in the medium with mm S 6+ Biomass-Se content corresponded to 100% of Se 6+ added to the medium (Fig. 5). Similarly to the selected A. caucasica lines, T. majus S and T lines selected and then treated with selenate in the medium with the reduced S 6+ content (1.125 mm) after treatment with 100 M Se 6+ accumulated more Se than the lines cultured in the medium with a higher S 6+ content (1.5 mm). However, opposite to the selected A. caucasica lines, the difference in the Biomass-Se content between T. majus S and T lines occurred. According to the medium S 6+ concentration T.S:1.5/0 and T.S:1.125/0 lines accumulated about 40 and 60% of the Se 6+ added to the medium, respectively, whereas in lines T.T:1.5/100 and T.T:1.125/100 Bio mass-se content corresponded to about 70 and 85% of Se 6+ added to the medium (Fig. 5). No influence of the medium S 6+ concentration (1.5 or mm) on selenium incorporation into glucosinolate fractions of A. caucasica and T. majus S and T lines was found (Fig. 6). Ten days after treatment with 100 M Se 6+ sensitive A. caucasica lines A.S:1.5/0 and A.S:1.125/0 accumulated into Gls-Se about 20% of Se 6+ added to the culture medium, which corresponded to about 23% of Biomass-Se. Similarly, the cultures of A.T:1.5/100 and A.T:1.125/100 lines accumulated into Gls-Se about 23% of Se 6+ added to the culture medium, which corresponded up to 27% of Biomass-Se (Fig. 6). Selenium content in Gls-Se of T. majus lines was several-fold lower than in A. caucasica ones, moreover distinct differences in Gls-Se between T. majus S and T lines were found. Ten days after treatment with 100 M Se 6+ sensitive T. majus lines T.S:1.5/0 and T.S:1.125/0 accumulated into Gls-Se about 3.6 and 5.6%, respectively, of Se 6+ added to the culture medium, which corresponded to about 9% of Biomass-Se, whereas in T.S:1.5/100 and T.S:1.125/100 lines Gls-Se accumulation was by about fold higher and corresponded to about 12% of Biomass-Se (Fig. 6). The detected differences in cell viability and in Biomass-Se and Gls-Se contents between A. caucasica and T. majus S and T lines as well as small differences in the mentioned parameters between A. caucasica S and T lines indicated that, in general, the obtained T. majus lines were more sensitive to the used 100 M Se 6+ concentration than A. caucasica ones. The TTCreduction assay provides an adequate indicator of changes in metabolic activity of cells exposed to the stress conditions [GRACIA-MEDRANO, MIRANDA-HAM 2003]. It is obvious, that all Se 6+ - treated A. caucasica and T. majus lines absorbed selenium from the medium which led to biosynthesis of selenium analogues of cysteine and methionine [SORS et al. 2005]. A highest decrease in viability of T. majus cells indicated that, in comparison to A. caucasica, in T. majus cells more SeCys and SeMet entered the protein biosynthesis pathway leading to the formation of dysfunctional proteins whereas in A. caucasica cells probably more SeCys and SeMet was directed towards the biosynthesis of non-protein analogues. It was found that selenocysteine methyltransferase (SMT) specifically methylates selenocysteine to produce non-protein amino acid Se-methylselenocysteine and its accumulation was suggested to be the basis for selenium tolerance in Se secondary accumulators [NEUHIERL et al. 1999]. Se-

61 SELECTION in vitro AND ACCUMULATION OF SELENIUM methylselenocysteine constitutes the major peak of selenoamino acids in Se-enriched Brassica oleracea var. italica and also in other members of family Brassicaceae the activity of selenocysteine methyltransferase was found [LYI et al. 2005]. In our work the activity of SMT in the selected T. majus and A. caucasica lines was not studied, but in A. caucasica, as a member of Brassicaceae, the expression of that enzyme leading to enhanced Se accumulation and tolerance was possible. Moreover, the presence of Se in the digests of glucosinolate fractions suggested the formation of Se-analogues of glucotropaeolin and glucoiberverin. Cys is a source of sulfur in glucosinolate -D-thioglucoside moiety, core structure of several glucosinolates, including glucoiberverin, is Met-derived. Taking into consideration that Se-Cys can be transformed to Se-Met, the formation of glucosinolate Se-analogues, more intensive in the selected A. caucasica than in T. majus lines, was possible; however, our hypothesis needs further analyses and confirmation. The incorporation of Se into glucosinolate fractions might be the result of the detoxification reaction similar to the formation of non-protein analogues of amino acids in Se-hyperaccumulators and secondary accumulators leading to the decrease in biosynthesis of protein Se-analogues [NEUHIERL, BÖCK 1996]. Similarly in our previous work with Se-enriched hairy roots of T. majus and A. caucasica a higher level of Seincorporation into the biomass and glucosinolate fraction accompanied by a weaker decrease in the biomass growth was found for A. caucasica roots [WIELANEK et al. 2008]. Conclusions Selenate is a strong selective factor for A. caucasica and T. majus cells and its effect is both Se 6+ and S 6+ concentration-dependent. The selected cell lines sensitive to selenate or with enhanced tolerance to selenate differ in the level of Se accumulation both in the biomass and in glucosinolate fractions. These results suggest that the obtained T. majus and A. caucasica cell lines could be a useful tool in research into plant tolerance to selenium as well as the mechanisms of increasing of the health beneficial organoselenium compounds in plants. References BA UELOS G., TERRY N., LEDUC D., PILON-SMITS E.A.H., MACKAY B Field trial of transgenic Indian mustard plants shows enhanced phytoremediation of selenium-contaminated sediment. Environ. Sci. Technol. 39: DE BLOCK M., DE BROUWER D A simple and robust in vitro assay to quantify the vigour of oilseed rape lines and hybrids. Plant Physiol. Biochem. 40: DUMONT E., DE PAUW L., VANHAECKE F., CORNELIS R Speciation of Se in Bertholletia excelsa (Brazil nut): A hard nut to crack? Food Chem. 95: GAMBORG O.L., MILLER R.A., OJIMA K Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50: GRACIA-MEDRANO R.M.E., MIRANDA-HAM M.DE.L Analysis of elicitor- induced cell viability changes in Lycopersicon esculentum Mill. suspension culture by different methods. In Vitro Cell. Dev. Biol. - Plant 39:

62 74 E. Kaczkowska, M. Wielanek, M. Skłodowska HOPPER J.L., PARKER D.L Plant availability of selenite and selenate as influenced by the competing ions phosphate and sulfate. Plant Soil 210: LEDUC D.L., ABDELSAMIE M., MÓNTES-BAYON M., WU C.P., REISINGER S.J., TERRY N Overexpressing both ATP sulfurylase and selenocysteine methyltransferase enhances selenium phytoremediation traits in Indian mustard. Environ. Pollution 144: LEVESQUE M., VANDETTE E.D Selenium determination in soil and plant materials. Can. J. Soil. Sci. 51: LYI S.M., HELLER L.I., RUTZKE M., WELCH R.M., KOCHIAN L.V., LI L Molecular and biochemical characterization of the selenocysteine Se-methyltransferase gene and Semethylselenocysteine synthesis in broccoli. Plant Physiol. 138: MURASHIGE T., SKOOG F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: NEUHIERL B., BÖCK A On the mechanism of selenium tolerance in seleniumaccumulating plants. Eur. J. Biochem. 239: NEUHIERL B.,THANBICHLER M., LOTTSPEICH F., BÖCK A A family of S-methylmethionine-dependent thiol/selenol methyltransferases. J. Biol. Chem. 274: RAYMAN M.P The argument for increasing selenium intake. Proc. Nutr. Soc. 61: SORS T.G., ELLIS D.R., SALT D.E Selenium uptake, translocation, assimilation and metabolic fate in plants. Photosynthesis Res. 86: WIELANEK M., SKŁODOWSKA M., KRÓLICKA A., BERGIER K., GAJEWSKA E Influence of sulfate/selenate ratio on glucosinolate biosynthesis and selenium accumulation in biomass and in glucosinolate fractions of Tropaeolum majus L. and Arabis caucasica L. transformed roots. Adv. Agricult. Sci. Problem Iss. 524: WIELANEK M., URBANEK H Enhanced glucotropaeolin production in hairy root cultures of Tropaeolum majus L. by combining elicitation and precursor feeding. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 86: ZHANG L., SHI W., WANG X Difference in selenite absorption between high- and low-selenium rice cultivars and its mechanism. Plant and Soil 282: ZIEBUR N.K., SHRIFF A Response to selenium by callus cultures derived from Astragalus species. Plant Physiol. 47: Key words: glucoiberverin, glucotropaeolin, metabolic sulfur/selenium interaction, selenium accumulation, selenium tolerance Summary Arabis caucasica and Tropaeolum majus cells were selected for their ability to grow in a toxic concentration of selenate. As a result of selection on the media with 25 sulphate/selenate ratios in the range of 1.5, 1.125, 0.75, 0.375, 0 mm/200, 150, 100, 50, 0 M two A. caucasica and two T. majus cell lines with enhanced tolerance to selenate as well as two A. caucasica and two T. majus cell lines sensitive to selenate were

63 SELECTION in vitro AND ACCUMULATION OF SELENIUM initiated. In the presence of 100 M selenate the differences in the cell viability, selenium accumulation in biomass and in glucosinolate fraction were detected between both Se-sensitive and Se-tolerant lines as well as A. caucasica and T. majus lines. For both species the viability of Se-sensitive lines was lower than Se-tolerant ones, but the viability of all of the A. caucasica lines was higher than T. majus lines. Depending of the medium sulphate concentration A. caucasica lines accumulated in the biomass % of selenium added to the medium, and up to 27% of the accumulated selenium was incorporated into the glucosinolate fraction. Se-tolerant T. majus lines accumulated in the biomass 70-85% of selenium from the medium, and up to 12% of the accumulated selenium was incorporated into the glucosinolate fraction. SELEKCJA in vitro ORAZ AKUMULACJA SELENU PRZEZ LINIE KOMÓRKOWE Trapeolum majus L. I Arabis caucasica L. O PODWY SZONEJ TOLERANCJI NA SELENIAN Edyta Kaczkowska, Marzena Wielanek, Maria Skłodowska Katedra Fizjologii i Biochemii Ro lin, Uniwersytet Łódzki, Łód Słowa kluczowe: akumulacja selenu, glukoiberweryna, glukotropeolina, metaboliczna interakcja siarka/selen, tolerancja selenu Streszczenie Komórki Arabis caucasica i Tropaeolum majus poddano selekcji pod wzgl dem ich zdolno ci do wzrostu w obecno ci toksycznego st enia selenianu. W rezultacie selekcji na 25 podło ach o stosunku siarczan/selenian w zakresie 1,5; 1,125; 0,75; 0,375; 0 mm/200; 150; 100; 50; 0 M zainicjowano dwie linie komórkowe A. caucasica i dwie linie T. majus o podwy szonej tolerancji na selenian, jak równie dwie linie komórkowe A. caucasica i dwie linie T. majus wra liwe na selenian. W obecno ci 100 M selenianu ró nice w ywotno ci komórek oraz akumulacji selenu w biomasie i we frakcjach glukozynolanowych stwierdzono zarówno pomi dzy Se-wra liwymi i Setolerancyjnymi liniami, jak i pomi dzy liniami A. caucasica i T. majus. W przypadku obydwu gatunków ywotno linii Se-wra liwych była ni sza ni linii Setolerancyjnych, ale ywotno wszystkich linii A. caucasica była wy sza ni linii T. majus. W zale no ci od st enia siarczanu w podło u hodowlanym linie A. caucasica akumulowały w biomasie % selenu dodanego do podło a, przy czym do 27% zakumulowanego selenu było wbudowane we frakcj glukozynolanow. Setolerancyjne linie T. majus akumulowały w biomasie 70-85% selenu dodanego do podło a, przy czym do 12% zakumulowanego selenu było wbudowane we frakcj glukozynolanow. Dr Marzena Wielanek Katedra Fizjologii i Biochemii Ro lin Uniwersytet Łódzki ul. Banacha 12/ ŁÓD

64 76 E. Kaczkowska, M. Wielanek, M. Skłodowska

65 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: WPŁYW KADMU NA ZMIANY OBJ TO CI WAKUOL IZOLOWANYCH Z KOMÓREK RO LINNYCH Waldemar Karcz, Zbigniew Burdach, Joanna miszek Katedra Fizjologii Ro lin, Uniwersytet l ski w Katowicach Wst p Kluczowe znaczenie w utrzymaniu homeostazy jonowej komórki ro linnej ma centralna wakuola, która cz sto zajmuje w komórce ponad 90% jej obj to ci. Oprócz tej funkcji wakuola jest odpowiedzialna za: utrzymanie wła ciwego turgoru komórki, gromadzenie i magazynowanie zarówno potrzebnych komórce, jak i dla niej zb dnych substancji oraz przekazywanie sygnałów. W błonie wakuolarnej znajduje si wiele białek receptorowych, enzymów oraz białek katalizuj cych transport [MAESHIMA 2001; POTTOSIN, MU IZ 2002; MARTINOIA i in. 2007; KARCZ i in. 2008]. Do wa niejszych białek integralnych tej błony nale y tak e akwaporyna selektywny kanał wodny [WO NY 2006]. W błonie otaczaj cej wakuol stwierdzono obecno dwóch typów pomp protonowych, mianowicie H + -ATPaz, (zwan tak e dla odró nienia od plazmalemmowej H + -ATPazy), V-ATPaz oraz H + -pirofosfataz (H + -PPaz ). Pompy te bior udział w transporcie jonów H + do wn trza wakuoli, co prowadzi do zakwaszenia soku wakuolarnego i wytworzenia gradientu protonowego w poprzek błony, umo liwiaj c transport jonów i metabolitów do jej wn trza [MAESHIMA 2001; POTTOSIN, MU IZ 2002; MARTINOIA i in. 2007; KARCZ i in. 2008]. Ponadto w tonopla cie wyst puj transportery typu ABC, bior ce udział w przenoszeniu metabolitów wtórnych, glutationu i niektórych metali ci kich, a tak e antyportery typu Na + /H + oraz Ca 2+ - ATPaza, która przenosi jony wapnia. Dodatkowo w błonie wakuoli obecne s kanały kationowe typu SV (slow vacuolar channel), FV (fast vacuolar channel), VK (vacuolar K + channel) i inne [MAESHIMA 2001; POTTOSIN, MU IZ 2002; MARTINOIA i in. 2007; KARCZ i in. 2008]. Jednym z najlepiej poznanych hormonów ro linnych jest kwas indolilo-3- octowy (IAA), który uczestniczy w regulacji wzrostu wydłu eniowego komórek [KARCZ, BURDACH 2002; HAGER 2003; DAVIES 2004]. Ro liny w naturalnym rodowisku nara one s na działanie wielu czynników stresowych, do których m.in. nale kadm i inne metale ci kie. Ro liny wykształciły szereg mechanizmów maj cych na celu zminimalizowanie ich niekorzystnego wpływu. Do systemu detoksykacji metali ci kich w komórkach nale y wi zanie metali w kompleksy z ligandami (chelatacja) i transport tych kompleksów do wakuoli. Wy ej wymienione procesy zachodz przy udziale tzw. białek towarzysz cych (chaperonów), które bior udział w transporcie jonów do organelli i metaloprotein, a tak e innych czynników chelatujacych, maj cych za zadanie buforowanie nadmiaru jonów. Do takich czynników zaliczamy metalotioneiny, fitochelatyny, hemifitochelatyny, aminokwasy oraz kwasy organiczne [CLEMENS 2001]. W zwi zku z powy szym wydało si ciekawym zbadanie wpływu

66 78 W. Karcz, Z. Burdach, J. miszek kwasu indolilo-3-octowego (IAA) i jonów kadmu na obj to wakuol izolowanych z korzenia buraka zwyczajnego (Beta vulgaris L.). Materiał i metody Zmiany obj to ci wakuol, izolowanych z korzenia buraka zwyczajnego (Beta vulgaris L.), mierzono przy pomocy mikroskopu - model A 70 (Olympus Provis) sprz onego z kamer Hamamatsu typ 3CCD C5810 oraz komputerem Compaq Prosignia. Do izolacji wakuol sporz dzano roztwór zawieraj cy manitol i HEPES. Wyj ciowe ph powy szego roztworu ustalano w przedziale 7,2-7,5. Wyci te skrawki tkanki przemywano, przy pomocy pipety, roztworem do izolacji wakuol. Roztwór po przemyciu umieszczano na szkiełku podstawowym, które przykrywano szkiełkiem nakrywkowym. W zale no ci od wariantu przeprowadzanego eksperymentu do roztworu izolacyjnego wprowadzano kwas indolilo-3-octowy (IAA M) lub CdCl 2 (10-4 M). Wykonany preparat mikroskopowy obserwowano przy powi kszeniu 60. Zdj cia obserwowanej wakuoli, a tak e pomiary jej rednicy były wykonywane co 3 min za pomoc programu Analysis. Pomiarów rednicy wakuoli dokonywano 8-krotnie w celu zminimalizowania warto ci bł du pomiaru. Obliczano obj to ci wakuol oraz procentowe ich zmiany. Wyniki i dyskusja Komórki ro linne do zasilania transportu substancji przez błon komórkow wykorzystuj głównie gradient potencjału elektrochemicznego protonów, który jest wytwarzany przez plazmalemmowe pompy protonowe (H + -ATPazy). Badania przeprowadzone w ostatnich kilkunastu latach pokazuj, e aktywno plazmalemmowej H + -ATPazy i sprz onego z nim transportu wtórnego jest regulowana przez hormony ro linne, wiatło, temperatur i szeroko rozumiany stres rodowiskowy. Kluczowe znaczenie dla wzrostu komórek ro linnych ma kwas indililo-3-octowy, którego mechanizm działania jest ci le zwi zany z aktywno ci plazmalemmowej H + - ATPazy. Natomiast znacznie mniej wiadomo o wpływie hormonów ro linnych i stresu rodowiskowego na błon wakuolarn komórek ro linnych. Przeprowadzone badania wykazały, e kwas indolilo-3-octowy (IAA) i jony kadmu w istotny sposób modyfikuj zmiany obj to ci wakuol izolowanych z buraka zwyczajnego (Beta vulgaris L.), (rys. 1). W rodowisku kontrolnym, tzn. w rodowisku bez auksyny i jonów kadmu, obserwowana zmiana obj to ci wakuol mie ciła si w granicach ok. ±2% warto ci pocz tkowej. Dodanie auksyny do rodowiska inkubacyjnego powodowało przej ciowy spadek obj to ci wakuol, po którym nast pował znaczny ich wzrost, mieszcz cy si w przedziale od 40 do 60% w zale no ci od pocz tkowej obj to ci wakuoli. Stymulacj wzrostu obj to ci wakuol (o ok. 40%) stwierdzono równie w obecno ci 10-4 M Cd 2+. Auksyna podana równocze nie z kadmem do rodowiska inkubacyjnego wakuoli powodowała (w wi kszo ci przypadków) spadek ich obj to ci. Przeprowadzone badania wykazały, e zarówno IAA, jak i kadm, obecne w rodowisku inkubacyjnym wakuol, powoduj wzrost ich obj to ci (rys. 1). Badania przeprowadzone przez OZOLIN i in. [1996] na wakuolach izolowanych z buraka zwyczajnego wykazały, e IAA w st eniu 10-7 M i 10-6 M wpływa na aktywno H + -PPazy, podczas gdy aktywno V- ATPazy nie ulega zmianie. Jak wynika równie z danych literaturowych, ponad 80% całkowitej ilo ci kadmu obecnego w komórce jest zlokalizowana w wakuoli [KROTZ i in. 1989]. Tak wysokie st enie jonów kadmu, jak uwa aj SALT i WAGNER [1993] oraz GRIES

67 WPŁYW KADMU NA ZMIANY OBJ TO CI WAKUOL i WAGNER [1998], jest konsekwencj funkcjonowania antyportu H + /Cd 2+ zwi zanego z aktywno ci tonoplastowej V-ATPazy. Tak wi c obserwowany wzrost obj to ci wakuol (rys. 1), w rodowisku zawieraj cym kadm, mo e by zwi zany z wy ej wspomnianym mechanizmem transportu jonów kadmu. Rys. 1. Wpływ IAA (10-6 M) i CdCl 2 (10-4 M) na zmiany obj to ci wakuol izolowanych z korzenia buraka zwyczajnego (Beta vulgaris L.). IAA - kwas indolilo-3-octowy Fig. 1. Effect of IAA (10-6 M) and CdCl 2 (10-4 M) IAA on volume changes of vacuoles isolated from red beet (Beta vulgaris L.). IAA - indole-3-acetic acid Wnioski 1. Kwas indolilo-3-octowy - IAA (10-6 M), obecny w rodowisku inkubacyjnym wakuol izolowanych z korzenia buraka zwyczajnego (Beta vulgaris L.), powoduje wzrost ich obj to ci. 2. Kadm obecny w roztworze inkubacyjnym w st eniu 10-4 M powoduje, podobnie jak auksyna, wzrost obj to ci wakuol. Literatura CLEMENS S Molecular mechanism of plant metal homeostasis and tolerance. Planta 212: DAVIES P.J Plant hormones. Biosynthesis, signal transduction, action! Kluwer Academic Publishers, Dordrecht

68 80 W. Karcz, Z. Burdach, J. miszek GRIES G.E., WAGNER G.J Association of nickel versus transport of cadmium and calcium in tonoplast vesicles of oat roots. Planta 204: HAGER A Role of the plasma membrane H + -ATPase in auxin-induced elongation growth: historical and new aspects. J. Plant Res. 116: KARCZ W., BURDACH Z A comparison of the effects of IAA and 4-Cl-IAA on growth, proton secretion and membrane potential in maize coleoptile segments. J. Exp. Bot. 53: KARCZ W., TRELA Z., BURDACH Z., PRZESTALSKI S Pompy protonowe i kanały potasowe w błonie wakuolarnej komórek ro linnych, w: Błony biologiczne. Monografia. Gabriela J. i Misiak P. (red.), Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu: KROTZ R.M., EVANGELOU B.P., WAGNER G.J Relationships between Cd, Zn, Cdpeptide and organic acid in tobacco suspension cells. Plant Physiol. 91: MAESHIMA M Tonoplast transporters: organization and function. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 52: MARTINOIA E., MAESHIMA M., NEUHAUS H.E Vacuolar transporters and their essential role in plant metabolism. J. Exp. Bot. 58: OZOLINA N.V., PRADEDOVA E.V. AND SALYAEV R.K Phytohormone effects on hydrolytic activity of phosphohydrolases in red beet (Beta vulgaris L.) tonoplasts. Plant Growth Reg. 19: POTTOSIN I.I., MU IZ J Higher plant vacuolar ionic transport in the cellular context. Acta Bot. Mexicana 60: SALT D.E., WAGNER G.J Cadmium transport across tonoplast of vesicles from oat roots. J. Biol. Chem. 268(17): WO NY A Wakuole, w: Biologia komórki ro linnej. T. 1. Struktura. Wojtaszek P., Wo ny A., Ratajczak L. (red.), Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa: Słowa kluczowe: auksyna, IAA, kadm, wakuole, burak zwyczajny (Beta vulgaris L.), zmiany obj to ci Streszczenie Wzrost i rozwój ro lin jest regulowany przez hormony ro linne, jak równie przez czynniki rodowiskowe, w tym metale ci kie. Badania przeprowadzono na wakuolach wyizolowanych z korzenia buraka zwyczajnego (Beta vulgaris L.). rednic wakuol mierzono przy pomocy mikroskopu A 70 (Olympus Provis) sprz onego z kamer Hamamatsu typ 3CCDC5810. Przeprowadzone badania pozwalaj stwierdzi, e zarówno IAA, jak i kadm powoduj wzrost obj to ci wakuol. THE EFFECT OF CADMIUM ON VOLUME CHANGES OF VACUOLES ISOLATED FROM PLANT CELLS Waldemar Karcz, Zbigniew Burdach, Joanna miszek Department of Plant Physiology, University of Silesia, Katowice

69 WPŁYW KADMU NA ZMIANY OBJ TO CI WAKUOL Key words: auxin, IAA, cadmium, vacuole, red beet (Beta vulgaris L.), volume changes Summary Growth and development of plants is regulated by plant hormons as well as by environmental factors such as heavy metals. The aim of the present study was to determine the effect of IAA and cadmium on the volume changes of vacuoles. The experiments were carried out with vacuoles isolated from the red beet (Beta vulgaris L.) root. The diameter of vacuoles was measured by the means of microscope A 70 (Olympus Provis) connected with Hammamatsu camera. It was found that both IAA and cadmium increase the volume of vacuoles isolated from the red beet roots. Prof. dr hab. Waldemar Karcz Katedra Fizjologii Ro lin Uniwersytet l ski ul. Jagiello ska KATOWICE waldemar.karcz@us.edu.pl

70 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: WPŁYW RÓ NYCH W GLOWODANÓW NA WZROST I ROZWÓJ LILIOWCA in vitro 1 Ludwika Kawa-Miszczak, El bieta W grzynowicz-lesiak, Eleonora Gabryszewska, Justyna Góraj, Marian Saniewski Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa im. Szczepana Pieni ka w Skierniewicach Wst p W kulturach tkankowych w glowodany dodawane do po ywek s niezb dnym czynnikiem od ywczym dla rosn cych i ró nicuj cych si tkanek. Ponadto działaj jako induktory b d represory genów i tym samym reguluj wzrost i rozwój tkanek oraz zachodz ce w nich procesy metaboliczne [KOCH 1996]. Odgrywaj wa n rol w przekazywaniu sygnałów indukuj cych morfogenez, wzrost komórek i odpowied na stres [HO i in. 2001]. Cukry, a zwłaszcza alkohole cukrowe (sorbitol, mannitol), oddziałuj na procesy wzrostu i rozwoju tkanek równie poprzez wpływ na osmolarno po ywki [NETO, OTONI 2003; STAIKIDOU i in. 2005]. Poszczególne w glowodany mog mie ró ny wpływ na morfogenez in vitro. Na przykład glukoza i sacharoza s najlepszymi ródłami w gla w rozmna aniu odmian i klonów Vaccinium [DEBNATH 2005], glukoza dla ro lin z rodzaju Prunus [BORKOWSKA, SZCZERBA 1991], sorbitol dla gatunków z rodzaju Rosaceae [COFFIN i in. 1976], a maltoza w indukcji somatycznej embriogenezy i androgenezy [JEANNIN i in. 1995]. Jednak e najcz ciej stosowanym w po ywkach w glowodanem jest sacharoza, która pod wpływem inwertazy wydzielanej przez tkanki do po ywki, jest rozkładana do glukozy i fruktozy [UEDA i in. 1974; TREMBLAY, TREMBLAY 1995]. Z tego wzgl du eksplantaty rosn ce na po ywce maj mo liwo korzystania z mieszaniny ró nych cukrów: sacharozy, glukozy i fruktozy. W wielu przypadkach dla optymalnego wzrostu i rozwoju ro lin danego gatunku czy odmiany w warunkach in vitro niezwykle istotny jest nie tylko rodzaj, ale i st enie u ytego cukru. Celem bada było poznanie wpływu ró nych cukrów na wzrost i rozwój liliowca in vitro oraz na akumulacj chlorofilu i w glowodanów w p dach. Materiał i metody Materiał ro linny stanowiły p dy przybyszowe wybranego klonu hodowlanego Hemerocallis hybrida, pochodz ce z rozmna ania in vitro. Eksplantaty umieszczano na po ywce podstawowej MS [MURASHIGE, SKOOG 1962] zestalonej agarem, o ph 5,6 ustalonym przed sterylizacj. Po ywk uzupełniano regulatorami wzrostu: 6- benzyloaminopuryn (BAP) 2 mg dm -3, kinetyn 2 mg dm -3, 2-izopentyloadenin (2iP) 2 mg dm -3, tidiazuronem (TDZ) 0,03 mg dm -3 [LEMA SKA, GABRYSZEWSKA 2000]. Do po ywki dodawano sacharoz, glukoz, fruktoz, maltoz i alkoholowe 1 Badania były finansowane przez MNiI, Grant Nr 2 P06R

71 84 L. Kawa-Miszczak i inni pochodne cukrów sorbitol i mannitol. Sacharoz i glukoz stosowano w st eniach 10, 30 i 60 g dm -3, a pozostałe cukry w st eniach 10 i 30 g dm -3. Po 6 tygodniach prowadzenia kultur w fitotronie w temperaturze 20 C i przy 16-godzinnym o wietleniu, mierzono liczb i długo nowych p dów, liczb li ci, wie mas p dów i kalusa oraz analizowano zawarto w glowodanów i chlorofilu w p dach. W ka dej kombinacji było po 5 powtórze, powtórzeniem był słoik z 5 eksplantatami. P dy z 1 słoika przeznaczono do oznaczania zawarto ci chlorofilu w wie ym materiale, a pozostałe p dy liofilizowano (po uprzednim odci ciu kalusa). Zawarto glukozy, fruktozy, sacharozy i skrobi w liofilizowanym materiale oznaczano metodami enzymatycznymi, stosuj c zestawy testów (Boehringer Mannheim GmbH Biochemicals, Niemcy). Zawarto chlorofilu oznaczano metod Bruinsma [BRUINSMA 1963]. Analizy wykonano w 4 powtórzeniach. Wyniki do wiadczenia opracowano statystycznie metod analizy wariancji. Do oceny istotno ci ró nic pomi dzy rednimi zastosowano test t-duncana przy poziomie istotno ci 5%. Wyniki i dyskusja Wzrost i namna anie p dów liliowca in vitro było uzale nione nie tylko od rodzaju, ale równie od st enia cukru dodanego do po ywki. Najwi cej nowych p dów formowało si na po ywce zawieraj cej sacharoz (rys. 1A i 2, fot. 1). Przy czym na po ywce z 30 g dm -3 sacharozy formowało si wi cej nowych p dów, z wi ksz liczb li ci, ni na po ywce z 10 i 60 g dm -3 sacharozy. W traktowaniu tym, wi ksza była równie wie a masa p dów (rys. 3A). Natomiast masa kalusa (rys. 3B) i sucha masa p dów (dane nieprzedstawione) była wy sza przy 60 g dm -3 sacharozy. Wszystkie badane cukry zastosowane w st eniu 30 g dm -3 w wi kszym stopniu oddziaływały na wzrost i namna anie si p dów liliowca, ni w pozostałych st eniach. Jednak e na po ywkach zawieraj cych glukoz, fruktoz czy maltoz w st eniu 30 g dm -3 formowało si mniej p dów, z mniejsz liczb li ci i o ni szej wie ej masie, ni przy 30 g dm -3 sacharozy, ale długo pojedynczych p dów była podobna (rys. 1, 2 i 3). Natomiast dodanie sorbitolu do po ywki w mniejszym stopniu wpływało na wzrost p dów, a na po ywce zawieraj cej mannitol obserwowano brak wzrostu p dów liliowca (rys. 1, 2 i 3). Wpływ st enia sacharozy w po ywce na wzrost ro lin in vitro wykazano w prowadzonych wcze niej do wiadczeniach nad namna aniem p dów Clematis pitcheri. Stwierdzono, e zastosowanie niskiego st enia sacharozy (10 g dm -3 ) zwi kszało współczynnik namna ania oraz stymulowało wzrost wydłu eniowy p dów powojnika, przy czym wpływ st enia sacharozy był uzale niony od temperatury prowadzenia kultur. Wy sze st enie sacharozy w po ywce (30 g dm -3 ) ograniczało powstawanie i wzrost elongacyjny p dów bocznych, w mniejszym stopniu wpływaj c na wzrost p du głównego [GABRYSZEWSKA i in. 2008]. Równie w przypadku Nicotiana plumbaginifolia wysokie st enia heksoz hamowały proces regeneracji p dów [CABOCHE 1987]. Natomiast u kilku odmian Vaccinium corymbosum obserwowano, e wzrost st enia sacharozy w po ywce silnie stymulował powstawanie p dów bocznych, jednak optymalne st enie było ró ne dla poszczególnych odmian [CAO i in. 2003].

72 WPŁYW RÓ NYCH W GLOWODANÓW NA WZROST Rys. 1. Wpływ rodzaju i st enia cukru w po ywce MS na liczb p dów/eksplantat (A) oraz długo pojedynczego p du (B) liliowca; rednie oznaczone t sam liter nie ró ni si istotnie według testu t-duncana przy p=0,05 Fig. 1. Effect of the type and concentration of sugar in the MS medium on the number of shoots/explant (A) and the length of single shoot (B) of Hemerocallis; means with the same letters are not different according to t-duncan s test at p=0.05

73 86 L. Kawa-Miszczak i inni 10 g 30 g 60 g Fot. 1. Wzrost p dów liliowca na po ywce zawierajacej sacharoz w st eniu 10, 30 i 60 g dm -3 Photo 1. The growth of Hemerocallis shoots on the medium containing sucrose at 10, 30 i 60 g dm -3

74 WPŁYW RÓ NYCH W GLOWODANÓW NA WZROST Rys. 2. Wpływ rodzaju i st enia cukru w po ywce MS na liczb li ci/eksplantat liliowca; rednie oznaczone t sam liter nie ró ni si istotnie według testu t-duncana przy p=0,05 Fig. 2. Effect of the type and concentration of sugar in the MS medium on the number of leaves/explant of Hemerocallis; means with the same letters are not different according to t-duncan s test at p=0.05 Porównuj c zawarto w glowodanów w p dach Clematis pitcheri rosn cych in vitro na po ywce z 10 i 30 g dm -3 sacharozy stwierdzono, e p dy akumulowały wi cej glukozy, fruktozy i skrobi na po ywce z wy szym st eniem sacharozy, nie stwierdzono natomiast obecno ci sacharozy w p dach [KAWA-MISZCZAK i in. 2008]. Podobne zale no ci obserwowano w prezentowanych badaniach. Niezale nie od rodzaju cukru w po ywce, p dy liliowca nie zawierały sacharozy. W kulturach prowadzonych na po ywce z sacharoz, akumulacja glukozy, fruktozy i skrobi w p dach była tym wy sza, im wy sze było st enie sacharozy w po ywce, a p dy zawierały wi cej glukozy i fruktozy ni skrobi (rys. 4). W przypadku kultur Clematis pitcheri, zwłaszcza rosn cych na po ywce z 30 g dm -3 sacharozy, najwy sza była w p dach zawarto skrobi [KAWA-MISZCZAK i in. 2008]. Równie w p dach Clematis The President rosn cych in vitro wykazano wysoki poziom skrobi [LEES i in. 1991]. Skrobia była tak e głównym w glowodanem w p dach piwonii zielnej Jadwiga w fazie namna ania [GABRYSZEWSKA, KAWA-MISZCZAK 2006]. W prezentowanych badaniach stwierdzono, e zwi kszenie st enia maltozy w po ywce z 10 do 30 g dm -3 znacznie nasilało akumulacj w glowodanów w p dach (rys. 4). Natomiast wzrost st enia glukozy czy fruktozy w po ywce nie wpływał na zawarto skrobi w p dach, stymuluj c równocze nie akumulacj glukozy i fruktozy. Najwi cej skrobi akumulowały p dy rosn ce na po ywce z sorbitolem, przy czym p dy te zawierały ladowe ilo ci glukozy i fruktozy. Odwrotnie w przypadku p dów rosn cych na po ywce z mannitolem. Przy wy szym st eniu mannitolu (30 g dm -3 ) p dy akumulowały glukoz i fruktoz, a nie zawierały skrobi (rys. 4).

75 88 L. Kawa-Miszczak i inni Rys. 3. Wpływ rodzaju i st enia cukru w po ywce MS na wie mas p dów liliowca (bez kalusa) (A) oraz wie mas kalusa (B) z 1 powtórzenia; rednie oznaczone t sam liter nie ró ni si istotnie według testu t-duncana przy p=0,05 Fig. 3. Effect of the type and concentration of sugar in the MS medium on the fresh weight of shoots of Hemerocallis (without callus) (A) and fresh weight of callus (B) from 1 replicate; means with the same letters are not different according to t-duncan s test at p=0.05 Tabela 1; Table 1 Zawarto chlorofilu ( g 100 mg -1 wie ej masy) w p dach liliowca z zale no ci od rodzaju i st enia cukru w po ywce MS

76 WPŁYW RÓ NYCH W GLOWODANÓW NA WZROST Chlorophyll content ( g 100 mg -1 fresh weight) in Hemerocallis shoots depending on the type and concentration of sugar in the MS medium Cukier; Sugar St enie cukru Sugar concentration (g dm -3 ) Chlorofil a; Chlorophyll a Sacharoza; Sucrose 16,5 f 9,7 c 8,0 b Glukoza; Glucose 12,8 e 10,3 cd 12,3 e Fruktoza; Fructose 11,4 de 15,4 f - Maltoza; Maltose 9,3 bc 18,8 g - Sorbitol; Sorbitol 18,4 g 21,2 h - Mannitol; Mannitol 5,4 a 5,6 a - Chlorofil b; Chlorophyll b Sacharoza; Sucrose 5,7 f 4,3 de 2,7 a Glukoza; Glucose 5,2 f 4,1 c-e 4,5 e Fruktoza; Fructose 4,1 c-e 5,4 f - Maltoza; Maltose 3,5 bc 7,2 g - Sorbitol; Sorbitol 7,0 g 7,2 g - Mannitol; Mannitol 3,8 b-d 3,2 ab - Chlorofil a+b; Chlorophyll a+b Sacharoza; Sucrose 21,6 f 13,4 bc 10,3 a Glukoza; Glucose 17,4 e 13,9 bc 16,4 de Fruktoza; Fructose 15,1 cd 20,0 f - Maltoza; Maltose 12,5 b 25,3 g - Sorbitol; Sorbitol 24,8 g 27,4 h - Mannitol; Mannitol 8,9 a 8,4 a - rednie oznaczone t sam liter nie ró ni si istotnie według testu t-duncana przy p=0,05, oddzielnie dla chlorofilu a, b i a+b; means with the same letters are not different according to t-duncan s test at p=0.05, separately for chlorophyll a, b and a+b

77 90 L. Kawa-Miszczak i inni

78 WPŁYW RÓ NYCH W GLOWODANÓW NA WZROST Rys. 4. Zawarto w glowodanów (w 100 g suchej masy), glukozy (A), fruktozy (B) i skrobi (C), w p dach liliowca w zale no ci od rodzaju i st enia cukru w po ywce MS; rednie oznaczone t sam liter nie ró ni si istotnie według testu t-duncana przy p=0,05, oddzielnie dla A, B i C Fig. 4. The level of carbohydrates (in 100 g of dry matter), glucose (A), fructose (B) and starch (C), in Hemerocallis shoots after theit growth on the MS medium with different types and concentrations of sugar; means with the same letters are not different according to t-duncan s test at p=0.05, separately for A, B and C Analizuj c zawarto chlorofilu w p dach liliowca stwierdzono, e w przeliczeniu na jednostk wie ej masy poziom chlorofilu był najwy szy w p dach rosn cych na po ywce zawieraj cej sorbitol, a najni szy na po ywce z mannitolem (tab. 1). Wysok zawarto ci chlorofilu charakteryzowały si równie p dy rosn ce na po ywkach z maltoz i fruktoz, przy wy szych st eniach tych cukrów (30 g dm -3 ). St enie glukozy w po ywce w niewielkim stopniu wpływało na zawarto chlorofilu w p dach. Natomiast w przypadku p dów rosn cych na po ywce z sacharoz, przy 10 g dm -3 zawarto chlorofilu była najwy sza i obni ała si wraz ze wzrostem st enia tego cukru w po ywce (tab. 1). Inne wyniki uzyskano w badaniach dotycz cych wpływu st enia sacharozy i soli azotowych w po ywce oraz temperatury prowadzenia kultur na zawarto chlorofilu w p dach Clematis pitcheri [KAWA-MISZCZAK i in. 2009]. Zawarto chlorofilu była najwy sza w p dach rosn cych w 20 C, ni sza w 25 C, a najni sza w 15 C. Obni enie poziomu zwi zków azotowych w po ywce do 50% normalnego składu po ywki MS stymulowało akumulacj chlorofilu w p dach Clematis, natomiast wpływ st enia sacharozy w po ywce był niewielki [KAWA- MISZCZAK i in. 2009]. Rodzaj i st enie cukru oraz soli azotowych dodanych do po ywki mog wpływa nie tylko na wzrost i rozwój ro lin w warunkach in vitro, w tym na zawarto chlorofilu i intensywno fotosyntezy, ale równie na aklimatyzacj ro lin w warunkach ex vitro [LEES i in. 1991; GUIDI i in. 1998; JAIN i in. 1999; SOTIROPOULOS i in. 2005]. Wnioski

79 92 L. Kawa-Miszczak i inni 1. Wzrost i rozwój liliowca in vitro zale ał od rodzaju i st enia cukru w po ywce. 2. Wszystkie badane cukry dodane do po ywki w st eniu 30 g dm -3 wpływały korzystniej na wzrost p dów ni w pozostałych zastosowanych st eniach. 3. Sacharoza w st eniu 30 g dm -3 w najwi kszym stopniu zwi kszała współczynnik namna ania, liczb li ci i wie mas p dów. 4. Rodzaj i st enie cukru w po ywce wpływało na zawarto w glowodanów w p dach. 5. Dodanie do po ywki alkoholi cukrowych, bez dodatkowego ródła w gla, nie wpływało korzystnie na wzrost liliowca, ale p dy rosn ce na po ywce z sorbitolem zawierały najwi cej chlorofilu. Literatura BORKOWSKA B., SZCZERBA J Influence of different carbon sources on invertase activity and growth of sour cherry (Prunus cerasus L.) shoot cultures. J. Exp. Bot. 42: BRUINSMA J The quantitative analysis of chlorophyll a and b in plant extracts. Phytochem. Phytobiol. (Chlor. Metabol. Symp.) 2: CABOCHE M Nitrogen, carbohydrate and zinc requirements for the efficient induction of shoot morphogenesis from protoplast-derived colonies of Nicotiana plumbaginifoli. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 8: CAO X., FORDHAM I., DOUGLASS L., HAMMERSCHLAG F Sucrose level influences micropropagation and gene delivery into leaves from in vitro propagated highbush blueberry shoots. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 75: COFFIN R., TAPER C.D., CHONG C Sorbitol and sucrose as carbon source for callus culture of some species of Rosaceae. Can. J. Bot. 54: DEBNATH S.C Effects of carbon source and concentration on development of lingonberry (Vaccinium vitis-idaea L.) shoots cultivated in vitro from nodal explants. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 41: GABRYSZEWSKA E., KAWA-MISZCZAK L Zawarto w glowodanów w kulturach piwonii zielnej w fazie namna ania. XI Ogólnopolska Konferencja Kultur in vitro i Biotechnologii Ro lin Kultury in vitro podstaw biotechnologii ro lin, Mi dzyzdroje, 6-9 wrze nia 2006, PRINT GROUP Daniel Krzanowski, Szczecin, Streszczenia: 36. GABRYSZEWSKA E., KAWA-MISZCZAK L., W GRZYNOWICZ-LESIAK E., SANIEWSKI M Wpływ temperatury oraz zró nicowanego poziomu w gla i azotu w po ywce na wzrost i rozwój Clematis pitcheri in vitro. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 524: GUIDI L., LOREFICE G., PARDOSSI A., MALORGIO F., TOGNONI F., SOLDATINI G.F Growth and photosynthesis of Lycopersicon esculentum (L.) plants as affected by nitrogen deficiency. Biol. Plant. 40: HO S.L., CHAO Y.C., TONG W.F., YU S.M Sugar coordinately and differentially regulates growth- and stress-related gene expression via a complex signal transduction network and multiple control mechanisms. Plant Physiol. 125: JAIN V., PAL M., LAKKINENI K.C., ABROL Y.P Photosynthetic characteristics in two wheat genotypes as affected by nitrogen nutrition. Biol. Plant. 42: JEANNIN G., BRONNER R., HAHNE G Somatic embryogenesis and ogranogenesis

80 WPŁYW RÓ NYCH W GLOWODANÓW NA WZROST induced on the immature zygotic embryo of sunflower (Helianthus annuus L.) cultivated in vitro: role of the sugar. Plant Cell Rep. 15: KAWA-MISZCZAK L., GABRYSZEWSKA E., W GRZYNOWICZ-LESIAK E., SANIEWSKI M Carbohydrate content in Clematis pitcher shoots cultured in vitro depending on temperature and on the level of sucrose and nitrogen in the medium. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 524: KAWA-MISZCZAK L., W GRZYNOWICZ-LESIAK E., GABRYSZEWSKA E., SANIEWSKI M Effect of sucrose and nitrogen level in the medium on chlorophyll and anthocyanin content in Clematis pitcheri shoots cultured in vitro at different temperature. J. Fruit Ornam. Plant Res. (w druku). KOCH K.E Carbohydrate modulated gene expression in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47: LEES R.P., EVANS E.H., NICHOLAS J.R Photosynthesis in Clematis, The President, during growth in vitro and subsequent in vivo acclimatization. J. Exp. Bot. 42: LEMA SKA U., GABRYSZEWSKA E Rozmna anie liliowca in vitro. Zesz. Nauk. ISK 7: MURASHIGE T., SKOOG F A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: NETO V.B.P., OTONI W.C Carbon sources and their osmotic potential in plant tissue culture: does it matter? Sci. Hort. 97: SOTIROPOULOS T.E., MOUHTARIDOU G.N., THOMIDIS T., TSIRAKOGLOU V., DIMASSI K.N., THERIOS I.N Effects of different N-sources on growth, nutritional status, chlorophyll content, and photosynthetic parameters of shoots of the apple rootstock MM 106 cultured in vitro. Biol. Plant. 49: STAIKIDOU I., WATSON S., HARVEY B.M.R., SELBY C Narcissus bulblet formation in vitro: effect of carbohydrate type and osmolarity of the culture medium. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 80: TREMBLAY L., TREMBLAY F.M Maturation of black spruce somatic embryos: sucrose hydrolysis and resulting osmotic pressure of the medium. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 42: UEDA Y., ISHAYAMA H., FUKUI M., NISHI A Invertase in cultured Daucus carota cells. Phytochemistry 13: Słowa kluczowe: Hemerocallis, mikrorozmna anie, akumulacja w glowodanów, zawarto chlorofilu Streszczenie Badano wpływu ró nych w glowodanów na wzrost i rozwój liliowca in vitro. Do po ywki MS dodawano cytokininy oraz sacharoz, glukoz, fruktoz, maltoz i alkoholowe pochodne cukrów, sorbitol i mannitol. Sacharoz i glukoz stosowano w st eniach 10, 30 i 60 g dm -3, a pozostałe cukry w st eniach 10 i 30 g dm -3. Po 6 tygodniach wzrostu kultur w 20 C mierzono liczb i długo p dów, liczb li ci, wie mas p dów i kalusa oraz zawarto w glowodanów i chlorofilu w p dach. Wszystkie badane cukry dodane do po ywki w st eniu 30 g dm -3 wpływały korzystniej na wzrost p dów ni w pozostałych zastosowanych st eniach. Najwi cej nowych p dów z najwi ksz liczb li ci i o najwy szej wie ej masie formowało si na eksplantatach umieszczonych na po ywce zawieraj cej 30 g dm -3 sacharozy, ale zawarto chlorofilu

81 94 L. Kawa-Miszczak i inni była wy sza w p dach rosn cych na po ywce z 10 g dm -3 sacharozy. Im wy sze było st enie sacharozy w po ywce, tym p dy akumulowały wi cej w glowodanów. Niezale nie od rodzaju cukru w po ywce, p dy liliowca nie zawierały sacharozy. P dy rosn ce na po ywce z sorbitolem akumulowały najwi cej skrobi i zawierały najwi cej chlorofilu, ale wpływ sorbitolu na wzrost p dów był niewielki. Natomiast na po ywce zawieraj cej mannitol obserwowano brak wzrostu p dów. EFFECT OF VARIOUS SUGARS ON THE GROWTH AND DEVELOPMENT OF Hemerocallis in vitro Ludwika Kawa-Miszczak, El bieta W grzynowicz-lesiak, Eleonora Gabryszewska, Justyna Góraj, Marian Saniewski Research Institute of Pomology and Floriculture, Skierniewice Key words: Hemerocallis, micropropagation, carbohydrate accumulation, chlorophyll content Summary The effect of carbohydrate type on the growth and development of Hemerocallis in vitro was studied. MS medium supplemented with cytokinins and sucrose, glucose, fructose, maltose, sorbitol and mannitol was used. Sucrose and glucose were provided at 10, 30 and 60 g dm -3 and other sugars at 10 and 30 g dm -3. After 6 weeks of culture at 20 C the number and length of shoots, number of leaves, fresh weight of shoots and callus were measured. The content of carbohydrate and chlorophyll in shoots was also determined. All sugars added at 30 g dm -3 had better effect on the shoot growth than at other concentrations used. As compared to other sugar types and concentrations, on the medium with 30 g dm -3 of sucrose, the highest stimulation of plantlets growth and development occurred. The higher concentration of sucrose in the medium the lower level of chlorophyll and the higher content of carbohydrates in plantlets. Regardless of the sugar used no sucrose was found in shoots. The highest accumulation of starch in shoots took place after the addition of sorbitol to the medium. Explants cultured on the medium with sorbitol also accumulated the highest level of chlorophyll but sorbitol had a small effect on shoots growth. No shoots growth was observed on the medium with mannitol. Dr Ludwika Kawa-Miszczak Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa im. Szczepana Pieni ul. Pomologiczna SKIERNIEWICE Ludwika.Miszczak@insad.pl ka

82 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: WRA LIWO NA KULTURY in vitro ORAZ WYDAJNO REGENERACJI U BURAKA CUKROWEGO Magdalena Klimek, Paweł Adamczyk, Rafał Bara ski Katedra Genetyki, Hodowli i Nasiennictwa, Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołł taja w Krakowie Wst p Burak cukrowy (Beta vulgaris L.) jest ro lin przemysłow o bardzo du ym znaczeniu gospodarczym. Jest on głównie wykorzystywany jako surowiec do produkcji cukru, a dodatkowo produkty uboczne, które powstaj w procesie jego produkcji, mi dzy innymi li cie, melasa, wysłodki, wapno defekacyjne, mog by szeroko wykorzystane jako nawóz, pasza dla zwierz t lub w przemy le spo ywczym. Obecne kierunki hodowli buraka cukrowego s skierowane zarówno na zwi kszenie plonu (odmiany poliploidalne), jak i otrzymanie odmian posiadaj cych po dane cechy, np. podwy szon tolerancj na herbicydy, odporno na choroby oraz szkodniki. Hodowla nowych odmian jest jednak bardzo trudna zarówno ze wzgl du na dwuletni cykl rozwojowy gatunku, jak i ograniczony zakres dost pnej zmienno ci. Wykorzystanie metod biotechnologicznych, w tym otrzymanie ro lin genetycznie zmodyfikowanych (GM), mo e przyczyni si do dalszego ulepszania odmian buraka cukrowego. Otrzymanie odmian GM wymaga opracowania wydajnych metod transformacji obejmuj cych zarówno proces morfogenezy, jak i transgenezy. Wydajno obu procesów jest silnie uzale niona od szeregu czynników, do których nale y zaliczy skład u ywanych po ywek, rodzaj i miejsce pobrania eksplantatu oraz genotyp ro lin wyj ciowych [GÜREL i in. 2008]. Dane literaturowe nie wskazuj jednoznacznie, jakie warunki prowadzenia kultury in vitro buraka cukrowego nale y uzna za optymalne. Ponadto, powa nym problemem, znacznie ograniczaj cym wydajno procesu regeneracji, jest cz ste czernienie i zamieranie tkanek w trakcie prowadzenia kultur [KRENS i in. 1990; GÜREL 1997; YILDIZ i in. 2007]. W niniejszej pracy przedstawiono wyniki porównania reakcji szerokiego zakresu materiałów buraka cukrowego o ró nym pochodzeniu na warunki kultur in vitro oraz proces regeneracji z uwzgl dnieniem składu po ywki. Materiał i metody Materiał ro linny stanowiły 34 genotypy buraka cukrowego o ró nym pochodzeniu. Rozety li ciowe były utrzymywane w szklanych słoikach na po ywce BCM (tab. 1), tj. zmodyfikowanej po ywce MS [MURASHIGE, SKOOG 1962] wzbogaconej o dodatkow ilo tiaminy i regulatory wzrostu. Kultury in vitro prowadzono w fitotronie, w temperaturze 26 ±2 C, przy o wietleniu lampami fluorescencyjnymi o nat eniu

83 96 M. Klimek, P. Adamczyk, R. Bara ski mol m -2 i fotoperiodzie 16/8 h (dzie /noc). Skład po ywek stosowanych w kulturach tkankowych buraka cukrowego The composition of media for sugar beet tissue culture Tabela 1; Table 1 Baza; Basal medium BCM BBP1 BBP3 BZ05 MS Tiamina*; Thiamin* (mg dm -3 ) 0, BAP (mg dm -3 ) 0, NAA (mg dm -3 ) 0, Zeatyna**; Zeatin** (mg dm -3 ) Sacharoza; Sucrose (g dm -3 ) , Agar (g dm -3 ) ph 5,8 5,8 5,8 5,8 Sterylizacja Sterilization Autoklaw, 0,1 MPa, 121 C Autoclaving, 0.1 MPa, 121 C * dodatkowa ilo dodawana do MS z witaminami (Duchefa); additional amount added to MS including vitamins ** sterylizowana przez filtrowanie; filter sterilized Materiał przenoszono co trzy tygodnie na wie po ywk BCM rozdzielaj c rozro ni te rozety li ciowe. Na tej podstawie obliczano współczynnik rozmno enia informuj cy o liczbie uzyskanych p dów potomnych z jednej rozety po 3 tygodniach prowadzenia kultury. W trakcie kultury oceniano tak e stopie wra liwo ci p dów na warunki in vitro, który wyra ano w czterostopniowej skali (tab. 2). Klasy wra liwo ci tkanek na kultury in vitro Scale of tissue sensitivity to in vitro culture Tabela 2; Table 2 Klasa wra liwo ci Degree of sensitivity Powierzchnia zamierania tkanek Surface of tissue blackening * brak; none ** niewielkie fragmenty li ci small fragments of leaves *** pojedyncze li cie; single leaves **** całe p dy; all shoots

84 WRA LIWO NA KULTURY in vitro Rys. 1. Przygotowanie eksplantatów ogonków li ciowych i nerwu głównego do regeneracji p dów Fig. 1. Preparation of explants for shoot regeneration Zdolno do regeneracji p dów badano z wykorzystaniem eksplantatów pobieranych z 2-3-tygodniowych li ci. Eksplantaty stanowiły 1-cm fragmenty ogonka li ciowego i nerwu głównego li cia, po wcze niejszym usuni ciu pozostałej cz ci blaszki li ciowej (rys. 1). Uzyskane eksplantaty wykładano po 10 sztuk do szalek Petriego 90 mm zawieraj cych po ywki regeneracyjne BBP1, BBP3 i BZ05 (tab. 1). Zało ono 3 niezale ne do wiadczenia w 5 powtórzeniach ka de. Regeneracj p dów prowadzono przez okres 6 tygodni w analogicznych warunkach, w jakich prowadzono mikrorozmna anie. Pasa eksplantatów na wie po ywk wykonywano po 3 tygodniach od zało enia eksperymentu. Ocen do wiadcze wykonano dwukrotnie zarówno po 3, jak i 6 tygodniach kultury. Na podstawie uzyskanych wyników obliczono wska nik regeneracji, wyra ony jako iloczyn procentu regeneruj cych eksplantatów oraz redniej liczby zregenerowanych p dów na jednym regeneruj cym eksplantacie. Wskazuje on na teoretyczn liczb zregenerowanych p dów ze stu eksplantatów li ciowych wyło onych na po ywki regeneracyjne. Wra liwo p dów na kultury in vitro Wyniki i dyskusja Wyniki przeprowadzonych do wiadcze ujawniły, e badane 34 genotypy buraka cukrowego wykazywały silnie zró nicowan reakcj na kultury in vitro. Znaczna cz genotypów praktycznie nie tolerowała warunków kultury, co objawiało si szybkimi zmianami tkanek, prowadz cymi do ich czernienia lub szklisto ci. Cz sto niepo dane zmiany obserwowano ju w krótkim czasie po przepasa owaniu p dów na wie e po ywki. Najbardziej wra liwe obiekty wykazywały bardzo silny stopie czernienia obejmuj cy nawet całe rozety li ciowe. Na skutek tak drastycznej reakcji, cz wra liwych genotypów nie podj ła rozwoju in vitro i nie mogła by utrzymana w celu okre lenia wydajno ci mikrorozmna ania ani regeneracji. U mniej wra liwych genotypów dochodziło do rozwoju stref czernienia b d zeszklenia na ich tkankach, jednak e były one na tyle niewielkie, e umo liwiały skuteczne namna anie tkanek oraz pobieranie eksplantatów do do wiadcze zwi zanych z regeneracj. Najbardziej tolerancyjne genotypy zaliczone do pierwszej i drugiej klasy wra liwo ci pozostawały w pełni zielone i cechowały si silnym wigorem przez cały okres trwania pasa u. Spo ród 34 badanych genotypów tylko 16 zakwalifikowano jako tolerancyjne (tab. 3). Dwa z nich (nr 12 i 27) cechowały si wy sz podatno ci na panuj ce warunki i obser-

85 98 M. Klimek, P. Adamczyk, R. Bara ski wowano u nich wi cej zamieraj cych li ci ni u pozostałych genotypów. Mimo takiej reakcji charakteryzowały si one stosunkowo wysokim współczynnikiem rozmno enia wynosz cym 3,3. Wyselekcjonowane genotypy wykazywały równie zró nicowan efektywno namna ania p dów, która wahała si w przedziale od 2,0 do 5,2 potomnych p dów. Cecha ta nie była skorelowana z wra liwo ci na kultury in vitro. W literaturze brak jest doniesie o zamieraniu b d czernieniu p dów u buraka cukrowego w trakcie prowadzenia mikrorozmna ania, by mo e głównie ze wzgl du, i wi kszo autorów pobierało eksplantaty do bada bezpo rednio ze szklarni [GÜREL i in. 2003; GO KA 2004]. Niniejsze badania wskazuj jednak, e zjawisko to w znacznym stopniu ogranicza dost pne zasoby genowe, które mog by wykorzystywane do prac w kulturach tkankowych. 1 Genotyp Genotype Tabela 3; Table 3 Charakterystyka genotypów i zdolno ci do mikrorozmna ania i regeneracji Genotype characteristic and their ability to micropropagation and regeneration Wra liwo 1 Prze ywalno eksplantatów (%) Sensitivity 1 Survived explants % Współczynnik rozmno enia Ratio of micropropagation Wska nik regeneracji; Regeneration rate 3 * 48,9 5,2 ±0,3 5 5 * 45,7 3,4 ±0, * 46,7 2,8 ±0, * 82,2 3,2 ±0, *** 17,5 3,3 ±0, ** 50,8 2,8 ±0, * 61,5 3,5 ±0, ** 59,8 2,0 ±0, * 86,7 3,0 ±0, ** 76,1 3,0 ±0, *** 73,3 3,3 ±0, ** 31,0 3,0 ±0, * 59,5 2,0 ±0, * 98,0 3,5 ±0,3 145 O ** 74,4 5,0 ±0,2 0 S * 68,4 5,0 ±0,3 0 wra liwo genotypów na kultury in vitro: brak (*), mała (**), rednia (***). Opis klas w tek cie i w tabeli 2; genotype sensitivity to in vitro culture: none (*), low (**), medium (***). See the description of the classes in the text and Table 2 Regeneracja p dów Badania prowadzone przez ró nych autorów wskazuj, e regeneracja p dów u buraka cukrowego bardzo silnie zale y od szeregu czynników, głównie rodzaju i miejsca pobrania eksplantatu, składu po ywki oraz genotypu. Bezpo redni regeneracj p dów prowadzono zarówno z hipokotyli, li cieni [GO KA 2004], p ków kwiatowych, wierzchołków p dów, segmentów podwierzchołkowych [KRUCZKOWSKA i in. 1989] oraz ogonków li ciowych [ZHONG i in. 1993; GRIEVE i in. 1997; GÜREL i in. 2003; MISHUTKINA, GAPONENKO 2006]. Najwydajniej proces regeneracji nowych p dów zachodził z

86 WRA LIWO NA KULTURY in vitro eksplantatów pobieranych z ró nych fragmentów li ci. MISHUTKINA, GAPONENKO [2006] indukowali regeneracj p dów z eksplantatów ogonków li ciowych, spo ród których 73-97% tworzyło nowe p dy. DETREZ i in. [1988] stwierdzili, e bezpo redni organogenez u buraka cukrowego mo na osi gn bezpo rednio na młodych li ciach. Wi kszo uzyskanych przez nich p dów rozwijała si w regionie przej cia blaszki li ciowej w ogonek li ciowy. Z ogonka li ciowego pochodziło zaledwie 15% zregenerowanych p dów, natomiast na samej blaszce li ciowej regeneracja nie zachodziła. St d te w przeprowadzonych przez nas badaniach jako eksplantaty wykorzystano fragmenty ogonka li ciowego oraz nerwu głównego pozbawionego blaszki li ciowej. Otrzymane wyniki nie potwierdziły obserwacji o zale no ci wydajno ci regeneracji od pierwotnego poło enia eksplantatu w li ciu, gdy morfogeneza p dów zachodziła na równym poziomie zarówno na eksplantatach pobranych z miejsca przej cia blaszki w ogonek (16,7 ±6,0 bł. std.), jak równie z nerwu głównego blaszki li ciowej (13,4 ±7,5 bł. std.) oraz samego ogonka (10,3 ±4,9 bł. std.). Wpływ regulatorów wzrostu W kulturach tkankowych buraka cukrowego stosowano wiele wariantów po ywek regeneracyjnych, w których uwzgl dniono zró nicowany skład makroi mikroelementów [FREYTAG i in. 1988; KRUCZKOWSKA i in. 1989; OWENS, EBERTS 1992; KULSHRESTHA, COUTTS 1997; GÜREL i in. 2003; GO KA 2004; MISHUTKINA, GAPONENKO 2006]. Jednak e, jak wskazuj uzyskane wyniki, wpływ tych składników na wydajno regeneracji i jako kultury nie był znaczny. Znacznie wi kszy wpływ ma rodzaj oraz st enie zastosowanego regulatora wzrostu. Najcz ciej w badaniach wykorzystywano BAP [ZHONG i in. 1993; GRIEVE i in. 1997; GO KA 2004; MISHUTKINA, GAPONENKO 2006] b d te BAP ł cznie z auksyn [FREYTAG i in. 1988; GÜREL i in. 2003]. Wydajno regeneracji zazwyczaj była wysoka, jednak e w bardzo du ym stopniu była uzale niona od samego genotypu. Dodatkowo, cz sto wyniki uzyskane przez ró ne zespoły badawcze, korzystaj ce z tej samej techniki regeneracji p dów, znacznie ró niły si, co tłumaczone jest przede wszystkim ró nym pochodzeniem materiału ro linnego u ytego do bada oraz jego wysok heterozygotyczno ci. W zwi zku z powy szym proponowane przez licznych autorów po ywki nie s w adnym stopniu uniwersalne [GÜREL i in. 2003]. Niniejsze badania, maj ce na celu okre lenie ywotno ci eksplantatów oraz wydajno ci regeneracji, oparto w pierwszej kolejno ci o dobór wła ciwej po ywki, któr testowano w oparciu o wyniki reakcji czterech genotypów. W do wiadczeniu tym uwzgl dniono trzy po ywki o zró nicowanym składzie regulatorów wzrostu (tab. 1). Z testowanych po ywek najkorzystniejsza okazała si BBP1, która zawierała 1 mg dm -3 BAP. W przypadku trzech genotypów co najmniej 80% wyło onych eksplantatów pozostawało ywotnych po 3 tygodniach kultury. Na po ywce BBP3 zawieraj cej 3 mg dm -3 BAP ywotno eksplantatów wahała si w przedziale od 65-98%, a na po ywce BZ05 w zakresie od 10-65% wyło onych eksplantatów. Dodatkowo po ywka BBP1 umo liwiała uzyskanie wysokiej wydajno ci regeneracji. W przypadku wi kszo ci genotypów uzyskiwano znacznie wy sz wydajno regeneracji ni w przypadku pozostałych po ywek. Uzyskane wyniki s zgodne z ZHONG i in. [1993], którzy równie uzyskali wy sz wydajno regeneracji na po ywce z 1 mg dm -3 BAP ni w obecno ci wy szego st enia regulatora wzrostu. Natomiast GO KA [2004] uzyskała najni sz wydajno regeneracji w obecno ci 1 mg dm -3 BAP, znacznie wi cej p dów regenerowało w obecno ci wy szego st enia czynnika. Z kolei wpływ zeatyny na wydajno regeneracji badali MISHUTKINA i GAPONENKO [2006], którzy uzyskali stosunkowo wysok wydajno regeneracji; była ona na podobnym poziomie jak ta uzyskana w obecno ci BAP.

87 100 M. Klimek, P. Adamczyk, R. Bara ski Wpływ genotypu Na podstawie przeprowadzonych bada, w dalszych do wiadczeniach uwzgl dniono jedynie po ywk zawieraj c 1 mg dm -3 BAP, któr wykorzystano do porównania 16 genotypów pod wzgl dem zdolno ci regeneracji, a które wyselekcjonowano w trakcie mikrorozmna ania. Wykazywały one zró nicowan wydajno regeneracji nowych p dów. Procent regeneruj cych eksplantatów wahał si w przedziale od 0% do 65%, ale tylko u jednego z 16 badanych genotypów procent ten wynosił znacznie powy ej 30% (nr 30), a u jednego powy ej 60% (nr 22; rys. 2). Zazwyczaj do regeneracji nowych p dów dochodziło w miejscu bezpo redniego uszkodzenia tkanki, jednak e obserwowano równie ich indukcj z tkanek nieuszkodzonych. Zwykle na jednym eksplantacie rozwijało si od 1 do 4 nowych p dów, podczas gdy najbardziej podatny na regeneracj genotyp nr 22 wytwarzał rednio 9 p dów na jednym regeneruj cym eksplantacie (rys. 3). U najbardziej podatnych genotypów cz sto dochodziło do regeneracji nowych p dów niemal e na całej powierzchni wyło onych eksplantatów, dzi ki czemu z jednego regeneruj cego eksplantatu mo liwe było uzyskanie wielu, nawet kilkudziesi ciu zregenerowanych p dów. Znaczna cz badanych przez nas genotypów nie wykazywała zdolno ci do indukcji nowych p dów b d proces ten zachodził na nieznacznej liczbie wyło onych eksplantatów. Tak sytuacj obserwowano u genotypów, które wykazywały zarówno wysok tolerancj na warunki kultury in vitro, jak i wysok ywotno eksplantatów, np. genotypy 10 i S. Uzyskane przez nas wyniki na podstawie porównania 16 genotypów pokazuj, e ró nice mi dzy genotypami w ich potencjale do regeneracji s bardzo du e. Inni autorzy, którzy stosowali dodatek 1 mg dm -3 BAP do po ywki regeneracyjnej, obserwowali mniejsze wahania wydajno ci regeneracji pomi dzy badanymi genotypami. MISHUTKINA, GAPONENKO [2006] badaj c 7 genotypów uzyskali wydajno regeneracji w zakresie od 30-60%, a ZHONG i in. [1993] w zakresie od 15 do 45%. W literaturze zazwyczaj brak jest danych opisuj cych liczb zregenerowanych p dów. Tylko YILDIZ i in. [2007] porównali trzy linie buraka cukrowego i wykazali, e na po ywce z 1% sacharoz liczba otrzymanych p dów wahała si od 2,3 do 14,4, a dla linii CBM315 osi gn ła nawet 23,7 przy najlepszej kombinacji st enia regulatorów wzrostu (1 mg dm -3 BAP+0,2 mg dm -3 NAA). Wskazali oni tym samym na mo liwo ró nej reakcji genotypów na stosowane po ywki.

88 WRA LIWO NA KULTURY in vitro Czernienie eksplantatów Zaobserwowano zró nicowan ywotno eksplantatów w trakcie kultury in vitro, która wahała si w przedziale od 18% do 98% w zale no ci od genotypu (tab. 3).

89 102 M. Klimek, P. Adamczyk, R. Bara ski Dodatkowo nie korelowała ona z wra liwo ci p dów w trakcie mikrorozmna ania, poniewa stosunkowo cz sto obserwowano genotypy, które pomimo wysokiej tolerancji na kultury in vitro wykazywały nisk ywotno eksplantatów (np. genotypy 3, 5, 8). Zamieranie eksplantatów zazwyczaj zaczynało si od rozwoju niewielkiego fragmentu ciemnej tkanki, głównie w miejscu bezpo redniego kontaktu eksplantatu z po ywk i nie miało zwi zku z miejscem uszkodzenia w trakcie przygotowania eksplantatu. W trakcie trwania kultury dochodziło do powi kszania si nekrozy, w efekcie czego obserwowano nawet całkowite zamieranie eksplantatu. Sporadycznie równie obserwowano zamieranie b d szklenie si eksplantatów, na których doszło do regeneracji nowego p du. Zamieranie eksplantatów mo e by spowodowane oksydacj zwi zków fenolowych [GÜREL i in. 2001]. Obecno zwi zków fenolowych wpływa w znacznym stopniu na zahamowanie wzrostu tkanek oraz powoduje powstawanie nekroz. Stwierdzono, i w procesie czernienia tkanek bior udział głównie dwa enzymy: polifenylooksydaza oraz polifenyloperoksydaza, których obni enie aktywno ci na drodze chemicznej b d enzymatycznej prowadzi do ograniczenia czernienia [DOWD, NORTON 1995]. W kulturach in vitro najcz ciej zaleca si metody chemiczne zmierzaj ce do ograniczenia aktywno ci wymienionych enzymów, najcz ciej sugerowanymi s w giel aktywowany, kwas askorbinowy, kwas cytrynowy oraz chlorek sodu [YILDIZ i in. 2007]. W przypadku buraka cukrowego przeprowadzono szereg bada maj cych na celu obni enie zawarto ci zwi zków fenolowych, a co za tym idzie ograniczenie rozwoju czernienia i zamierania tkanek. Stwierdzono korzystny wpływ obni onej w po ywce zawarto ci NaCl [DIAS, COSTA 1983], dodatku prowitaminy D 2 [KE- VERS i in. 1983], a tak e dodatku w gla aktywowanego [YILDIZ i in. 2007]. Zabieg taki powodował równie w znacznym stopniu ograniczenie wydajno ci regeneracji. Najkorzystniejsze efekty, zapewniaj ce zarówno silne ograniczenie zamierania tkanek, a tak e wydajn regeneracj, zapewniło obni enie zawarto ci sacharozy do poziomu 1% [YILDIZ i in. 2007]. W ostatnich latach u pewnych gatunków, np. ry u, udało si zidentyfikowa markery QTL bezpo rednio skorelowane z czernieniem tkanek w kulturach in vitro [ZHONG i in. 2007]. Umo liwiło to bardzo proste i szybkie zidentyfikowanie genotypów przydatnych w do wiadczeniach nad regeneracj nowych p dów. Dlatego te prowadzenie przyszłych bada nad zastosowaniem dodatkowych składników antyoksydacyjnych mo e pozwoli na ograniczenie zjawiska czernienia eksplantatów. Efektywno procesu regeneracji jest uzale niona od 1) procentu eksplantatów, które podejmuj morfogenez oraz 2) liczby tworz cych si p dów na eksplantacie. Dlatego dobr miar efektywno ci mo e by wska nik regeneracji uwzgl dniaj cy oba te parametry i pozwalaj cy na oszacowanie teoretycznej liczby p dów, jak mo na uzyska ze 100 eksplantatów wyło onych na po ywk regeneracyjn. Porównanie uzyskanych warto ci wska nika regeneracji wskazuje, e badane genotypy drastycznie ró niły si w zdolno ci do regeneracji (tab. 3). Na tej podstawie wyselekcjonowano sze genotypów buraka cukrowego, które charakteryzowały si du ym potencjałem do regeneracji (wska nik regeneracji powy ej 40) i mog by przydatne do dalszych bada nad transformacj genetyczn tego gatunku. Nale y równocze nie zauwa y, e genotypy te nie wykazywały predyspozycji do intensywnego mikrorozmna ania. Otrzymane wyniki wskazuj, e genotyp jest kluczowym czynnikiem, który musi zosta uwzgl dniony w badaniach wymagaj cych zastosowania wysoce efektywnego procesu regeneracji nowych p dów. Wnioski

90 WRA LIWO NA KULTURY in vitro Rozety li ciowe buraka cukrowego wykazuj znaczne zró nicowanie zarówno pod wzgl dem wra liwo ci na kultury in vitro, jak i wydajno ci mikrorozmna ania. 2. Regeneracja p dów na eksplantatach li ciowych jest silnie uzale niona od rodzaju oraz st enia regulatora wzrostu. Najwy sz wydajno morfogenezy uzyskano w obecno ci 1 mg dm -3 BAP, natomiast obecno zeatyny znacznie ograniczała zachodzenie tego procesu głównie ze wzgl du na intensywne zamieranie eksplantatów. 3. Na wydajno regeneracji p dów w du ym stopniu wpływa tak e genotyp buraka cukrowego. W ród 16 badanych zidentyfikowano sze, których eksplantaty charakteryzowały si wysok prze ywalno ci oraz zdolno ci do morfogenezy. Literatura DETREZ C., TÉTU T., SANGWAN RS., SANGWAN-NORREEL BS Direct organogenesis from petiole and thin cell layer explants in sugar beet cultured in vitro. J. Exp. Bot. 39: DIAZ M.A., COSTA M.M Effect of low salt concentrations on nitrate reductase and peroxidase of sugar beet leaves. J. Exp. Bot. 34: DOWD P.W., NORTON R.A Browning-associated mechanism of resistance to insects in corn callus tissues. J. Chem. Ecol. 21: FREYTAG A.H., ANAND S.C., RAO-ARELLI A.P., OWENS L.D An improved medium for adventitious shoot formation and callus induction in Beta vulgaris L. in vitro. Plant Cell Rep. 7: GO KA M Wpływ cytokinin na morfogenez buraka cukrowego (Beta vulgaris L.) w kulturach in vitro. Biotechnologia 65: GRIEVE T.M., GARTLAND K.M.A., ELLIOTT M.C Micropropagation of commercially important sugar beet cultivars. Plant Growth Regul. 21: GÜREL E Callus and root development from leaf explants of sugar beet (Beta vulgaris L.): variability at variety, plant and organ level. Turk. J. Bot. 21: GÜREL E., GÜREL S., LEMAUX P Biotechnology applications for sugar beet. Crit. Rev. Plant Sci. 27: GÜREL S., GÜREL E., KAYA Z Callus development and indirect shoot production from seedling explants of sugar beet (Beta vulgaris L.) cultured in vitro. Turk. J. Bot. 25: GÜREL S., TOPAL S., GÜREL E The effect of pretreating seedlings with TDZ on direct shoot regeneration from petiole explants of sugar beet (Beta vulgaris L.). Asia Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 11: KEVERS C.L., STICHER C., PENEL H., GREPPIN H., GASPAR TH The effect of ergosterol, ergocalciferol and cholecalciferol on calcium-controlled peroxidase secration by sugarbeet cell. Physiol. Plantarum 57: KRENS F.A., JAMAR D., ROUWENDAL G.J.A., HALL R.D Transfer of cytoplasm from new Beta CMS source to sugar beet by asymmetric fusion. Theor. Appl. Genet. 79: KRUCZKOWSKA H., MISZKE W., PAWŁOWSKA H., SKUCI SKA B Przydatno ró nych eksplantatów nasiennika buraka pastewnego do klonowania in vitro. Acta Agraria et

91 104 M. Klimek, P. Adamczyk, R. Bara ski Silvestria 28: KULSHRESTHA S., COUTTS R.H.A Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from mature sugarbeet (Beta vulgaris L.) zygotic cotyledons. Plant Growth Regul. 22: MISHUTKINA YA.V., GAPONENKO A.K Sugar beet (Beta vulgaris L.) morphogenesis in vitro: effects of phytohormone type and concentration in the culture medium, type of explants, and plant genotype on shoot regeneration frequency. Russ. J. Genet. 42: MURASHIGE T., SKOOG E A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue culture. Physiol. Plant. 15: OWENS L.D., EBERTS D.R Sugarbeet leaf disc culture: an improved procedure for inducing morphogenesis. Plant Cell Tiss. Organ. Cult. 31: YILDIZ M., ONDE S., OZGEN M Sucrose effects on phenolic concentration and plant regeneration from sugar beet leaf and petiole explants. J. Sugar Beet Res. 44: ZHONG L., DUAN S., KONG J., SHAOQING L., YANGSHENG L., YINGGUO Z A single genetic locus in chromosome 1 controls conditional browning during the induction of calli from mature seeds of Oryza sativa ssp. Indica. Plant Cell Tiss. Organ. Cult. 89: ZHONG Z., SMITH HG., THOMAS TH In vitro culture of petioles and intact leaves of sugar beet (Beta vulgaris). Plant Growth Regul. 12: Słowa kluczowe: Beta vulgaris, burak cukrowy, regeneracja, czernienie Streszczenie Mo liwo przeprowadzenia transformacji genetycznej wymaga opracowania skutecznej techniki regeneracji p dów. Jednak e w przypadku buraka cukrowego (Beta vulgaris L.) pojawia si szereg czynników wpływaj cych, a cz sto dodatkowo ograniczaj cych wydajn morfogenez. Prezentowane wyniki otrzymano z bada 34 genotypów, u których oceniono tolerancj na warunki prowadzenia kultury in vitro i potencjał namna ania p dów na drodze mikrorozmna ania. Na podstawie intensywno ci czernienia tkanek wybrano 16 genotypów, które nie wykazywały znacz cych zmian nekrotycznych na li ciach i charakteryzowały si stosunkowo wysokim potencjałem do namna ania p dów. Wyselekcjonowane genotypy ró niły si znacznie pod wzgl dem prze ywalno ci eksplantatów li ciowych (18-98%), procentem regeneruj cych eksplantatów (0-65%) oraz liczb nowo tworz cych si p dów ( rednio 0-9). Najbardziej podatny genotyp regenerował p dy na całej powierzchni eksplantatów, co pozwalało na uzyskanie nawet kilkudziesi ciu nowych p dów z jednego eksplantatu. SUGAR BEET SENSITIVITY TO in vitro CONDITIONS AND THE EFFICIENCY OF REGENERATION Magdalena Klimek, Paweł Adamczyk, Rafał Bara ski Department of Genetics, Plant Breeding and Seed Science, Agricultural University, Kraków Key words: Beta vulgaris, sugar beet, regeneration, blackening

92 WRA LIWO NA KULTURY in vitro Summary Genetic transformation requires establishing the efficient regeneration procedure. However in sugar beet (Beta vulgaris L.) culture there are however several factors affecting and limiting morphogenesis. The presented results were obtained from 34 genotypes, evaluated for their sensitivity to in vitro conditions and shoot development potential. Based on the intensity of tissue blackening, 16 genotypes were selected which did not show any significant leaf decay and were characterized by a high morphogenic potential. Those genotypes differed considerably in the leaf explant survival rate (19-98%), percentage of regenerated explants (0-65%) and the number of new shoots (0-9 on the average). The most potent genotype regenerated shoots along the whole surface of the explants that allowed a large number of shoots to be obtained per one explant. Dr hab. Rafał Bara ski Katedra Genetyki, Hodowli i Nasiennictwa Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołł taja al. 29 Listopada KRAKÓW baranski@ogr.ar.krakow.pl

93 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: PRELIMINARY INVESTIGATION OF CYTOLOGICAL STABILITY OF THE HYBRID Cattleya waltersiana C. schoenbrunnensis, AND C. schoenbrunnensis (Orchidaceae) in vivo AND in vitro Edyta Kobylec 1, Tomasz Ilnicki 1, Andrzej Joachimiak 1, Teresa Cybularz-Urban 2 1 Department of Plant Cytology and Embryology, Jagiellonian University, Kraków 2 Department of Botany, Agricultural University, Kraków Introduction Orchidaceae are very interesting plants, both in terms of their structure and environmental requirements. They have beautiful flowers, highly valued by horticulturists and breeders of ornamental plants [ARDITTI 1977]. Natural capability of hybridization and introgression are their natural characteristic feature [HEDREN 1996; PEAKL et al. 1997; PEDERSEN 1998; OSZKINIS 2000; D EMERICO 2005]. Since 1863 species of the genus Cattleya have already been used for hybridization with plants belonging to related genera, such as Laelia, Epidendrum, Brassavola, Sophronitis, Schomburghia, Diactrium [OSZKINIS 2000]. This initiated cultivation of artificially developed intervarietal, interspecies or intergeneric hybrids [STORT 1984], characterized by abundant flowering and a multitude of lip shapes and colors. Interspecific hybrids are usually characterized by a higher ploidy than parent species because a quick recovery of hybrid fertility usually requires the doubling of chromosome number. Therefore, from the caryological point of view, orchid hybrids are interesting though still a little known group. A majority of cytological studies conducted so far on orchids have been limited to the determination of the somatic chromosome number. It was estimated to range from 2n=10 in Psygmorchis pussilla (L.) [FELIX, GUERRA 1999] to 2n=168 in two Oncidium species [FELIX, GUERRA 2000]. Caryological studies are hindered by problems with obtaining high-quality chromosomal preparations and by the fact that plants propagated in vitro are characterized by uncontrolled variability. Several types of this variability were distinguished [BORKOWSKA 1995, 1997]. One of them, a somaclonal variation, that can be observed at the morphological level, frequently occurs in regenerates of many plant species in tissue cultures [STELLY et al. 1989; BORKOWSKA 1997]. A precise determination of causes of morphological variability in somaclones has not been so far possible [PL DER 1997]. However, it was principally attributed to changes in chromosome numbers. Polyploidy is more frequent in tissue cultures than aneuploidy [KAEPPLER et al. 2000]. According to PERA [1970], different odd polyploids obtained by in vitro methods (triploids, pentaploids) can be a product of

94 108 E. Kobylec et al. genomic segregation in multipolar mitoses. Several ploidy levels, sometimes associated with morphological changes can be seen in certain plant groups, e.g. Anacamptis s.1. species, even under natural conditions. Moreover, plants of the same species can have different cytotypes depending on the geographical location [BERNARDOS et al. 2003; D EMERICO 2005]. Aneuploidy, though rarer, was also encountered in in vitro cultures. Aneuploids usually develop in the first phase of callus induction during amitosis, i.e. nucleus fragmentation [D AMATO 1985]. The aim of this study was to determine chromosome numbers in Cattleya waltersiana C. schoenbrunnensis and one of the parent C. schoenbrunnensis in vivo and to compare cytological stability on the basis of nuclei size and its their structure of the hybrid orchid with the callus from which they had been derived and the only available parent species C. schoenbrunnensis grown in vitro in tissue cultures, and in vivo. Material and methods The studies were conducted on plants of the genus Cattleya waltersiana C. schoenbrunnensis and one of the parent species C. schoenbrunnensis grown in Botanical Garden of Jagiellonian University. The plants were obtained in vivo in a greenhouse (perennial plants) or in vitro at different developmental stages from a 7-day callus to 1-year plants. Callus and young plants were cultured under sterile conditions on the MS medium with KOZAK S modification [1991], supplemented with 2.0 mg dm -3 adenine sulfate, 9.7 mg dm -3 ascorbic acid, 0.5 mg dm -3 zeatin, 4.95 mg dm -3 BA and 1.0 mg dm -3 NAA. The medium solidified with 0.8% agar (Difco) had ph 5.5. Sucrose (3%) was used as a carbon source. Tissue cultures were maintained in 350 ml glass flasks containing 50 ml of the medium at a constant temperature of 25 C ±2 C, about 70% relative humidity, under 16 h light/8 h dark cycle. Callus was subcultured at 3-week intervals while plants were subcultured at 3-month intervals. Fluorescent lamp emitting white light of 80 mol m -2 s -1 intensity was used as a light source. Root tips from aerial roots of both species and small callus pieces fixed in acetic-alcohol (1:3) comprised the direct material for study. Specimens from this material were stained with toluidine blue, Schiff s reagent and fluorescent dye DAPI. Material for analysis of the chromosome number was treated with -bromonaphtalene or 8-hydroxyquinoline for 24 h at 4 C. Detailed procedures of slide preparation and staining were described earlier [JOACHIMIAK 1994]. Nuclei size analysis was conducted always on the basis of 50 randomly chosen nuclei. To determine the approximate diameter of a nucleus, its length (the largest dimension) and width (the smallest dimension) were measured and their mean was calculated. Data obtained for each specimen were grouped into 12 classes of an equal size (every 2 m) from 4 m to 28 m. Cytological specimens were examined and analyzed using Optiphot 2 microscope (Nikon) equipped with mercury lamp and black-and-white camera (Bishke) and some images were stored on a computer. The images were processed using Photostyler (Adobe). Nucleus length was measured using Mickey software. Additional photographs were taken with Nikon camera and Kodak 400 film.

95 PRELIMINARY INVESTIGATION OF CYTOLOGICAL STABILITY Results Some problems with obtaining metaphase plates and even dividing cells from root tips and from callus were encountered in the initial phase of the research. This is a frequent problem in the family Orchidaceae. Specimen incubation in -bromonaphtalene was unsuccessful. A little better results were obtained after the treatment with 8-hydroxyquinoline and additional storage in a refrigerator (24 h). This procedure allowed to obtain scanty metaphase plates, in which chromosomes were appropriately shortened and well-stained. Cytological analysis of slides was hindered by numerousness of tiny chromosomes weakly differentiated in terms of length, whose centromeres were usually difficult to distinguish. In order to determine chromosome number in root tips of the hybrid C. waltersiana C. schoenbrunnensis, the best six metaphase plates were selected from among a dozen or so plates obtained in the experiment. The analysis showed wide differences in chromosome number between plates: one of them contained 45 chromosomes (Photo 1A), two plates had 57 (Photo 1B) and the next two 62 chromosomes each (Photo 1C) and one plate had 69 chromosomes (Photo 1D). Unfortunately, metaphase cells in callus of this hybrid (from which the study plants originated) were not found. To determine chromosome number in the roots of C. schoenbrunnensis, two out of several obtained metaphase plates were selected. Each of them contained 34 chromosomes (Photo 1E, F). No metaphase plates from callus of this species were obtained. The size of interphase nuclei in the aerial roots of C. waltersiana C. schoenbrunnensis ranged from 7.1 m to 17.7 m, but nuclei with the diameter of about 10 m were most often observed. The diameter of callus nuclei in the hybrid showed a wide variation, ranging from 7.3 m to 26.7 m, and was the largest in whole material under study, however, small nuclei of about 9 m in diameter were the most frequent. The size of interphase nuclei in aerial roots of C. schoenbrunnensis varied from 4.3 m to 13.6 m. The diameter from 8 m to 9 m was the most common. These nuclei were the smallest and the least variable in size (Photo 2D). The diameter of callus nuclei in this species was from 5.8 m to 23.8 m. The most frequent were the nuclei of 7-8 m in diameter. Analysis of the number of chromocenters in the root meristem of C. waltersiana C. schoenbrunnensis (corresponding to the number of bright segments) revealed 4-7 structures. They were large, distinct, oval aggregates of DAPI-positive chromatin (Photo 2A). In callus cells of this hybrid, bright segments amounting to 6 10 were numerous. In this case, chromocenters were clearly distinguishable, the brightest and the largest of all specimens under analysis (Photo 2B, C).

96 110 E. Kobylec et al. A D C. waltersiana C. schoenbrunnensis E F C. schoenbrunnensis A - 2n=45; B - 2n=57; C - 2n=62; D - 2n=69; E F - 2n=34 Photo 1. Fot. 1. Metaphase plates stained with 0.1% toluidine blue water solution Płytki metafazowe barwione 0,1% wodnym roztworem bł kitu toluidyny

97 PRELIMINARY INVESTIGATION OF CYTOLOGICAL STABILITY Photo 2. DAPI-stained interphase nuclei of C. waltersiana C. schoenbrunnensis (A -roots, B-C - callus). DAPI-stained interphase nuclei of the parent species C. schoenbrunnensis (D - roots, E-F - callus) Fot. 2. J dra interfazowe C. waltersiana C. schoenbrunnensis barwione DAPI (A -korzenie, B-C - kalus). J dra interfazowe C. schoenbrunnensis barwione DAPI (D - korzenie, E-F - kalus)

98 112 E. Kobylec et al. The number of chromocenters in C. schoenbrunnensis root meristem was the smallest varying from 2 to 4. Moreover, they were tiny, elongated and showed less bright fluorescence (Photo 2D). Callus cells of this species exhibited large variability in the terms of the number of chromocenters. Their number ranged from 4 to 8. They were the tiniest of all analyzed specimens, so tiny that they were very difficult to count. Unlike in root meristem, they showed, however, bright fluorescence (Photo 2E, F). Discussion Chromosome numbers in somatic cells from (growth cones) the tips of aerial roots of the hybrid form C. waltersiana C. schoenbrunnensis were diverse and amounted to 2n=45, 57, 62, 69. The number of chromosomes in one of parent plants C. schoenbrunnensis was estimated at 2n=34. There were problems with obtaining the second parent (C. waltersiana), and the somatic number 2n in this plant could not be determined. Due to a large number of chromosomes, their small size and similar morphology, precise establishing of karyotype of the plants under study was not possible. Since the second parent plant was not available and there were no literature data on its chromosome number, it was difficult to calculate the chromosome number in the hybrid, which should be the sum of parents chromosome number. Since the hybrid proved to be a cytological chimera anyway, the cause of diverse chromosome number in its tissues seems to be more interesting. There may be several basic sources of this variability: firstly, unstable chromosome number merely due to hybridity (non-matching parental genomes resulting in elimination of some chromosomes, polyploidy, etc.), secondly, the derivation of specimens under analysis from callus cultures in vitro which are usually cytologically unstable [BORKOWSKA 1995; JOACHIMIAK et al. 1995]. The variability of chromosome numbers is often observed in orchids, although the causes are not always known. The genus Epipactis can be an example of different chromosome numbers [BERNARDOS et al. 2003]. High ploidy level was described in Dactylorhiza, Gymnadenia of the subtribe Orchidinae [D EMERICO 2005], and for the subtribes Cymbidioid [FELIX, GUERRA 2000], Spiranthes [ARFT, RANKER 1998]. Autotetraploids and allopolyploids prevailed in this group, which was attributed to the fact that most of species were of hybrid origin [HEDREN 1996, 2003]. It is interesting that species of Cymbidioid subtribe have a very high ploidy and variable basic chromosome number [FELIX, GUERRA 2000], very difficult to establish. Numerous cases of somatic aneuploidy were noted in the genus Ophrys with somatic chromosome numbers 2n=37, 38, 39, 40, which correlated with the hybridization or introgression [D EMERICO 2005]. A serial aneuploid with unstable chromosome number was observed in the species Epipactis tremolsii, which according to the authors, can indicate the development of a new species [KULA 1999; CIE LAK et al. 2000; BERNARDOS et al. 2003]. D'EMERICO [2005] in his article presented several cases of interspecific hybridization in orchids. Some hybrid plants of genus Anacamptis (A. morio 2n=36 A. papilionacea 2n=32) had a chromosome number of one of the parents, while other specimens showed the intermediate chromosome numbers. Chromosome numbers in the offspring of this hybrid obtained by a vegetative propagation of bulbs were 2n=33, 34, 35 [D EMERICO 2005]. Chromosome numbers in the genus Ophrys (O. apulica O. bombyliflora) were 2n=2x=36 and 2n=4x=72, 2n=6x=108, 2n=8x=144 [D EMERICO 2005]. ARFT and RANKER [1998] investigated rare species of the genus Spiranthes. It was shown that most of these species are alloploids (hybrids as well), obtained by chromosome doubling. Many

99 PRELIMINARY INVESTIGATION OF CYTOLOGICAL STABILITY reports proved that interspecific hybrids can possess very variable chromosome numbers, which may be due to the polyploidization. Propagation in in vitro cultures, particularly if cultures originated from callus may be a source of instability and distorted chromosome number. It can be explained by different reasons, e.g. the effect of hormones in the culture media [JOACHIMIAK, ILNICKI 1997]. Somaclonal variation, consequent to genetic changes in in vitro cultures is already manifested in the first-generation regenerants [BORKOWSKA 1995]. It results in the deviations in chromosome numbers and structure, amplification, loss of DNA fragments, and nuclear DNA rearrangement [GOLCZYK 1994; JOACHIMIAK et al. 1995; PL DER 1997; KAEPPLER et al. 2000; KONIECZNY et al. 2003]. The studies of the nuclei size presented here confirm the hypothesis that cytological stability in vitro is much lower than in vivo. They reveal that the plants regenerated in vitro are more stable and show smaller variability than callus, from which they originated. However, our observations suggest that cytological variability of C. waltersiana C. schoenbrunnensis specimens under study does not need to result from their derivation from in vitro culture, but it can be consequent to the hybrid origin. It can be deduced from the fact, that C. schoenbrunnensis plants derived from callus have presumably constant somatic chromosome number in tissues (2n=34). This issue can be elucidated by the analysis of chromosome number of specimens from Botanical Garden of Jagiellonian University because they were obtained by sexual reproduction, not cloning. Such an attempt was undertaken but the metaphase plates from these plants were not achieved. The occurrence of heterochromatin in orchid karyotypes is an interesting phenomenon. Two types of heterochromatin are currently distinguished: constitutive and facultative [JOACHIMIAK 1983]. Constitutive heterochromatin exhibits species specificity. Its amount is expressed in the percent of the karyotype length [JOACHIMIAK, ILNICKI 1997] or the percent of the area in the interphase nucleus [KAO et al. 2001]. Its content is constant in tissues of an individual, except for some polyploid cells, where it may be elevated or diminished due to the incomplete replication or amplification [JOACHIMIAK 1983]. Such changes were observed by NAGL [1972], and SCHWEIZER and NAGL [1976] in Cymbidium orchid protocorms cultured in vitro. KAO et al. [2001] discovered a positive relationship between the amount of the nuclear DNA and heterochromatin content in the interphase nucleus in the genus Phalaenopsis. Three basic heterochromatin locations and types can be distinguished: a) telomeric, b) intercalary and c) centromeric [JOACHIMIAK 1983]. The latter is the most common among orchids [KAO et al. 2001]. The analysis of the heterochromatin contribution to plant karyotypes indicates that large chromosomes usually have more heterochromatin than small ones. For instance, large chromosomes in Orchis often possess heterochromatin arms while small ones do not have them at all or contain only trace amounts of heterochromatin [D EMERICO et al. 2002]. In the genus Phalaenopsis, which has relatively small chromosomes, heterochromatin is gathered around centromere. Changes in the contents of the repetitive DNA (the main component of constitutive heterochromatin) can cause different effects in cells and organism, such as changes in the nucleus volume, cell dimensions, length of cell cycle [JOACHIMIAK 1983; KAO et al. 2001]. Comparing the number of DAPI-positive chromocentres, some differences were observed between plants under study: C. waltersiana C. schoenbrunnensis and C. schoenbrunnensis, and callus from which they originated. In both cases, the number of chromocenters was greater in callus than in the plant. Furthermore, two observations regarding chromocenters deserve attention. Firstly, in the hybrid, there were no weakly fluorescent segments characteristic of C. schoenbrunnensis, secondly, in the latter,

100 114 E. Kobylec et al. heterochromatin segments in callus were tinier and brighter. Both observations are difficult to explain without more detailed studies. Conclusions 1. The studies confirm that the plants C. schoenbrunnensis and C. waltersiana C. schoenbrunnensis regenerated in vitro are more cytologically stable and show smaller variability than callus, from which they originated. In general, a significantly higher variation in nuclei size was observed in calli than in the derived plants. 2. The number of DAPI-positive chromocenters was greater in callus than in the plants. 3. Cytological unstability of hybrid specimens four different chromosome numbers were found, 2n = 45, 57, 62 and 69 does not need to result from their derivation from in vitro culture, but it can be consequent to the hybrid origin. References ARDITTI J Orchid biology reviews and perspectives. I. Comstock Publishing Associated Adivision of Cornell University Press. Ithaca and London: ARFT A.M., RANKER T.A Allopolyploid origin and population genetics of the rare orchid Spiranthes diluvialis. American Journal of Botany 85: BERNARDOS S., AMICH F., CRESPI A Karyological and taxonomical notes on three species of the genus Epipactis (Neottioideae, Orchidaceae) in the Central-Western Iberian Peninsula. Folia Geobotanica 38: BORKOWSKA B Zmienno w kulturach in vitro. Wiadomo ci Botaniczne 39: BORKOWSKA B Czy zmienno musi słu y rozmna aniu? Mat. konf. nauk. Ro linne kultury in vitro w badaniach podstawowych i stosowanych. Zesz. Nauk. AR w Krakowie 50: CIE LAK E., ILNICKI T., FLIS M Cytotaxonomical studies on the caltha palustris complex (Ranunculaceae) in Poland. Preliminary Report. Acta Biologica Cracoviensia, Ser. Botanica 42(1): D AMATO F Cytogenetics of plant cell and tissue cultures and their regenerantes. CRC Critical Review Plant of Science 3: D EMERICO S Cytogenetic diversity Orchis s.l. and allied genera (Orchisinae, Orchidaceae). Plant Genome: Biodiversity and Evolution - 1B: D EMERICO S., COZZOLINO S., PELLEGRINO G., PIGNONE D., SCRUGLI A Heterochromatin distribution in selected taxa of the 42-chromosomes Orchis s.l. (Orchidaceae). Caryologia 55: FELIX L.P., GUERRA M Chromosome analysis in Psygmorchis pusilla L. Dodson & Dressler: the smallest chromosome number known in Orchidaceae. Caryologia 52: FELIX L.P., GUERRA M Cytogenetics and cytotaxonomy of some Brazilian species of Cymbidioid orchids. Genetics and Molecular Biology 23: GOLCZYK H Cytological changes in tissue culture of Allium sibiricum L. Acta Biologica Cracoviensa Series Botanica 36:

101 PRELIMINARY INVESTIGATION OF CYTOLOGICAL STABILITY HEDREN M Genetic differentiation, poliploidyzation and hybridization in northern European Dactylorhiza (Orchidaceae): evidence from allozyme markers. Plant Systematics and Evolution 201: HEDREN M Plastid DNA variation in the Dactylorhiza icarnata/maculata polyploid complex and the origin of allotetraploids D. sphagnicola (Orchidaceae). Molecular Ecology 12: JOACHIMIAK A Analiza kariotypu ro lin. Skrypt UJ nr 717. Kraków: 96 pp. JOACHIMIAK A Heterochromatyna. Budowa i funkcje w obr bie genomu. Post py Biologii Komórki 10: JOACHIMIAK A., ILNICKI T Wpływ ró nych st e 2,4-D na zró nicowana proliferacj linii komórkowych obecnych w kalusie Allium fistulosum. Zeszyty Naukowe AR w Krakowie 50: JOACHIMIAK A., ILNICKI T., KOWALSKA A., PRZYWARA L Chromosome alterations in tissue culture cells of Allium fistulosum. Genetica 96: KAEPPLER S.M., KAEPPLER H.F., RHEE Y Epigenetic aspect of somaclonal variation in plants. Plant Molecular Biology 43: KAO Y.Y., CHANG S.B., LIN T.Y., HSIEH C.H., CHEN Y.H., CHEN W.H., CHEN C.C Differential accumulation of heterochromatin as cause for karyotype variation in Phalaenopsis orchids. Annals of Botany 87: KONIECZNY R., CZAPLICKI A.Z., GOLCZYK H., PRZYWARA L Two pathways of plant regenerants in wheat anther culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 73: KOZAK D Shoot regeneratiom from various parts of Narcissus cv. Carlon through tissue culture. Prace Instytutu Sadownictwa i Kwiaciarstwa. Ro liny Ozdobne. Seria B 16: KULA A Cytogenetic studies in the cultivated form of Bromus carinatus (Poaceae). Fragmenta Floristica et Geobatanica Suppl. 7: NAGL W Evidence of DNA amplification in the orchid Cymbidium in vitro. Cytobios 5: OSZKINIS K Storczyki. PWRiL, Warszawa. PEAKL R., BOWER C., LOGAN A. E., NICOL L. I Confirmation of the hybrid origin of Chiloglottis pescotiana (Orchidaceae: Diurideae). 1. Genetic and morphometric evidence. Australian Journal of Botany 45: PEDERSEN H.E Allozyme variation and genetic integrity of Dactylorhiza incarnate (Orchidaceae). Nordic Journal of Botany 18: PERA F Mechanismen der Polyploidiserung und der somatischen Reduktion. Springer-Verlag, Berlin. PL DER W Zmienno somaklonalna w kulturach in vitro. Mat. konf. nauk. Ro linne kultury in vitro w badaniach podstawowych i stosowanych. Zesz. Nauk. AR w Krakowie 50: SCHWEIZER D., NAGL W Heterochromatin diversity in Cymbidium, and its relationship to differential DNA replication. Experimental Cell Research 98: STELLY D.M., ALTMAN D.W., RANGAN T.S., COMMISKEY E Cytogenetic abnormalities of cotton somaclones from callus cultures. Genome 32: STORT M.N. S Sterylity bariers of some artifical F1 orchid hybrids: male sterility. 1. Microsporogenesis and pollen germination. American Journal of Botany 71:

102 116 E. Kobylec et al. Key words: orchids, somaclonal variability, polyploids, aneuploids, the chromosomes, heterochromatin Summary The subject of this study was the caryological analysis of a hybrid form Cattleya waltersiana C. schoenbrunnensis and one of its parental species, C. schoenbrunnensis. All the used plants were origined from tissue cultures. It was shown that the hybrid form was cytologically unstable four different chromosome numbers were found, 2n=45, 57, 62 and 69. Parental species has the constant chromosome number 2n=34. The size of interphase nuclei in callus and root-tip cells of both forms was investigated. The results showed the existence of significant difference in nuclei size between callus and plants of the same form and between forms. The highest variation of nuclei size was found in callus of the hybrid, while the lowest in C. schoenbrunnensis roots. In general, significantly higher variation in nuclei size was observed in calli than in the derived plants. The nuclei of hybrid contained a higher number of AT-rich heterochromatin segments than C. schoenbrunnensis. What is more, these segments showed more intense fluorescence. The number of heterochromatic segments in callus of given plants C. schoenbrunnensis and hybrid was higher than in roots. The smaller and less intense fluorescent segments characteristic for C. schoenbrunnensis were not found in the nuclei of the hybrid form. What is interesting, such segments were also not observed in C. schoenbrunnensis calli. Instead, very small and intensively fluorescent segments were observed in tissue culture of this species. STABILNO CYTOLOGICZNA MIESZA CA Cattleya waltersiana C. schoenbrunnensis I C. schoenbrunnensis (Orchidaceae) in vivo I in vitro - WST PNE BADANIA Edyta Kobylec 1, Tomasz Ilnicki 1, Andrzej Joachimiak 1, Teresa Cybularz-Urban 2 1 Katedra Cytologii Ro lin i Embriologii, Uniwersytet Jagiello ski, Kraków 2 Katedra Botaniki, Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołł taja, Kraków Słowa kluczowe: storczyki, zmienno somaklonalna, poliploidy, aneuploidy, chromosomy, heterochromatyna Streszczenie Przeprowadzono analiz liczby chromosomów u formy miesza cowej Cattleya waltersiana C. schoenbrunnensis oraz u jednego z jej gatunków rodzicielskich, C. schoenbrunnensis. Ro liny te zostały wyprowadzone z kalusa i pochodziły z kultur in vitro. Forma miesza cowa okazała si niestabilna pod wzgl dem cytologicznym, w jej komórkach zanotowano somatyczn liczb chromosomów 2n=45, 57, 62 i 69. Gatunek rodzicielski wykazywał jednolit liczb chromosomów, 2n=34. Analizowano wielko ci j der interfazowych w kalusie oraz w komórkach merystematycznych pochodz cych z korzeni powietrznych obydwu form. Wykazano zró nicowane wielko ci j der pomi dzy ro linami a kalusem danej formy, jak i pomi dzy analizowanymi formami. Najwi ksze zró nicowanie wielko ci j der obserwowano w kalusie formy miesza cowej, najmniejsze w korzeniach C. schoenbrunnensis. Generalnie znacznie wi kszy rozrzut w wielko ci j der obserwowano w kalusach ni w wyprowadzonych z nich ro linach. J dra komórkowe miesza ca

103 PRELIMINARY INVESTIGATION OF CYTOLOGICAL STABILITY zawierały wi ksz liczb AT bogatych segmentów heterochromatynowych ni j dra C. schoenbrunnensis. Segmenty te wykazywały te znacznie ja niejsz fluorescencj. Liczba segmentów w kalusie danej ro liny była wy sza ni w jej korzeniach. Drobniejszych i słabiej wiec cych segmentów charakterystycznych dla C. schoenbrunnensis nie obserwowano w j drach komórkowych formy miesza cowej. Co ciekawsze, segmentów takich nie obserwowano tak e w kalusie C. schoenbrunnensis. Zamiast nich obserwowano segmenty niezwykle drobne, jasno fluoryzuj ce. Dr Teresa Cybularz-Urban Katedra Botaniki Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołł taja al. 29 Listopada KRAKÓW tcybularz@ogr.ar.krakow.pl Dr Tomasz Ilnicki Katedra Cytologii i Embriologii Ro lin Uniwersytet Jagiello ski ul. Grodzka KRAKÓW tomasz.ilnicki@uj.edu.pl

104 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: ZDOLNO CI REGENERACYJNE ZARODKÓW ANDROGENETYCZNYCH MARCHWI NA PO YWKACH Z PODWY SZONYM ST ENIEM MIEDZI Urszula Kowalska 1, Krystyna Górecka 1, Ryszard Górecki 1, Krystyna M. Janas 2, Dorota Krzy anowska 1, Waldemar Kiszczak 1 1 Instytut Warzywnictwa im. Emila Chroboczka w Skierniewicach 2 Katedra Ekofizjologii Rozwoju Ro lin, Uniwersytet Łódzki w Łodzi Wst p Mied nale y do grupy pierwiastków ladowych zwanych mikroelementami, które znajduj si w niewielkiej ilo ci w organizmach ro linnych i zwierz cych. Jest jednak niezb dna do prawidłowego wzrostu, rozwoju ro lin i pokrycia fizjologicznych potrzeb. Ro liny pobieraj znikom ilo tego pierwiastka, mimo, e jest on składnikiem wielu enzymów bior cych udział w procesach yciowych. W glebach mied wyst puje w niewielkich ilo ciach. Jednak w intensywnej produkcji poprzez nawo enie mineralne, stosowanie rodków ochrony ro lin wprowadzane s do niej du e ilo ci miedzi. Emisja zanieczyszcze przemysłowych wpływa równie na zwi kszenie zawarto ci miedzi w glebie. Jest to niebezpieczne, poniewa pierwiastek ten jest mało ruchliwy i ulega kumulacji w glebie. Zarówno nadmiar, jak i niedobór tego pierwiastka jest szkodliwy dla ro lin, zwierz t i człowieka [BURZY SKI i in. 2005]. Niedobór miedzi mo e doprowadzi do zahamowania procesów yciowych, takich jak fotosynteza czy oddychanie. Wpływa równie negatywnie na przemiany zwi zków organicznych, syntez białek i witaminy C, transport w glowodanów, powstawanie RNA i DNA [PODLE NA, WOJCIESKA-WYSKUPAJTYS 1996]. Powoduje to zahamowanie wzrostu p dów, chloroz na brzegach li ci, utrat j drno ci, uszkodzenie systemu korzeniowego i ograniczenie jego wzrostu, co w efekcie ko cowym doprowadza do spadku plonu. Jednak e obecnie cz ciej mamy do czynienia z nadmiarem miedzi. Wywołuje on zaburzenia rozwoju manifestuj ce si chloroz elazow, zgrubieniem i skróceniem łodyg. Androgeneza in vitro jest najcz ciej stosowan i najbardziej wydajn metod otrzymywania haploidów przez pobudzenie mikrospor lub ziaren pyłku do rozwoju w kalus lub zarodek androgenetyczny [MALEPSZY 1979; DATTA 2005]. Otrzymywanie linii DH z zastosowaniem kultur pylnikowych in vitro kilkakrotnie skraca czas potrzebny do wyhodowania miesza ców heterozyjnych. Na podkre lenie zasługuje fakt, e linie uzyskane przez podwojenie liczby chromosomów w haploidach s w pełni homozygotyczne. Proces ten jest wieloetapowy. Po otrzymaniu zarodków w kulturach pylników trzeba zregenerowa z nich ro liny. Celem bada było okre lenie wpływu wysokich st e miedzi na proces regeneracji ro lin marchwi z zarodków androgenetycznych uzyskanych metod kultur

105 120 U. Kowalska i inni pylnikowych. Materiał i metody Materiał badawczy stanowiły zazielenione zarodki marchwi odmiany Feria F 1 ', uzyskane na drodze androgenezy według procedury opisanej przez GÓRECK i in. [2005]. Kontrol stanowiła najlepsza, według wcze niejszych bada, do regeneracji zarodków androgenetycznych marchwi, po ywka B5 GAMBORGA i in. [1968] bez aminokwasów i regulatorów wzrostu z zaleconym przez tego autora st eniem miedzi 0,1 M CuSO 4 5H 2 O. Po ywk t poddano modyfikacjom zwi kszaj c zawarto miedzi w postaci CuSO 4 5H 2 O w stosunku do kontroli 10, 100, 1000 i razy. St enia miedzi w poszczególnych po ywkach wynosiły: kontrola - B5+0,1 M, B5+1 M, B5+10 M, B5+100 M, B M. Odczyn po ywki ustalono na poziomie ph=5,8. Na ka d z po ywek o ró nym st eniu Cu 2+ wykładano po 20 zarodków uzyskanych w procesie androgenezy z kultur pylnikowych. Probówki z zarodkami umieszczono w pokoju hodowlanym w temperaturze +20 C; 16 h fotoperiod (nat enie napromieniowania ok. 30 mol m -2 s -1 ). Wykonano 3 pasa e z uzyskanego materiału po 4 tygodniach, po 9 tygodniach i po 15 tygodniach kultury. Badania wykonano w 8 powtórzeniach dla ka dej po ywki (1 powtórzenie = 1 probówka). Wyodr bniono nast puj ce kategorie otrzymanych struktur: zielone zawi zki rozet, prawidłowe rozety bez korzeni, prawidłowe ukorzenione rozety (kompletne ro liny), ółte rozsypuj ce si struktury (wtórne zarodki), ółte rozsypuj ce si struktury z zawi zkami rozet. Uzyskany materiał ro linny liczono i wa ono. Cz namno onego materiału dla kontynuacji bada przekładano do 20 probówek ze wie po ywk o tym samym składzie. W celu opracowania wyników wykonano jednoczynnikow analiz wariancji testem Newmana-Keulsa, n=8, 0,05 (5%) Wyniki Na po ywce B5, zawieraj cej 1000 M CuSO 4, wszystkie wyło one zarodki androgenetyczne zamarły. W ci gu 4 pierwszych tygodni wzrostu na po ywce kontrolnej (B5+0,1 M CuSO 4 ) nie zaobserwowano objawów rozwoju zarodków. Stwierdzono natomiast korzystny wpływ podwy szonych st e miedzi na efektywno regeneracji z zarodków androgenetycznych. Na po ywkach z dodatkiem ró nych st e miedzi wytworzyły si prawidłowe rozety bez korzeni (fot. 1a) i prawidłowe kompletne ukorzenione ro liny (fot. 1b). Statystycznie istotnie najwi ksz ilo rozet bez korzeni (2,9) otrzymano z 1 zarodka na po ywce B5+1 M CuSO 4. Tak e ich masa była statystycznie istotnie wy sza. Wraz ze wzrostem st enia miedzi w po ywce wzrastała liczba rozet ukorzenionych. Najwi cej ro lin (2,4) o masie 0,078 grama z 1 zarodka powstało na po ywce B M CuSO 4. Tabela 1; Table 1 Wpływ miedzi na tworzenie prawidłowych rozet i ro lin w kulturze androgenetycznych zarodków marchwi The effect of copper on the formation of regular rosettes and plants in androgenetic embryo cultures of carrot

106 ZDOLNO CI REGENERACYJNE ZARODKÓW ANDROGENETYCZNYCH Pasa Passage Po ywka+cu 2+ ( M) Medium+Cu 2+ ( M) Zielone zawi zki rozet; Green incipient rosettes liczba number masa (g) mass (g) Rozety bez korzeni Rosettes without roots liczba number masa (g) mass (g) liczba number Ro liny Plants masa (g) mass (g) I Po 4 tygodniach kultury; After 4 weeks of culture B5 B5+1 B5+10 B ,0 a 0,0 a 0,0 a 0,0 a 0,000 a 0,000 a 0,000 a 0,000 a 0,0 b 2,9 a 0,5 b 0,0 b 0,000 b 0,053 a 0,017 ab 0,000 b 0,0 a 0,2 a 1,0 a 2,4 a 0,000 a 0,050 a 0,046 a 0,078 a II Po 9 tygodniach kultury; After 9 weeks of culture B5 B5+1 B5+10 B ,0 a 4,3 a 0,9 a 1,4 a 0,000 a 0,340 a 0,048 a 0,135 a 1,1 a 0,0 a 1,1 a 1,6 a 0,022 a 0,000 a 0,091 a 0,091 a 4,9 a 3,0 a 1,6 a 0,6 a 0,172 a 0,174 a 0,061 a 0,059 a III Po 15 tygodniach kultury After 15 weeks of culture B5 B5+1 B5+10 B ,0 a 0,0 a 0,0 a 0,0 a 0,000 a 0,000 a 0,000 a 0,000 a 0,0 a 0,0 a 0,0 a 0,0 a 0,000 a 0,000 a 0,000 a 0,000 a 11,5 a 4,3 a 4,0 a 4,9 a 0,677 a 0,288 b 0,327 b 0,260 b Liczby oznaczone tymi samymi literami w kolumnach nie ró ni si istotnie według testu Newmana-Keulsa n=8, 0,05; Values marked with the same letters (within columns) do not significantly differ according to Newman-Keuls test n=8, 0.05 Tabela 2; Table 2 Wpływ miedzi na tworzenie wtórnych zarodków w kulturze androgenetycznych zarodków marchwi The effect of copper on the formation of secondary embryos in androgenetic embryo cultures of carrot Pasa Passage I Po 4 tygodniach kultury; After 4 weeks of culture Po ywka+cu 2+ ( M) Medium+Cu 2+ ( M) B5 B5+1 B5+10 B5+100 Wtórne zarodki Secondary embryos liczba number 8,0 a 6,3 a 10,1 a 3,4 a masa (g) mass (g) 0,149 b 0,194 b 0,514 a 0,192 b Wtórne zarodki z zawi zkami rozet; Secondary embryos with incipient rosettes liczba number 1,1 a 0,0 a 1,1 a 0,0 a masa (g) mass (g) 0,023 a 0,000 a 0,188 a 0,000 a II Po 9 tygodniach kultury; After 9 weeks of culture B5 B5+1 B5+10 B ,8 a 0,0 a 0,0 a 0,0 a 0,098 a 0,000 a 0,000 a 0,000 a 0,0 a 1,9 a 0,0 a 0,9 a 0,000 a 0,212 a 0,000 a 0,066 a Liczby oznaczone tymi samymi literami w kolumnie nie ró ni si istotnie według testu Newmana-Keulsa n=8, 0,05; Values marked with the same letters (within columns) do not significantly differ according to Newman-Keuls test n=8, 0.05

107 122 U. Kowalska i inni 1a rozety bez korzeni - 4 tygodnie kultury, B5+1 M CuSO 4; rosettes without roots 4 weeks of culture, B5+1 M CuSO 4 1b ro liny - 4 tygodnie kultury, B5+100 M CuSO 4; plants - 4 weeks of culture, B5+100 M CuSO 4 1c zielone zawi zki rozet 9 tygodni kultury, B5+10 M CuSO 4; incipient green rosettes - 9 weeks of culture, B5+10 M CuSO 4 1d wtórne zarodki - 4 tygodnie kultury, B5+10 M CuSO 4; secondary embryos - 4 weeks of culture, B5+10 M CuSO 4 Fot. 1. Photo 1. Rozety, ro liny i zarodki wtórne otrzymane z zarodków androgenetycznych marchwi na po ywkach z podwy szonymi st eniami miedzi Rosettes, plants and secondary embryos from carrot androgenic embryos on media with the increased concentration of cooper W drugim pasa u nie obserwowano na po ywce kontrolnej prawidłowych zielonych zawi zków rozet. Natomiast na wszystkich po ywkach z podwy szonym poziomem miedzi powstawały prawidłowe zielone zawi zki rozet (fot. 1c). Najwi cej zawi zków rozet (4,3) o masie 0,340 grama z 1 zarodka powstawało na po ywce B5+1 M CuSO 4. W trzecim pasa u po 15 tygodniach od zało enia kultury, nie stwierdzono ju wyst powania nieukorzenionych rozet ani zielonych zawi zków rozet na adnej z badanych po ywek, a zarodki androgenetyczne zregenerowały w prawidłowe ukorzenione rozety na ka dej z nich. Najwi cej ro lin (11,5) z 1 probówki uzyskano na po ywce kontrolnej, tzn. zawieraj cej 0,1 M CuSO 4 5H 2 O, których masa wynosiła 0,677 grama (tab. 1). W przypadku masy ro lin była to ró nica statystycznie istotna. W pierwszym pasa u na zarodkach androgenetycznych powstawały wtórne zarodki jako ółte rozsypuj ce si struktury (fot. 1d), które w pó niejszym czasie rozwijały si w rozety. Najwi cej zarodków wtórnych (10,1) z 1 probówki tak e o

108 ZDOLNO CI REGENERACYJNE ZARODKÓW ANDROGENETYCZNYCH najwy szej masie 0,514 grama wytworzyło si na po ywce B5+10 M CuSO 4. W przypadku masy tych zarodków była to ró nica statystycznie istotna (tab. 2). Dyskusja W do wiadczeniach przeprowadzonych w ramach niniejszej pracy stwierdzono, i wzrost zawarto ci miedzi w po ywce B5 stymulował proces powstawania rozet i ro lin marchwi z zarodków androgenetycznych w ci gu 4 tygodni od zało enia kultury. Najefektywniej proces ten przebiegał na po ywce B5+100 M CuSO 4. Stres wywołany wy sz zawarto ci mikroelementów ni w po ywce standardowej mo e stworzy odpowiednie warunki w kierunku regeneracji wi kszej liczby p dów i korzeni [PURNHAUSER 1991]. Podobne wyniki uzyskali ró ni autorzy. BOJARCZUK [2002] wykazała wyra ny korzystny wpływ wysokich st e miedzi na rozwój kultur in vitro topoli. Siarczan miedzi w st eniu 10 M nie tylko nie hamował rozwoju kultur, ale nawet stymulował powstawanie p dów i korzeni. O pozytywnym wpływie miedzi w hodowlach kultur in vitro j czmienia i u innych gatunków zbó donie li CHO i in. [1998], NUUTILA i in. [2000]. St enie 5 M CuSO 4 w po ywce dało najlepszy wynik w regeneracji z niedojrzałych zarodków Hordeum vulgare L. [NUUTILA i in. 2000]. Według PURNHAUSER i GYULAI [1993] wy sze, ni w po ywce kontrolnej MS [MURASHIGE i SKOOG 1962], st enia CuSO 4 znacz co indukowały regeneracj p dów z kalusa u pszenicy, pszen yta, rzepaku i w kulturach li ci tytoniu. W niniejszych do wiadczeniach CuSO 4 w st eniu 1 i 10 M w ci gu pierwszych 4 tygodni kultury korzystnie wpływało na powstawanie z zarodków androgenetycznych rozet marchwi bez korzeni, podczas gdy na po ywce kontrolnej nie było ich wcale. Według PRA AKA [2000b] CuSO 4 w st eniu 10 M (100-krotnie wy szym, ni w standardowej po ywce) MS stymulowało procesy morfogenetyczne w czasie mikrorozmna ania Dendrobium kingiannum BIDWILL. Mied w ww. st eniu korzystnie wpływała na liczb uzyskanych p dów, warto ich wie ej i suchej masy. W innej pracy ten sam autor [PRA AK 2004] uzyskał najwy sz liczb zregenerowanych p dów miesza ca pszenicy z kozie cem na po ywce z 10 M CuSO 4. Po ywka B5+10 M CuSO 4 korzystnie wpływała na tworzenie si wtórnych zarodków marchwi w pierwszych 4 tygodniach w do wiadczeniach prezentowanych w niniejszej pracy. WOJNAROWIEZ i in. [2002] obserwowali równie, korzystny wpływ wy szych st e miedzi na proces powstawania zarodków androgenetycznych j czmienia. Najlepsze wyniki uzyskano na po ywce z 10 M CuSO 4. Współczynnik pylników wytwarzaj cych zarodki wzrósł z około 57 do 72%. Wy sze koncentracje CuSO 4 wpływaj równie korzystnie na regeneracj ro lin j czmienia (Hordeum vulgare L.) uzyskanych z niedojrzałych zarodków DAHLEEN [1995]. Jak wykazały przeprowadzone w naszej pracy badania, mied w st eniu razy wy szym ni w po ywce kontrolnej (B5) jest toksyczna i powoduje zamieranie wszystkich zarodków ju w ci gu pierwszych 4 tygodni kultury. Jak podaje PRA AK [2000a], 1000-krotnie wy sza zawarto CuSO 4 w po ywce była silnie toksyczna dla dwóch badanych odmian Triticum aestivum L. i hamowała organogenez. Wnioski

109 124 U. Kowalska i inni 1. Podwy szone st enie miedzi 10-krotnie wy sze ni w po ywce kontrolnej (B5) stymuluje organogenez w procesie regeneracji zarodków androgenetycznych marchwi w ci gu pierwszych 4 tygodni kultury. 2. St enie miedzi krotnie wy sze ni w kontroli (B5) jest toksyczne dla zarodków androgenetycznych marchwi odmiany Feria F 1 '. Literatura BOJARCZUK K Wpływ toksycznych jonów metali na rozwój topoli (Populus tremula L. x Populus alba L.) w kulturach in vitro. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 488: BURZY SKI M., MIGOCKA M., KŁOBUS G Cu and Cd transport in cucumber (Cucumis sativus L.) root plasma membranes. Plant Science 168: CHO M.J., JIANG W., LEMAUX P.G Transformation of recalcitrant barley cultivars through improvement of regenerability and decreased albinism. Plant Science 138: DAHLEEN L.S Improved plant regeneration from barley callus cultures by increased cooper levels. Plant Cell, Tiss. and Organ Cult. 43: DATTA S.K Androgenic haploids: Factors controlling development and its application in crop improvement. Current Science 89(11): GAMBORG O.L, MILLER R.A., OJIMA K Nutrient requirements of suspensions culture of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50: GÓRECKA K., KRZY ANOWSKA D., GÓRECKI R The influence of several factors on the efficency of androgenesis in carrot. J. Appl. Genet. 46(3): MALEPSZY S Kultury tkankowe w genetyce ro lin ze szczególnym uwzgl dnieniem haploidów. Zesz. Nauk. SGGW AR, Warszawa Rozprawy Naukowe 110. MURASHIGE T., SKOOG F A received medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: NUUTILA A.M., HÄMÄLÄINEN J., MANNONEN L Optymalization of media nitrogen and copper concentrations for regeneration of green plants from polyembryogenic cultures of barley (Hordeum vulgare L.). Plant Science 151: PODLE NA A., WOJCIESKA-WYSKUPAJTYS U Mied i molibden w rodowisku - problemy ekologiczne i metodyczne. Materiały z sympozjum w dniu 17 XI Opracowanie wykonane w ramach programu komitetu naukowego Człowiek i rodowisko przy Prezydium PAN. Pobieranie i wykorzystanie miedzi przez ro liny zbo owe. Zesz. Nauk. 14: PRA AK R. 2000a. Wpływ jodu, kobaltu, miedzi oraz molibdenu na wzrost i ró nicowanie si tkanki kalusowej Triticum aestivum L. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 471: PRA AK R. 2000b. Wpływ jodu, kobaltu, miedzi oraz molibdenu na wzrost i rozwój Dendrobium kingianum Bidwill w kulturze in vitro. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 471: PRA AK R Wpływ jodu, kobaltu, miedzi i molibdenu na wzrost i ró nicowanie si tkanki kalusowej miesza ców Aegilopsis Triticum. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 496: PURNHAUSER L Stimulation on shoot and root regeneration in wheat Triticum aestivum callus cultures by cooper. Cereal Research Communications 19: PURNHAUSER L., GYULAI G Effect of copper on shoot and root regeneration in

110 ZDOLNO CI REGENERACYJNE ZARODKÓW ANDROGENETYCZNYCH wheat, triticale, rape and tabacco tissue cultures. Plant Cell, Tiss. and Organ Cult. 35: WOJNAROWIEZ G., JACQUARD C., DEVAUX P., SANGWAN R.S., CLEMENT C Influence of copper sulfate on anther culture in barley (Hordeum vulgare L.). Plant Science 162: Słowa kluczowe: marchew, zarodki androgenetyczne, CuSO 4, wtórne zarodki, organogeneza Streszczenie Badania prowadzono w celu okre lenia wpływu podwy szonych st e miedzi w po ywce regeneracyjnej na powstawanie ro lin z zarodków marchwi odmiany Feria F 1 ' otrzymanych w kulturach pylnikowych. Zarodki wykładano na 5 po ywek na bazie B5 bez hormonów zawieraj cych: 0,1 - kontrola, 1, 10, 100 i 1000 M CuSO 4 5H 2 O. Wykonano trzy pasa e po 4, 9 i 15 tygodniach kultury, obserwuj c powstaj ce struktury, które klasyfikowano, liczono i wa ono. St enia 1, 10 M CuSO 4 w ci gu pierwszych 4 tygodni stymulowały organogenez. Koncentracja 1 M CuSO 4 indukowała powstawanie najwi kszej liczby zawi zków rozet, a st enie 10 M CuSO 4 korzystnie wpływało na tworzenie si wtórnych zarodków. W kolejnych pasa ach wpływ podwy szonych st e jonów miedzi nie był ju tak korzystny. W trzecim pasa u wy sze st enia CuSO 4 hamowały powstawanie prawidłowych ukorzenionych rozet. Najwy sze ze stosowanych st e miedzi okazało si toksyczne dla zarodków marchwi. Zamierały one nie rozwijaj c si w pierwszych 4 tygodniach kultury. REGENERATION ABILITIES OF CARROT ANDROGENETIC EMBRYOS ON MEDIA WITH THE INCREASED CONCENTRATIONS OF COPPER Urszula Kowalska 1, Krystyna Górecka 1, Ryszard Górecki 1, Krystyna M. Janas 2, Dorota Krzy anowska 1, Waldemar Kiszczak 1 1 Research Institute of Vegetable Crops, Skierniewice 2 Department of Ecophysiology and Plant Development, University of Lodz, Łód Key words: carrot, androgenetic embryos, CuSO 4, secondary embryos, organogenesis Summary The aim of the study was to determine the effect of high copper concentrations on the process of regeneration of carrot plants cv. Feria F 1 ' from androgenic embryos. The experiment was designed to include five B5 regeneration media containing 0.1 (control), 1.0, 10.0, and M CuSO 4 5H 2 O. During the passages, which were carried out 3 times at approximately monthly intervals the regenerated structures were examined and classifield accordingly, counted and weighed. Concentrations of CuSO 4 1.0, 10.0 M stimulated organogenesis in the first 4 weeks of culture. The concentration of 1.0 M CuSO 4 induced the formation of the largest number of incipient rosettes, while 10.0 M CuSO 4 had a favourable effect on

111 126 U. Kowalska i inni the formation of secondary embryos in the first 4 weeks of culture. In subsequent passages the effect of elevated Cu-ion concentration was not beneficial. During the third passage, higher concentrations of CuSO 4 in the medium suppressed the formation of normal, rooted rosettes. The B5 medium containing M CuSO 4 was highly toxic for embryos. They did not develop and died during the first 4 weeks of culture. Mgr Urszula Kowalska Pracownia Kultur Tkanek Instytut Warzywnictwa im. Emila Chroboczka ul. Konstytucji 3 Maja 1/ SKIERNIEWICE ujkowalska@op.pl

112 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: WPŁYW KADMU NA INDUKOWANY PRZEZ IAA WZROST ELONGACYJNY SEGMENTÓW KOLEOPTYLI KUKURYDZY (Zea mays L.) INKUBOWANYCH W OBECNO CI POTASU Renata Kurtyka, Waldemar Karcz, Eliza Folty ska Katedra Fizjologii Ro lin, Uniwersytet l ski w Katowicach Wst p Wzrost koleoptyli kukurydzy indukowany działaniem auksyny (IAA) zale y od obecno ci jonów potasu [CLAUSSEN i in. 1997], które pełni wiele specyficznych funkcji w metabolizmie ro lin [CLARKSON, HANSON 1980; ZIMMERMANN, SENTENAC 1999; BECKER, HEDRICH 2002]. Jako bardzo ruchliwe jony skutecznie konkuruj z innymi kationami, w tym z kadmem, o pobieranie i transport zarówno na poziomie struktur komórkowych, jak i organów, przez co, jak si wydaje, mog wpływa na oddziaływanie kadmu na wzrost ro lin. W naszych wcze niejszych badaniach wykazali my, e wysokie st enia kadmu hamuj wzrost [KARCZ, KURTYKA 2007], powoduj depolaryzacj potencjału membranowego komórek koleoptyli kukurydzy [KARCZ i in. 2002], jak równie zmieniaj zawarto potasu i wapnia w siewkach Zea mays L. [KURTYKA i in. 2008]. W zwi zku z powy szym podj to badania maj ce na celu okre lenie udziału kadmu w indukowanym przez IAA wzro cie elongacyjnym segmentów koleoptyli kukurydzy (Zea mays L.) inkubowanych w obecno ci ró nych st e potasu w rodowisku wzrostowym. Materiał i metody Badania przeprowadzono na 10-mm segmentach koleoptyli kukurydzy wycinanych z 4-dniowych etiolowanych siewek Zea mays L. odmiany Koka, pochodz cej ze Stacji Hodowli Ro lin w Kobierzycach. Kultur siewek prowadzono w ciemno ci, w temperaturze 27 C. Segmenty koleoptyli wycinano w odległo ci 3 mm od wierzchołka, a nast pnie usuwano z nich pierwszy li. Przed traktowaniem segmentów koleoptyli roztworami IAA (0,01 mmol dm -3 ) lub IAA (0,01 mmol dm -3 ) i Cd (0,1 mmol dm -3 ) podanymi równocze nie do rodowiska inkubacyjnego, preinkubowano je przez 2 godziny w roztworze APW zawieraj cym 0,1 mmol dm -3 NaCl i 0,1 mmol dm -3 CaCl 2 oraz ró ne st enia potasu (KCl): 1 mmol dm -3 (APW 1) lub 10 mmol dm -3 (APW 2). Roztwór o składzie 0,1 mmol dm -3 NaCl i 0,1 mmol dm -3 CaCl 2, pozbawiony potasu, oznaczano jako APW 0. Wzrost elongacyjny oraz synchronicznie z nim mierzone zmiany ph rodowiska inkubacyjnego segmentów koleoptyli kukurydzy wyznaczano zgodnie z metodyk opisan przez KARCZA i BURDACHA [2002] oraz KARCZA i KURTYK

113 128 R. Kurtyka, W. Karcz, E. Folty ska [2007] wykorzystuj c układ pomiarowy składaj cy si z układu optycznego oraz ph-metrów typu CI-316 (Elmetron, Polska) i elektrod typu OSH (Metron, Polska). Zarówno preinkubacja, jak i 5-godzinna inkubacja przebiegały przy stałej cyrkulacji rodowiska, któr zapewniała pompa perystaltyczna typu 304 (Elmed, Polska). Ilo roztworu przypadaj ca na jeden segment koleoptyla wynosiła 300 l, a pocz tkowe ph roztworów było ustalane na poziomie 5,8 6,0. Wszystkie czynno ci zwi zane z przygotowaniem materiału ro linnego oraz badania przeprowadzono przy zielonym wietle. Wyniki i dyskusja Przeprowadzone badania wykazały, e indukowany przez IAA wzrost elongacyjny segmentów koleoptyli Zea mays L. zale y od st enia potasu w rodowisku inkubacyjnym (rys. 1, 2). Najwi kszy wzrost segmentów koleoptyli kukurydzy (2097,63 ±31 m cm -1 ) obserwowano w roztworze o najwi kszym st eniu potasu w rodowisku zewn trznym (10 mmol dm -3 ), jednak wzrost ten nie ró nił si istotnie od wzrostu, który był stymulowany przez IAA w obecno ci 1 mmol dm -3 KCl (1987,20 ± 91 m cm -1 ). Brak potasu w rodowisku segmentów koleoptyli kukurydzy powodował około 40% spadek ich wzrostu w stosunku do tego, który obserwowano w obecno ci obu zastosowanych st e potasu (1 mmol dm -3 lub 10 mmol dm -3 ). Jest to zgodne z wynikami bada przeprowadzonymi przez HEDRICH A i BECKER A [1994], BECKER A i in. [1996] oraz CLAUSEN A i in. [1997], w których wykazano, e usuni cie ze rodowiska jonów K + lub zastosowanie blokerów kanałów potasowych (TEA + lub Cs + ) powoduje zahamowanie wzrostu elongacyjnego indukowanego przez kwas indolilo-3- octowy. Stymulacyjne działanie IAA na wzrost elongacyjny komórek ro linnych mo na przywróci poprzez usuni cie brokerów kanałów potasowych lub wprowadzenie jonów potasu [PHILIPPAR i in. 1999].

114 WPŁYW KADMU NA INDUKOWANY PRZEZ IAA WZROST czas; time (min) Rys. 1. Wpływ kadmu (0,1 mmol dm -3 ) na indukowany przez IAA (0,01 mmol dm -3 ) wzrost elongacyjny segmentów koleoptyli kukurydzy (Zea mays L.) inkubowanych w obecno ci ró nych st e potasu (APW 0-0,0; APW 1-1,0; APW 2-10 mmol dm -3 ). SE nie przekroczył 6%, n=8 Fig. 1. Effect of cadmium (0.1 mmol dm -3 ) on the IAA-induced (0.01 mmol dm -3 ) elongation growth of maize coleoptile segments incubated in the presence of various concentrations of potassium (APW 0-0.0; APW 1-1.0; APW 2-10 mmol dm -3 ). SE did not exceed 6%, n=8 Rys. 2. Wpływ kadmu (0,1 mmol dm -3 ) na indukowany przez IAA (0,01 mmol dm -3 ) wzrost elongacyjny segmentów koleoptyli kukurydzy (Zea mays L.) inkubowanych w obecno ci ró nych st e potasu (APW 0-0,0; APW 1-1,0; APW 2-10 mmol dm -3 ). Za 100% przyj to wzrost segmentów koleoptyli kukurydzy w roztworze APW 1+IAA (1 mmol dm -3 KCl) Fig. 2. Effects of cadmium (0.1 mmol dm -3 ) on the IAA-induced (0.01 mmol dm -3 ) elongation growth of maize coleoptile segments incubated in the presence of various concentrations of potassium (APW 0-0.0; APW 1-1.0; APW 2-10 mmol dm -3 ). As 100% elongation growth of maize coleoptile segments in APW 1+IAA (1 mmol dm -3 KCl) was taken czas; time (min) Rys. 3. Wpływ kadmu (0,1 mmol dm -3 ) na indukowane przez IAA (0,01 mmol dm -3 ) zmiany ph

115 130 Fig. 3. R. Kurtyka, W. Karcz, E. Folty ska rodowiska segmentów koleoptyli kukurydzy (Zea mays L.) inkubowanych w obecno ci ró nych st e potasu (APW 0-0,0; APW 1-1,0; APW 2-10 mmol dm -3 ). SE nie przekroczył 7%, n=8 Effects of cadmium (0.1 mmol dm -3 ) on the IAA-induced (0.01 mmol dm -3 ) ph changes in the incubation medium of maize coleoptile segments incubated in the presence of various concentrations of potassium (APW 0-0.0; APW 1-1.0; APW 2-10 mmol dm -3 ). SE did not exceed 7%, n=8 Rys. 4. Procentowa zale no zmian ph rodowiska inkubacyjnego segmentów koleoptyli kukurydzy (Zea mays L.) indukowanych działaniem IAA (0,01 mmol dm -3 ) i Cd (0,1 mmol dm -3 ) zachodz cych w obecno ci ró nych st e potasu (APW 0-0,0; APW 1-1,0; APW 2-10 mmol dm -3 ). Za 100% przyj to ph obliczan dla roztworu APW 1+IAA (1 mmol dm -3 KCl), jako warto bezwzgl dn ró nicy ph w 420 minucie i 120 minucie Fig. 4. Effects of cadmium (0.1 mmol dm -3 ) on the IAA-induced (0.01 mmol dm -3 ) ph changes in the incubation medium of maize coleoptile segments incubated in the presence of various concentrations of potassium (APW 0-0.0; APW 1-1.0; APW 2-10 mmol dm -3 ). As 100% ph in APW1+IAA (1 mmol dm -3 KCl), calculated as absolute values of difference of ph at 420 min and 120 min, was taken Jak powszechnie wiadomo, indukowanemu przez IAA wzrostowi elongacyjnemu towarzyszy zakwaszanie rodowiska inkubacyjnego, co zwi zane jest, mi dzy innymi, ze stymulacj plazmolemowej pompy protonowej (H + -ATPazy), która prowadzi do zakwaszania apoplastu i rozlu nienia struktury ciany komórkowej [RAYLE, CLELAND 1970; HAGER i in. 1971]. Jak pokazano na rys. 3, stymulowanemu przez IAA wzrostowi elongacyjnemu segmentów koleoptyli kukurydzy towarzyszyło zakwaszanie rodowiska inkubacyjnego, które osi gn ło najwy sz warto w roztworze, w którym st enie potasu wynosiło 1 mmol dm -3. Najmniejsze zmiany ph zaobserwowano, gdy auksyna została podana do roztworu, w którym nie było potasu (rys. 3, 4) i w którym odnotowano najmniejszy wzrost elongacyjny. Dane zamieszczone na rys. 1 i 2 wskazuj, e kadm zaburzał wzrost segmentów koleoptyli w stopniu zale nym od st enia potasu w rodowisku. Najbardziej hamuj ce działanie metalu zaobserwowano, gdy st enie potasu w rodowisku wynosiło 1 mmol dm -3, podczas gdy przy braku potasu nie zaobserwowano efektu działania kadmu. W tym przypadku wzrost segmentów koleoptyli stanowił około 60% wzrostu indukowanego przez IAA w obecno ci 1 mmol dm -3 KCl i nie ró nił si istotnie od wzrostu indukowanego przez IAA w roztworze APW 0 (bez potasu). Stwierdzono, e 10 mmol dm -3 st enie potasu w rodowisku inkubacyjnym zmniejsza toksyczne działanie kadmu na wzrost indukowany przez IAA. Prezentowane w tej pracy badania pokazuj, e traktowanie kadmem oraz IAA segmentów koleoptyli kukurydzy w

116 WPŁYW KADMU NA INDUKOWANY PRZEZ IAA WZROST obecno ci 10 mmol dm -3 potasu prowadzi do znacznego zakwaszania rodowiska, co jak si wydaje, z jednej strony potwierdza wysuni t przez CLAUSSEN A i in. [1997] hipotez, e zakwaszanie rodowiska inkubacyjnego przez pomp protonow wymaga napływu jonów potasu do komórki, z drugiej za strony pokazuje, e powodowane przez potas obni enie toksycznego działania kadmu na wzrost elongacyjny segmentów koleoptyli kukurydzy mo e by, mi dzy innymi, zwi zane ze zmniejszeniem oddziaływania kadmu na H + -ATPaz. Wnioski 1. Indukowany przez IAA wzrost elongacyjny segmentów koleoptyli kukurydzy zale y od st enia potasu w rodowisku. 2. Traktowanie segmentów koleoptyli Cd (0,1 mmol dm -3 ) hamuje ich wzrost oraz zmienia ph rodowiska inkubacyjnego w stopniu zale nym od st enia potasu. 3. Potas cz ciowo znosi toksyczne działanie kadmu na wzrost elongacyjny segmentów koleoptyli kukurydzy. Literatura BECKER D., DREYER I., HOTH S., REID J.D., BUSCH H., LEHNEN M., PALME K., HEDRICH R Changes in voltage activation, Cs + sensitivity, and ion permeability in H5 mutants of the plant K + channel KAT1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: BECKER D., HEDRICH R Channelling auxin action: modulation of ion transport by indole-3-acetic acid. Plant Molec. Biol. 49: CLARKSON D.T., HANSON J.B The mineral nutrition of higher plants. Ann. Rev. Plant Physiol. 31: CLAUSSEN M., LÜTHEN H., BLATT M., BÖTTGER M Auxin-induced growth and its linkage to potassium channels. Planta 201: HAGER A., MENZEL H., KRAUSS A Versuche und Hypothese zur Primärwirkung des Auxins beim Streckungswachstum. Planta 100: HEDRICH R., BECKER D Green circuits: the potential of plant specific ion channels. Plant Mol. Biol. 26: KARCZ W., BURDACH Z A comparison of the effects of IAA and 4-Cl-IAA on growth, proton secretion and membrane potential in maize coleoptile segments. J. Exp. Bot. 53: KARCZ W., KURTYKA R Effect of cadmium on growth, proton extrusion and membrane potential in maize coleoptile segments. Biol. Plant. 51: KARCZ W., KURTYKA R. MAŁKOWSKI E., K DZIORSKA M Reakcja wzrostowa i elektrofizjologiczna komórek koleoptyli kukurydzy traktowanych ołowiem i kadmem. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 488: KURTYKA R., MAŁKOWSKI E., KITA A., KARCZ W Effect of calcium and cadmium on growth and accumulation of cadmium, calcium, potassium and sodium in maize seedlings. Pol. J. Environ. Stud. 17: PHILIPPAR K., FUCHS I., LUTHEN H., HOTH S., BAUER C.S., HAGA K., THIEL G., LJUNG K., SANDBERG G., BOTTGER M., BECKER D., HEDRICH R Auxin-induced K + channel

117 132 R. Kurtyka, W. Karcz, E. Folty ska expression represents an essential step in coleoptile growth and gravitropism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: RAYLE D.L., CLELAND R.E Enhancement of wall loosening and elongation by acid solutions. Plant Physiol. 46: ZIMMERMANN S., SENTENAC H Plant ion channels: from molecular structures to physiological functions. Curr. Opinion Plant Biol. 2: Słowa kluczowe: auksyna (IAA), kadm, potas, segmenty koleoptyli kukurydzy, wzrost elongacyjny Streszczenie Badano wpływ kadmu na indukowany przez IAA wzrost elongacyjny segmentów koleoptyli kukurydzy (Zea mays L.) inkubowanych w obecno ci ró nych st e potasu w rodowisku wzrostowym. Do wiadczenia przeprowadzono na 10-mm segmentach koleoptyli kukurydzy wycinanych z 4-dniowych etiolowanych siewek Zea mays L., z których usuwano pierwszy li. Segmenty koleoptyli traktowano roztworami IAA (0,01 mmol dm -3 ) lub IAA (0,01 mmol dm -3 ) i Cd (0,1 mmol dm -3 ) podanymi równocze nie do rodowiska inkubacyjnego o ró nej zawarto ci potasu (1 i 10 mmol dm -3 ). Wzrost elongacyjny oraz synchronicznie z nim mierzone zmiany ph rodowiska inkubacyjnego segmentów koleoptyli kukurydzy wyznaczano zgodnie z metodyk opisan przez Karcza i Burdacha (2002) oraz Karcza i Kurtyk (2007). Stwierdzono, e indukowany przez IAA wzrost elongacyjny segmentów koleoptyli kukurydzy zale y od st enia potasu w rodowisku. Natomiast traktowanie segmentów koleoptyli Cd (0,1 mmol dm -3 ) hamuje ich wzrost oraz zmienia ph rodowiska inkubacyjnego w stopniu zale nym od st enia potasu. EFFECT OF CADMIUM ON IAA-INDUCED ELONGATION GROWTH OF MAIZE COLEOPTILE SEGMENTS (Zea mays L.) INCUBATED IN THE PRESENCE OF POTASSIUM Renata Kurtyka, Waldemar Karcz, Eliza Folty ska Department of Plant Physiology, University of Silesia, Katowice Key words: auxin (IAA), cadmium, potassium, maize coleoptile segments, elongation growth Summary We examined the effect of cadmium (0.1 mmol dm -3 ) on the IAA-induced elongation growth of maize coleoptile segments incubated in the presence of various potassium concentrations (0 or 1 or 10 mmol dm -3 ). The experiments were performed on 10 mm coleoptile segments cut from 4-day old etiolated seedlings. The primary leaf was removed. Maize coleoptile segments were treated with IAA (0.01 mmol dm -3 ) or IAA (0.01 mmol dm -3 ) and CdCl 2 (0.1 mmol dm -3 ) in the presence of different potassium concentrations (0 or 1 or 10

118 WPŁYW KADMU NA INDUKOWANY PRZEZ IAA WZROST mmol dm -3 ). The growth experiments were carried out in an apparatus, which allowed simultaneous measurements of the elongation growth and ph of the incubation medium, in agreement with the methods described previously by Karcz i Burdach (2002) and Karcz i Kurtyka (2007). It was found that auxin-induced elongation growth depends on extracellular potassium concentration. In maize coleoptile segments Cd caused a significant inhibition of growth as well as changed the proton extrusion. The treatment of maize coleoptile segments by K + (10 mmol dm -3 ) added together with Cd counteracted the toxic effect of Cd on the IAA-induced growth. Dr Renata Kurtyka Katedra Fizjologii Ro lin Uniwersytet l ski ul. Jagiello ska KATOWICE rkurtyka@us.edu.pl

119 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: PORÓWNANIE DZIAŁANIA KWASU INDOLILO-3-OCTOWEGO ORAZ KWASU INDOLILO-3-MASŁOWEGO NA WZROST ELONGACYJNY SEGMENTÓW KOLEOPTYLI KUKURYDZY (Zea mays L.) Renata Kurtyka, Waldemar Karcz, Marta Wieczorek Katedra Fizjologii Ro lin, Uniwersytet l ski w Katowicach Wst p Kwas indolilo-3-octowy (IAA) oraz kwas indolilo-3-masłowy (IBA) s naturalnymi auksynami, wyst puj cymi u wielu gatunków ro lin. Odgrywaj one kluczow rol w procesach wzrostu i rozwoju ro lin, szczególnie w ich ukorzenianiu [LUDWIG- MÜLLER i in. 2005]. Kwas indolilo-3-octowy był pierwszym hormonem ro linnym, który został u yty do ukorzeniania ro lin [COOPER 1935]. Jak wykazały pó niejsze badania, znacznie bardziej skutecznym w ukorzenianiu ro lin okazał si by IBA [NORDSTROM i in. 1991; LUDWIG-MÜLLER 2000]. Do tej pory nie prowadzono jednak bada dotycz cych porównania działania obu auksyn na wzrost elongacyjny nadziemnych cz ci ro lin. W zwi zku z powy szym wydało si celowym prowadzenie takich bada, tzn. porównanie wpływu optymalnych st e obu substancji wzrostowych na wzrost elongacyjny nadziemnych organów ro lin. Materiał i metody Badania przeprowadzono na 10-mm segmentach koleoptyli kukurydzy wycinanych 3-4 mm poni ej wierzchołka, z 4-dniowych etiolowanych siewek Zea mays L. cv. Koka. Z segmentów usuwano pierwszy li, a nast pnie umieszczano je w roztworze APW o nast puj cym składzie: 1,0 mmol dm -3 KCl, 0,1 mmol dm -3 NaCl oraz 0,1 mmol dm -3 CaCl 2. Po 2 godzinach preinkubacji segmenty koleoptyli traktowano roztworami IAA (0,01 mmol dm -3 ) lub/i IBA (0,01 mmol dm -3 lub 0,1 mmol dm -3 ) podanymi razem lub osobno do rodowiska inku bacyjnego. Pomiarów szybko ci wzrostu dokonano przy pomocy liniowego transducera k towego (TWK Electronic, Dusseldorf) zgodnie z metodyk opisan wcze niej przez KARCZA i BURDACHA [2002] oraz KARCZA i KURTYK [2007]. Pocz tkowe ph roztworów ustalano na poziomie 5,8-6,0 przy pomocy: 0,1 mol dm -3 HCl oraz 0,1 mol dm -3 NaOH. Wszystkie czynno ci zwi zane z przygotowaniem materiału ro linnego oraz badania przeprowadzono przy zielonym wietle. Uzyskane wyniki stanowi redni z 9 niezale nych eksperymentów.

120 136 R. Kurtyka, W. Karcz, M. Wieczorek Wyniki i dyskusja W wyniku przeprowadzonych bada stwierdzono, e traktowanie segmentów koleoptyli kukurydzy IAA lub/i IBA stymuluje ich wzrost elongacyjny. Stymulacja wzrostu segmentów koleoptyli kukurydzy obserwowana w obecno ci IBA była porównywalna z uzyskan dla optymalnego st enia IAA (0,01 mmol dm -3 ). Jak wynika z rys. 1 i 2 nie stwierdzono istotnych ró nic pomi dzy działaniem obu badanych st e IBA (0,01 lub 0,1 mmol dm -3 ) na wzrost elongacyjny segmentów. Równoczesne traktowanie segmentów koleoptyli IAA i IBA w st eniach 0,01 mmol dm -3 powodowało synergistyczne działanie obu substancji wzrostowych (rys. 2), czego nie obserwowano przy wspólnym działaniu 0,01 mmol dm -3 IAA oraz 0,1 mmol dm -3 IBA (rys. 1 i 3). czas; time (min) Rys. 1. Wzrost elongacyjny segmentów koleoptyli kukurydzy (Zea mays L.) inkubowanych w obecno ci IAA (0,01 mmol dm -3 ) lub/i IBA (0,1 mmol dm -3 ) podanych razem lub osobno do rodowiska. Wyniki s rednimi z 9 niezale nych pomiarów. SE nie przekraczał 10% Fig. 1. Effect of IAA (0.01 mmol dm -3 ) or/and IBA (0.1 mmol dm -3 ) on the elongation growth of maize coleoptile segments (Zea mays L.). Results are average of 9 independent measurements. SE did not exceed 10%

121 PORÓWNANIE DZIAŁANIA KWASU INDOLILO-3-OCTOWEGO

122 138 R. Kurtyka, W. Karcz, M. Wieczorek

123 PORÓWNANIE DZIAŁANIA KWASU INDOLILO-3-OCTOWEGO Pomimo, i proces wzrostu elongacyjnego indukowanego naturalnymi auksynami był przedmiotem wielu bada, uwaga badaczy była skoncentrowana głównie na działaniu kwasu indolilo-3-octowego (IAA) [KARCZ i in. 1990, 1995; RAYLE, CLELAND 1992; HAGER 2003; KARCZ, KURTYKA 2007]. Jak wykazali wcze niej KARCZ i BURDACH [2002], auksyna (w st eniu 0,01 mmol dm -3 ) dodana do rodowiska inkubacyjnego segmentów koleoptyli kukurydzy stymulowała ich wzrost w porównaniu z kontrol. Szybko wzrostu segmentów koleoptyli kukurydzy przedstawiono na rys. 4 oraz rys. 5. Taktowanie segmentów koleoptyli IAA (0,01 mmol dm -3 ) lub/i IBA (0,01 mmol dm -3 lub 0,1 mmol dm -3 ), w takich samych warunkach eksperymentu jak w pracy KARCZA i BURDACHA [2002], stymulowało ich wzrost elongacyjny oraz zmieniało kinetyk endogennego wzrostu (rys. 1, 2, 3 i 4). W przypadku traktowania segmentów koleoptyli kukurydzy 0,1 mmol dm -3 IBA zaobserwowano dwufazow zmian szybko ci wzrostu (rys. 4). Pierwsza z faz charakteryzowała si znacznie mniejszym maksimum tempa wzrostu w porównaniu z drug faz. Przy wspólnym działaniu obu auksyn obserwuje si znaczne opó nienie maksymalnego tempa wzrostu w porównaniu z IAA, co prawdopodobnie wynika z nało enia si wolnej fazy działania IBA (0,1 mmol dm -3 ) z maksymalnym tempem wzrostu obserwowanym w obecno ci IAA (rys. 4). Wy ej wspomnianych zmian nie obserwuje si w przypadku działania 0,01 mmol dm -3 IBA (rys. 5). Równoczesne podanie obu auksyn w st eniu 0,01 mmol dm -3 powodowało zwi kszenie szybko ci wzrostu w porównaniu z oddzielnym działaniem ka dej z auksyn. W tym przypadku stwierdzono synergistyczne działanie obu substancji wzrostowych. Zale na od IAA stymulacja wzrostu elongacyjnego segmentów, zgodnie z zało eniami teorii kwasowego wzrostu [RAYLE, CLELAND 1970; HAGER i in. 1971] wynika, przynajmniej cz ciowo, ze stymulacji plazmolemowej H + -ATPazy, co prowadzi do zakwaszania apoplastu i rozlu nienia struktury ciany komórkowej. Dane niepublikowane, uzyskane w naszym laboratorium pokazuj, e wzrostowi indukowanemu przez IBA, podobnie jak IAA, towarzyszy obni enie ph rodowiska inkubacyjnego segmentów koleoptyli kukurydzy. Wcze niejsze doniesienia PETERSA i FELLE [1991], pokazuj ce wzrost zakwaszania rodowiska inkubacyjnego segmentów koleoptyli kukurydzy w obecno ci IBA, mog wiadczy o podobnym mechanizmie działania obu auksyn w stymulacji procesów wzrostowych. Wnioski 1. Traktowanie segmentów koleoptyli IAA lub IBA stymuluje, na podobnym poziomie, ich wzrost elongacyjny. 2. Wprowadzenie do rodowiska inkubacyjnego IAA równocze nie z IBA (0,01 mmol dm -3 ) powoduje synergistyczne działanie obu auksyn w stymulacji wzrostu. Literatura COOPER W.C Hormones in relations to root formation on stem cuttings. Plant. Physiol. 10: HAGER A Role of the plasma membrane H + -ATPase in auxin-induced elongation growth: historical and new aspects. J. Plant Res. 116: HAGER A., MENZEL H., KRAUSS A Versuche und Hypothese zur Primärwirkung des

124 140 R. Kurtyka, W. Karcz, M. Wieczorek Auxins beim Streckungswachstum. Planta 100: KARCZ W., BURDACH Z A comparison of the IAA and 4-Cl-IAA on growth, proton secretion and membrane potential in maize coleoptile segments. J. Exp. Bot. 53: KARCZ W., KURTYKA R Effect of cadmium on growth, proton extrusion and membrane potential in maize coleoptile segments. Biol. Plant. 51: KARCZ W., STOLAREK J., LEKACZ H., KURTYKA R., AND BURDACH Z Comparative investigation of auxin and fusicoccin-induced growth and H + -extrusion in coleoptile segments of Zea mays L. Acta Physiol. Plant. 17(1): 3-8. KARCZ W., STOLAREK J., PIETRUSZKA M., MAŁKOWSKI E The dose-response curves for IAA induced elongation growth and acidification of the incubation medium of Zea mays coleoptile segments. Physiol. Plant. 80: LUDWIG-MÜLLER J Indole-3-butyric acid in plant growth and development. Plant Growth Regul. 32: LUDWIG-MÜLLER J., VERTOCNIK A., TOWN C.D Analysis of indole-3-butyric acid induced adventitious root formation on Arabidopsis stem segments. J. Exp. Bot. 56: NORDSTROM A.C., JACOBS F.A., ELIASSON L Effect of exogenous indole-3-acetic acid and indole-3-butyric acid on internal levels of the respective auxins and their conjugation with aspartic acid during adventitious root formation in pea cuttings. Plant Physiol. 96: PETERS W.S., FELLE H Control of apoplast ph in corn coleoptiles segments. II. The effects of various auxin and auxin analogues. J. Plant Physiol. 137: RAYLE D.L., CLELAND R.E Enhancement of wall loosening and elongation by acid solutions. Plant Physiol. 46: RAYLE D.L., CLELAND R.E The acid-growth theory of auxin induced cell elongation is alive and well. Plant Physiol. 99: Słowa kluczowe: auksyny, IAA, IBA, segmenty koleoptyli kukurydzy, wzrost elongacyjny Streszczenie Kwas indolilo-3-octowy (IAA) oraz kwas indolilo-3-masłowy (IBA) s naturalnymi auksynami, wyst puj cymi u wielu gatunków ro lin. Odgrywaj one kluczow rol w procesach wzrostu i rozwoju ro lin, szczególnie w ich ukorzenianiu. Jednak, do tej pory, nie prowadzono bada dotycz cych porównania działania obu auksyn na wzrost elongacyjny nadziemnych cz ci ro lin. Badania przeprowadzono na 10-mm segmentach koleoptyli kukurydzy wycinanych z 4-dniowych etiolowanych siewek Zea mays L., z których usuwano pierwszy li. Segmenty koleoptyli traktowano roztworami IAA (0,01 mmol dm -3 ) lub/i IBA (0,01 mmol dm -3 lub 0,1 mmol dm -3 ) podanymi razem lub osobno do rodowiska. Pomiarów szybko ci wzrostu dokonano przy pomocy liniowego transducera k towego. Wykazano, e traktowanie segmentów koleoptyli IAA (0,01 mmol dm -3 ) lub/i IBA (0,01 mmol dm -3 lub 0,1 mmol dm -3 ) stymuluje ich wzrost elongacyjny. W przypadku wprowadzenia do rodowiska wzrostowego IAA równocze nie z IBA w st eniu 0,01 mmol dm -3 stwierdzono synergistyczne działanie obu auksyn.

125 PORÓWNANIE DZIAŁANIA KWASU INDOLILO-3-OCTOWEGO A COMPARISON OF THE EFFECTS OF IAA AND IBA ON ELONGATION GROWTH OF MAIZE COLEOPTILE SEGMENTS (Zea mays L.) Renata Kurtyka, Waldemar Karcz, Marta Wieczorek Department of Plant Physiology, University of Silesia, Katowice Key words: auxins, IAA, IBA, maize coleoptile segments, elongation growth Summary Indole-3-acetic acid (IAA) as well as indole-3-butyric acid (IBA) are the endogenous auxin in a variety of plant species. They are involved in many aspects of growth and development of plant, particularly in the promotion of rooting. Many investigations showed that IBA has a greater ability to promote the lateral and adventitious root formation as compared with IAA. Up to date there is a, lack of data in literature concerning the effect of IBA on the elongation growth of maize coleoptile. The experiments were carried out on 10 mm-long segments obtained from 4-dayold maize coleopiles grown in dark. The primary leaf was removed. Maize coleoptile segments were treated with IAA (0.01 mmol dm -3 ) or/and IBA (0.01 mmol dm -3 or 0.1 mmol dm -3 ). The growth experiments were conducted with an angular position-transducer. It was found that the treatment of maize coleopile segments with IAA (0.01 mmol dm -3 ) or/and IBA (0.01 mmol dm -3 or 0.1 mmol dm -3 ) stimulates their elongation growth. The addition of IAA together with IBA (0.01 mmol dm -3 ) caused a synergistic effect of both auxins on the growth of maize coleoptile segments. Dr Renata Kurtyka Katedra Fizjologii Ro lin Uniwersytet l ski ul. Jagiello ska KATOWICE renata.kurtyka@us.edu.pl

126 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: ROZMNA ANIE DZIKICH GATUNKÓW RODZAJU Beta W KULTURACH in vitro 1 Kamilla Ku dowicz, Maria Go ka Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Ro lin, Oddział w Bydgoszczy Wst p Dzikie gatunki rodzaju Beta stanowi cenne ródło genów odporno ci lub tolerancji na choroby, szkodniki i trudne warunki rodowiska [FILUTOWICZ, DALKE 1970; JUNG i in. 1990; JUNG, HERRMAN 1991; MESBACH i in. 1997; PANELLA, FRESE 2000; ASHER i in. 2001; FRESE i in. 2001; GAO, JUNG 2002; FRESE 2004; GRZEBELUS i in. 2004; KU DOWICZ 2007]. Jak dot d jednak, ze wzgl du na du e zró nicowanie morfologiczne i genetyczne, drog hodowli konwencjonalnej, nie udało si wprowadzi wszystkich po danych cech gatunków dzikich do form uprawnych buraka. Du e mo liwo ci wykorzystania puli genowej rodzaju Beta daje rozwój technik kultur tkankowych i biotechnologii [JUNG i in. 1986, 1990; PAUL i in. 1987, 1990; HUIZING i in. 1988; KRENS i in. 1988; PEDERSON 1990; JUNG, HERRMANN 1991]. Celem pracy było opracowanie efektywnej metody mikrorozmna ania wybranych gatunków dzikich rodzaju Beta. Materiał i metody Materiał do bada pochodził z kolekcji polowej rodzaju Beta, znajduj cej si na terenie Oddziału Instytutu Hodowli i Aklimatyzacji Ro lin w Bydgoszczy, nale cej do Krajowego Centrum Ro linnych Zasobów Genowych w Radzikowie. Obejmował on cztery wieloletnie dzikie gatunki buraka, nale ce do sekcji Corollinae o ró nym stopniu ploidalno ci ro lin i ró nym pochodzeniu: B. macrorhiza 2n, B. lomatogona 2n i 4n, B. corolliflora 4n (z Bułgarii i z USA) oraz B. trigyna 6n. Kontrol do bada stanowiły diploidalne wielonasienne buraki cukrowe. Eksplantatem wyj ciowym w do wiadczeniu były wierzchołki wzrostu p dów kwiatostanowych o długo ci 0,1-0,3 cm. Pobrany materiał odka ano 70% roztworem etanolu i 5% roztworem podchlorynu wapnia i wykładano na po ywk indukcyjn MS [MURASIGE, SKOOG 1962] zawieraj c 0,2 mg dm -3 BAP (6-benzyloaminopuryna). Kultury prowadzono w temperaturze 25 C, przy 16-godzinnym fotoperiodzie. Dla uzyskania bardziej efektywnej regeneracji p dów modyfikowano skład po ywek stosuj c ró ne st enia (0,2 lub 1,0 mg dm -3 ) i rodzaje regulatorów wzrostu: 6-benzyloaminopuryn (BAP), tidiazuron (TDZ), kinetyn (KIN), 1 Praca wykonana w ramach projektu badawczego Nr 2 PO6A

127 144 K. Ku dowicz, M. Go ka 6-(, dwumetyloalliloamino) puryn (2iP). Do ukorzeniania zregenerowanych p dów zastosowano po ywk MS lub pełn MS z dodatkiem 3,0; 6,0 lub 9,0 mg dm -3 kwasu indolilo-3-masłowego (IBA) oraz po ywk MS o zwi kszonej zawarto ci witamin z dodatkiem 6,0 mg dm -3 kwasu indolilo-3-octowego (IAA) lub 1,0 mg l -1 kwasu naftylo- 1-octowego (NAA), (tab. 2 i 3). Liczb regeneruj cych p dów w kulturach in vitro ró nych gatunków dzikich buraka okre lono współczynnikiem rozmna ania. Jest to rednia liczba p dów tworz cych si na jednym eksplantacie. W niniejszym do wiadczeniu warto t okre lono po 12 i 16 tygodniach kultury. Wyniki i dyskusja Po czterech tygodniach inkubacji wierzchołków wzrostu p dów kwiatostanowych obserwowano tworzenie p ków wegetatywnych. Cz stotliwo ró nicowania si p dów zale ała od gatunku (tab. 1). Najwy szym potencjałem morfogenetycznym charakteryzował si gatunek B. corolliflora pochodz cy z Bułgarii. Około 66% eksplantatów wyło onych na po ywki tworzyło p dy przybyszowe. U gatunków B. corolliflora i B. macrorhiza obserwowano równie tworzenie p dów generatywnych, bezpo rednio po wyło eniu wierzchołków wzrostu na po ywk indukcyjn. Na eksplantatach wierzchołków wzrostu p dów kwiatostanowych tworzyły si głównie pojedyncze p dy przybyszowe, dlatego konieczne było ich rozmno enie dla otrzymania wi kszej ilo ci materiału. Namna anie prowadzono na po ywce MS zawieraj cej 0,2 mg dm -3 BAP (tab. 1). Ze wzgl du na niski współczynnik rozmna ania po trzecim pasa u zwi kszono st enie BAP do 1 mg dm -3, uzyskuj c w ten sposób bardziej efektywn regeneracj p dów dzikich gatunków buraka. Wy sze st enie tej cytokininy (powy ej 1,0 mg dm -3 ) w po ywce działało hamuj co na wzrost p dów. Najlepiej rozmna ały si ro liny gatunku B. corolliflora pochodz ce z Bułgarii oraz diploidalne ro liny gatunku B. lomatogona ( rednio 2-4 ro lin z jednego eksplantatu), (tab. 1). Do regeneracji p dów przybyszowych z wierzchołków wzrostu p dów kwiatostanowych, oprócz BAP, stosowano równie TDZ w st eniu 0,2 lub 1,0 mg dm -3. Uzyskano stosunkowo wysoki współczynnik regeneracji i namno enia w kolejnych pasa ach (dane niepublikowane). Wyró nicowane p dy wykazywały jednak zmiany morfologiczne li ci i ogonków li ciowych. Posiadały niewielk liczb li ci o wydłu onych i w skich blaszkach z objawami witryfikacji. Nie nadawały si do dalszego namna ania i z tego wzgl du w kolejnych pasa ach z cytokininy tej zrezygnowano. Nie udało si uzyska regeneracji ro lin na eksplantatach wyło onych na po ywk indukcyjn zawieraj c 0,2 lub 1,0 mg dm -3 KIN lub 2iP, poniewa eksplantaty zamierały. W zwi zku z tym do rozmna ania wszystkich badanych wieloletnich gatunków dzikich buraka w warunkach kultur in vitro stosowano po ywk regeneracyjn zawieraj c 1,0 mg dm -3 BAP. Przed przeniesieniem ro lin na po ywk ukorzeniaj c zmniejszano st enie BAP do 0,2 mg dm -3. Wpływ st enia BAP na regeneracj p dów z wierzchołków wzrostu p dów kwiatostanowych buraka Effect of BAP concentration on the shoot regeneration from tips Tabela 1; Table 1

128 Po ywka MS Medium MS Gatunek Species B. lomatogona 2n B. lomatogona 4n B. macrorhiza 2n B. corolliflora 4n Bulg. B. corolliflora 4n USA liczba ekspl. no. of explants ROZMNA ANIE DZIKICH GATUNKÓW RODZAJU Beta % eksplantatów tworz cych p dy % explants of shoots regeneration of inflorescence shoots BAP 0,2 mg dm -3 BAP 1 mg dm -3 I pasa (liczba p dów) I passage (no. of shoots) II pasa (liczba p dów) II passage (no. of shoots) III pasa (liczba p dów) III passage (no. of shoots) współ. rozmn. po III pasa u coefficient of reprod. after III passage IV pasa (liczba p dów) IV passage (no. of shoots) współ. rozmn. po IV pasa u coefficient of reprod. after IV passage 98 20, , , , , , , ,8 16 1, , , , , , ,36 B. trigyna 6n , ,6 96 2,46 B. vulgaris 2n , , ,29 W trakcie prowadzonych bada regeneracja ro lin dzikich gatunków buraka zachodziła na drodze organogenezy bezpo redniej. W kolejnych do wiadczeniach próbowano regenerowa ro liny na drodze po redniej poprzez kalus. W tym celu pobierano fragmenty ogonków i blaszek li ciowych z p dów otrzymanych in vitro z wierzchołków wzrostu p dów kwiatostanowych i wykładano na po ywk MS zawieraj c 0,5; 1,0 lub 2,0 mg dm -3 BAP. Kultury umieszczono w termostacie, w temperaturze 31 C, w ciemno ci na okres 20 tygodni. Tworzenie kalusa obserwowano jedynie na eksplantatach dwuletniego gatunku B. maritima i buraka cukrowego. Eksplantaty wieloletnich gatunków dzikich nie ró nicowały si. Na po ywce regeneracyjnej p dy gatunków dzikich buraka nie tworzyły korzeni. Dobrze rozwini te regeneranty przenoszono na po ywk ukorzeniaj c. Po 6 tygodniach kultury, na po ywce MS z dodatkiem 3 i 6 mg dm -3 IBA, ro liny dzikich gatunków: B. lomatogona 2n i 4n oraz B. trigyna, wytworzyły pojedyncze korzenie przybyszowe, które jednak po około dwóch tygodniach zamarły (tab. 2). Dla porównania, ro liny buraka cukrowego tworzyły korzenie na prawie wszystkich zastosowanych kombinacjach po ywek (tab. 2 i 3). Nie znamy przyczyny braku ryzogenezy w kulturach in vitro u badanych buraków wieloletnich. Dotychczasowe badania w tym zakresie prowadzone zarówno w Polsce, jak i na wiecie, dotyczyły przewa nie form uprawnych buraka [GO KA 2004], natomiast gatunki dzikie, w tym głównie B. maritima nale ca do sekcji Beta, badane były sporadycznie [MAJEWSKA- SAWKA, JASSEM 1988; YU 1989]. Wpływ st enia IBA na tworzenie korzeni u buraka w kulturach in vitro Effect of IBA concentration on beet rooting in in vitro cultures Tabela 2; Table 2

129 146 K. Ku dowicz, M. Go ka Po ywka Medium MS IBA mg dm % wszystkich ukorzenionych p dów; % of all rooted shoots Gatunek Species B. lomatogona 2n B. lomatogona 4n liczba p dów no. of shoots MS % wszystkich ukorzenionych p dów; % of all rooted shoots liczba p dów no. of shoots * 8* 8 6, * 12 8,3 B. macrorhiza 2n B. corolliflora 4n Bulg B. trigyna 6n * 8 3,1 B. vulgaris 2n 4* 4* 4* 4 62,5 4 4* 4* 4 43,8 * kombinacja na której ró nicowały si korzenie; combination on which roots differentiated Tabela 3; Table 3 Wpływ NAA i IAA oraz witamin na tworzenie korzeni u buraka w kulturach in vitro Effect of NAA and IAA and vitamins on beet rooting in in vitro cultures Po ywka; Medium MS + witaminy MS + vitamins mg dm -3 1 NAA 3 NAA % ukorzenionych p dów % of rooted shoots Gatunek; Species liczba p dów no. of shoots MS + witaminy MS + vitamins 6 IAA % ukorzenionych p dów % of rooted shoots liczba p dów no. of shoots B. lomatogona 2n z 0 B. lomatogona 4n z 0 B. macrorhiza 2n z 0 B. corolliflora 4n Bulg z 0 B. trigyna 6n z 0 B. vulgaris 2n ,0 6 83,3 z zamarły; dead Witaminy; Vitamins: B6 pirydoksyna; pyridoxine - 1 mg dm -3 PP kw. nikotynowy; nicotinic acid - 1 mg dm -3 B1 tiamina; tiamine - 2 mg dm -3 Na podstawie wcze niejszych bada trudno wnioskowa jakie rodzaje eksplantatów form dzikich buraka s podatne na regeneracj w kulturach in vitro i jaka jest wydajno tej metody. Niezb dne zatem jest dopracowanie efektywnej metody mikrorozmna ania i ukorzeniania dzikich gatunków rodzaju Beta w kulturach in vitro poprzez dobór składników po ywki oraz innych warunków kultury. Prace s kontynuowane. Wnioski

130 ROZMNA ANIE DZIKICH GATUNKÓW RODZAJU Beta Wierzchołki wzrostu p dów kwiatostanowych dzikich gatunków rodzaju Beta mog by z powodzeniem wykorzystywane jako eksplantaty wyj ciowe do mikrorozmna ania. 2. Najbardziej efektywn regeneracj p dów gatunków dzikich uzyskano przy st eniu 1 mg dm -3 BAP w po ywce MS. 3. Metoda ukorzeniania p dów gatunków dzikich buraka in vitro wymaga dopracowania składu po ywek ukorzeniaj cych oraz warunków kultury. Literatura ASHER M.J.C., LUTERBACHER M.C., FRESE L Wild Beta species as a source of resistance to sugar-beet pests and diseases. International Sugar Journal 103: FILUTOWICZ A., DALKE L Charakterystyka gatunków sekcji Corollinae rodzaju Beta i mo liwo ci ich wykorzystania w hodowli buraka. Biuletyn IHAR 5/6: FRESE L Rationale for in situ management of wild Beta species. Wyd. PGR FORUM. Birmingham. Crop Wild Relative 2: 4-7. FRESE L., DESPREZ B., ZIEGLER D Potential of genetic resources and breeding strategies for basebroadening in Beta, w: Broadening the genetic base of crop. Wyd. IPGR, Rzym: GAO D., JUNG C Monosomic addition lines of Beta corolliflora in sugar beet: plant morphology and leaf spot resistance. Plant Breeding 121: GO KA M Wpływ cytokinin na morfogenez buraka cukrowego (Beta vulgaris L.) w kulturach in vitro. Biotechnologia 2: GRZEBELUS D., BARA SKI B., REBY E., MICHALIK B Poszukiwanie ródeł odporno ci na Cercospora beticola Sacc. w zasobach genowych rodzaju Beta. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 497: HUIZING H.J., VAR DER MODEN W., KRENS F.A Investigation into chromosomal stability of in-vitro growing cells from a transformed monosomic addition plant of beet. Euphytica 5: JUNG C., HERRMANN R. G DNA probe for rapid screening of sugar beet (Beta vulgaris L.) carrying extra chromosomes from wild beets of the Procumbentes section. Plant Breeding 107: JUNG C., KLEINE M., FISHER F., HERMAN R.G Analysis of DNA from Beta procumbens chromosome fragment in sugar beet carrying a gene for nematode resistance. Theor. Appl. Genet. 79: JUNG C., WEHLING P., LOPTIEN H Electrophoretic investigations on nematode resistant sugar beets. Plant Breeding 98: KRENS F.A., ZIJLSTRA C., MOLEN W., JAMAR D., HUIZING H Transformation and regeneration in sugar beet (Beta vulgaris L.) induced by shooter mutans of Agrobacterium tumefaciens. Euphytica. Suppl.: KU DOWICZ K Kolekcja gatunków dzikich i form uprawnych rodzaju Beta - gromadzenie, ocena i wykorzystanie w badaniach i hodowli. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 517:

131 148 K. Ku dowicz, M. Go ka MAJEWSKA-SAWKA A., JASSEM B The comparison of in vitro morphogenetic abilities in the Corollinae section of the genus Beta. Zuchtungsforsh 18: MESBACH M., SCHOLTEN O.E. DE BOCK T.S.M., LANGE W Chromosome localization of genes for resistance to Heterodera schachtii, Cercospora beticola and Polymyxa betae using sets of Beta procumbens and B. patellaris derived monosomic additions in B. vulgaris. Euphytica 97: MURASIGE, SKOOG A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: PANELLA L., FRESE L Cercospora resistance in Beta species and the development of resistant sugar beet lines, w: Cercospora beticola Sacc. biology, agronomic influence and control measures in sugar beet. International Institute for Beet Research, Brussels, vol. 2.: PAUL H., ZIJLSTRA C., LEEUWANGH J.E., KRENS F.A., HUIZING H Reproduction of the cyst nematode Heterodera schachtii Schm. on transformed root cultures of Beta vulgaris L. Plant Cell Rep. 6: PAUL H., VAN DEELEN J.E.M., HENKEN B., DE BOCK TH. S.M., LANGE W., KRENS F.A Expression in vitro of resistance to Heterodera schachtii Schm. in hairy roots of an alien monotelosomic addition plant of Beta vulgaris transformed by Agrobacterium rhizogenes. Euphytica 48: PEDERSON H.C Transformation of sugarbeet protoplasts using Agrobacterium tumefaciens spheroplasts. VII International Congress on Plant Tissue and Cell Culture. Amsterdam. Abst. A YU M.H Callus induction and differentiation from leaf explants of different species of the genus Beta. Crop Sci. 29: Słowa kluczowe: burak, Corollinae, regeneracja, p dy przybyszowe Streszczenie Dzikie gatunki rodzaju Beta stanowi cenne ródło genów odporno ci lub tolerancji na choroby, szkodniki i trudne warunki rodowiska. Celem pracy było opracowanie wydajnej metody mikrorozmna ania dzikich gatunków rodzaju Beta. Eksplantatem wyj ciowym w do wiadczeniu były wierzchołki wzrostu p dów kwiatostanowych (B. macrorhiza, B. lomatogona, B. corolliflora, B. trigyna), które wykładano na po ywk MS z ró nymi rodzajami i st eniami cytokinin (BAP, TDZ, KIN, 2iP). Kontrol stanowiły ro liny buraka cukrowego. Najbardziej efektywna regeneracja p dów gatunków dzikich buraka zachodziła na po ywce zwieraj cej BAP w st eniu 1 mg dm -3. Uzyskane p dy przenoszono na po ywk ukorzeniaj c MS z dodatkiem 3,0; 6,0 lub 9,0 mg dm -3 IBA oraz po ywk MS o zwi kszonej zawarto ci witamin z dodatkiem 6,0 mg dm -3 IAA, 1,0 lub 3,0 mg dm -3 NAA. Badane dzikie gatunki rodzaju Beta w przeciwie stwie do buraka cukrowego sporadycznie tworzyły korzenie na zastosowanych kombinacjach po ywek. In vitro MULTIPLICATION OF WILD BEET SPECIES OF THE GENUS Beta

132 ROZMNA ANIE DZIKICH GATUNKÓW RODZAJU Beta Kamilla Ku dowicz, Maria Go ka Plant Breeding and Acclimatization Institute, Research Division Bydgoszcz Key words: beet, Corollinae, plant regeneration, adventitious shoots Summary Wild species of the genus Beta are important as a source of genes resistant or tolerant to diseases, pests and stress abiotic factors. The purpose of this investigation was to search for the efficient in vitro multiplication method of some of the wild beet species of the genus Beta. The initial explants were the tips of inflorescence shoots (B. macrorhiza, B. lomatogona, B. corolliflora, B. trigyna) based on MS medium supplemented with several levels and concentrations of growth regulators (BAP, TDZ, KIN, 2iP). Sugar beets were used as a control. MS medium with 1 mg dm -3 BAP was the best for the effective plant regeneration of wild beet species. For rooting, multiplied shoots were transferred to MS rooting medium with 3.0, 6.0 or 9.0 mg dm -3 IBA and MS medium supplemented with the increased level of vitamins and 6.0 mg dm -3 IAA, 1,0 and 3.0 mg dm -3 NAA. The investigated wild beet species of the genus Beta contrary to sugar beet, sporadically regenerated roots on the used mediums. Mgr in. Kamilla Ku dowicz Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Ro lin Oddział w Bydgoszczy ul. Powsta ców Wielkopolskich BYDGOSZCZ k.kuzdowicz@ihar.bydgoszcz.pl.

133 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: WYKORZYSTANIE METODY in vitro W GENERATYWNYM I WEGETATYWNYM ROZMNA ANIU DERENIA JADALNEGO (Cornus mas L.) Włodzimierz Lech, Ewa Dziedzic, Monika Bieniasz, Roman Rduch Katedra Sadownictwa i Pszczelnictwa, Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołł taja w Krakowie Wst p W grupie mniej znanych gatunków ro lin, które ciesz si obecnie zwi kszonym zainteresowaniem jest dere jadalny [KAWECKI, BIENIEK 2005]. Gatunek ten znany jest od dawna, wg ródeł archeologicznych lady derenia sprzed lat p.n.e. znaleziono w pobli u Urfy, na południu Turcji. W stanie naturalnym wyst puje w rodkowej i południowej Europie, na Kaukazie oraz w zachodniej Azji [SENETA 1973]. Dere jest dobrze przystosowany do niekorzystnych warunków rodowiska i jednocze nie mało podatny na choroby i szkodniki. Odporny na niskie temperatury, polecany jest na wilgotne, yzne gleby, stanowiska słoneczne. Nadaje si na szpalery i ywopłoty, jest miododajn ro lin, a drewno jest wykorzystywane w tokarstwie. Owoce derenia jadalnego mog by czerwone, ró owe lub ółte, okr głego lub wydłu onego kształtu. rednia masa owocu waha si od 5-8 gramów. Pestka stanowi od 7,5 do 11,0% całkowitej masy owocu [SENETA 1973]. Owoce odznaczaj si wysokimi wła ciwo ciami leczniczymi i dietetycznymi [GÜLÇIN i in. 2005]. Zawarto cukrów wynosi od 8,0 do 1,0%, kwasów organicznych od 1,3 do 1,9%, witaminy C waha si od 101 to 193 mg%. W skórce owoców zawarto antocyjanów wynosi od 670 do 850 mg%, podczas gdy w mi szu od 36 do 121 mg%. W ród antocyjanów przewa a cyjanidino-3-glukozyd, którego zawarto wynosi 223 mg w 100 g w.m. owocu [PANTELIDIS i in. 2007]. Owoce nadaj si na ró nego typu przetwory, d emy, nalewki. Znany tak e w medycynie ludowej dere stosowany jest w celu obni enia gor czki, a ostatnie badania wykazały równie jego aktywno antybiotyczn w odniesieniu do bakterii: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Micrococcus luteus [DULGER, DONUZ 2004]. Obecnie w wielu o rodkach na wiecie prowadzone s systematyczne prace nad tworzeniem kolekcji, odbudow zasobów genowych i selekcj wielkoowocowych odmian tego gatunku [KLIMIENKO 2004; ERCÝSLÝ 2004; GÜLERYÜZ i in. 1998]. Rozmna anie generatywne derenia, podobnie jak innych gatunków drzew i krzewów owocowych, napotyka na du e trudno ci. Kiełkowanie nasion derenia po samoistnym wysianiu nast puje po 2 lub 3 latach, a otrzymane w ten sposób ro liny zaczynaj owocowa dopiero po 20 latach. Przyczyn niekiełkowania nasion wielu gatunków ro lin zaraz po zbiorze s czynniki fizyczne i fizjologiczne. Łupina nasienna mo e by stwardniała i nie przepuszcza wody i gazów, mo e te zawiera inhibitory, które hamuj kiełkowanie nasion. Nasiona mog cechowa si fizjologicznym bezwzgl dnym spoczynkiem wewn trznym (płytkim, po rednim lub gł bokim). Ten rodzaj spoczynku jest regulowany przez zarodek lub łupiny nasienne. Istniej te

134 152 W. Lech i inni nasiona o podwójnym spoczynku, powodowanym zarówno przez łupiny nasienne, jak i zarodek. Chc c zmusi nasiona do kiełkowania przeprowadza si odpowiednie zabiegi, które przyspieszaj kiełkowanie [REJMAN, MAKOSZ 1995]. Najcz ciej jest to stratyfikacja ciepło-zimna. Stosuje si równie skaryfikacj, traktowanie nasion gor c wod, działanie rodkami chemicznymi (gibereliny, cytokininy, etylen, azotan potasu, tiomocznik). Traktowanie st onym kwasem siarkowym (5 min) nasion Cornus capitata zwi kszyło procent kiełkuj cych nasion i znacznie skróciło czas kiełkowania [AIRI i in. 2005]. W przypadku rozmna ania wegetatywnego derenia dobre efekty mo na uzyska przy wykorzystaniu sadzonek półzdrewniałych, wykonanych w drugiej połowie czerwca, z zastosowaniem ukorzeniacza Rhizopon AA 1% lub 2% w podło u z mieszaniny torfu wysokiego i perlitu w stosunku obj to ciowym 1:1, ph w H 2 O - 5,0 [KORSZUN, KOLASI SKI 2002]. Mo liwa jest te okulizacja na siewkach derenia oczkami z ju owocuj cych drzew. Metoda ta cz sto jest stosowana przy rozmna aniu szlachetnych odmian derenia. Podejmowane s te próby zastosowania kultur sterylnych w rozmna aniu derenia. Metoda otrzymywania siewek derenia w krótkim czasie, dzi ki przełamaniu spoczynku nasion w warunkach in vitro mogłaby znale zastosowanie w produkcji szkółkarskiej. Prowadzone dotychczas badania wskazuj, e warunki in vitro umo liwiaj przełamanie spoczynku i kiełkowanie nasion wielu gatunków ro lin. Gł boki spoczynek zarodkowy nasion jabłoni został przełamany i stymulacja kiełkowania izolowanych zarodków nast powała w wyniku krótkotrwałego traktowania ich cyjanowodorem (1 mm, 6 godz.) [BOGATEK i in. 1991]. Ostatnio stwierdzono, e w regulacji kiełkowania nasion ró nych gatunków ro lin bierze udział tlenek azotu. Zastosowanie donorów tlenku azotu (S-nitrozo-N-acetylopenicyloaminy oraz nitroprusydku sodu) wywołuje efekt podobny jak u ycie cyjanowodoru [GNIAZDOWSKA, BOGATEK 2007]. Szczegółowo opisana technologia rozmna ania w warunkach in vitro mo e znale zastosowanie do otrzymywania wielkoowocowych odmian derenia, co przyczyniłoby si do popularyzacji uprawy tego gatunku. Opracowano ju metodyk regeneracji całych ro lin z p ków bocznych w kulturze siewek Cornus florida L. [KAVERIAPPA i in. 1997], jak równie somatyczn embriogenez i kiełkowanie zarodków somatycznych [TRIGIANO i in. 1989]. Przykładem odmiany derenia jadalnego, dla której została opracowana metodyka rozmna ania z wykorzystaniem kultur tkankowych, jest odmiana Macrocarpa [ URKOVI 2008]. Materiał i metody Kiełkowanie nasion derenia jadalnego na po ywkach w warunkach in vitro Z dojrzałych owoców derenia typu lokalnego wydobywano pestki, z których usuni to resztki mi szu. Bardzo twardy endokarp przecinano w poprzek ostrym narz dziem, a nast pnie wydobywano ostro nie nasiona. Nasiona poddano dezynfekcji w 1% roztworze podchlorynu wapnia przez 5 min i kolejno kilkakrotnie przepłukano wod steryln. Tak przygotowane nasiona wykładano na po ywki w celu pobudzenia ich do kiełkowania. Zastosowano po ywki wykonane według składu mineralnego po ywki MURASHIGE i SKOOG [1962]. Zestalone 0,6% agarem po ywki zawierały 3,0% sacharozy oraz substancje wzrostowe o podanych kombinacjach i st eniach (tab. 1). Odczyn po ywki ustalono na poziomie ph=5,7. Tabela 1; Table 1

135 WYKORZYSTANIE METODY in vitro Skład po ywek do kiełkowania nasion derenia Media composition for germination of cornelian cherry seeds Lp. No. Po ywka Media 1 Murashige i Skoog (1962) Murashige and Skoog (1962) Rodzaj i st enie substancji wzrostowych Type and concentration of hormonal substances 0,2 mg dm -3 BA 2 0,2 mg dm -3 BA+0,5 mg dm -3 GA 3 3 0,2 mg dm -3 BA+5,0 mg dm -3 GA 3 Przy wykładaniu na po ywki zastosowano dwa sposoby traktowania nasion. Cz nasion wykładano z nietkni t łupin nasienn, a u cz ci delikatnie łupin nacinano. Do wiadczenie zało ono w czterech powtórzeniach, jedno powtórzenie stanowiła jedna kolba, zawieraj ca cztery nasiona. Kolby z nasionami umieszczono w fitotronie, w warunkach 16-godzinnego fotoperiodu przy o wietleniu 92,8 mol m -2 s -1 oraz w temperaturze 23 ±1 C. Obserwacje i pomiary prowadzone były po 7, 14, 21, 36 oraz 66 dniach od wyło enia nasion na po ywki. Kultura p ków derenia w warunkach in vitro Kultury dwóch odmian derenia jadalnego Devin oraz Titus zało ono z pobranych jesieni oraz wiosn p ków k towych. Po zdj ciu br zowych okryw p ki poddano dezynfekcji, któr przeprowadzono według schematu: 70% alkohol - 1 min, 12% podchloryn wapnia - 10 min 3-krotne przemycie wod steryln, a nast pnie krótkotrwałe przepłukanie 1% roztworem podchlorynu wapnia. Po dezynfekcji p ki wyło ono na inicjuj c po ywk MURASHIGE i SKOOG [1962] z dodatkiem IBA w st eniu 0,1 mg dm -3 oraz BA w st eniu 1,0 mg dm -3. Po uzyskaniu stabilnej kultury zało ono do wiadczenie, maj ce na celu znalezienie wła ciwej po ywki namna aj cej dla p dów derenia. Na tym etapie do wiadczenia wykorzystano po ywki sporz dzone w oparciu o skład po ywki LLOYD i MCCOWN [1980]. Skład badanych po ywek podano w tab. 2. Tabela 2; Table 2 Lp. No. Skład po ywek do namno enia p dów derenia jadalnego Media composition for multiplication of cornelian cherry shoots Po ywka Media 1 Lloyd i McCown (1980) Lloyd and McCown (1980) Rodzaj i st enie substancji wzrostowych Type and concentration of hormonal substances 0,6 mg dm -3 BA+2% sacharozy; 0.6 mg dm -3 BA+2% saccharose 2 0,6 mg dm -3 BA+2% glukozy; 0.6 mg dm -3 BA+2% glucose 3 0,6 mg dm -3 BA+0,05 mg dm -3 IBA+2% sacharozy 0.6 mg dm -3 BA+0.05 mg dm -3 IBA+2% saccharose 4 0,6 mg dm -3 BA+0,05 mg dm -3 IBA+2% glukozy 0.6 mg dm -3 BA+0.05 mg dm -3 IBA+2% glucose Odczyn po ywek ustalono na poziomie ph=5,7; po ywki zestalono 0,6% agarem. Kolby z p dami utrzymywano w warunkach fotoperiodu 16 h/8 h, dzie /noc przy o wietleniu 92,8 mol m -2 s -1 oraz w temperaturze 23 ±1 C. Obserwacje i pomiary przeprowadzono pod koniec ka dego z czterech pasa y, wykonywanych w czterotygodniowych odst pach. Do wiadczenie zało ono w pi ciu powtórzeniach (kolbach), w kolbie wysadzano pi sztuk p dów. Wyniki uzyskane w kolejnych etapach do wiadczenia poddane zostały obli-

136 154 W. Lech i inni czeniom statystycznym w oparciu o analiz wariancji, z uwzgl dnieniem wielokrotnego testu Duncana przy poziomie prawdopodobie stwa =0,05. Wyniki i dyskusja Kiełkowanie nasion derenia jadalnego na po ywkach w warunkach in vitro rednie wymiary nasion wykładanych na po ywki wynosiły 1,06 cm 0,3 cm. Stwierdzono, e w zale no ci od wielko ci pestki znajdowało si w niej 1-3 nasion. Po siedmiu dniach od wyło enia nasion na po ywki zaobserwowano ró nice w tempie kiełkowania zarodków, w zale no ci od rodzaju po ywki oraz sposobu traktowania nasion (tab. 3). Tabela 3; Table 3 Procent kiełkuj cych nasion derenia jadalnego z naci t i nienaci t okryw nasienn po 7, 14, 21, 36 oraz 66 dniach od wyło enia na po ywki Percent of germinating cornelian cherry seeds with cut and non-cut coat 7, 14, 21, 36, 66 days after placing on the media Obiekt Object Dni od wyło enia nasion na po ywki Days after placing of seeds on the media Rodzaj i st enie substancji wzrostowych w po ywce Type and concentration of hormonal substances 0,2 mg dm -3 BA 14,6 b 14,6 a 19,6 a 22,2 a 28,8 a 0,2 mg dm -3 BA+0,5 mg dm -3 GA 3 12,4 b 14,6 a 37,1 a 59,8 b 60,0 b 0,2 mg dm -3 BA+5,0 mg dm -3 GA 3 0,4 a 22,2 a 30,9 a 77,8 b 80,0 b Sposób traktowania nasion; Method od seed treatment Okrywa nienaci ta; Non-cut seed coat 0,2 a 0,8 a 10,3 a 21,3 a 28,8 a Okrywa naci ta; Cut seed coat 23,1 b 47,8 b 52,2 b 75,8 b 82,0 b rednie oznaczone tymi samymi literami nie ró ni si statystycznie przy same letters do not differ at =0.05 =0,05; means followed by the Naci cie łupiny nasiennej spowodowało szybsze kiełkowanie zarodków na po ywce z mniejsz zawarto ci gibereliny oraz na po ywce bez tego hormonu. Na po ywce z dodatkiem gibereliny w st eniu 5,0 mg dm -3 kiełkowanie zarodków z nasion z naci t łupin zaobserwowano po dalszych siedmiu dniach kultury. Po trzech tygodniach od zało enia do wiadczenia odnotowano kiełkowanie zarodków na wszystkich po ywkach dla obydwu sposobów traktowania nasion, z tym, e w przypadku nasion z naci t łupin procent kiełkuj cych nasion był istotnie wy szy (52,2%) w porównaniu do nasion z łupin nienaci t (10,3%). Po przeszło dwóch miesi cach trwania do wiadczenia stwierdzono, e zarówno naci cie łupiny, jak i dodatek gibereliny do po ywki przyczyniło si do statystycznie wi kszej liczby kiełkuj cych zarodków. Nasiona, które zostały poło one bez nacinania łupiny na po ywk pozbawion gibereliny po dwóch miesi cach do wiadczenia zamarły. W efekcie stwierdzono, e dodatek gibereliny do po ywek istotnie wpłyn ł na procent kiełkuj cych nasion, niezale nie od zastosowanego st enia gibereliny. Spostrze enia dokonane w przeprowadzonym do wiadczeniu, a dotycz ce korzystnego wpływu gibereliny na kiełkowanie zarodka, s zgodne z sugestiami

137 WYKORZYSTANIE METODY in vitro BEWLEY A [1997], który szeroko omawia znaczenie i rol, jak odgrywaj gibereliny w przełamywaniu spoczynku nasion. Wydaje si, e gibereliny nie s samodzielnie zaanga owane w kontrol spoczynku nasion, ale odgrywaj wa n rol w podtrzymaniu kiełkowania i działaj w chwili, gdy spoczynek nasion powodowany przez ABA zostaje przełamany. Współdziałanie ABA oraz giberelin mo e by wzajemnie powi zane, o czym wiadczy fakt, e w mutantach Arabidopsis aba oraz do2, obni onemu spoczynkowi nasion towarzyszy ni sze zapotrzebowanie na gibereliny do kiełkowania [LÉON-KLOOSTERZIEL i in. 1996]. Tabela 4; Table 4 Cechy morfologiczne siewek derenia jadalnego uzyskanych po 66 dniach od wyło enia nasion na po ywki w warunkach in vitro Morphological features of cornelian cherry seedlings obtained 66 days after placing the seeds on the media in in vitro conditions Obiekt Object Wysoko siewek (cm) Height of seedling (cm) Rodzaj i st enie substancji wzrostowych w po ywce Type and concentration of hormonal substances Długo korzenia siewek (cm) Length of seedling root (cm) Szeroko li cia siewek (cm); Width of seedling leaf (cm) Długo li cia siewek (cm) Length of seedling leaf (cm) 0,2 mg dm -3 BA 2,4 a 0,3 a 0,6 n.s. 2,8 a 0,2 mg dm -3 BA+0,5 mg dm -3 GA 3 5,8 b 0,5 a 1,1 n.s. 5,4 ab 0,2 mg dm -3 BA+5,0 mg dm -3 GA 3 6,9 b 3,0 b 1,5 n.s. 7,9 b Okrywa nienaci ta Non-cut seed coat Sposób traktowania nasion; Methods of seed treatment 2,5 a 0,7 a 0,9 n.s. 4,2 a Okrywa naci ta; Cut seed coat 7,7 b 1,9 b 1,2 n.s. 6,5 a n.s. zró nicowanie nieistotne przy =0,05; differentiation non-significant at =0.05 rednie oznaczone tymi samymi literami nie ró ni si statystycznie przy =0,05; means followed by the same letters do not differ at =0.05 Stwierdzono istotne zró nicowanie w wysoko ci siewek uzyskanych z nasion z nienaci t i naci t łupin nasienn (tab. 4). rednia wysoko siewek otrzymanych z tych ostatnich nasion wynosiła 7,7 cm, podczas gdy rednia wysoko siewek z nasion, na których łupina nie została naci ta - 2,5 cm. Na po ywkach zawieraj cych giberelin uzyskane siewki cechowały si istotnie wi ksz wysoko ci w porównaniu do siewek z nasion wyło onych na po ywk bez gibereliny. Równie w długo ci korzeni siewek stwierdzono istotne zró nicowanie na korzy siewek z nasion z naci t łupin ( rednia długo korzenia wynosiła 1,9 cm) oraz po ywki, zawieraj cej giberelin w st eniu 5,0 mg dm -3 ( rednia długo korzenia wynosiła 3,0 cm). Po dwóch miesi cach kultury siewki wytworzyły rednio 5-6 li ci. Li cie siewek z po ywek zawieraj cych giberelin odznaczały si statystycznie wi ksz długo ci, ale nie ró niły si pod wzgl dem szeroko ci (tab. 4). Kultury p ków derenia w warunkach in vitro Wyniki dotycz ce skuteczno ci zabiegu dezynfekcji p ków k towych dwóch odmian derenia jadalnego Devin i Titus zamieszczono w tabeli 5.

138 156 W. Lech i inni Obiekt Object Efektywno zabiegu odka ania p ków k towych derenia jadalnego Effectiveness of cornelian cherry axial buds sterilization Liczba p ków poddanych odkaaniu; Number of sterilized buds Procent p ków zaka onych Percent of infected buds Procent p ków zamarłych Percent of dead buds Termin pobrania p ków - jesie ; Time of bud collecting - Autumn Tabela 5; Table 5 Procent p ków ywych Percent of survived buds Devin 24 41,7 41,6 16,7 Titus 33 6,1 84,8 9,1 Termin pobrania p ków - wiosna; Time of bud collecting - Spring Devin ,1 20,9 Titus ,5 20,5 Obiekt Object Liczba oraz długo p du dwóch odmian derenia jadalnego Number and length of two cultivars cornelian cherry shoots rednia liczba p dów mean number of shoots Po ywki wg tabeli 2; Media according to Table 2. Tabela 6; Table rednia długo p du mean length of shoot (cm) rednia liczba p dów mean number of shoots rednia długo p du mean length of shoot (cm) rednia liczba p dów mean number of shoots rednia długo p du mean length of shoot (cm) rednia liczba p dów mean number of shoots rednia długo p du mean length of shoot (cm) Devin 3,8 a 2,6 a 4,0 a 2,6 a 4,3 ab 2,8 ab 4,8 b 3,1 b Titus 4,6 b 2,8 a 4,7 b 2,7 a 4,3 ab 2,9 ab 3,8 a 2,7 a rednie oznaczone tymi samymi literami nie ró ni si statystycznie przy same letters do not differ at =0.05 =0,05; means followed by the Spo ród dwóch terminów pobierania p ków i zakładania kultury derenia, korzystniejszym okazał si termin wiosenny, ze wzgl du na wi kszy procent uzyskanych ywych i zdrowych p ków odmiany Devin (20,9%) oraz odmiany Titus (20,5%), (tab. 5). W etapie namna ania odmiany ró niły si współczynnikiem namno enia p dów oraz reakcj na składy po ywek (tab. 6). Odmiana Titus cechowała si wy szym współczynnikiem namna ania p dów na po ywkach nr 1 i 2, w porównaniu do odmiany Devin. Współczynniki namno enia p dów odmiany Titus wynosiły 1:4,6 na po ywce nr 1 oraz 1:4,7 na po ywce nr 2 (tab. 6). Na po ywce nr 3 współczynniki namno enia obu odmian były jednakowe, natomiast na po ywce nr 4 odmiana Devin cechowała si istotnie wi ksz liczb wytworzonych p dów. Uzyskane wyniki wskazuj, e brak w po ywce auksyny wywiera korzystny wpływ na zdolno pobudzania p ków k towych odmiany Titus do wybijania w nowe p dy, natomiast dla odmiany Devin dodatek do po ywek auksyny był korzystny.

139 WYKORZYSTANIE METODY in vitro W badaniach URKOVI [2008] dotycz cych derenia jadalnego odmiany Macrocarpa za najbardziej przydatn uznano po ywk LLOYD i MCCOWN [1980]. Kombinacja cytokininy BA w st eniu 0,7 mg dm -3 oraz auksyny NAA w st eniu 0,05 mg dm -3 okazała si najkorzystniejsz bior c pod uwag wysoki współczynnik namna ania p dów wynosz cy 1: 6,2, przy redniej długo ci p dów 1,55 cm. Tak wysoki współczynnik namno enia jest zadowalaj cy i z punktu widzenia opłacalno ci produkcji uzasadnia celowo tego rodzaju bada. EDSON i in. [1994] przy namna aniu derenia Ascona (Cornus nuttallii Audubon) na po ywce LLOYD i MCCOWN [1980] uzyskał współczynnik namno enia p dów 3,1 w obecno ci w po ywce cytokininy BA w st eniu 1,0 mg dm -3. W namna aniu Cornus florida spo ród stosowanych siedmiu po ywek o ró nym składzie mineralnym najkorzystniejsz okazała si po ywka LLOYD i MCCOWN [1980] z dodatkiem BA w st eniu 0,5 mg dm -3 oraz IBA w st eniu 1,0 mg dm -3 [DECLERCK, KORBAN 1994]. W innych badaniach dotycz cych tego gatunku wysoki współczynnik namno enia p dów wynosz cy od 1:5,5 do 1:6,0 został osi gni ty po zastosowaniu cytokininy BA w st eniu 1,0 mg dm -3 [KAVERIAPPA i in. 1997]. W przeprowadzonych badaniach rodzaj zastosowanego cukru (sacharoza, glukoza) nie wywarł znacz cego wpływu na współczynnik namno enia ani na długo p dów (tab. 6). Obserwacje te s zgodne z wynikami innych autorów [BORKOWSKA i in. 1994], którzy wykazali dla wi ni odmiany Łutówka podobny wzrost kultur p dowych na po ywce z sacharoz lub glukoz. Ci sami autorzy wykazali, e 2% st enie cukru w po ywce, niezale nie od rodzaju tego cukru, zabezpiecza zapotrzebowanie tkanek ro linnych na ródło energii i tworzenie biomasy. Dodatkowa jednoprocentowa zawarto cukru (w przypadku najcz ciej stosowanego 3% st enia cukru w po ywce) jest zu ytkowywana na regulacj ci nienia osmotycznego. Równie dla kilku odmian urawiny i brusznicy wykazano korzystny wpływ 2% st enia sacharozy w po ywce, ze wzgl du na efektywno namna ania p dów [DEBNATH 2005]. Wyniki dotycz ce długo ci p dów były porównywalne dla obydwu odmian derenia na po ywkach nr 1, 2 oraz 3 i jedynie na po ywce nr 4 p dy odmiany Devin były statystycznie dłu sze (3,1 cm) w porównaniu do odmiany Titus (2,7 cm), (tab. 6). W prezentowanych badaniach du y problem stanowiło wyst powanie objawów szklisto ci p dów (tab. 7). W najni szym nasileniu to zaburzenie fizjologiczne odnotowano na po ywce nr 1 dla obydwu odmian (43,1% szklistych p dów odmiany Devin i 49,0% szklistych p dów odmiany Titus ) oraz na po ywce nr 4 dla odmiany Devin (44,0% szklistych p dów), (tab. 7). Obiekt Object Procent p dów szklistych dwóch odmian derenia jadalnego Percent of cornelian cherry vitrified shoots Po ywki wg tabeli 2 Media according to Table 2 Tabela 7; Table Devin 43,1 80,0 67,4 44,0 Titus 49,0 68,2 66,7 62,1 Prawdopodobn przyczyn tego zjawiska mógł by zbyt niski odczyn po ywki

140 158 W. Lech i inni wynosz cy ph=5,7-5,8. URKOVI [2008] w swoich badaniach nad odmian Macrocarpa uzyskał bardzo korzystny współczynnik namno enia p dów wynosz cy 1:6,6 po podniesieniu odczynu po ywki do poziomu ph=6,2. Autor ten nie podaje adnych informacji o wyst powaniu szklisto ci p dów. Obiekt Object Procent i wielko kalusa u podstawy p dów derenia Percent and size of callus at the base of cornelian cherry shoots Po ywki wg tabeli 2 Media according to Table 2 Tabela 8; Table a b c a b c a b c a b c Devin 69,5 26,3 4,2 85,0 15,0 0 75,8 22,1 2,1 78,9 20,0 1,1 Titus 67,8 23,4 8,8 60,0 34,2 5,8 71,6 23,1 5,3 67,4 24,2 8,4 Wielko tkanki kalusa według skali, gdzie: a= 1-2 mm, b= 3-5 mm, c= 6 mm i wi cej; Size of callus according to scale, where: a= 1-2 mm, b= 3-5 mm, c= 6 mm and more W trakcie namna ania obserwowano du skłonno odmiany Titus do tworzenia na wszystkich po ywkach u podstawy p dów du ej masy kalusa (tab. 8). Obecno obfitej tkanki kalusa cz sto jest przyczyn pojawiania si p dów przybyszowych z niezorganizowanej tkanki kalusa lub z li ci, które maj bezpo redni kontakt z po ywk. O tym ostatnim zjawisku donosi w swojej pracy URKOVI [2008]. Zagadnienie powstawania p dów przybyszowych oraz konsekwencje tego zjawiska w przypadku borówki wysokiej zostały szeroko i dogł bnie omówione przez LITWI CZUKA [2007]. Autor wskazuje, jak przebiega indukowanie tego typu niepo danych p dów oraz jakie zwi zki hormonalne dodawane do po ywek stymuluj ten proces. Podkre la znaczenie prawidłowo przeprowadzanej analizy i eliminacji p dów przybyszowych w trakcie procesu namna ania, aby unikn wprowadzania ich do dalszych etapów produkcji ro lin. Wnioski 1. Naci cie łupiny nasiennej oraz dodanie gibereliny w st eniu 0,5 lub 5,0 mg dm -3 przełamuje spoczynek bezwzgl dny nasion derenia jadalnego i ułatwia kiełkowanie. 2. Po ywka Lloyd i McCown (1980) z dodatkiem BA w st eniu 0,6 mg dm -3 indukuje namna anie p dów derenia jadalnego w zadowalaj cym stopniu. Literatura AIRI S., RAWAL R.S., DHAR U Presowing treatment effects on germination of Cornus capitata seeds. Seed Sci. and Technol. 33(1): BEWLEY J.D Seed germination and dormancy. The Plant Cell 9: BOGATEK R., DZIEWANOWSKA K., LEWAK S Hydrogen cyanide and embryonal dormancy in apple seeds. Physiol. Plant. 83:

141 WYKORZYSTANIE METODY in vitro BORKOWSKA B., SZCZERBA J., KUBIK M Gospodarka cukrami w kulturach p dowych wi ni odm. Łutówka. I Ogólnopolska Konferencja Zastosowanie kultur in vitro w fizjologii ro lin. Kraków, XII 1994: DEBNATH S.C Effect of carbon source and concentration on development of lingonberry (Vaccinium vitis-idea L.) shoots cultivated in vitro from nodal explants. In Vitro Cell. and Develop. Biol. Plant 41(2): DECLERCK V., KORBAN S.S Effects of source of macronutrients and plant growth regulator concentrations on shoot proliferation of Cornus florida. Plant Cell, Tiss. and Organ Cult. 38: DULGER B., DONUZ A Antimicrobial activity of some Turkish medicinal plants. Pakistan J. of Biol. Sci. 7(9): URKOVI J Micropropagation of mature Cornus mas Macrocarpa. Trees 22: EDSON J.L., WENNY D.L., LEEGE-BRUVEN A Micropropagation of Pacific dogwood Hort Science 29(11): ERCÝSLÝ S Cornelian cherry germplasm resources of Turkey. J. Fruit Ornam. Plant Res. 92 Special ed. vol. 12: GNIAZDOWSKA A., BOGATEK R Regulacyjna rola tlenku azotu w kiełkowaniu nasion. Post. Biol. Kom. 34(3): GÜLÇIN I., BEYDEMIR S., AT G., KÜFREVIO_LU Ö.I Evaluation of antioxidant activity of cornelian cherry (Cornus mas L.). Acta Alimentaria 34: GÜLERYÜZ M., BOLAT I., PIRLAK L Selection of table cornelian cherry (Cornus mas L.) types in Çoruhv Valley. Tr. J. of Agriculture and Forestry 22: KAVERIAPPA K.M., PHILLIPS L.M., TRIGIANO R.N Micropropagation of flowering dogwood (Comus florida) from seedlings. Plant Cell Reports 16: KAWECKI Z., BIENIEK A Cornelian cherry (Cornus mas L.) as a perspective orchard and ornamental plant. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 507: KLIMIENKO S The cornelian cherry (Cornus mas L.): collection, preservation and utilization of genetic resources. J. Fruit Ornam. Plant Res. 98 Special ed. 12: KORSZUN S., KOLASI SKI M Alternatywna technologia rozmna ania derenia jadalnego (Cornus mas L). Biulet. Ogrod. Botan. 11: LÉON-KLOOSTERZIEL K.M., VAN DE BUNT G.A., ZEEVAART J.A.D., KOORNNEEF M Arabidopsis mutants with reduced seed dormancy. Plant Physiol. 110: LITWI CZUK W Rozmna anie borówki wysokiej (Vaccinium corymbosum L.) w kulturach in vitro. Wpływ mikrorozmna ania na wzrost i owocowanie krzewów. Wydaw. Uniw. Rzeszowskiego, Rzeszów ISBN LLOYD G., MCCOWN B Commercially feasible micropropagation of mountain laurel Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture. Proc. Int. Plant. Prop. Soc. 30: MURASHIGE T., SKOOG F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: PANTELIDIS G.E., VASILAKAKIS M., MANGANARIS G.A, DIAMANTIDIS GR Antioxidant capacity, phenol, anthocyanin and ascorbic acid contents in raspberries, blackberries, red currants, gooseberries and cornelian cherries. Food Chemistry 102(3): REJMAN A., MAKOSZ E Szkółkarstwo ro lin sadowniczych. Plantpress, Kraków:

142 160 W. Lech i inni SENETA W Dendrologia. PWN, Warszawa: TRIGIANO R.N., BEATY R.M., DIETRICH J.T Somatic embryogenesis and plantlet regeneration in Cornus florida. Plant Cell Rep. 8: Słowa kluczowe: giberelina, kultury in vitro, skaryfikacja, spoczynek nasion, współczynnik namno enia Streszczenie Metod kultur tkankowych wykorzystano w generatywnym i wegetatywnym namna aniu derenia jadalnego. Poprzez wyło enie nasion na po ywki i zastosowanie naci cia łupiny nasiennej oraz dodanie gibereliny w st eniu 0,5 lub 5,0 mg dm -3 do po ywek przełamano spoczynek bezwzgl dny nasion. Po okresie dwóch miesi cy uzyskano prawidłowo wykształcone siewki derenia. Na podstawie zało onej kultury odmian derenia Devin oraz Titus oceniono mo liwo namna ania p dów derenia w warunkach sterylnych. Uzyskano zadowalaj cy współczynnik namna ania p dów, wynosz cy od 1:3,8 do 1:4,8; rednia długo p du wahała si od 2,6 do 3,1 cm w zale no ci od odmiany i po ywki. APPLYING OF in vitro METHOD IN GENERATIVE AND VEGETATIVE PROPAGATION OF CORNELIAN CHERRY (Cornus mas L.) Włodzimierz Lech, Ewa Dziedzic, Monika Bieniasz, Roman Rduch Department of Pomology and Apiculture, Agricultural University, Kraków Key words: seed dormancy, in vitro culture, index of multiplication, Devin, Titus Summary In vitro method was applyed in generative and vegetative propagation of cornelian cherry. Breaking of the seed dormancy was achieved after a gentle cut of seed coat and the addition of GA 3 at the concentration of 0.5 lub 5.0 mg dm -3 into the medium. After two months of culture the regular developed seedlings were obtained. The shoot culture of two cornelian cherry cultivars Devin and Titus was established in in vitro conditions. The multiplication index ranged from 1:3.8 to 1:4.8; mean length of shoots ranged from 2.6 to 3.1 cm depending on the cultivar and medium. Dr in. Ewa Dziedzic Katedra Sadownictwa i Pszczelnictwa Wydział Ogrodniczy Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołł taja al. A. Mickiewicza KRAKÓW ewa@ogr.ar.krakow.pl

143 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH W KULTURACH in vitro TULIPANA Małgorzata Ma lanka, Anna Bach Katedra Ro lin Ozdobnych, Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołł taja w Krakowie Wst p Tulipan, ze wzgl du na długotrwał i mało wydajn drog rozmna ania, jest obiektem wielu bada, maj cych na celu zwi kszenie plonu oraz przyspieszenie jego uprawy. Obiecuj c technologi produkcji tulipana jest somatyczna embriogeneza, ze wzgl du na bardzo szybki i wydajny sposób rozmna ania [DE VROOMEN 1997]. Somatyczne zarodki, powstaj ce z komórek innych ni zygota, czyli na drodze rozmna ania bezpłciowego, poprzez manipulowanie składem po ywki, mog tworzy si w du ej ilo ci, w stosunkowo krótkim czasie [K PCZY SKA 2006]. Liczba uzyskanych zarodków, obok ich jako ci, decyduje o przydatno ci somatycznej embriogenezy do masowej produkcji ro lin. W przypadku tulipana nie opracowano, jak dot d, metody szybkiego i synchronicznego otrzymywania licznych somatycznych zarodków, pomimo poznania ju mechanizmów kontroluj cych te procesy. Celem przeprowadzonych bada było okre lenie wpływu czasu trwania kultury na efektywno formowania zarodków somatycznych (terminu pojawienia si pierwszych zarodków globularnych i torpedo oraz ich liczby) u tulipana. Zbadano tak e wpływ ró nych st e auksyny na dynamik formowania zarodków. Materiał i metody Badania przeprowadzono na tulipanach odmiany Apeldoorn (nale cej do grupy miesza ców Darwina) i Rosy Wing (z grupy pojedynczych pó nych). Jako eksplantaty inicjalne zastosowano zal nie, wyizolowane z chłodzonych przez 12 tygodni, w 5 C, cebul o obwodzie cm. Zdezynfekowane eksplantaty ci to na 1-2- mm fragmenty (plastry) i wykładano do szalek Petriego na po ywki zawieraj ce sole mineralne według MURASHIGE i SKOOG [1962], 25 lub 50 M Picloramu; 0,25-10 M BA, 3% sacharozy, zestalone 0,7% agarem. Kultury prowadzono w ciemno ci, w 20 C. Tworz cy si ółty, embriogeniczny kalus odejmowano od tkanki matecznej, namna ano na jednej z po ywek inicjalnych, a nast pnie poddano działaniu 10 lub 5 M Picloramu oraz 1 M BA, w celu formowania zarodków somatycznych, zgodnie z procedur według BACH i PTAK [2001]. W czasie 20 tygodni prowadzenia kultury okre lono procent eksplantatów ró nicuj cych zarodki globularne oraz liczb, powstałych z 1 g kalusa, zarodków w

144 164 M. Ma lanka, A. Bach stadium torpedy (długo ci 5-10 mm), w zale no ci od genotypu, st enia auksyny i czasu trwania kultury. Analiz histologiczn formuj cych si struktur sporz dzono w oparciu o preparaty mikroskopowe, wykonane metod parafinow według FILUTOWICZA i KU DOWICZA [1951]. Do wiadczenie wykonano w 5 powtórzeniach po 5 eksplantatów. Wyniki opracowano statystycznie za pomoc metody analizy wariancji. Porównanie rednich i okre lenie grup jednorodnych wykonano przy u yciu testu Duncana, z uwzgl dnieniem poziomu istotno ci = 0,05. Wyniki i dyskusja Ró nicowanie zarodków w fazie rozwoju globularnego Do rozwoju somatycznych zarodków u tulipana niezb dne jest obni enie st enia auksyny w po ywce lub jej usuni cie [GUDE, DIJKEMA 1997]. Ró nicowanie zarodków stymuluje równie obecno cytokinin, najsilniej podczas powstawania zarodków w stadium globularnym, któremu towarzysz intensywne podziały komórkowe [SZWEYKOWSKA 1994]. Kultury zwykle prowadzi si w ciemno ci, stymuluj cej m.in. rozwój zarodków globularnych [BACH, WARCHOŁ 2000] oraz obni aj cej stopie deformacji zarodków w stadium torpedy [MA LANKA, BACH 2007]. rednie oznaczone tymi samymi literami nie ró ni si istotnie na poziomie istotno ci =0,05; means marked with the same letter du not differ significantly at the significance level =0.05 Rys. 1. Wpływ czasu trwania kultury i st enia auksyny na ró nicowanie zarodków globularnych u odmiany Apeldoorn Fig. 1. Effect of cultivation time and auxin concentration on the globular embryo differentiation of cv. Apeldoorn W przeprowadzonym do wiadczeniu, formowanie zarodków globularnych zachodziło na drodze embriogenezy po redniej, przez kalus. Ró nicowanie to miało miejsce od pierwszych tygodni do wiadczenia, ale nasiliło si po 2-3 miesi cach prowadzenia kultury. W przypadku odmiany Apeldoorn i po ywki z 5 M auksyny, najwy szy procent eksplantatów formuj cych zarodki globularne, wynosz cy 76%, odnotowano po 8 tygodniach trwania kultury. Stosuj c 10 M Picloramu, wi ksze ró nicowanie zarodków, równe 60%, otrzymano po 12 tygodniach od zało enia

145 DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH do wiadczenia, w stosunku do pozostałego okresu kultury. Wraz z upływem czasu trwania kultury obni ała si wydajno kalusa embriogenicznego w tworzeniu zarodków, a po 20 tygodniach pod wpływem 5 M Picloramu nie obserwowano ró nicowania nowych zarodków (rys. 1). U tulipana Rosy Wing zaobserwowano intensywniejsze ró nicowanie zarodków globularnych po 2-3 miesi cach, w stosunku do całego okresu kultywacji, niezale nie od st enia auksyny (rys. 2). obja nienia jak w rys. 1; explanations see Fig. 1 Rys. 2. Wpływ czasu trwania kultury i st enia auksyny na ró nicowanie zarodków globularnych u odmiany Rosy Wing Fig. 2. Effect of cultivation time and auxin concentration on the globular embryo differentiation of cv. Rosy Wing Tabela 1; Table 1 Procent eksplantatów ró nicuj cych zarodki globularne, w zale no ci od genotypu i st enia auksyny, przez 20 tygodni prowadzenia kultury Percentage of explants forming globular embryos, depending on genotype and auxin concentration, for 20 weeks of cultivation Po ywka; Medium Apeldoorn Odmiana; Cultivar Rosy Wing 10 M Picloram, 1 M BA 39,2 b 20,8 a 5 M Picloram, 1 M BA 33,6 b 23,2 a rednia; Average 36,4 b 22,0 a obja nienia jak w rys. 1; explanations see Fig. 1 Oceniaj c wpływ st enia auksyny na ró nicowanie zarodków, u obu odmian tulipana stwierdzono, e badana cecha nie była zale na od ró nych st e Picloramu (tab. 1). Ró nicowanie zarodków globularnych uzale nione było natomiast od genotypu. Odmiana Apeldoorn efektywniej formowała pocz tkowe stadia zarodków (36,4% eksplantatów) ni Rosy Wing (22% eksplantatów; tab. 1). Kalus embriogeniczny obu badanych odmian tulipana, utrzymywany na poywkach z 10 lub 5 M Picloramu oraz 1 M BA, stopniowo tracił embriogeniczny charakter i ró nicował coraz mniej zarodków. W kulturach kalusa przetrzymywanych

146 166 M. Ma lanka, A. Bach przez dłu szy czas na po ywce z auksyn lub cytokinin nast puj zwykle zmiany epigenetyczne, polegaj ce na wzgl dnie trwałym uniezale nieniu si od egzogennych regulatorów. Procesowi temu sprzyja prowadzenie kultur w ciemno ci [ORLIKOWSKA 1997]. By mo e kalus tulipana po kilku miesi cach kultury in vitro traci stopniowo wra liwo na obecne w po ywce auksyny i cytokininy, albo te stosowane regulatory w ni szych st eniach działaj słabiej. O działaniu regulatorów ro linnych decyduje nie tylko ich rodzaj i koncentracja, ale tak e wra liwo eksplantatu na te regulatory w momencie aplikacji. Działanie substancji wzrostowych zale y tak e od wieku kultur [ORLIKOWSKA 1997]. Niestety zdarza si, e kalus embriogeniczny ma powolny wzrost i szybko traci kompetencj do embriogeniczno ci [RAGHAVAN 1997]. Ró nicowanie zarodków w stadium torpedy Somatyczne zarodki tulipana w stadium torpedy, długo ci 5-10 mm, obserwowano w 8 i 12 tygodniu prowadzenia kultury, odpowiednio u odmiany Apeldoorn i Rosy Wing. U obu badanych odmian wi cej zarodków uformowało si po 12 tygodniach kultury, w porównaniu z pozostałym okresem trwania do wiadczenia (rys. 3, 4). BOUMAN i in. [1999] otrzymywali w pełni wykształcone zarodki tulipana po 10 tygodniach na po ywkach niezawieraj cych auksyn. BACH i PTAK [2001] natomiast obserwowały formowanie si pierwszych zarodków w 12. tygodniu od chwili zało enia kultur. obja nienia jak w rys. 1; explanations see Fig. 1 Rys. 3. Wpływ czasu trwania kultury i st enia auksyny na liczb zarodków w stadium torpedy u odmiany Apeldoorn Fig. 3. Effect of cultivation time and auxin concentration on the number of torpedo-shaped embryos of cv. Apeldoorn St enie auksyny nie miało wpływu na liczb otrzymanych zarodków w stadium torpedy. U obu badanych odmian, wi cej (o ponad 30%) uformowanych zarodków na po ywce z 5 M Picloramu nie stanowiło istotnej ró nicy w stosunku do po ywki ze st eniem Picloramu równym 10 M (tab. 2). PTAK i BACH [2007] najwi ksz liczb somatycznych zarodków tulipana uzyskały na po ywkach z przewa aj cym udziałem Picloramu nad BA.

147 DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH obja nienia jak w rys. 1; explanations see Fig. 1 Rys. 4. Wpływ czasu trwania kultury i st enia auksyny na liczb zarodków w stadium torpedy u odmiany Rosy Wing Fig. 4. Effect of cultivation time and auxin concentration on the number of torpedo-shaped embryos of cv. Rosy Wing Tabela 2; Table 2 Liczba zarodków w stadium torpedy, z 1 g kalusa, w zale no ci od genotypu i st enia auksyny, przez 20 tygodni prowadzenia kultury Number of torpedo-shaped embryos, from 1 g of callus, depending on genotype and auxin concentration, for 20 weeks of cultivation Po ywka; Medium Apeldoorn Odmiana; Cultivar Rosy Wing 10 M Picloram, 1 M BA 5,32 ab 1,6 a 5 M Picloram, 1 M BA 7,96 b 2,6 a rednia; Average 6,64 b 2,1 a obja nienia jak w rys. 1; explanations see Fig. 1 Podobnie jak w przypadku ró nicowania zarodków globularnych, liczba uzyskanych zarodków w stadium torpedy tak e zale ała od genotypu ro liny. rednio 6,64 zarodków otrzymano z 1 g kalusa tulipana Apeldoorn w ci gu 20 tygodni, niezale nie od po ywki. Odmiana Rosy Wing uformowała w tych samych warunkach trzykrotnie mniej zarodków (tab. 2). Porównana przez autorów [BACH, PTAK 2002] odmiana Apeldoorn równie charakteryzowała si wi ksz efektywno ci procesu somatycznej embriogenezy w stosunku do odmiany Red Matador (mieszaniec Darwina). Z kolei w badaniach PODWYSZY SKIEJ i in. [1997] odmiana Apeldoorn okazała si mie najsłabsze zdolno ci do ró nicowania, w porównaniu z innymi odmianami tulipana. Analiza histologicza Analiza histologiczna otrzymanych regularnych, dwubiegunowych struktur, z uformowanym li cieniem, pasmem wi zek przewodz cych i merystemem p dowym potwierdziła, e w przeprowadzonych badaniach istotnie formowały si zarodki

148 168 M. Ma lanka, A. Bach somatyczne, które swoj budow odpowiadały zarodkom zygotycznym (fot. 1). Niestety, zregenerowane zarodki tulipana nie posiadały korzenia. Wzdłu somatycznych zarodków tulipana PODWYSZY SKA i MARASEK [2003] równie zaobserwowały podłu ne pasma wi zek naczyniowych, nie odnotowały natomiast formowania si korzonka zarodkowego. Brak korzeni u somatycznych zarodków tulipana mo na tłumaczy wysok temperatur (20-23 C) kultur in vitro i obecno ci cytokinin, które opó niaj ich rozwój [PODWYSZY SKA, MARASEK 2003]. Fot. 1. Przekrój podłu ny przez somatyczny zarodek tulipana (pow. 30, li - li cie, mp - merystem p dowy) Photo 1. Longitudinal section of the tulip somatic embryo (magnification 30, li - cotyledon, mp - shoot meristem) Wnioski 1. Długo okresu prowadzenia kultury odgrywała istotn rol w somatycznej embriogenezie tulipanów. Wzrost ró nicowania zarodków globularnych obserwowano do 8-12 tygodnia kultury in vitro, a formowanie zarodków w stadium torpedy nasiliło si po 3 miesi cach kultury. 2. St enie auksyny w zakresie 5 i 10 M nie miało istotnego wpływu na ró - nicowanie zarodków globularnych i formowanie torped. 3. Wydajno somatycznej embriogenezy zale ała od genotypu. Zarodki globularne ró nicowało rednio 36% eksplantatów Apeldoorn i 22% Rosy Wing. Tulipan Apeldoorn uformował wi ksz liczb zarodków somatycznych ( rednio 6,6) ni

149 DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH Rosy Wing ( rednio 2,1) z 1 g kalusa. 4. Analiza histologiczna potwierdziła formowanie zarodków somatycznych w stadium torpedy. Literatura BACH A., PTAK A Somatic embryogenesis and plant regeneration from ovaries of Tulipa gesneriana L. in in vitro cultures. Acta Horticulturae 560: BACH A., PTAK A Nowa metoda mikrorozmna ania tulipana (Tulipa gesneriana L.) z tkanek zal ni. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 483: BACH A., WARCHOŁ M Effect of light quality on proliferation of embryogenic callus of Hyacinthus orientalis cv. Delft s Blue. Acta Biologica Cracoviensia 42: 17. BOUMAN H., LANGENS M., SCHOO W., DIJKEMA M Somatic embryogenesis of tulip. Acta Biologica Cracoviensa 41: 34. DE VROOMEN C.O.N Farm management aspects of somatic embryogenesis for tulip bulb production. Acta Horticulturae 430: FILUTOWICZ A., KU DOWICZ A Mikrotechnika ro linna. PWRiL, Warszawa. GUDE H., DIJKEMA M.H.G.E Somatic embryogenesis in tulip. Acta Horticulturae 430: K PCZY SKA E Kiełkowanie i konwersja somatycznych zarodków in vitro. Biotechnologia 4(75): MA LANKA M., BACH A Wpływ kwasu abscysynowego oraz wiatła na wzrost i rozwój zarodków somatycznych tulipana (Tulipa gesneriana L.). Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 523: MURASHIGE T., SKOOG F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Plant Physiology 15: ORLIKOWSKA T Regulatory ro linne w kulturach in vitro, w: Regulatory wzrostu i rozwoju ro lin. Zastosowanie w ogrodnictwie, rolnictwie, le nictwie i w kulturach tkanek. Jankiewicz S.L. Praca zbiorowa, PWN, Warszawa: PODWYSZY SKA M., MARASEK A Effects of thidiazuron and paclobutrazol on regeneration potential of tulip flower stalk explants in vitro and subsequent shoot multiplication. Acta Societatis Botanicorum Poloniae 72(3): PODWYSZY SKA M., MARASEK A., GABRYSZEWSKA E Indukcja tworzenia p dów przybyszowych i zarodków somatycznych w kulturach in vitro tulipana. Zeszyty Naukowe AR w Krakowie 318: PTAK A., BACH A Somatic embryogenesis in tulip (Tulipa gesneriana L.) flower stem cultures. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant 43: RAGHAVAN V Molecular embryology of flowering plants. Somatic embryogenesis. Cambridge University Press: SZWEYKOWSKA A Procesy ró nicowania w kulturach tkanek i komórek ro linnych. Prace Ogrodu Botanicznego Polskiej Akademii Nauk 5/6: 9-18.

150 170 M. Ma lanka, A. Bach Słowa kluczowe: tulipan, somatyczna embriogeneza, zarodki globularne, torpedo Streszczenie Kalus embriogeniczny tulipanów odmian Apeldoorn i Rosy Wing, uzyskany z eksplantatów zal ni, wykładano na po ywki z obni on zawarto ci substancji wzrostowych, w stosunku do po ywki namna aj cej, w celu formowania zarodków somatycznych. W czasie 20 tygodni prowadzenia kultury tkanki embriogenicznej, na po ywkach z 10 i 5 M Picloramu, okre lano procent eksplantatów ró nicuj cych zarodki w fazie rozwoju globularnego w zale no ci od genotypu, st enia auksyny i czasu trwania kultury. Okre lano równie liczb, powstałych z 1 g kalusa, zarodków w stadium torpedy. Najwi kszy procent eksplantatów ró nicuj cych zarodki globularne odnotowano po 8 i 12 tygodniach prowadzenia kultury, wynosz cy odpowiednio 62% i 50% dla odmiany Apeldoorn oraz 32% i 30% dla odmiany Rosy Wing. Równie po 3 miesi cach kultury uzyskano najwi cej zarodków w stadium rozwoju torpedo (blisko 14 szt. u Apeldoorn i 4 szt. u Rosy Wing ), po tym czasie obni ała si liczba pozyskiwanych zarodków. Formowanie zarodków somatycznych uzale nione było od genotypu badanej ro liny. rednio 6,64 zarodków otrzymano z kalusa odmiany Apeldoorn w ci gu 20 tygodni, niezale nie od po ywki, co stanowiło trzykrotn, istotn przewag nad odmian Rosy Wing. DYNAMICS OF SOMATIC EMBRYO FORMATION IN TULIP in vitro CULTURES Małgorzata Ma lanka, Anna Bach Department of Ornamental Plants, Agricultural University, Kraków Key words: tulip, somatic embryogenesis, globular and torpedo-shaped embryos Summary Embryogenic callus of tulips cv. Apeldoorn and Rosy Wing, obtained from ovary explants, was put on medium with a lower level of growth regulators, as compared to the proliferation medium, in order to produce somatic embryos. During 20 weeks of the embryogenic tissue cultivation, treated with 10 and 5 M Picloram, the effect of genotype, auxin concentration and cultivation time on the globular embryo differentiation were investigated. The number of torpedo-shaped embryos obtained from 1g of callus were also examined. The highest percentage of explants forming globular embryos were observed after 8 and 12 weeks of cultivation. For Apeldoorn it was 62 and 50%, and for Rosy Wing 32 and 30%, respectively. After three months of the embryogenic callus cultivation, the highest number of torpedo-shaped embryos (about 14 for Apeldoorn and 4 for Rosy Wing ) were obtained. However, during the prolongation of culture the embryo number decreased. Somatic embryo formation closely depended on the genotype. During 20 weeks of cultivation, Apeldoorn tulip produced, on the average, 6,64 embryos, independently of medium composition. It trebled the results of Rosy Wing.

151 DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH Dr in. Małgorzata Ma lanka Katedra Ro lin Ozdobnych Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołł taja al. 29 Listopada KRAKÓW

152 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: WZROST ORGANÓW RO LINNYCH W OBECNO CI JONÓW GLINU Roman Mizerski Katedra Fizjologii Ro lin, Uniwersytet l ski w Katowicach Wst p Pomimo licznych bada, mechanizm toksycznego działania glinu na ro liny nie został poznany. Istnieje wiele hipotez dotycz cych fitotoksyczno ci glinu. Opieraj si one na interakcjach glinu ze składnikami ciany lub błony komórkowej, zakłócaniu procesów transportu przez błon lub transdukcji sygnałów, hamowaniu podziałów komórkowych oraz negatywnym oddziaływaniu na ró ne struktury cytoplazmatyczne [DELHAIZE, RYAN 1995; KOCHIAN 1995; RENGEL 1996; FRANTZIOS i in. 2000]. Wi kszo danych literaturowych, dotycz cych działania glinu na ro liny, opiera si na badaniach prowadzonych na korzeniach. Organ ten uwa a si za najbardziej wra liwy na glin [BENNET, BREEN 1991; RYAN i in. 1993; KOCHIAN 1995]. Wcze niejsze badania przeprowadzone na siewkach kukurydzy, pozwoliły ustali st enie glinu i warto ph rodowiska inkubacyjnego, przy którym negatywny efekt wzrostowy działania glinu jest najsilniejszy. Stwierdzono, e badania najlepiej prowadzi stosuj c glin w st eniu 1 mmol dm -3 i utrzymuj c ph rodowiska inkubacyjnego na poziomie 4,2 [MIZERSKI i in. 1999, 2004, 2008]. Wybór rodowiska o ph 4,2 do dalszych bada był podyktowany z jednej strony faktem, e w rodowisku o tym odczynie stwierdzano najwi ksze przyrosty korzeni i cz ci nadziemnej siewek [MIZERSKI i in. 2004], z drugiej za strony specjacj glinu. KINRAIDE [1991] wykazał, e w rodowisku o ph 4,2, ponad 90% glinu wyst puje w postaci jonów Al 3+, natomiast w roztworach o ph powy ej 4,5 jest du e prawdopodobie stwo pojawienia si innej, znacznie bardziej toksycznej formy glinu (tzn. Al 13 ). Celem niniejszej pracy było okre lenie oddziaływania jonów glinu na wzrost wydłu eniowy całych, nieuszkodzonych siewek oraz komórek parenchymatycznych segmentów koleoptyli kukurydzy. Materiał i metoda Badania prowadzono na 4-dniowych, etiolowanych siewkach Zea mays L. cv. K33 F2 oraz segmentach koleoptyli z nich wycinanych. Wzrost siewek mierzono w rodowisku APW o składzie: 0,1 mmol dm -3 CaCl 2, 0,1 mmol dm -3 NaCl, 1 mmol dm -3 KCl, w temperaturze 24 C. Warto ph rodowiska inkubacyjnego utrzymywano na poziomie 4,2. Glin stosowano w postaci AlCl 3, w st eniu 1 mmol dm -3. Glin podawano do rodowiska na pocz tku pomiaru (segmenty eksponowano na jego działanie przez cały

153 174 R. Mizerski czas pomiaru) lub bezpo rednio przed pomiarem. Elongacj segmentów stymulowano dodaj c do rodowiska inkubacyjnego auksyn (IAA, kwas indolilo-3-octowy) w st eniu 0,01 mmol dm -3. Roztwory inkubacyjne podczas pomiarów intensywnie napowietrzano. Wzrost całych organów (korzeni i p dów) okre lano zmodyfikowan metod cieniograficzn [KARCZ i in. 1988], natomiast wydłu anie 10-mm segmentów koleoptyli, wycinanych 3-4 mm poni ej wierzchołka i pozbawionych li cia, mierzono przy pomocy liniowego transducera k towego (TWK Electronic, Niemcy). W eksperymentach stosowano dwa rodzaje segmentów: nieuszkodzone (tzw. nieobcierane) oraz z usuni t kutikul (tzw. obcierane). Metodyka przygotowania segmentów obcieranych została oparta na pracach LÜTHENA i in. [1990] oraz KARCZA i in. [1995]. Wyniki W pierwszym etapie bada dokonywano synchronicznych pomiarów wzrostu wydłu eniowego korzeni i cz ci nadziemnej siewek kukurydzy. Wykazano, e glin hamuje wzrost korzeni ju po 40 minutach oraz e efekt ten pogł bia si wraz z upływem czasu. Korzenie o długo ci pocz tkowej wynosz cej w kontroli 5,48 ±0,49 cm, w trakcie 5-godzinnego pomiaru, przyrastały rednio o 0,63 ±0,05 cm, natomiast w obecno ci glinu o 0,18 ±0,06 cm, co stanowiło 30% przyrostu korzeni w kontroli (rys. 1). czas; time (min) Rys. 1. Wydłu anie (10-2 m) korzeni i cz ci nadziemnej 4-dniowych siewek kukurydzy inkubowanych w obecno ci glinu w st eniu 1 mmol dm -3. ph rodowiska 4,2. Warto ci s rednimi ± SE, n=10 Fig. 1. Elongation (10-2 m) of root and shoot 4-day-old maize seedlings incubated in the presence of aluminum at the concentration of 1 mmol dm -3. ph of the medium 4.2. Values are means ± SE, n=10 Analiza wyników tych bada pozwoliła dostrzec interesuj c zale no. Hamowaniu wzrostu korzenia przez glin towarzyszyła stymulacja wzrostu p du, rozpoczynaj ca si w minucie eksperymentu (rys. 1). Cz nadziemna siewek o długo ci pocz tkowej 5,69 ±0,48 cm, w rodowisku bez glinu, przyrastała o około 0,92 ±0,11 cm, natomiast w obecno ci glinu o 19% wi cej (rys. 1). Reakcja ta nie była przypadkowa i znalazła potwierdzenie w badaniach na segmentach koleoptyli wycinanych z tych siewek (rys. 3).

154 WZROST ORGANÓW RO LINNYCH W OBECNO CI JONÓW GLINU 175 W drugim etapie bada okre lano wzrost wydłu eniowy segmentów koleoptyli kukurydzy wycinanych z 4-dniowych siewek. Dane uzyskane w tym do wiadczeniu zebrano w tab. 1. W eksperymencie stosowano zarówno segmenty obcierane, jak i nieobcierane. Wzrost wydłu eniowy segmentów obcieranych był wi kszy. Zastosowanie egzogennej auksyny skutkowało jeszcze wi kszym przyrostem segmentów na długo (tab. 1). Najsilniejszy efekt (stymulacja wzrostu o 59%) auksyna powodowała w 5. godzinie ekspozycji. W 15. godzinie pomiaru IAA stymulowała wzrost wydłu eniowy o 41%. W przypadku segmentów nieobcieranych warto ci wynosiły odpowiednio 53 i 36% (tab. 1). Podobne zale no ci czasowe dotyczyły działania glinu. Wydłu enie czasu trwania ekspozycji segmentów na glin do 15 godzin wcale nie zwi kszało stopnia hamowania ich wzrostu. Najwi kszy stopie hamowania wzrostu wydłu eniowego segmentów koleoptyli przez glin obserwowano w 5. godzinie pomiaru. Glin skuteczniej hamował elongacj segmentów obcieranych. W obecno ci IAA stopie hamowania elongacji tych segmentów osi gał 19% (tab. 1). Toksyczny efekt działania glinu na wzrost wydłu eniowy segmentów obcieranych i nieobcieranych ró nił si nieznacznie (o około 5%), kolejne eksperymenty przeprowadzano na segmentach nieobcieranych z zastosowaniem kwasu indolilo-3-octowego. Tabela 1; Table 1 Wydłu anie (10-6 m na segment) 10-mm segmentów (obcieranych i nieobcieranych) koleoptyli kukurydzy inkubowanych (5, 10 lub 15 h) w obecno ci glinu w st eniu 1 mmol dm -3 z/bez IAA. ph rodowiska 4,2. Warto ci s rednimi ± SE, n=6 Elongation (10-6 m per segment) of 10-mm maize coleoptile segments (abraded and nonabraded) incubated (5, 10 or 15 h) in the presence of aluminum at the concentration of 1 mmol dm -3 with/without IAA. ph of the medium 4,2. Values are means ± SE, n=6 Czas ekspozycji Time of exposure (h) Wydłu anie; Elongation (10-6 m na segment; 10-6 m per segment) segmenty obcierane abraded segments segmenty nieobcierane nonabraded segments IAA APW IAA APW APW APW+Al APW APW+Al APW APW+Al APW APW+Al ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±78 IAA kwas indolilo-3-octowy; indole-3-acetic acid APW sztuczna woda stawowa; artifical pond water

155 176 R. Mizerski czas; time (min) Rys. 3. Wydłu anie (10-5 m segment -1 ) 10-mm segmentów koleoptyli wyci tych z 4-dniowych siewek kukurydzy, które w 3. i 4. dobie uprawy hydroponicznej rosły w obecno ci glinu w st eniu 1 mmol dm -3. ph rodowiska 4,2. Warto ci s rednimi ± SE, n=8 Fig. 3. Elongation (10-5 m segment -1 ) of 10-mm coleoptile segments cut from of 4-day-old maize seedlings which in 3 rd and 4 th day of hydroponic culture grew in the presence of aluminum at the concentration of 1 mmol dm -3. ph of the medium 4.2. Values are means ± SE, n=8 W trzecim etapie bada wykonano dwa do wiadczenia. W pierwszym segmenty eksponowano na działanie glinu zarówno w trakcie 2-godzinnej preinkubacji poprzedzaj cej pomiar, jak i w trakcie 5 godzin eksperymentu (rys. 2), natomiast w

156 WZROST ORGANÓW RO LINNYCH W OBECNO CI JONÓW GLINU 177 drugim stosowano segmenty, które wycinano z siewek kukurydzy, które wcze niej (przez 48 godzin) rosły w uprawie hydroponicznej zawieraj cej glin (rys. 3). W obu do wiadczeniach na pocz tku pomiaru dodawano IAA. Pierwsze do wiadczenie pozwoliło zaobserwowa interesuj c dynamik wzrostu segmentów. W 5. godzinie pomiaru segmenty w kontroli przyrastały rednio o 2631 ±239 m, natomiast traktowane glinem o 2096 ±173 m, czyli o 21% mniej (rys. 2). Drugie do wiadczenie potwierdziło nietypow (opisan wcze niej rys. 1) reakcj wzrostow p du pojawiaj c jako odpowied na podanie glinu do rodowiska korzeni. Indukowany przez IAA wzrost wydłu eniowy segmentów koleoptyli, wycinanych z siewek rosn cych w obecno ci glinu, był wi kszy od wzrostu segmentów w kontroli o 38% (rys. 3). Nale y równie doda, e elongacja segmentów koleoptyli z drugiego do wiadczenia była o ponad 50% mniejsza ni w innych badaniach. Dyskusja Eksperyment na całych, nieuszkodzonych siewkach kukurydzy wykazał, e glin w st eniu 1 mmol dm -3 powoduje silne (o 68%) hamowanie wzrostu korzeni z równoczesn stymulacj (o 19%) wzrostu cz ci nadziemnej siewek (rys. 1). Zjawisko to znalazło równie potwierdzenie w badaniach na segmentach koleoptyli kukurydzy wycinanych z siewek rosn cych wcze niej w obecno ci glinu (rys. 3). Podobne zjawisko obserwowali GUNSE i in. [1992]. Jest ono trudne do interpretacji, gdy uwa a si, e efekt działania glinu na cz nadziemn jest zjawiskiem wtórnym. Przypuszcza si, e jest on konsekwencj działania w ro linie systemu transdukcji sygnału lub transportem z korzenia do cz ci nadziemnej siewki nieznanej substancji. SIVAGURU i in. [1999] uwa aj, e cz ci tego systemu jest transdukcja sygnału pomi dzy poszczególnymi strefami korzenia. Efekt ten tłumaczy si równie przyspieszeniem (wskutek działaj cego stresu) transportu auksyn lub cytokinin, limitowaniem transportu kwasu abscysynowego, wzmo onym wytwarzaniem substancji pokarmowych, zwi kszonym pobieraniem wody, transportem glinu lub zaburzeniami w transporcie wapnia [HASENSTEIN, EVANS 1987, 1988; MASSOT i in. 1992; LAZOF i in. 1994; OLIVETTI i in. 1995; LARSEN i in. 1997; SIVAGURU, HORST 1998]. Wzmo ony wzrost p du mo e te wynika z gromadzenia w nim materiałów budulcowych i energetycznych, koniecznych do wznowienia wzrostu siewki po ust pienia stresu [LARSEN i in. 1997; KIDD, PROCTOR 2000]. Kolejn cz pracy stanowiły badania wzrostowe przeprowadzone na fragmentach organów siewek, tj. segmentach koleoptyli kukurydzy. W badaniach tych stosowano segmenty nieuszkodzone oraz z cz ciowo usuni t (uszkodzon ) kutikul. Zabieg ten miał ułatwi penetracj glinu do komórki. W badaniach tych stosowano auksyn - IAA, która jest powszechnie u ywana do stymulacji wzrostu wydłu e- niowego komórek ro linnych [LÜTHEN i in. 1990; KARCZ i in. 1990, 1995, 1999]. Zabieg obcierania segmentów, wraz z zastosowaniem IAA, wzmaga sekrecj jonów H + do ciany komórkowej, rozlu nia jej struktur i stymuluje wydłu anie. Zabieg obcierania segmentów stosowali LÜTHEN i in. [1990], PETERS i FELLE [1991] oraz KARCZ i in. [1995]. W badaniach nad fitotoksyczno ci glinu istotny był wybór rodzaju segmentów: nieuszkodzone czy obcierane. Te ostatnie nieco szybciej rosły i to zarówno w obecno ci, jak i przy braku IAA. Ponadto glin nieco silniej modyfikował ich wzrost (tab. 1). Zjawiskiem niepo danym było natomiast szybkie ograniczanie ich wydłu ania w czasie i mo liwo mechanicznego uszkodzenia komórek w trakcie zabiegu obcierania (abrazji). Badania wykazały negatywny, toksyczny wpływ glinu, przejawiaj cy si redukcj wzrostu wydłu eniowego segmentów koleoptyli kukurydzy (tab. 1, rys. 2).

157 178 R. Mizerski Stopie hamowania wzrostu segmentów przez glin nie był du y, nie przekraczał 21%. Uzyskane wyniki skłaniaj do tezy, e segmenty koleoptyli, przynajmniej w badaniach wzrostowych nad fitotoksyczno ci glinu, s kłopotliwym i niezbyt dogodnym obiektem. Niewielka reakcja wzrostowa segmentów koleoptyli kukurydzy na glin zaskakuje, segmenty te s przecie obiektem modelowym w badaniach nad działaniem ró nych metali, np. Cd, Mn, Pb [KARCZ i in. 1988; KURTYKA i in. 1994; MAŁKOWSKI i in. 1996]. Mała wra liwo komórek parenchymatycznych segmentów koleoptyli kukurydzy na glin mo e wynika z obecno ci kutikuli, która stanowi barier dla wnikania jonów tego pierwiastka do komórki. Zastosowany w pracy zabieg obcierania segmentów okazał si mało skuteczny i zdaje si przeczy tej tezie. Okre lenie mechanizmu toksyczno ci glinu jest trudne. Uzyskane wyniki mog jedynie skłania do hipotezy, w my l której glin zmienia przepuszczalno błony komórkowej, czego konsekwencj jest zmiana ci nienia turgorowego i modyfikacja wzrostu. Wnioski 1. Hamowaniu wzrostu korzeni kukurydzy przez glin, towarzyszy wzmo ony wzrost p du. 2. Segmenty koleoptyli kukurydzy wycinane z siewek traktowanych glinem lepiej rosn. 3. Bezpo rednia ekspozycja segmentów koleoptyli kukurydzy na glin w st eniu 1 mmol dm -3 redukuje ich wzrost maksymalnie o 21%. Literatura BENNET R.J., BREEN C.M The recovery of the roots of Zea mays L. from various aluminum treatments: towards elucidating the regulatory processes that underlie root growth control. Environ. Exp. Bot. 157: DELHAIZE E., RYAN P.R Aluminum toxicity and tolerance in plants. Plant Physiol. 107: FRANTZIOS G., GALATIS B., APOSTOLAKOS P Aluminium effects on microtubule organization in dividing root-tips cells of Triticum turgidum. I. Mitotic cells. New Phytol. 145: GUNSE B., LLUGANY M., POSCHENRIEDER CH., BARCELÓ J Simultaneous and continuous measurement of root and coleoptile growth with a computerized linear displacement transducer system. Plant Physiol. Biochem. 30(4): HASENSTEIN K.H., EVANS M.L Effect of cations on hormone transport in maize roots. Plant Physiol. 83: 102. KARCZ W., LÜTHEN H., BÖTTGER M Effect of IAA and 4-Cl-IAA on growth rate in maize coleoptile segments. Acta Physiol. Plant. 21(2): KARCZ W., STOLAREK J., LEKACZ H., KURTYKA R., BURDACH Z Comparative investigation of auxin and fusicoccin-induced growth and H + - extrusion in coeoptile segments of Zea mays L. Acta Physiol. Plant. 17(1): 3-8. KARCZ W., STOLAREK J., PIETRUSZKA M., MAŁKOWSKI E The dose response curves for IAA induced elongation growth and acidification of medium of Zea mays L. coleoptile segments. Physiol. Plant. 80:

158 WZROST ORGANÓW RO LINNYCH W OBECNO CI JONÓW GLINU 179 KARCZ W., STOLAREK J., ZIENTARA M Short-term effects of Mn 2+ on elongation growth and H + - extrusion in Zea mays L. coleoptile segments. Acta Soc. Bot. Pol., Vol. 57, No. 3: KIDD P., PROCTOR J Effects of aluminium on the growth and mineral composition of Betula pendula Roth. J. of Exp. Bot. 51: KINRAIDE T.B Identity of the rhizotoxic aluminum species. Plant and Soil 134: KOCHIAN L.V Cellular mechanisms of aluminum toxicity and resistance in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46: KURTYKA R., STOLAREK J., KARCZ W Cadmium stress in growth reaction of plant cells. Biol. Plant. 36 (suppl.): 28. LARSEN P.B., KOCHIAN L.V., HOWELL S.H Al inhibits both shoot development and root growth in als3, an Al-sensitive Arabidopsis mutant. Plant Physiol. 114: LAZOF D.B., GOLDSMITH J.G., RUFTY T.W., LINTON R.W Rapid uptake of aluminum into cells of intact soybean root tips. A microanalytical study using secondary ion mass spectrometry. Plant Physiol. 106: LÜTHEN H., BIGDON M., BÖTTGER M Reexamination of the acid growth theory of auxin action. Plant Physiol. 93: MAŁKOWSKI E., STOLAREK J., KARCZ W Toxic effect of Pb 2+ ions on extension growth of cereal plants. Polish J. of Environ. Studies, Vol. 5, No. 1: MASSOT N., POSCHENRIEDER C., BARCELO J Differential response of three bean Phaseolus vulgaris cultivars to aluminum. Acta Bot. Neerl. 41: MIZERSKI R., KARCZ W., BURDACH Z Reakcja elektryczna i wzrostowa komórek Nitellopsis obtusa na działanie glinu. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 469: MIZERSKI R., KURTYKA R. KARCZ W Wzrost i rozci gliwo segmentów koleoptyli kukurydzy traktowanych glinem. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 524: MIZERSKI R., LEKACZ H., KARCZ W Wpływ glinu na potencjał membranowy komórek parenchymatycznych korzeni i koleoptyli siewek Zea mays L. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 496: OLIVETTI G.P., GUMMING J.R., ETHERTON B Membrane potential depolarization of root cap cells precedes aluminum tolerance in snapbean. Plant Physiol. 109: PARKER D.R., BERTSCH P.M Identification and quatification of the Al 13 tridecameric polycation using ferron. Environ. Sci. Technol. 26, vol. 5: PETERS W.S., FELLE H Control of apoplast ph in corn coleoptile segments. I. The endogenous regulation of cell wall ph. J. of Plant Physiol. 137: RENGEL Z Uptake of aluminum by plant cells. New Phytol. 134: RYAN P.R., TOMASO D., KOCHIAN L.V Aluminum toxicity in roots; an investigation of spatial sensitivity and the role of the root cap. J. Exp. Bot. 44: SIVAGURU M., BALUŠKA F., VOLKMANN D., FELLE H.H., HORST W.J Impacts of aluminum on the cytoskeleton of the maize root apex. Short-term effects on the distal part of the transition zone. Plant Physiol. 119: SIVAGURU M., HORST W.J The distal part of the transition zone is the most aluminum-sensitive apical root zone of maize. Plant Physiol. 116: Słowa kluczowe: glin, Zea mays L., segmenty koleoptyli, wzrost wydłu eniowy

159 180 R. Mizerski Streszczenie Pomimo du ej liczby prac na temat fitotoksyczno ci glinu, mechanizm tego zjawiska wci nie jest wyja niony. Istnieje kilka hipotez dotycz cych działania tego pierwiastka na komórki ro linne. Dotycz one m.in. interakcji glinu ze składnikami ciany i błony komórkowej, zakłócania procesów transportu przez błon i transdukcji sygnałów, hamowania podziałów komórkowych oraz oddziaływania na struktury cytoplazmatyczne. Celem pracy było okre lenie oddziaływania jonów glinu na wzrost siewek oraz komórek parenchymatycznych komórek segmentów koleoptyli kukurydzy. Badania przeprowadzono na całych siewkach oraz 10-mm segmentach koleoptyli Zea mays L., wycinanych z 4-dniowych, etiolowanych siewek. Wzrost wydłu eniowy siewek mierzono zmodyfikowan metod cieniograficzn, natomiast segmentów koleoptyli przy pomocy liniowego transducera k towego. Glin w postaci AlCl 3 stosowano w st eniu 1 mmol dm -3. Warto ph rodowiska inkubacyjnego wynosiła 4,2. Wykazano, e glin ogranicza wzrost całych siewek, w szczególno ci korzeni oraz segmentów koleoptyli kukurydzy. Uzyskane wyniki mog potwierdza hipotez, w my l której glin zmienia przepuszczalno błony komórkowej, czego efektem jest zmiana ci nienia turgorowego i modyfikacja wzrostu. PLANT GROWTH IN THE PRESENCE OF ALUMINUM Roman Mizerski Department of Plant Physiology, University of Silesia, Katowice Key words: aluminum, Zea mays L., coleoptile segments, elongation growth Summary Despite a large number of recently published papers on aluminum toxicity the mechanism of Al-induced growth inhibition remains poorly understood. Several mechanisms for aluminum exclusion were proposed. The main objective of the study was to determine and to compare the effect of aluminum ions on the root and shoot growth of seedlings of Zea mays L. and on the elongation of coleoptile segments cut from them. The experiments were carried out on maize seedlings and on 10-mm long coleoptile segments cut from four-day-old etiolated maize seedling. Elongation growth were performed using a modification of a shadow method (seedlings measured) and by means of a position of angular transducer (coleoptile segments measured). Aluminum (AlCl 3 ) was used at the concentration of 1 mmol dm -3. ph of the incubation medium was 4.2. It was showed that the exposure of Zea mays L. seedlings and coleoptile segments to aluminum brought about a suppression of root growth and coleoptile elongation. It was found that aluminum ions caused the inhibition of root growth and stimulation of shoot growth. Elongation growth of maize coleoptile segments was limited by aluminum in 21% at the most. This data support the hypothesis that aluminum may lead to the alterations in membrane permeability and consequently change the turgor pressure and inhibit growth of plant tissues.

160 WZROST ORGANÓW RO LINNYCH W OBECNO CI JONÓW GLINU 181 Dr Roman Mizerski Katedra Fizjologii Ro lin Wydział Biologii i Ochrony rodowiska Uniwersytet l ski ul. Jagiello ska KATOWICE

161 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: ROLA ELAZA W KULTURACH RO LIN in vitro Teresa Orlikowska, Marta Zawadzka Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa im. Szczepana Pieni ka w Skierniewicach Wst p elazo jest niezb dnym składnikiem ka dego organizmu ywego. Ro liny s pierwotnym ródłem elaza dla ludzi. elazo stanowi ok. 5% całej masy skorupy ziemskiej i jest czwartym pod wzgl dem obfito ci składnikiem litosfery [KIM, GUERINOT 2007]. W wierzchniej warstwie wyst puje prawie wył cznie w postaci utlenionej - Fe[III], słabo rozpuszczalnej w wodzie [BRIAT, LOBRÉAUX 1997]. Dla optymalnego wzrostu ro liny potrzebuj elaza w st eniach od 10-9 do 10-4 M, natomiast w glebach wapiennych, stanowi cych ok. 30% gleb ornych, st enie elaza nie jest wy sze od M. W ro linach rozwin ły si mechanizmy umo liwiaj ce aktywne pobieranie tego pierwiastka z podło a o niskiej jego zawarto ci. Pobieranie elaza przez korzenie i li cie Ro liny pobieraj elazo w wyniku protonizacji, chelatyzacji i redukcji. Znane s dwie strategie pobierania elaza z gleby [GUERINOT, YI 1994]. Pierwsza jest charakterystyczna dla ro lin dwuli ciennych, jednoli ciennych (wszystkich rodzin z wyj tkiem Poacea) oraz dro d y. Druga strategia jest charakterystyczna dla ro lin z rodziny Poaceae, bakterii i grzybów. Strategia I. W przypadku sygnału niedoboru elaza płyn cego z li ci, dzi ki aktywacji specyficznej H + -ATPazy, pompa protonowa pompuje jony H + na zewn trz korzenia, zakwaszaj c rodowisko i rozpuszczaj c elazo [GUERINOT, YI 1994]. Trójwarto ciowe zwi zki elaza zostaj zredukowane za po rednictwem specyficznego enzymu, tzw. reduktazy turbo, aktywizowanej w korzeniach. Ta redukcja katalizuje transmembranowy transport elektronów z cytozolu do zewn trzkomórkowych zwi zków elaza, jako akceptorów, co jest warunkiem wst pnym dla pobrania elaza. Zredukowane elazo jest transportowane przez membrany plazmatyczne korzeni przy pomocy białkowych transporterów kationów dwuwarto ciowych [BRIAT, LOBRÉAUX 1997; KIM, GUERINOT 2007]. elazo jest najcz ciej transportowane ksylemem w formie chelatu cytrynowego, ale w przypadku nasion, wierzchołków wzrostu i zarodków tak e floemem [KIM, GUERINOT 2007]. Jeszcze w apopla cie, bezpo rednio przed wnikni ciem do symplastu, elazo musi by zredukowane, a nast pnie przeniesione przez membran komórkow przez specyficzne białko transportowe [NIKOLIC, RÖMHELD 1999]. W komórce elazo jest natychmiast wi zane z ró nymi chelatorami, co zapobiega tworzeniu szkodliwych rodników hydroksylowych [KIM, GUERINOT 2007]. elazo trójwarto ciowe tworzy najcz ciej zwi zki z kwasem cytrynowym, natomiast elazo dwui trójwarto ciowe wi e amin nikotynow [HELL, STEPHAN 2003].

162 184 T. Orlikowska, M. Zawadzka Strategia II polega na chelatowaniu elaza przez fitosiderofory, niskocz s- teczkowe zwi zki aminokwasów niebiałkogennych, z rodziny kwasu mugeninowego. Na sygnał niedoboru elaza s one wydzielane do rizosfery, gdzie wi si z elazem okołokorzeniowym, po czym cały kompleks jest przenoszony do komórek epidermy poprzez specyficzny system transportowy dla fitosideroforów i chelatów aminy nikotynowej [KIM, GUERINOT 2007]. Udział w pobieraniu elaza przez ro liny maj tak e bakterie, które wi elazo z gleby przez siderofory, a kompleksy te s pobierane nast pnie przez stref korzeniow. Wysokie ph apoplastu, charakteryzuj ce ro liny rosn ce na glebach wapiennych, jednak nie pozwala na redukcj elaza i jego transport do cytoplazmy, zatem, mimo du ej ilo ci elaza w apopla cie, li cie wykazuj objawy niedoboru tego pierwiastka [MASALHA i in. 2000]. Na przestrzeni kilkunastu lat pojawiło si kilka prac przegl dowych o pobieraniu, przemieszczaniu si i metabolizmie elaza w ro linach [MARSCHNER, RÖMHELD 1994; GUERINOT, YI 1994; BRIAT, LOBRÉAUX 1997; SCHMIDT 1999: SCHMIDT 2003; HELL, STEPHAN 2003; BRIAT i in. 2007; KIM, GUERINOT 2007; CURIE i in. 2009]. Wiedza na ten temat nie jest jednak kompletna. Sklonowanie genów, uaktywnianych w czasie pobierania elaza z gleby, umo liwiło scharakteryzowanie pewnych elementów tego procesu na poziomie molekularnym [BRIAT, LOBRÉAUX 1997; MORI 1999; CURIE, BRIAT 2003; SCHMIDT 2003; KIM, GUERINOT 2007; CURIE i in. 2009; JEONG, CONNOLLY 2009]. Poznane lub wytypowane zostały geny z trzech etapów strategii I, tj. pobierania, transportu i metabolizowania w komórkach, mianowicie: ATPaza protonowa, której ekspresja jest indukowana przez deficyt elaza, reduktaza chelatu Fe[III], która redukuje elazo i bierze udział w jego transporcie, oraz geny z rodziny transporterów metali (w tym elaza) oraz przechowywania w kompleksie z ferrytyn. Poznano tak e geny koduj ce fitosiderofory, warunkuj ce przebieg pobierania wg Strategii II, geny syntazy aminy nikotynowej z metioniny, która to jest po rednikiem w syntezie kwasów mugeninowych, a tak e geny koduj ce białka transportowe Fe-fitosiderofory. Pobieranie elaza jest mo liwe tylko w rodowisku o odczynie kwa nym, st d niedobory elaza wyst puj głównie na glebach zasadowych, o strukturze umo liwiaj cej wysoki poziom utlenienia. W Polsce zjawisko to wyst puje na r - dzinach. Do niedoborów mog tak e doprowadzi bł dy nawo eniowe w czasie uprawy. Nawo enie siarczanem elaza obni a ph rodowiska i umo liwia pobieranie tego pierwiastka. Szybkie poprawienie kondycji ro lin mo na uzyska w wyniku nawo enia dolistnego zwi zkami elaza. Pierwiastki w postaci jonowej wnikaj do li ci przez p kni cia epidermy, przez komórki przyszparkowe, najcz ciej na stronie spodniej, przez włoski i inne wyspecjalizowane struktury [FERNÁNDEZ, EBERT 2005]. elazo, szczególnie podane dolistnie w postaci chelatu przemieszcza si w kierunku młodych rosn cych li ci. St enie dolistnego oprysku powinno zawiera si pomi dzy 1 a 29 mm Fe [FERNÁNDEZ, EBERT 2005]. Tylko korzenie posiadaj system pobierania poprzedzony niezb dnym zakwaszeniem. Nawozy elazowe podawane s dolistnie w formie zakwaszonej, tj. siarczanu lub chelatów. Mechanizm pobierania ich przez li cie nie został kompletnie wyja niony, ale wiadomo, e wnikaniu towarzyszy redukcja, bowiem w takiej formie elazo pokonuje membrany cytoplazmatyczne [BRÜGGERMAN i in. 1993; LARBI i in. 2001]. Pomocne w udost pnianiu elaza ro linom s mikroorganizmy glebowe, które wytwarzaj siderofory kompleksuj ce elazo Fe[III] i komponenty auksynopodobne, które wzmacniaj system redukcyjny, wa ny dla pobierania elaza [MASALHA i in. 2000; JIN i in. 2006]. Rola elaza w ro linach elazo, obok azotu i fosforu, jest pierwiastkiem, którego brak najbardziej ogranicza wzrost ro lin [GUERINOT 2001]. Jest ono zaanga owane w fundamentalne

163 ROLA ELAZA W KULTURACH RO LIN in vitro 185 procesy yciowe, jako kofaktor kluczowych enzymów, przez co uczestniczy w procesach fotosyntezy, oddychania, wi zania azotu cz steczkowego, syntezy DNA, lipidów i chlorofilu oraz syntezy regulatorów wzrostu [BOUZAYEN i in. 1991; SIEDOW 1991; BRIAT, LOBRÉAUX 1997; CURIE i in. 2009]. Du a cz elaza jest składnikiem porfiryn (cytochromów i ferredoksyny) odpowiedzialnych za wytwarzanie wysokoenergetycznych zwi zków chemicznych - NADPH i ATP, a tak e dysmutazy ponadtlenkowej, katalazy czy reduktazy azotanowej [STARCK 2005]. Ponadto, elazo jest wymagane do uaktywnienia enzymu peroksydazy, która spełnia rol ochronn w tkankach, zapobiegaj c nagromadzeniu si nadtlenku wodoru (H 2 O 2 ), który mo e prowadzi do degradacji DNA, białek i błon lipidowych, indukowa mutacje, hamowa fotosyntez, powodowa starzenie si ro lin, a w konsekwencji ich mier [SCANDALIOS 1990]. Peroksydaza po redniczy tak e w katabolizmie IAA [MOLASSIOTIS i in. 2003]. Deficyt elaza w li ciach mo e by powodem fotoinhibicji [ABADIA 1992]. elazo trudno przemieszcza si w tkankach ro lin, dlatego pierwsze objawy jego niedoboru pojawiaj si na najmłodszych li ciach, w postaci chlorozy mi dzy yłkowej [TERRY, ABADIA 1986]. A 80-90% elaza komórkowego znajduje si w chloroplastach, przy czym tylko około 0,1% ilo ci elaza jest metabolicznie czynna. Chloroza jest wynikiem zmniejszenia zawarto ci chlorofilu w chloroplastach, ale tak e karotenoidów i ksantofili [PUSHNIK i in. 1984]. Obni a to pojemno fotosyntetyczn, przez co ulega redukcji plon [PUSHNIK i in. 1984]. Pierwotne objawy niedoboru elaza pojawiaj si na korzeniach w postaci rozrostu strefy wło nikowej, skracania korzeni, nabrzmienia wierzchołków wzrostu i wytwarzania komórek transportowych [ROMERA i in. 1999, 2003]. Te zmiany prowadz do zwi kszenia efektywno ci pobierania elaza. Oprócz chlorozy, niedobór elaza powoduje zahamowanie wydłu ania p dów, zahamowanie tempa wzrostu, a w rezultacie znaczne obni enie plonów. elazo wpływa na bilans regulatorów wzrostu w ro linie. Brak elaza podwy sza poziom auksyny i etylenu, co wpływa na zmiany histologiczne i morfologiczne korzeni ro lin grupy Systemu I [ROMERA i in. 1999]. Zawarto IAA w korzeniach Malus xiaojinensis rosn cej w warunkach deficytu elaza była 4-5 razy wy sza ni w korzeniach kontrolnych, co pozwala na przypuszczenie, e IAA mo e by czynnikiem sygnalnym dla indukcji reakcji zwi zanej z deficytem tego pierwiastka [ZHEN i in. 2005]. Deficyt elaza mo e by sygnalizowany zarówno przez cz ci zielone, jak i korzenie. W obu przypadkach nast puj reakcje prowadz ce do bardziej wydajnego pobierania [ROMERA i in. 1992]. elazo, którego niedobór jest tak wa ny, w nadmiarze jest bardzo szkodliwe. Jego obecno w komórce w formie dwuwarto ciowej, która umo liwia przemieszczanie przez błony plazmatyczne, jest zwi zana z reakcj Fentona, w wyniku której powstaj wolne rodniki. Rodnik hydroksylowy ( - OH) jest szczególnie szkodliwy, poniewa niszczy struktur DNA wskutek p kania wi za ł cz cych obie nici, fragmentacji dezoksyrybozy i zamiany nukleotydów [AMBRO i in. 2001; HELL, STEPHAN 2003; AMBRO i in. 2004; VON SONNTAG 2006], a tak e powoduje zniszczenie struktury lipidów i białek [BECANA i in. 1998; CONNOLLY, GUERINOT 2002]. Z tego powodu ro liny wytworzyły mechanizm utrzymuj cy elazo w homeostazie (równowadze), dzi ki której jego nadmiar jest wi zany przez zwi zki kompleksuj ce, rozpuszczalne i udost pniane w miar potrzeb. Cz elaza jest lokowana w wodniczkach w powi zaniu z amin nikotynow, a cz jest zwi zana bardzo wydajnie (1 cz steczka wi e do atomów elaza) przez fitoferrytyn w chloroplastach [BRIAT, LOBRÉAUX 1997; PICH i in. 2001]. elazo w kulturach ro linnych Podobnie, jak w warunkach in situ, najwa niejszymi pierwiastkami dla wzrostu i

164 186 T. Orlikowska, M. Zawadzka rozwoju eksplantatów s : azot, fosfor i wap. W kulturach kalusa tytoniu wył czenie azotu i fosforu powoduje zanik zdolno ci do tworzenia merystemów. Wył czenie pojedynczo azotu, fosforu, wapnia, potasu i magnezu uniemo liwia wyrastanie p dów i znaczn redukcj suchej masy [RAMAGE, WILIAMS 2003]. LEE i DEFOSSARD [1977] donosili, e tak e selektywne wył czenie elaza z po ywki powodowało znaczn redukcj wzrostu p dów truskawki. Podobnie, LOMBARDI i in. [2003] w do wiadczeniach wykonywanych z kulturami p dowymi Prunus cerasifera Mr.S 2/5 stwierdzaj, e w warunkach całkowitego braku elaza w po ywce wyst piło istotne obni enie st enia chlorofilu i karotenoidów oraz wzrostu, wyra onego w wie ej i suchej masie p dów. W warunkach in vitro elazo jest stałym składnikiem zrównowa onej chemicznie po ywki. Dost pno elaza (i innych pierwiastków) w kulturach in vitro modyfikuj zmiany ph po ywki, powstałe w wyniku autoklawowania lub przemian zwi zanych ze starzeniem si kultury, niekorzystne relacje pomi dzy składnikami po ywki, typ zwi zku elaza i jego st enie oraz jako i intensywno wiatła w pokoju wzrostowym [LEIFERT i in. 1995]. Niedobory elaza w eksplantatach in vitro mog wyst powa w wyniku braku tego pierwiastka, w przypadku bł dnego sporz dzenia po ywki, a przede wszystkim z powodu jego przemiany w form nieprzyswajaln. Korzenie ro lin posiadaj sprawny system pobierania elaza ze zwi zków nieprzyswajalnych w warunkach in vivo. Podobny system musi działa w warunkach in vitro, poniewa nie obserwuje si zazwyczaj chlorozy na p dach prawidłowo ukorzenionych, tak e w po ywce o takim składzie, w której kultury nieukorzenione wykazuj niedobór elaza [DOLCET-SANJUAN i in. 1990; ZAWADZKA, ORLIKOWSKA (zło one w redakcji). W najszerzej stosowanej po ywce MURASHIGE-SKOOGA [1962] elazo wyst puje w postaci chelatu FeEDTA. Jest to forma fotolabilna, a wi c elazo do szybko si uwalnia i przestaje by dost pne, tworz c zwi zek z fosforem. Wolne cz steczki chelatu wi za inne pierwiastki, zmieniaj c ich dost pno w po ywce i zawarto w eksplantatach [WILLIAMS 1993, 1995]. Zwi kszenie st enia tego chelatu, np. w po ywce ANDERSONA [1980], tylko opó nia wyst pienie chlorozy. Lepszym rozwi zaniem jest dodawanie do po ywki zawieraj cej FeEDTA fotostabilnego chelatu FeEDDHA lub zast pienie FeEDTA równowa n ilo ci elaza w formie FeEDDHA. W jego obecno ci chlorotyczne li cie zieleniej i objawy chlorozy nie pojawiaj si przez kilka tygodni. Obecno FeEDDHA poprawia stan fizjologiczny kultur p dowych, zwi ksza si zdolno do namna ania i ukorzeniania p dów oraz zdolno do tworzenia p dów przybyszowych i zarodków somatycznych (tab. 1). FeEDDHA jest form, z której elazo jest wydajnie pobierane tak e przez ro liny rosn ce w warunkach in vivo [LUCENA 2003]. Pocz tkowo, po ywki u ywane do sterylnego mno enia ro lin w laboratorium nie zawierały elaza ani innych mikroelementów, a obecno tych pierwiastków w po ywce pochodziła z nieoczyszczonej wody. W toku dalszego rozwoju techniki in vitro zacz to stosowa wod destylowan, wł czaj c w skład po ywki mikroelementy. Wybór formy elaza był przez wiele lat przedmiotem eksperymentowania. Po ywka GAUTHERETA [1942] 1 * zawierała 50 mg dm -3 Fe 2 [SO 4 ] 2, po ywka HILDEBRANDTA [1946] 1 * 40 mg dm -3 winianu elaza, po ywka NITSCH [1951] 1 * 10 mg dm -3 FeC 6 O 5 H 7 5 H 2 O, po ywka HELLERA [1953] 1 * 1 mg dm -3 FeCl 3 6 H 2 O], po ywka REINERT i WHITE [1956] 1 * i WHITE [1963] 1 * 2,5 mg dm -3 Fe 2 [SO 4 ] 2. Od czasu zaistnienia po ywki MURASHIGE i SKOOGA [1962] elazo wł czano w postaci chelatu FeEDTA. Pierwszymi, którzy zaproponowali form sekwestronow elaza byli GAMBORG i in. [1968] 1 *. 1 * Przytaczane w tym rozdziale informacje pochodz z pracy NARAYANASWAMY [1977].

165 ROLA ELAZA W KULTURACH RO LIN in vitro 187 Chloroza spowodowana niedoborem elaza w tkankach ro linnych jest wynikiem fotochemicznej destrukcji chelatu FeEDTA, przez fale o długo ci nm i przechodzeniem Fe w formy niedost pne dla kultur ro linnych. Wg DALTON i TURNER [1983], elazo jest wytr cane w postaci niedost pnego dla eksplantatów fosforanu, zmniejszaj c w ci gu dwóch dni pocz tkow ilo schelatowanego elaza w po ywce o 45%. SCHENK i in. [1991] proponowali przeciwdziałanie wytr caniu elaza przez autoklawowanie NaFeEDTA i KH 2 PO 4 oddzielnie od pozostałych składników po ywki MS. Poniewa nie wszystkie ro liny cierpi na niedobór elaza na po ywce MS, wydaje si, e elazo mo e uwalnia si stopniowo z fosforanów lub te niektóre genotypy mog aktywnie pozyskiwa elazo z fosforanów, co sugerowano dla ziemniaka odmiany Arran Banner [PAPATHANASIOU i in. 1996]. Proces rozpadu chelatu FeEDTA jest hamowany przez filtr ółty [STASINOPOULOS, HANGARTER 1990; VAN DER SALM i in. 1994]. EDTA jest donorem elektronów dla fotoredukcji flawin i redukcji Fe[III] do Fe[II] [STASINOPOULOS, HANGARTER 1990; HANGARTER, STASINOPOULOS 1991]. Ponadto, degradacja EDTA katalizuje wytwarzanie szeregu zwi zków, z których np. formaldehyd jest toksyczny dla ro lin. Ze wzgl du na fotochemiczn dynamik FeEDTA, proponowano u ywanie chelatu FeEDDHA, który ma wi zania fenolowe, bardziej stabilne od wi za karboksylowych w FeEDTA, w zakresie ph od 4,0 do 8,0 [YUNTA i in. 2003]. U ycie FeEDDHA w równowa nych ilo ciach jonu Fe wydaje si korzystniejsze ni zwi kszanie ilo ci FeEDTA. W literaturze jest kilkana cie doniesie na temat naprawczej roli FeEDDHA w kulturach in vitro (tab. 1). Pobieranie elaza przez eksplantaty in vitro nast puje przez powierzchni stykaj c si z po ywk, a wi c przez epiderm p du, li cia lub bezpo rednio przez ksylem w kulturach p dowych i szczególnie w tym ostatnim przypadku powierzchnia pobierania jest mała, dlatego stabilna forma gwarantuje korzystanie z elaza w dłu szym czasie. Specyfika eksplantatów li ciowych, które na po ywkach z regulatorami nie przylegaj cał powierzchni do po ywki, a w wyniku nierównomiernych na całej powierzchni podziałów komórek fałduj si, powoduje, e decyduj ce o pobieraniu elaza s pierwsze dni, kiedy li przylega wi ksz powierzchni. Zupełnie niejasne s sposoby przemieszczania si elaza w kulturach kalusa, poniewa brak jest tam tkanki przewodz cej.

166 188 T. Orlikowska, M. Zawadzka

167 ROLA ELAZA W KULTURACH RO LIN in vitro 189

168 190 T. Orlikowska, M. Zawadzka

169 ROLA ELAZA W KULTURACH RO LIN in vitro 191 Pobieranie, transport i metabolizm elaza w dojrzałych tkankach ro lin in situ jest w du ym stopniu poznany, natomiast wiadomo ci dotycz ce wykorzystania elaza w kulturach in vitro s do pobie ne. Jak wynika z danych zebranych w tabeli 1, poprawienie dost pno ci elaza wpływa na wydajno namna ania, jako mikrop dów, wydajno ukorzeniania, jako mikrosadzonek, wydajno powstawania p dów przybyszowych i zarodków somatycznych. Autorzy notuj wpływ elaza na kultury, ale interpretacja mechanizmu pobierania i oddziaływania wydaje si zdawkowa. Wiadomo, e fotosynteza w warunkach in vitro nie odgrywa du ej roli w ywieniu eksplantatów i e niekorzystny wpływ niedoboru elaza jest wynikiem jego udziału w innych procesach. Z pewno ci, zwi kszenie dost pno ci elaza przez zastosowanie optymalnej formy chemicznej i/lub st enia zwi ksza ilo chlorofilu i elaza ogólnego, co skutkuje popraw jako ci mikrop dów, przede wszystkim likwidacj chlorozy [DOLCET-SANJUAN i in. 1990; VAN DER SALM i in. 1994; SHIBLI i in. 1997; KAUPPINEN 2001; NAS, READ 2001; ZAWADZKA, ORLIKOWSKA 2006; CHRISTENSEN i in. 2008], eliminacj nadmiernego uwodnienia tkanek [SHIBLI i in. 1997; NAS, READ 2001], wydłu aniem p dów [VAN DER SALM i in. 1994; CHRISTENSEN i in. 2008], a tak e zwi kszaniem zdolno ci do rozkrzewiania [THOMAS i in. 2000; SHIBLI i in. 2002; ZAWADZKA, ORLIKOWSKA 2006]. Wła ciwa forma elaza umo liwiała optymalizacj ukorzeniania [DIMASSI i in. 2003; SCHWAMBACH i in. 2005; ANTONOPOULOU i in. 2007; ZAWADZKA, ORLIKOWSKA (zło ona do redakcji)]. Zanotowano tak e wpływ formy elaza na zwi kszenie efektywno ci regeneracji embrioidów i zarodków somatycznych [RASHID, STREET 1973; KIM i in. 2003] i p dów przybyszowych [TSAO, REED 2002; ZAWADZKA, ORLIKOWSKA 2006] (tab. 1). Objawy braku elaza w warunkach in vitro zauwa ono u nielicznych gatunków, wówczas poprawienie jego dost pno ci w znacz cy sposób zwi kszało efektywno namna ania, ukorzeniania, aklimatyzacji, regeneracji przybyszowej i embriogenezy somatycznej. W warunkach optymalnych, bez objawów niedoboru elaza, nie znaleziono zwi zku efektywno ci regeneracji z ilo ci pobieranego elaza z po ywki. Z pracy RAMAGE i WILLIAMS [2003] wynika, e elazo podane w formie NaFeEDTA, w ilo ci standardowej dla po ywki MS, było pobierane intensywnie przez dyski li ciowe tytoniu od pocz tku kultury. Po 4 dniach w po ywce z dodatkiem cytokininy (stymuluj cej tworzenie p dów przybyszowych) pozostało ok. 56%, a po 35 dniach jedynie 16% elaza. Pobieranie elaza przez dyski li ciowe z po ywki nieorganogennej (bez cytokininy) było jeszcze bardziej intensywne i po 4 dniach w po ywce pozostało tylko 25%, a po 35 dniach jedynie ladowe jego ilo ci. Jak pokazano w tabeli 1, ródło i st enie elaza wpływało na morfogenez tak e w innych ni wcze niej przytaczano przypadkach, takich jak: zwi kszenie zdolno ci do tworzenia płodnych gametofor mchu Microdus brasiliensis [SHARMA, CHOPRA 1985], uniezale nienie od intensywno ci wiatła na etapie stabilizacji kultur Carica papaya [CASTILLO i in. 1997], czy wydłu enie okresu przechowywania w niskich temperaturach chmielu [AYNALEM i in. 2006]. Zazwyczaj form korzystniejsz był chelat FeEDDHA (sekwestren 138), cho w odosobnionych przypadkach bardziej wydajn morfogenez zapewniał FeEDTA (tab. 1). Kultury in vitro mog by technik przydatn do prowadzenia wst pnej selekcji na cech tolerancji niedoboru elaza, co stwierdzono dla winoro li [TANGOLAR i in. 2008], soi [GRAHAM i in. 1992], pigwy [MULEO i in 1995] i podkładki brzoskwini [ROMERA i in. 1991]. Jest to mo liwe, poniewa eksplantaty p dowe reaguj na sygnał niedoboru zakwaszaniem po ywki, podobnie jak korzenie w glebie [LOMBARDI i in. 2003; DONNINI i in. 2008], a reakcja genotypów wra liwych i tolerancyjnych jest podobna w warunkach uprawy in vitro i in vivo [DOLCET-SANJUAN i in. 1990; STEPHENS i in. 1990]. CINELLI i in. [2004] donosili o regeneracji somaklonów pigwy, a PALOMBI i in. [2007] somaklonów gruszy Pyrus pyraster tolerancyjnych na niedobór Fe, spowodowany zmniejszeniem st enia FeEDTA lub dodaniem do po ywki KHCO 3 lub NaHCO 3.

170 192 T. Orlikowska, M. Zawadzka W zagadnieniach zwi zanych z dost pno ci elaza w kulturach in vitro, nie nale y tak e zapomina o mo liwo ci udost pniania tkankom ro linnym Fe przez bakterie, które cz sto bezobjawowo zanieczyszczaj kultury [ORLIKOWSKA, ZAWADZKA 2006], a które mog, podobnie jak w warunkach uprawy glebowej, wi za i transportowa elazo do eksplantatów, poprzez bakteryjne siderofory [MASALHA i in. 2000]. Problem elaza w ro linach jest od dziesi cioleci przedmiotem bada, a powodem jest fakt, e niedobór elaza i zwi zane z tym choroby dotykaj około 3 miliardów ludzi [JEONG, CONNOLLY 2009]. Przeniesienie cz ci bada na kultury in vitro pozwoli na lepsze poznanie mechanizmu genetycznego efektywnego korzystania z elaza oraz mo e wspomóc prace hodowlane poprzez prowadzenie wst pnej selekcji genotypów lepiej przystosowanych do wykorzystania elaza z podło a. Literatura ABADIA J Leaf responses to Fe deficiency: a review. J. Plant Nutr. 15: AMBRO H.B., BRADSHAW T.K., KEMP T.J., KORNACKA E.M., PRZYBYTNIAK G.K Role of iron ions in damage to DNA: influence of ionizing radiation, UV light and H 2 O 2. J. Photochem. and Photobiol.: Chemistry 142: AMBRO H.B., KEMP T.J., RODGER A., PRZYBYTNIAK G Ferric and ferrous ions: binding to DNA and influence on radiation-induced processes. Radiation Physics and Chemistry 71: ANDERSON W.C Tissue culture propagation of red and black raspberies, Rubus ideaus and R. occidentalis. Acta Hort. 112: ANTONOPOULOU C., DIMASSI K., THERIOS I., CHATZISSAVVIDIS C., PAPADAKIS I The effect of Fe-EDDHA and ascorbic acid on in vitro rooting of the peach rootstock GF- 677 explants. Acta Physiol. Plant. 29: AYNALEM H.M., RIGIETTI T.L., REED B.M Iron formulation affects in vitro storage of hops: an image analysis. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 42: BECANA M., MORAN J.F., ITURBE-ORMAETXE I Iron-dependent oxygen free radical generation in plants subjected to environmental stress: toxicity and antioxidant protection. Plant and Soil 201: BOUZAYEN M., FELIX G., LATCHÉ A., PECH J.-C., BOLLER T Iron: an essential cofactor for the conversion of 1-aminocyclopropane-1carboxylic acid to ethylene. Planta 184: BRIAT J.-F., CURIE C., GAYMARD F Iron utilization and metabolism in plants. Curr. Opinion in Plant Biol. 10: BRIAT J.-F., LOBRÉAUX S Iron transport and storage in plants. Trends in Plant Sci. 2: BRÜGGERMAN W., MAAS-KANTEL K., MOOG P.R Iron uptake by leaf mesophyll cells: The role of the plasma membrane-boud ferric-chelate reductase. Planta 190: CASTILLO B., SMITH M.A.L., MADHAVI D.L., YADAVA U.L Interaction of irradiance level and iron chelate source during shoot tip culture of Carica papaya L. HortScience 32: CHRISTENSEN B., SRISKANDARAJAH S., SEREK M., MÜLLER R In vitro culture of Hibiscus rosa-sinensis L.: Influence of iron, calcium and BAP on establishment and multiplication. Plant Cell, Tiss. and Organ Cult. 93:

171 ROLA ELAZA W KULTURACH RO LIN in vitro 193 CINELLI F., LORETI F., MULEO R Regeneration and selection of quince BA29 (Cydonia oblonga Mill.) somaclones tolerant to lime-induced chlorosis. Acta Hortic. 658: CONNOLLY E.I., GUERINOT M.L Iron stress in plants. Genome Biology 3: < CURIE C., BRIAT J.-F Iron transport and signaling in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 54: CURIE C., CASSIN G., COUCH D., DIVOL F., HIGUCHI K., LE JEAN M., MISSON J., SCHIKORA A., CZERNIC P., MARI S Metal movement within the plant: contribution of nicotiamine and yellow stripe 1-like transporters. Annals of Bot. 103: DALTON C.C., TURNER D.A Iron phosphate precipitation in Murashige and Skoog media. Physiol. Plant. 57: DIMASSI K., CHOULIARAS V., DIAMANTIDIS G., THERIOS I Effect of iron and auxins on peroxidase activity and rooting performance of three citrus rootstocks in vitro. J. Plant Nutr. 26: DOLCET-SANJUAN R., MOK D.W.S., MOK M.C Micropropagation of Pyrus and Cydonia and their responses to Fe-limiting conditions. Plant Cell, Tiss. and Organ Cult. 21: DONNINI S., CINELLI F., SENSALE L. MULEO R., ZOCCHI G., RANIERI A Pear plantlets cultured in vitro under lime-induced chlorosis display a better adaptive strategy than quince plantles. Plant Cell, Tiss. and Organ Cult. 93: FERNÁNDEZ V., EBERT G Foliar iron fertilization: a critical review. J. Plant Nutr. 28: GRAHAM M.J., STEPHENS P.A., WITHOLM J.M., NICKELL C.D Soybean genotype evaluation for iron deficiency chlorosis using sodium bicarbonate and tissue culture. J. Plant Nutr. 15: GUERINOT M.L Improving rice yields-ironing out the details. Nature Biotechnology 19: GUERINOT M.L., YI Y Iron: nutritious, noxious and not readily available. Plant Physiol. 104: HANGARTER R.P., STASINOPOULOS T.C Effect of Fe-catalyzed photooxidation of FeEDTA on root growth in plant culture media. Plant Physiol. 96: HELL R., STEPHAN U.W Iron uptake, trafficking and homeostasis in plants. Planta 216: JEONG J., CONNOLLY E.L Iron uptake mechanisms in plants: Functions of the FRO family of ferric reductases. Plant Sci. 176: JIN C.W., HE Y.F., TANG C.X., WU P., ZHENG S.J Mechanisms of microbially enhanced Fe acquisition in red clower (Trifolium pretense L.). Plant Cell Environm. 29: KAUPPINEN S Optimizing shoot proliferation and rooting of micropropagated Japanese quince (Chaenomeles japonica (Thunb.) Lindl. Ex. Spach). Acta Hort. 560: KIM S.A., GUERINOT M.L Mining iron: iron uptake and transport in plants. FEBS Letters 581: KIM S.W., SEUNG C., IN D.S., LIU J.R Plant regeneration of rose (Rosa hybrida) from embryogenic cell-derived protoplasts. Plant Cell, Tiss. and Organ Cult. 73: LARBI A., MORALES F., LOPEZ-MILLAN A.F., GOGORCENA Y., ABADIA A., MOOG P.R., ABADIA J Technical advance: reduction of Fe (III)-chelates by mesophyll leaf discs of sugar beet. Multi-component origin and effects of Fe deficiency. Plant & Cell Physiol.

172 194 T. Orlikowska, M. Zawadzka 42: LEE E.C.M., DEFOSSARD R.A Some factors affecting multiple bud formation of strawberry [x Fragaria ananassa Duchesne] in vitro. Acta Hort. 78: LEIFERT C., MURPHY K.P., LUMSDEN P.J Mineral and carbohydrate nutrition of plant cell and tissue culture. Crit. Rev. Plant Sci. 14: LOMBARDI L., SEBASTIANI L., VITAGLIANO C Physiological, biochemical, and molecular effects of in vitro induced iron deficiency in peach rootstock Mr.S 2/5. J. Plant Nutr. 10/11: LUCENA J.J Fe chelates for remediation of Fe chlorosis in strategy I plants. J. Plant Nutr. 26: MARSCHNER H., RÖMHELD V Strategies of plants for acquisition of iron. Plant and Soil 165: MASALHA J., KOSEGARTEN H., ELMACI Ö., MENGEL K The central role of microbial activity for iron acquisition in maize and sunflower. Biol. Feril. Soils 30: MOLASSIOTIS A.N., DIMASSI K., THERIOS I., DIAMANTIDIS G Fe-EDDHA promotes rooting of rootstocks GF-677 (Prunus amygdalus x P. persica) explants in vitro. Biol. Plant. 47: MORI S Iron acquisition in plants. Curr. Opinion in Plant Biol. 2: MULEO R., CINELLI F., VITI R Application of tissue culture on quince rootstock in iron limiting conditions. J. Plant Nutr. 18: MURASHIGE T., SKOOG F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15: NARAJANASWAMY S Regeneration of plants from tissue culture, w: Plant cell, tissue, and organ culture. (red. - Reinert J., Bajaj Y.P.S.), Springer Verlag: NAS M.N., READ P.E Micropropagation of hybrid hazelnut: medum composition, physical state and iron source affect shoot morphogenesis, multiplication and explant vitality. Acta Hortic. 556: NIKOLIC M., RÖMHELD V Mechanism of Fe uptake by the leaf symplast: Is Fe inactivated in leaf a cause of Fe deficient chlorosis? Plant and Soil 215: ORLIKOWSKA T., ZAWADZKA M Bakterie w kulturach tkanek ro linnych in vitro. Biotechnologia 4(75): PALOMBI M.A., LOMBARDO B., CABONI E In vitro regeneration of wild pear (Pyrus pyraster Burgsd) clones tolerant to Fe-chlorosis and somaclonal variation analysis by RAPD markers. Plant Cell, Tiss. and Organ Cult. 26: PAPATHANASIOU F., SELBY C., HARVEY B.M.R Soluble iron is lost from MS medium pre-exposed to light but growth of potato plantlets is not inhibited. Plant Cell, Tiss. and Organ Cult. 46: PICH A., MANTEUFFEL R., HILLMER S., SCHOLZ G., SCHMIDT W Fe homeostasis in plant cells: Does nicotianamine play multiple roles in the regulation of cytoplasmic Fe concentration? Planta 213: PUSHNIK J.C., MILLER G.W., MANWARING J.H The role of iron in higher plant chlorophyll biosynthesis, maintenance and chloroplast biogenesis. J. Plant Nutr. 7: RAMAGE C.M., WILLIAMS R.R Mineral uptake in tobacco leaf discs during different developmental stages of shoot organogenesis. Plant Cell Rep. 21: RASHID A., STREET H.E The development of haploid embryoids from anther cultures of Atropa belladonna L. Planta 113: ROMERA F.J., ALC NTARA E., DE LA GUARDIA M.D Characterization of the tolerance

173 ROLA ELAZA W KULTURACH RO LIN in vitro 195 to iron chlorosis in different peach rootstocks grown in nurient solution. II. Iron-stress response mechanisms. Plant and Soil 130: ROMERA F.J., ALC NTARA E., DE LA GUARDIA M.D Role of roots and shoots in the regulation of the Fe efficiency responses in sunflower and cucumber. Physiol. Plant. 85: ROMERA F.J., ALC NTARA E., DE LA GUARDIA M.D Ethylene production by Fe-deficient roots and its involvement in the regulation of Fe-deficiency stress responses by strategy I plants. Ann. Bot. 83: ROMERA F.J., FREJO V.M., ALC NTARA E Simultanous Fe- and Cu-deficiency synergically accelerates the induction of several Fe-deficiency stress responses in strategy I plants. Plant Physiol. and Biochem. 41: SCANDALIOS J.G Response of plant antioxidant defence genes to environmental stress, w: Genomic responses to environmental stress. Scandalios J.G. (red.). Academic Press: SCHENK N., HSIAO K.C., BORNMAN C.H Avoidance of precipitation and carbohydrate breakdown in autoclaved plant tissue culture media. Plant Cell Rep. 10: SCHMIDT W Mechanisms and regulation of reduction-based iron uptake in plants. New Phytol. 141: SCHMIDT W Iron solutions: acquisition strategies and signaling passways in plants. Trends in Plant Sci. 8: SCHWAMBACH J., FADANELLI C., FETT-NETO A Mineral nutrition and adventitious footing in microcuttings of Eucalyptus globulus. Tree Physiol. 25: SHARMA P., CHOPRA R.N Effects of chelating agents and metal ions on growth and fertility in the male clones of the moss Microdus brasiliensis (Dub.) Ther. J. Exp. Bot. 36: SHIBLI R.A., MOHAMMAD M.J., AJLOUNI Z.I Growth and micronutrient acquisition of in vitro grown bitter almond and sour orange in response to iron concentration from different iron chelates. J. Plant Nutr. 25: SHIBLI R.A., SMITH M.A.L., NASR R Iron source and cytokinin mitigate the incidence of chlorosis and hyperhydration in vitro. J. Plant Nutr. 20: SIEDOW J.N Plant lipoxygenase: structure and function. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: STARCK Z Rola składników mineralnych w ro linie, w: Fizjologia ro lin. Jan Kopcewicz J., Lewak S. PWN, Warszawa: STASINOPOULOS T.C., HANGARTER R.P Preventing photochemistry in culture media by long-pass light filters alters growth of cultured tissues. Plant Physiol. 93: STEPHENS P.A., WIDHOLM J.M., NICKELL C.D Iron-deficiency chlorosis of soybeen with tissue culture. Theor. Appl. Genet. 80: TANGOLAR S.G., ÜNLÜ G., TANGOLAR S Use in vitro method to evaluate some grapevine varieties for tolerance and susceptibilty to sodium bicarbonate-induced chlorosis. In Vitro Cell Dev. Biol.-Plant 44: TERRY N., ABADIA J Function of iron in chloroplasts. J. Plant Nutr. 9: THOMAS P., MYTHILI J.B., SHIVASHANKARA K.S Effects of photo-oxidative loss of FeNaEDTA and of higher iron supply on chlophyll content, growth and micropropagation rate in triploid watermelon cultures. In Vitro Cell Dev. Biol.-Plant 36: TSAO C.W.V., REED B.M Gelling agents, silver nitrate, and sequestrene iron influence adventitious shoot and callus formation from Rubus leaves. In Vitro Cell Dev. Biol. - Plant 38: VAN DER SALM T.P.M., VAN DER TOORN C.J.G., HÄNISCH TEN CATE C.H., DUBOIS L.A.M., DE VRIES D.P., DONS H.J.M Importance of the iron chelate formula for micro-

174 196 T. Orlikowska, M. Zawadzka propagation of Rosa hybrida L. Moneyway. Plant Cell, Tiss. and Organ Cult. 37: VON SONNTAG C Free-radical-induced DNA damage and its repair: a chemical perspective. Springer: 523 ss. WILLIAMS R.R Mineral nutrition in vitro - a mechanistic approach. Ann. J. Bot. 41: WILLIAMS R.R The chemical environment, w: Automation and environmental control in plant tissue culture. Aitken-Christi J., Kozai T., Smith M.A.L. (red.). Kluwer Academic Press: YUNTA F., GARCÍA-MARCO S., LUCENA J.J Theoretical speciation of ethylenediamine-n-(o-hydroxyphenylacetic)-n -(p-hydroxyphenylacetic) acid (o,p-eddha) in agronomic conditions. J. Agric. Food Chem. 51: ZAWADZKA M., ORLIKOWSKA T The influence of FeEDDHA in red raspberry cultures during shoot multiplication and adventitious regeneration from leaf explants. Plant Cell, Tiss. and Organ Cult. 85: ZAWADZKA M., ORLIKOWSKA T. The influence of FeEDDHA on the in vitro rooting and acclimatization in peat and vermiculite of red raspberry (wysłane do redakcji). ZHEN H., CHANG-QING H., XUE-FENG X., QIAN W Relationship between iron deficiency stress and endogenous hormones in iron-efficient versus inefficient apple genotypes. J. Plant Nutr. 28: Słowa kluczowe: chelat, chloroza, kultury in vitro, mikrorozmna anie, regeneracja, elazo Streszczenie Omówiono sposób pobierania elaza z podło a i jego rol w yciu ro lin oraz oddziaływanie formy i st enia elaza w po ywkach na reakcj kultur ro linnych in vitro. Przedstawiono znane przypadki wpływu tego pierwiastka na wszystkie etapy procesów mikrorozmna ania i regeneracji przybyszowej - inicjacj kultur, namna anie, ukorzenianie i aklimatyzacj oraz na embriogenez somatyczn i regeneracj p dów przybyszowych. Doniesienia dotycz kilkunastu gatunków ro lin, dla przykładu ró y, je yny, maliny, borówki, jabłoni, pigwy i in. THE ROLE OF IRON IN in vitro CULTURES Teresa Orlikowska, Marta Zawadzka Research Institute of Pomology and Floriculture, Skierniewice Key words: chelate, chlorosis, in vitro culture, iron, micropropagation, regeneration Summary Ways of iron acquisition from soil and its role in the plant life are discussed briefly. Based on the available literature information the influence of chemical sources and iron concentration on the reaction of plant tissue culture is presented. The examples of iron effects at all stages of micropropagation and adventitious regeneration (culture initiation, shoot multiplication, rooting and acclimatization), adventitious shoot

175 ROLA ELAZA W KULTURACH RO LIN in vitro 197 regeneration, and somatic embryogenesis are given. The above mentioned information concerns different plant species - rose, raspberry, blackberry, apple, blueberry, quince and others. Prof. dr hab. Teresa Orlikowska Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa im. Szczepana Pieni SKIERNIEWICE ul. Pomologiczna 18 Teresa.Orlikowska@insad.pl ka

176

177 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: WYKORZYSTANIE KULTUR in vitro RODZIMYCH GATUNKÓW RÓ DO OCHRONY ZASOBÓW GENOWYCH Bo ena Pawłowska 1, Anna Bach 1, Ryszard Popek 2 1 Katedra Ro lin Ozdobnych, Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołł taja w Krakowie 2 Instytut Biologii, Akademia Pedagogiczna w Krakowie Wst p Jedn z proponowanych strategii ochrony zasobów genowych jest ochrona ex situ, polegaj ca na przeniesieniu pojedynczych osobników lub ich grup z siedliska naturalnego do sztucznych warunków, w celu ich rozmno enia albo zachowania ró norodno ci biologicznej. W Polsce wyst puje na stanowiskach naturalnych 16 gatunków ró. Dziko rosn ce ró e odgrywaj ogromn rol w kształtowaniu terenów zieleni, s odporne na choroby i szkodniki, zanieczyszczenia powietrza oraz maj małe wymagania glebowe. Owoce s cennym surowcem dla przemysłu spo ywczego i farmaceutycznego, a kwiaty wykorzystuje si do produkcji perfum. Ró a rdzawa i dzika znajduj zastosowanie w produkcji szkółkarskiej jako podkładki. Dzikie gatunki ró odgrywaj rol w hodowli, której intensywno doprowadziła do zaw enia genetycznej bazy i obecnie opiera si na w skiej puli genowej. Strategia ochrony ex situ jest realizowana przez tworzenie banku genów tkanek i kultur in vitro [DE VRIES, DUBOIS 1996; ENGELMANN, ENGELS 2002; POPEK 2002; PODYMA 2004; YAN i in. 2005]. Z przeprowadzonych dotychczas bada nad kulturami in vitro ró wynika jednoznacznie, e decyduj cym czynnikiem w mikrorozmna aniu jest genotyp. Wysoka heterozygotyczno i poliploidalno ró jest czynnikiem utrudniaj cym i ograniczaj cym rozmna anie, jednocze nie wymusza konieczno indywidualnych bada nad ka dym z genotypów. Tylko nieliczne prace dotycz zako czonej sukcesem embriogenezy somatycznej, cz ciej stosuje si rozmna anie ró drog organogenezy, poprzez pobudzanie do rozwoju p ków bocznych [KINTZIOS i in. 1999; KIM i in. 2003; PAWŁOWSKA 2005; PATI i in. 2006]. Celem bada było stworzenie kolekcji in vitro pi ciu gatunków ró rosn cych na stanowiskach naturalnych w Polsce: sinej, kutnerowej, rdzawej, polnej i dzikiej. Materiał i metody Do zało enia kultur in vitro 5 gatunków ró rosn cych dziko na stanowiskach naturalnych w południowej cz ci Krakowa w dzielnicach Pychowice i Tyniec: R. canina L. (ró a dzika), R. rubiginosa L. (r. rdzawa), R. agrestis SAVI (r. polna), Rosa dumalis BECHST. EMEND. BOULEBGER (r. sina) i R. tomentosa SM. (r. kutnerowa) wybrano osobniki o typowych cechach morfologicznych. Eksplantatami inicjalnymi były merystemy wierzchołkowe izolowane ze pi cych p ków bocznych pozyskanych ze

178 200 B. Pawłowska, A. Bach, R. Popek rodkowej cz ci p dów zeszłorocznych. Izolacja merystemów była poprzedzona podwójn dezynfekcj powierzchniow p ków bocznych w 15% roztworze Domestosu i przeprowadzona w dwóch terminach: w lutym 2008 roku - bezpo rednio po zbiorze p dów oraz 4 tygodnie pó niej (cz p dów przechowywano w temperaturze 4 C do czasu rozpocz cia izolacji). Merystemy (wielko ci 0,1-0,2 mm) umieszczano pojedynczo w probówkach na po ywce o składzie podstawowym wg QUOIRIN A i in. [1977] (QL), zawieraj cej 20 g dm -3 sacharozy, o ph 5,6, zestalon agarem w st eniu 0,7%. Testowano dwie po ywki inicjalne (tab. 1). Obliczono % eksplantatów odka onych i regeneruj cych oraz % eksplantatów formuj cych p dy boczne i kalus. Na etapie namna ania uzyskane p dy boczne zawieraj ce od 3 do 5 li ci wykładano po 4 do kolbek Erlenmeyer a (o pojemno ci 100 dm 3 ). Przetestowano 4 po ywki o składzie podstawowym wg QL, zawieraj ce BA (6-benzyloaminopuryna) M, NAA (kwas naftylo-1-octowy) - 0-0,2 M oraz GA 3 (kwas giberelinowy) - 0,3-0,5 M (tab. 3). Wszystkie po ywki do namna ania były dodatkowo wzbogacone w 20 mg dm -3 FeEDDHA (chelat elaza - kompleksowy zwi zek elaza z kwasem etylenodiamino-n,n -di[(orto-hydroksyfenylo)octowym]). Obliczono współczynnik namna ania p dów bocznych (liczba nowopowstałych p dów na jeden wyło ony eksplantat) oraz redni wysoko ro lin. Tabela 1; Table 1 Wpływ po ywki inicjalnej na procent eksplantatów odka onych i regeneruj cych w pierwszym terminie 5 gatunków dziko rosn cych ró Effect of initial medium on 5 species of wild rose explants disinfection and regeneration percents in the first term Gatunek Species 5 BA+0,2 NAA +0,5 GA 3 Zawarto regulatorów wzrostu w po ywkach QL ( M) Plant growth regulators in QL media ( M) 9 BA+0,03 NAA +0,3 GA 3 % odka onych effectiveness of disinfection (%) 5 BA+0,2 NAA +0,5 GA 3 9 BA+0,03 NAA +0,3 GA 3 % regenerujacych effectiveness of regeneration (%) Rosa canina 97a 93a 76bc 55ab Rosa rubiginosa 100a 96a 75bc 42a Rosa agrestis 97a 96a 73bc 75bc Rosa dumalis 100a 93a 90c 57ab Rosa tomentosa 96a 91a 81c 55ab a, b... rednie oznaczone tymi samymi literami nie ró ni si mi dzy sob istotnie; means designated with the same letter do not significantly differ Kultury umieszczano w fitotronie w temperaturze 23/25 C (noc/dzie ), wilgotno ci wzgl dnej 80%, przy 16-godzinnym dniu i nat eniu PPFD 30 mol m -2 s -1 i przenoszono na wie e po ywki co 5 tygodni. W czasie namna ania p dów bocznych połow kultur umieszczono w temperaturze 19/21 C (noc/dzie ), zachowuj c niezmienione pozostałe warunki zewn trzne. Przy obliczaniu wyników zastosowano metod statystyczn kombinowan w układzie niezale nym dwuczynnikowym lub trzyczynnikowym, z uwzgl dnieniem poziomu istotno ci =0,05, a przy porz dkowaniu danych korzystano z testu Duncana.

179 WYKORZYSTANIE KULTUR in vitro RODZIMYCH GATUNKÓW RÓ Wyniki i dyskusja Niebezpiecze stwo erozji genetycznej, zwi zane z intensywn hodowl ró, opart na bardzo w skiej puli genowej, zostało w ostatnich latach potwierdzone badaniami molekularnymi, a obserwowana na wiecie tendencja do korzystania w hodowli z dziko rosn cych gatunków ł czy si z zagadnieniami dotycz cymi ochrony ró norodno ci biologicznej [TANTIKANJA i in. 2001; YAN i in. 2005]. Rys. 1. Regeneracja dziko rosn cych ró inicjowanych w pierwszym terminie Rys. 1. Wild roses regeneration - iniciation in the first term W przeprowadzonych badaniach jako eksplantatów wyj ciowych u yto merystemów, które izolowano z p ków wegetatywnych pobranych ze rodkowej cz ci jednorocznych p dów ró, które s najlepszym materiałem do zakładania kultur in vitro. Wysokie st enie auksyny w p kach pozyskiwanych z wierzchołkowej cz ci p dów hamuje rozwój p ków bocznych [PATI i in. 2006]. Zastosowana metoda podwójnego odka ania eksplantatów wyj ciowych do izolacji merystemów 15% Domestosem okazała si skuteczna w %, nie wykazano istotnych ró nic w zale no ci od składu u ytej po ywki i terminu izolacji (tab. 1, 2). Uzyskane wyniki dotycz ce odka ania rodzimych gatunków ró pozyskiwanych ze stanowisk naturalnych nie potwierdzaj bada KUCHARSKIEJ i in. [2001], które wskazuj na wysoki procent zaka e w przypadku ró uprawianych w gruncie i zalecaj u ywanie do odka ania HgCl 2. W przeprowadzonych badaniach nie było konieczne u ywanie na tym etapie antybiotyków, jak w pracach SALEHI i KHOSH-KHUI [1997]. Na etapie inicjacji kultur zaobserwowano czernienie cz ci odka onych eksplantatów, szczególnie u Rosa rubiginosa, R. tomentosa i R. dumalis. ROUT i in. [1999] zalecaj stosowanie w po ywce PVP, kwasu cytrynowego lub askorbinowego, substancji przeciwdziałaj cych utlenianiu zwi zków fenolowych. Regeneruj ce merystemy formowały p dy boczne lub kalus. Stwierdzono, e merystemy izolowane w terminie II (po 4 tygodniach przechowywania p dów ró w temperaturze 4 C) regenerowały słabiej (57%), w porównaniu do merystemów izolowanych i wykładanych na po ywki bezpo rednio po zbiorze (79%). Wskazuje to na konieczno prowadzenia izolacji bezpo rednio po zbiorze, z pomini ciem fazy przechowywanie w temperaturze 4 C (tab. 2). Dla merystemów wyło onych na po ywki w pierwszym terminie nie wykazano wpływu składu po ywki na formowanie p dów, natomiast intensywno formowania p dów zale ała od gatunku ró y. Najsłabiej

180 202 B. Pawłowska, A. Bach, R. Popek rozwijały si p dy Rosa rubiginosa, pozostałe gatunki formowały p dy na 23,5-37,5% regeneruj cych eksplantatów, na pozostałych obserwowano powstawanie kalusa (rys. 1). Termin; Term Wpływ terminu izolacji merystemów na procent eksplantatów ró odka onych i regeneruj cych Effect of meristems isolation terms on wild rose explants disinfection and regeneration percents % odka onych Effectiveness of disinfection (%) Tabela 2; Table 2 % regeneruj cych Effectiveness of regeneration (%) I termin; I term 98a 79b II termin; II term 94a 57a a, b... rednie oznaczone tymi samymi literami nie ró ni si mi dzy sob istotnie; means designated with the same letter do not significantly differ I termin; I term izolacja bezpo rednio po zbiorze; isolation after shoot crop II termin; II term izolacja po 4 tygodniach przechowywania w temperaturze 4 C; isolation after 4 weeks storage in 4 C Tabela 3; Table 3 Wpływ regulatorów wzrostu w po ywce i temperatury zewn trznej na namna anie p dów bocznych dziko rosn cych ró w cyklu pi ciotygodniowym Effect of plant growth regulators and temperature on axillary buds of wild roses multiplication rate in 5 weeks cycle Gatunek Species Regulatory wzrostu; Plant growth regulators ( M) 5 BA+0,5 GA 3 +0,2 NAA 9 BA+0,3 GA 3 +0,03 NAA 10 BA+0,3 GA 3 +0,06 NAA temperatura kultur (dzie /noc); temperature (day/night) 10 BA+0,3 GA 3 21/19 C 25/23 C 21/19 C 25/23 C 21/19 C 25/23 C 21/19 C 25/23 C Rosa canina 1,0a 1,1ab 1,0a 1,2bc 1,0a 1,2bc 1,5ef 2,0g Rosa rubiginosa 1,0a 1,0a 1,0a 1,0a 1,1ab 1,1ab 1,4de 1,6f Rosa agrestis 1,0a 1,0a 1,0a 1,1ab 1,0a 1,3cd 1,1ab 1,2bc Rosa dumalis 1,0a 1,1ab 1,1ab 1,2bc 1,0a 1,2bc 1,2bc 1,3cd Rosa tomentosa 1,0a 1,0a 1,0a 1,1ab 1,0a 1,1ab 1,1ab 1,2bc a, b... rednie oznaczone tymi samymi literami nie ró ni si mi dzy sob istotnie; means designated with the same letter do not significantly differ Do namna ania ró w literaturze spotyka si ró ne po ywki, zazwyczaj u ywana jest po ywka MS (1962), ale z ograniczon zawarto ci azotu, a zwi kszon ilo ci wapnia. W przeprowadzonych do wiadczeniach zastosowano po ywk zawieraj c składniki mineralne wg QL (1977). Charakteryzuje si ona wy sz o 40% zawarto ci jonów Ca ++, 4-krotnie ni sz zawarto ci NH 4 oraz niewielk zawarto ci jonów Cl -, w porównaniu do po ywki MS. Dodatkowo u yta po ywka została wzbogacona w 20 mg dm -3 FeEDDHA, który zawiera elazo w formie lepiej przyswajalnej i polecany jest w kulturach in vitro ró [VAN DER SALM i in. 1994]. W dotychczas opracowanych do namna ania p dów ró po ywkach wykorzystuje si BA (0,1-3 mg dm -3 ), NAA (0,004-0,5 mg dm -3 ) oraz GA 3 (0,01-0,25 mg dm -3 ) [PATI i in. 2006].

181 WYKORZYSTANIE KULTUR in vitro RODZIMYCH GATUNKÓW RÓ Najlepsza, spo ród testowanych do namna ania p dów bocznych R. canina i R. rubiginosa, była po ywka QL zawieraj ca 10 M BA i 0,3 GA 3, a współczynnik namna ania w cyklu czterotygodniowym wynosił odpowiednio 2,5 i 1,6 nowych p dow (tab. 3). Pozostałe badane gatunki Rosa tomentosa, R. dumalis i R. agrestis namna ały p ki boczne słabiej (współczynnik namna ania 1-1,3). Stwierdzono ponadto, e korzystniejsza dla kultur in vitro badanych gatunków ró jest temperatura 25/23 C, w porównaniu do temperatury 21/19 C. Uprawiane w wy szej temperaturze ró e namna ały si lepiej (tab. 3), ponadto uformowane p dy były bardzo dobrej jako ci, ciemnozielone i zdrowe, podczas gdy ni sza temperatura kultywacji powodowała ółkni cie li ci. LEYHE i HORN [1994] oraz ROUT i in. [1999] zanotowali korzystny wpływ temperatury 21 C na namna anie p dów. Nowopowstałe p dy miały rozetowy wzrost, ka da ro lina zawierała 4-5 li ci, wysoko ro lin wynosiła 5-7 mm, nie wykazano istotnej ró nicy pomi dzy wysoko ci p dów u badanych gatunków. Wnioski 1. Podwójna metoda odka ania p ków bocznych dziko rosn cych gatunków ró 15% Domestosem była skuteczna w %. Intensywno formowania p ków bocznych podczas inicjacji zale ała od gatunku, najsłabiej regenerowała R. rubiginosa (9,5%), pozostałe (R. canina, R. agrestis, R. dumali i R. tomentosa) rozwijały p ki boczne na poziomie 23,5-37,5%. 2. Najlepsza do namna ania p dów bocznych R. canina i R. rubiginosa była po ywka QL zawieraj ca 10 M BA i 0,3 GA 3, a współczynnik namna ania w cyklu czterotygodniowym wynosił 1,6-2,5, pozostałe gatunki namna ały p ki boczne słabiej. 3. Stwierdzono, e najkorzystniejsza dla kultur in vitro badanych gatunków ró jest temperatura 25/23 C. 4. Powstała w Katedrze Ro lin Ozdobnych UR kolekcja in vitro dziko rosn cych w Polsce ró stwarza mo liwo ci do podj cia bada nad długoterminowym przechowywaniem tkanek w ciekłym azocie. Literatura DE VRIES D.P., DUBOIS L.A.M Rose breeding: past, present, prospect. Acta Hort. 424: ENGELMANN F., ENGELS J.M.M Managing plant genetic diversity. Engels J.M.M., Ramanatha Rao V., Brown A.H.D., Jackson M.T. (red.). Wallingford and Rome, CAB International and IPGRI: KIM S.W., OH S.C., LIU J.R Control of direct somatic embryogenesis by exogenous growth regulators in immature zygotic embryo cultures of rose. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 74(1):

182 204 B. Pawłowska, A. Bach, R. Popek KINTZIOS S.C., MANOS C., MARKI O Somatic embryogenesis from mature leaves of rose (Rosa sp.). Plant Cell Report 18: KUCHARSKA D., WI NIEWSKA-GRZESZKIEWICZ H., ORLIKOWSKA T Mikrorozmna anie podkładki Rosa india Major. Biotechnologia 3(54): LEYHE U., HORN W A contribution to micropropagation of Rosa hybrid. Gartenbauwissenschaft 59(2): PATI P.K., RATH S.P., SHARMA M., SOOD A., AHUJA P.S In vitro propagation of rose - a review. Biotechnology Advances 24: PAWŁOWSKA B Wpływ cytokinin na rozwój p ków k towych ró y pn cej New Dawn w kulturach in vitro. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 504/2: PODYMA W Ochrona zasobów genowych, w: Biotechnologia ro lin. Malepszy S. (red.). Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa: 608 ss. POPEK R Ró e dziko rosn ce Polski. Klucz - atlas. Plantpress, Kraków: 112 ss. QUOIRIN M., LEPOIVRE P., BOXUS P Un premier bilan de 10 annees de recherches sur les cultures de meristemes st la multiplication in vitro de fruitiers ligneus, w: et repports de synthese. C.R. Rech., Stat. des Cult. Fruit. Et Maraich. Glemblous: ROUT G.R., SAMANTARAY S., MOTTLEY J., DAS P Biotechnology of the rose: a review of recent progress. Sci. Hortic. 81: SALEHI H., KHOSH-KHUI M Effect of explants length and diameter on in vitro shoot growth and proliferation rate of miniature rose - The Faiy. Orissa J. Hortic. 25: TANTIKANJA T., YOUNG J., LETHAM S., GRIFFITH M., HUSSAIN M., LJUNG K., SANDBERG G., SUNDARASEN V Control of axillary bud initiation and shoot architecture in Arabidopsis through the SUPERSHOOT gene. Genes and Development 15: VAN DER SALM T.P.M., VAN DER TOORN C.J.G., HANISCH TEN CATE C.H., DUBOIS L.A.M., DE VIRES D.P., DONS H.J.M Importance of the iron chelate formula for icropropagation of Rosa hybryda L. Moneyway. Plant Cell Tissue and Organ Culture 37: YAN Z., DENNEBOOM C., HATTENDORF A., DOLSTRA O., DEBENER T., STAM P., VISSER P.B Construction of an integrated map of rose with AFLP, SSR, PK, RGA, RFLP, SCAR and morphological markers. Theor. Appl. Genet. 110: Słowa kluczowe: ró e dziko rosn ce, mikrorozmna anie, ró norodno biologiczna Streszczenie Stworzono kolekcj in vitro gatunków ró rosn cych na stanowiskach naturalnych w Polsce. W prezentowanym etapie bada do zało enia kultur wybrano 5 gatunków wyst puj cych w południowej cz ci Krakowa w rejonie Pychowic i Ty ca: Rosa dumalis BECHST. EMEND. BOULEBGER (ró a sina), R. tomentosa SM. (r. kutnerowa), R. rubiginosa L. (r. rdzawa), R. agrestis SAVI (r. polna) i R. canina L. (r. dzika). Do zapocz tkowania kultur in vitro posłu yły merystemy wierzchołkowe (wielko ci 0,1-0,2 mm) izolowane ze pi cych p ków bocznych p dów jednorocznych w terminie wczesnowiosennym 2008 roku. Po przeprowadzeniu dezynfekcji powierzchniowej pobrano merystemy i umieszczono je na po ywce o składzie podstawowym wg Quoirin a i Lepoivre a (QL 1977) wzbogaconej wcytokinin BA i

183 WYKORZYSTANIE KULTUR in vitro RODZIMYCH GATUNKÓW RÓ niewielki dodatek auksyny NAA oraz giberelin, o ph 5,6. Zastosowana metoda odka ania p ków bocznych była skuteczna w %. Regeneruj ce eksplantaty formowały p ki boczne i kalus, przy czym u Rosa rubiginosa, R. tomantosa oraz R. dumalis obserwowano czernienie eksplantatów wyj ciowych u podstawy. Intensywno formowania p ków bocznych podczas inicjacji zale ała od gatunku, najsłabiej regenerowała R. rubiginosa (9,5%), pozostałe na poziomie 23,5-37,5%. Najlepsza do namna ania p dów bocznych R. canina i R. rubiginosa była po ywka QL zawieraj ca 10 M BA i 0,3 GA 3, a współczynnik namna ania w cyklu pi ciotygodniowym wynosił 1,6-2,5, pozostałe gatunki namna ały p ki boczne słabiej. Stwierdzono, e najkorzystniejsza dla kultur in vitro badanych gatunków ró jest temperatura 25/23 C. THE USE OF in vitro CULTURES OF DOMESTIC ROSES FOR PROTECTION OF GENE RESOURCES Bo ena Pawłowska 1, Anna Bach 1, Ryszard Popek 2 1 Department of Ornamental Plants, Agricultural University, Kraków 2 Institute of Biology, Pedagogical University, Kraków Key words: wild roses, micropropagtion, biodiversity Summary The aim of the present study was to create an in vitro collection of rose species growing on natural stands in Poland. At this stage of research, 5 species of roses occurring in the southern part of the city of Kraków in the area of Pychowice and Tyniec were used for culture initiation: Rosa dumalis BECHST., R. tomentosa SM., R. rubiginosa L., R. agrestis SAVI and R. canina L. In vitro cultures were initiated from apical meristems ( mm) isolated from one-year-old aestive shoot buds in the early spring in After surface disinfection, meristems were collected and transferred to the medium of the basic composition according to Quoirin and Lepoivre (QL 1977) supplemented with the cytokinin BA and a trace of the auxin NAA and gibberellin, ph 5.6. Efficiency of the method of shoot bud disinfection was %. Regenerating explants formed shoot buds and callus, however, blackening of initial explants at the base was noted in Rosa rubiginosa, R. tomantosa and R. dumalis. Intensity of shoot bud formation during culture initiation depended on the species: R. rubiginosa regenerated the weakest (9.5 %) and the remaining species at the level of %. QL medium containing 10 M BA and 0.3 GA 3 was the best for shoot multiplication in R. canina and R. rubiginosa; multiplication coefficient in a five-week cycle was The remaining species showed weaker shoot bud multiplication. Temperature of 25/23 C was the most beneficial for in vitro cultures of rose species under study. Dr in. Bo ena Pawłowska Katedra Ro lin Ozdobnych Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołł taja

184 206 B. Pawłowska, A. Bach, R. Popek al. 29 Listopada KRAKÓW

185 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: ODDZIAŁYWANIE MOLIBDENU NA ZAWARTO BARWNIKÓW CHLOROFILOWYCH W LI CIACH SIEWEK Zea mays L. Krystyna Pazurkiewicz-Kocot 1, Andrzej Kita 2, Agata Krzykawska 1 1 Katedra Fizjologii Ro lin, Uniwersytet l ski w Katowicach 2 Zakład Chemii Analitycznej, Instytut Chemii, Uniwersytet l ski w Katowicach Wst p Molibden jest niezb dnym pierwiastkiem do prawidłowego wzrostu i rozwoju ro lin [FOX, GUERINOT 1998; KABATA-PENDIAS, PENDIAS 1999; FRAUSTO DA SILVA, WILLIAMS 2001]. Rozproszony w skorupie ziemskiej podlega du ej bioakumulacji, zwłaszcza w rodowisku alkalicznym. Pobieranie molibdenu przez ro liny jest procesem biernym i jest proporcjonalne do ilo ci jego form mobilnych w glebie, a wolne w glany i substancja organiczna ułatwiaj pobieranie tego pierwiastka. Metal ten jest zlokalizowany głównie w młodych rosn cych organach, jak i w górnych cz ciach li ci. Li cie zawieraj wi cej molibdenu ni łodygi i korzenie i jest on tam kumulowany przede wszystkim w mi kiszu mi dzy nerwami. Ilo ci molibdenu konieczne ro linom do normalnego wzrostu i rozwoju s du o mniejsze ni innych mikroelementów uznawanych za niezb dne. Odpowiednia zawarto molibdenu w ro linach jest wa na i jego zawarto nie powinna by ni sza ni 0,2 ppm i nie wy sza ni 5 ppm w przeliczeniu na such mas ro lin. Brak molibdenu w ro linach wywołuje chloroz, a na nadmiar tego pierwiastka ro liny s stosunkowo mało wra liwe. Nadmiar molibdenu w komórkach powoduje ółkni cie li ci, a tak e zahamowanie wzrostu i rozwoju ro lin. Metal ten gromadzi si w postaci kompleksowych poł cze z tanin i antocjanem [HALE i in. 2001]. Wchodzi on w skład wielu enzymów, w tym reduktaz nitrogenazowej i azotanowej oraz oksydaz [HALE i in. 2001], a tak e wpływa na syntez barwników chlorofilowych [KOWALCZYK i in. 2004]. Deficyt molibdenu powoduje silny spadek st enia kwasu askorbinowego i dehydroaskorbinowego. Molibden wykazuje współzale no w stosunku do wielu pierwiastków, która wynika z łatwo ci tworzenia trwałych poł cze i z wzajemnego oddziaływania. Wchodzi łatwo w interakcje z innymi pierwiastkami [FOX, GUERINOT 1998; KABATA-PENDIAS, PENDIAS 1999; FRAUSTO DA SILVA, WILLIAMS 2001; MENDEL 2007]. Celem pracy było zbadanie wpływu ró nych st e Na 2 MoO 4 2H 2 O na zawarto barwników chlorofilowych w siewkach kukurydzy oraz ich wzrost. Materiał i metodyka bada W pracy do wiadczenia prowadzono na 9-dniowych siewkach kukurydzy (Zea

186 208 K. Pazurkiewicz-Kocot, A. Kita, A. Krzykawska mays L.) odmiany Koka (nasiona pochodziły ze Stacji Hodowli Ro lin w Kobierzycach), hodowanych na po ywce Hoaglanda kontrola [HOAGLAND, ARNON 1950], po ywce pozbawionej molibdenu po ywka 0 oraz na po ywkach zawieraj cych Na 2 MoO 4 2H 2 O w st eniu 10-3 mol dm mol dm -3, który był wprowadzany do hodowli 96 godzin przed analiz chemiczn, ph roztworu wynosiło 6,5. Pocz tkowo ro liny hodowano w cieplarce ciemniowej w temperaturze 27 C, potem w szklarni przy 12-godzinnym dniu i nocy, w temperaturze 21 C. Zawarto barwników chlorofilowych w siewkach kukurydzy oznaczano w kr kach o okre lonej powierzchni, wyci tych z li ci odpowiednim korkoborem. Materiał umieszczano w probówkach z acetonem. Po zagotowaniu materiału probówki szczelnie zamykano i przechowywano w ciemno ci, w lodówce, do czasu wykonania oznacze. Ekstrakcj barwników przeprowadzano w tym samym dniu. Li cie rozcierano z odrobin drobno potłuczonego szkła i z niewielk ilo ci CaCO 3, w obecno ci 80% wodnego roztworu acetonu. Ekstrakcj kontynuowano wie ymi porcjami wodnego roztworu acetonu do momentu uzyskania roztworu bezbarwnego. Wyci g acetonowy filtrowano przez s czek szklany (Schott G3) i dopełniano do okre lonej obj to ci. Barwniki chlorofilowe oznaczano metod spektrofotometryczn. Absorbancj barwników odczytywano przy trzech długo ciach fali: 649 nm, 665 nm oraz 710 nm, na spektrofotometrze VSU2-P (produkcji firmy Carl Zeiss Jena). Pomiary absorbancji dokonywane były w kuwetach szklanych grubo ci 1 cm. St enie barwników obliczano ze wzorów Vernona, b d cych modyfikacj wzorów Arnona [VERNON 1960]: chlorofil a (mg dm -3 ) = 11,63 A 665 2,39 A 649, chlorofil b (mg dm -3 ) = 20,11 A 649 5,18 A 665, chlorofil a+b (mg dm -3 ) = 6,45 A ,72 A 649, gdzie: A 665 maksimum absorpcji chlorofilu a, A 649 maksimum absorpcji chlorofilu b. Ilo barwników przeliczano na 1 g suchej masy ro linnej. W celu zmierzenia st enia molibdenu w tkance li ci materiał ro linny suszono w suszarce w temperaturze 70 C do stałej masy i tak przygotowane próbki poddawano analizie chemicznej. Kumulacj molibdenu w tkankach li ci badano przy zastosowaniu metody atomowej spektrometrii emisyjnej (ICP-OES). Zastosowanie tej techniki w analizie materiałów pochodzenia ro linnego wymaga przeprowadzenia próbki organicznej do roztworu. Such mas próbki o masie około 0,5 g mineralizowano metod bezci nieniow na mokro z udziałem st onego HNO 3. W analicie oznaczano molibden wykorzystuj c lini analityczn 202,030 nm, czas integracji 3 s. Wzrost 9- dniowych ro lin mierzono metod planimetryczn. Wyniki i dyskusja Siewki kukurydzy (Zea mays L.) hodowane na po ywce zawieraj cej molibden w postaci Na 2 MoO 4 2H 2 O pobieraj ten pierwiastek z podło a i kumuluj go w li ciach (rys. 1). W porównaniu z kontrolnymi ro linami, których hodowla prowadzona była na po ywce Hoaglanda, wyra ny wzrost zawarto ci tego pierwiastka w li ciach stwierdzono u ro lin hodowanych na podło u zawieraj cym zwi kszone ilo ci molibdenianu(vi) sodu.

187 ODDZIAŁYWANIE MOLIBDENU NA ZAWARTO BARWNIKÓW Rys. 1. Zawarto Mo w li ciach 9-dniowych siewek kukurydzy ( rednie z 5 pomiarów; bł d 8-10%) Fig. 1. Content of Mo in the leaves of 9-day seedlings of maize (average from 5 measurements; error 8-10%) W 9-dniowych siewkach kukurydzy poddanych działaniu molibdenu w st eniach 10-3 mol dm mol dm -3 badano zawarto barwników chlorofilowych (chlorofil a, b oraz a+b), a tak e wzrost ro lin. Kontrol dla wszystkich pomiarów stanowiły ro liny rosn ce tylko na po ywce Hoaglanda. Zwi kszon zawarto chlorofilu a, b, a+b, jak i stosunku chlorofilu a/b w przeliczeniu na 1 gram suchej masy li ciowej zaobserwowano przy wszystkich st eniach Na 2 MoO 4 2H 2 O w odniesieniu do kontroli (rys. 2, 3, 4, 5). Najwi kszy wzrost zawarto ci chlorofilu a, b oraz a+b stwierdzono przy st eniu 10-7 mol dm -3. Spadek zawarto ci chlorofilu a, b oraz a+b w porównaniu do kontroli zaobserwowano w li ciach siewek hodowanych na po ywce Hoaglanda pozbawionej molibdenu. Wyniki najbardziej zbli one do kontroli uzyskano przy st eniu 10-3 mol dm -3. W li ciach ro lin traktowanych molibdenianem(vi) sodu we wszystkich st eniach zawarto chlorofilu a, b oraz a+b przekracza 100% (za 100% przyjmuje si zawarto chlorofilu w kontroli). W przypadku li ci siewek rosn cych na po ywce Hoaglanda bez molibdenu (po ywka 0), zawarto chlorofilu a, b i a+b jest ni sza ni w kontroli (rys. 2, 3, 4). Stosunek zawarto ci chlorofilu a/b w porównaniu do kontroli jest wy szy w li ciach siewek traktowanych Na 2 MoO 4 2H 2 O w st eniu 10-4 mol dm -3 i 10-5 mol dm -3. Stosunek ten jest ni szy w przypadku st enia 10-3 mol dm -3 i w li ciach siewek hodowanych na po ywce Hoaglanda bez molibdenu, a najni szy przy st eniu 10-6 mol dm -3 (rys. 5).

188 210 K. Pazurkiewicz-Kocot, A. Kita, A. Krzykawska Rys. 2. Zawarto chlorofilu a w suchej masie li ci siewek Zea mays L. poddanych w trakcie hodowli działaniu Na 2 MoO 4 2H 2 O w ró nych st eniach ( rednie z 5 pomiarów; bł d 6-7%) Fig. 2. Content of chlorophyll a in the dry mass of maize seedling leaves treated with Na 2 - MoO 4 2H 2 O at different concentrations during growing (average from 5 measurements; error 6-7%) Rys. 3. Zawarto chlorofilu b w suchej masie li ci siewek Zea mays L. poddanych w trakcie hodowli działaniu Na 2 MoO 4 2H 2 O w ró nych st eniach ( rednie z 5 pomiarów; bł d 6-7%) Fig. 3. Content of chlorophyll b in the dry mass of maize seedling leaves treated with Na 2 - MoO 4 2H 2 O at different concentrations during growing (average from 5 measurements; error 6-7%)

189 ODDZIAŁYWANIE MOLIBDENU NA ZAWARTO BARWNIKÓW Rys. 4. Zawarto chlorofilu a+b w suchej masie li ci siewek Zea mays L. poddanych w trakcie hodowli działaniu Na 2 MoO 4 2H 2 O w ró nych st eniach ( rednie z 5 pomiarów; bł d 6-7%) Fig. 4. Content of chlorophyll a+b in the dry mass of maize seedling leaves treated with Na 2 MoO 4 2H 2 O at different concentrations during growing (average from 5 m- easurements; error 6-7%) Rys. 5. Stosunek zawarto ci chlorofilu a/b w suchej masie li ci siewek Zea mays L. poddanych w trakcie hodowli działaniu Na 2 MoO 4 2H 2 O w ró nych st eniach Fig. 5. Relation of content of chlorophyll a/b in the dry mass of maize seedling leaves treated with Na 2 MoO 4 2H 2 O at different concentrations during growing

190 212 K. Pazurkiewicz-Kocot, A. Kita, A. Krzykawska Rys. 6. Długo siewek (cm) kukurydzy poddanych w trakcie hodowli działaniu Na 2 MoO 4 2H 2 O w ró nych st eniach ( rednie z 55 pomiarów; bł d 3-4%) Fig. 6. Length of maize seedlings (cm) treated with Na 2 MoO 4 2H 2 O at different concentrations during growing (average from 55 measurement; error 3-4%) Molibden, niezale nie od st enia, stymuluje wzrost siewek kukurydzy. Najwi kszy wzrost siewek, w porównaniu do kontroli, stwierdzono przy st eniu 10-4 mol dm -3 i 10-5 mol dm -3. W po ywce Hoaglanda niezawieraj cej molibdenu (po ywka 0) wzrost siewek jest mniejszy ni w próbie kontrolnej (po ywka Hoaglanda), (rys. 6). Niektórzy badacze wskazuj, e molibden wywiera dodatni wpływ na biosyntez chlorofilu. Deficyt molibdenu powoduje znaczny spadek ilo ci chlorofilu a i b, za wysokie st enie tego pierwiastka wywołuje wzrost zawarto ci zielonego barwnika u ro lin [KOWALCZYK i in. 2004]. Metal ten bierze udział w biosyntezie kwasu askorbinowego, który odgrywa wa n rol w regeneracji chlorofilu a i b z produktów ich fotooksydacji [RÜDIGER 1997; TANAKA, TANAKA 2006]. Niedobór molibdenu wywołuje silny spadek ilo ci tego kwasu. Spadek ten zwi zany jest ze wzrostem aktywno ci monooksygenazy monofenolowej, a tak e peroksydazy wyst puj cych u ro lin niedo ywionych molibdenem. Przy braku molibdenu kwas askorbinowy utlenia si dwukrotnie szybciej ni w jego obecno ci, co tłumaczy si ró n aktywno ci oksydazy askorbinianowej, w zale no ci od stopnia zaopatrzenia w ten metal [SZKOLNIK 1980]. Molibden powoduje popraw wydajno ci fotosyntezy oraz zwi ksza nat enie fosforylacji w chloroplastach [HALLE i in. 2001]. Metal ten wpływa równie na struktur i przepuszczalno błon komórkowych. Działa korzystnie na syntez fosfolipidów, które s głównymi składnikami tych struktur komórkowych. Molibden zmniejsza przepuszczalno błon komórkowych, a tym samym zwi ksza stopie otwarcia i przewodno aparatów szparkowych. Dzi ki temu podwy szona zostaje transpiracja, która odgrywa po redni rol w stymulowaniu fotosyntezy [SZKOLNIK 1980; MENDEL, HAENSCH 2002].

191 ODDZIAŁYWANIE MOLIBDENU NA ZAWARTO BARWNIKÓW Molibden jest pierwiastkiem, który wyst puje w układzie antagonistycznym i synergistycznym z wieloma innymi pierwiastkami. Metal ten wykazuje współzale no w stosunku do wielu pierwiastków, która wynika z łatwo ci tworzenia trwałych poł cze i z wzajemnego oddziaływania [FOX, GUERINOT 1998, KABATA-PENDIAS, PENDIAS 1999; FRAUSTO DA SILVA, WILLIAMS 2001]. Wchodzi łatwo w interakcje z innymi pierwiastkami, takimi jak mied, siarka, fosfor. Pierwiastek ten ułatwia pobieranie wielu metali niezb dnych do prawidłowej biosyntezy chlorofilu, takich jak cynk, kobalt, mangan, elazo. Czynniki glebowe, które zwi kszaj dost pno molibdenu dla ro lin działaj hamuj co na fitoprzyswajalno miedzi, z kolei siarczany(vi) ograniczaj pobieranie molibdenu, co jest wynikiem konkurencji jonów siarczanowych(vi) i molibdenianowych(vi). Jony fosforanowe(v) przeciwnie zwi kszaj ich przyswajalno przez ro liny dzi ki powstawaniu kompleksowych, rozpuszczalnych zwi zków fosforomolibdenianowych. Antagonizm pomi dzy molibdenem i manganem jest efektem wtórnym spowodowanym wysok kwasowo ci gleby, która ogranicza dost pno molibdenu ro linom, a ułatwia pobieranie manganu. Metal ten współdziała z manganem w stymulowaniu wzrostu ro lin. Mi dzy molibdenem i potasem istnieje synergizm. Na glebach kwa nych molibden chroni ro liny przed toksycznym działaniem glinu. Hamuje równie toksyczne działanie metali ci kich. Molibden wyra nie ogranicza przyswajalno niektórych metali, szczególnie metali ci kich, których obecno wpływa negatywnie na syntez chlorofilu i jest zdecydowanie niepo dana w rodowisku ro lin. Do metali tych mo na zaliczy m.in. kadm i ołów [PAZURKIEWICZ-KOCOT, KITA 2007, 2008a, 2008b]. Długo siewek, w porównaniu z kontrol, w ka dym przypadku wskazuje na stymuluj ce działanie molibdenu na wzrost ro lin. Ro liny traktowane, bez wzgl du na warto zastosowanego st enia, osi gn ły du o wi ksz długo siewek ni ro liny kontrolne (rys. 6). Pod wpływem molibdenu zmniejsza si stosunek zawarto ci kwasu dehydroaskorbinowego do askorbinowego. Spadek zawarto ci kwasu dehydroaskorbinowego w tkankach ro linnych działa korzystnie na wzrost, za zwi kszenie poziomu tego zwi zku u ro lin niedo ywionych molibdenem prowadzi do zahamowania procesów wzrostowych [ZURZYCKI, MICHNIEWICZ 1985]. Wnioski 1. Molibden działa stymuluj co na syntez chlorofilu a i b w li ciach Zea mays L. 2. Molibden stymuluje wzrost siewek kukurydzy w zakresie badanych st e tego pierwiastka w po ywce Literatura FOX T.C., GUERINOT M.L Molecular biology of cation transport in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49: FRAUSTO DA SILVA J.J.R., WILLIAMS R.J.P The biological chemistry of the elements. Oxford University Press, Oxford: 600 ss. HALE K.L., MCGRATH S.P., LOMBI E., STACK S.M., TERRY N., PICKERING I.J., GEORGE G.N., PILON-SMITS E.A.H Molybdenum sequestration in Brassica species. A role for anthocyanins? Plant Physiol. 126: HOAGLAND D.R., ARNON D.J The water culture method for growing plants without soil. Calif. Agric. Exp. Stat. Circ. 347: 1-32.

192 214 K. Pazurkiewicz-Kocot, A. Kita, A. Krzykawska KABATA-PENDIAS A., PENDIAS H Biogeochemia pierwiastków ladowyh. PWN, Warszawa: 398 ss. KOWALCZYK J., BORKOWSKA-BURNECKA J., ZGARDA A Chlorofil i metale ci kie w ogórkach. Wydawnictwo Politechniki Cz stochowskiej, Cz stochowa MENDEL R.R Biology of the molybdenum cofactor. J. Exp. Bot. 58: MENDEL R.R., HAENESCH R Molybdoenezymes and molybdenum cofactor in plants. J. Exp. Bot. 53: PAZURKIEWICZ-KOCOT K., KITA A Effect of molybdenum on metals accumulation in Zea mays L. leaves. Materiały 54. Zjazdu PTB, Szczecin, IX 2007: 52. PAZURKIEWICZ-KOCOT K., KITA A. 2008a. Oddziaływanie molibdenu na transport i kumulacj wybranych jonów w li ciach Zea mays L. Materiały konferencji naukowoszkoleniowej Błony biologiczne. Szklarska Por ba, V 2008: 51. PAZURKIEWICZ-KOCOT K., KITA A. 2008b. Oddziaływanie molibdenu na transport i kumulacj wybranych jonów w li ciach Zea mays L., w: Błony biologiczne. Gabrielska J., Misiak P. (red.), Wydawnictwo UP we Wrocławiu, Wrocław: RÜDIGER W Chlorophyll metabolism: from outer space down to the molecular level. Phytochemistry. 36: SZKOLNIK M Mikroelementy w yciu ro lin. PWRiL, Warszawa: TANAKA A.K., TANAKA R Chlorophyll metabolism. Current Opinien in Plant Biology. 9: VERNON L.P Spectrophotometric determination of chlorophyls and pheophytins in plant extracts. Anal Chem. 32: ZURZYCKI J., MICHNIEWICZ M Fizjologia ro lin. PWRiL, Warszawa: 728 ss. Słowa kluczowe: molibden, kumulacja, chlorofil a i b, Zea mays L. Streszczenie W pracy badano wpływ ró nych st e Na 2 MoO 4 2H 2 O na zawarto barwników chlorofilowych w siewkach kukurydzy oraz na ich wzrost. Do wiadczenia prowadzono na 9-dniowych siewkach kukurydzy hodowanych na po ywce Hoaglanda oraz na po ywkach zawieraj cych dodatkowo Na 2 MoO 4 2H 2 O w st eniach 10-3 mol dm mol dm -3, który to zwi zek podawano ro linom 96 godzin przed analiz chemiczn, ph roztworu wynosiło 6,5. Ro liny hodowano pocz tkowo przez cztery dni w cieplarce ciemniowej w temperaturze 27 C, potem w szklarni przy 12-godzinnym dniu i nocy w temperaturze 21 C. Zawarto barwników chlorofilowych w li ciach mierzono spektrofotometrycznie. Kumulacj pierwiastków w tkankach li ci badano przy zastosowaniu metody atomowej spektrometrii emisyjnej (ICP-OES). Długo siewek mierzono planimetrycznie. Uzyskane w pracy wyniki bada wskazuj na to, e molibden stymuluje syntez chlorofilu a i b w li ciach Zea mays L. oraz, e indukuje wzrost siewek kukurydzy, w zakresie badanych st e. EFFECT OF MOLYBDENUM ON THE CONTENT OF CHLOROPHYLL PIGMENTS IN THE LEAVES OF SEEDLINGS OF Zea mays L.

193 ODDZIAŁYWANIE MOLIBDENU NA ZAWARTO BARWNIKÓW Krystyna Pazurkiewicz-Kocot 1, Andrzej Kita 2, Agata Krzykawska 1 1 Department of Plant Physiology, Silesian University, Katowice 2 Department of Analytical Chemistry, Institute of Chemistry, Silesian University, Katowice Key words: molybdenum, accumulation, chlorophyll a and b, Zea mays L. Summary In the work the relationship between the accumulation of molybdenum and the content of chlorophyll a and b in the leaves of Zea mays L. plants was studied. The effect of molybdenum on the growth reaction of plants was investigated as well. The experiments were carried out on 9-day old maize plants grown on the Hoagland s medium. Seeds of maize were cultivated for four days in the darkness at 27 C on the moist filter paper. Than the individual seedlings were transferred into the aerated solution containing the macro- and microelements, and next cultivated in a green house for 12 hours in light and 12 hours in darkness at 21 C. The seedlings were exposed to the solution containing Na 2 MoO 4 2H 2 O at concentration of 10-3 mol dm mol dm -3 about 96 hours before chemical analysis, ph of the medium was 6,5. The accumulation of molybdenum in the seedlings of maize was measured by emission spectroscopy using the spectrometer with excitation by argon inductively coupled plasma technique (ICP-OES). The amount of chlorophyll pigments was determined by the spectrophotometer. The length of seedlings was measured using the planimetric method. The results presented in this work indicate the relationship between the uptake and accumulation of molybdenum in the leaves of maize plants and the presence of Na 2 MoO 4 2H 2 O in the external medium of growing plants. The study shows that the content of chlorophyll a and b in the maize leaves depends on the concentration of molybdenum in the medium and leaves of seedlings. In the work the interrelations between the growth of plants and concentration of Na 2 MoO 4 2H 2 O in the medium was also showed. Dr Andrzej Kita Zakład Chemii Analitycznej Instytut Chemii Uniwersytet l ski ul. Szkolna KATOWICE andrzej.kita@us.edu.pl

194 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: PRÓBY ELIMINACJI WIRUSA PIER CIENIOWEJ PLAMISTO CI ODONTOGLOSSUM (ORSV) Z TKANEK Cymbidium (Orchidaceae) W KULTURACH in vitro Anna Pindel, Teresa Cybularz-Urban Katedra Botaniki, Wydział Ogrodniczy, Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołł taja w Krakowie Wst p Dzi ki urzekaj cym barwom i formom kwiatów, storczyki wci nale do najpopularniejszych ro lin ozdobnych. Gatunki z rodzaju Cymbidium na holenderskiej giełdzie kwiaciarskiej w 2008 roku zaj ły 7. pozycj pod wzgl dem warto ci obrotu, głównie z uwagi na ich niezwykł trwało, która przewy sza nawet anturium [TRELKA 2008]. W uprawie storczyków od dawna jednak problemem jest infekcja wirusowa, co zwi zane jest ze sposobem ich rozmna ania. Storczyki nale do jednych z pierwszych ro lin, które rozmna ano przez kultury tkankowe i ju MOREL i MARTIN w 1955 roku wykazali, e jest mo liwe otrzymanie ro lin wolnych od wirusów kultywuj c wyizolowane merystemy wierzchołkowe in vitro. Coraz dokładniejsze metody identyfikacji wirusów wykazały jednak, e i w merystemach licznych gatunków ro lin mog si one znajdowa [BUTOWT 1997]. S odmiany, które wci s zawirusowane. Dotyczy to równie storczyków z rodzaju Cymbidium, gdzie u ro lin uzyskanych z meryklonów nadal wyst puj symptomy wiadcz ce o pora eniu przez ORSV i CyMV (wirus pier cieniowej plamisto ci odontoglossum i wirus mozaiki cymbidium) [ALBOUY i in. 1988]. Oprócz wi c izolowania jak najmniejszych fragmentów merystemów, szuka si innych metod eliminowania wirusów, np. przez długotrwałe kultury in vitro czy poddaj c protokormy, lub meryklony chemio- i/lub termoterapii. Cz stym terapeutykiem stosowanym w kulturach in vitro jest syntetyczny analog nukleotydowy rybawiryna (1- -D furanozylo triazolo-karboksyamid,) znany pod nazw handlow Virazol. W powodzeniu usuwania wirusów z zaka onych systemicznie tkanek zasadnicze znaczenie ma budowa merystemu wierzchołkowego [MORI 1977; TOUSSAINT i in. 1983]. Zamierzeniem pracy było uzyskanie wolnych od wirusów ro lin Cymbidium, poprzez wieloletni kultur in vitro meryklonów, z wykorzystaniem chemioterapii in vitro. Meryklony otrzymano poprzez proliferacj i ró nicowanie protokormów powstałych z merystemów apikalnych pobranych z ro lin pora onych przez ORSV z wyra nymi objawami systemicznymi. Materiał i metody

195 218 A. Pindel, T. Cybularz-Urban Procedur otrzymywania meryklonów oparto na metodzie szybkiego klonalnego rozmna ania opracowanej przez MORELA [1960, 1964, 1965] i WIMBERGA [1963]. Ro liny Cymbidium, z których pobierano meystemy wierzchołkowe do zainicjowania kultury in vitro, posiadały wyra ne objawy systemiczne pora enia wirusem ORSV. Szczególn uwag po wi cono wi c sterylizacji eksplantatów. Młode p dy długo ci około 10 cm, wyrastaj ce u podstawy pseudobulw, po odci ciu górnej cz ci li ci na _ wysoko ci zanurzano na 1 s w 70% etanolu i przeci gano nad palnikiem. Płomie gaszono przez zanurzenie eksplantatu w 5% roztworze podchlorynu sodu. Nast pnie spomi dzy li ci wyłuskiwano p ki i umieszczano w 3% roztworze podchlorynu na 10 min, po czym przemywano kilkakrotnie steryln wod destylowan. Dalsz izolacj wierzchołkowego merystemu prowadzono w komorze laminarnej ze sterylnym przepływem powietrza, a merystemy wielko ci ok. 5 mm z zawi zkami 2 li ci wkładano jeszcze na kilka minut do 0,5% roztworu podchlorynu sodu. Nast pnie wycinano jak najmniejsze skrawki (ok. 1 mm) tkanki merystematycznej i wykładano je na po ywki stałe o składzie _ podstawowej po ywki MS [MURASHIGE, SKOOG 1962] z dodatkiem 1 mg dm -3 IAA, 30 g dm -3 sacharozy i utwardzonej 0,8% agarem Difco. Kultury prowadzono w temp. 25 C ±2 C, przy wilgotno ci wzgl dnej wynosz cej ok. 70%, w warunkach fotoperiodu 16 h/8 h. ródłem wiatła były lampy fluorescencyjne o białej barwie i nat eniu promieniowania 80 mol m -2 sek -1. Po około 8 tygodniach rozwijaj ce si protokormy pasa owano na po ywk płynn zawieraj c 25 ppm Virazolu przes czonego przez filtr Sartoriusa. Po ywka zawierała soli MS, pełny skład witamin oraz 20 g dm -3 sacharozy, 0,3 mg dm -3 IAA, 1,0 mg dm -3 KIN. Odczyn ph ustalono na poziomie 5,3. Kolbki z protokormami wytrz sano przy amplitudzie 3/100 obr./min. Pasa e na wie e po ywki o takim samym składzie przeprowadzano w odst pach 3-4 tyg. Po 3 miesi cach, celem regeneracji ro lin, protokormy wykładano na po ywki utwardzone 0,8% agarem Difco, z obni on do 5 g dm -3 sacharoz oraz dodatkiem 3 g dm -3 w gla aktywowanego. Meryklony te stanowiły kontrol (K 0 ) w odniesieniu do ro lin, które umieszczano na po ywkach o takim samym składzie, lecz z ró nymi kombinacjami Virazolu: 10 ppm, 25 ppm oraz 30 ppm (kombinacje oznaczono odpowiednio V 10, V 25 i V 30 ). Równolegle prowadzono wi c 4 kombinacje. Regeneruj ce i namna aj ce si meryklony rozdzielano i umieszczano na nowych po ywkach, wg schematu do wiadczenia, uzyskuj c reprezentatywn liczb ro lin (min. 10), umo liwiaj c przeprowadzenie bada na obecno wirusa w tkankach. Kultury meryklonów w szkle prowadzono przez 7 lat (14 pasa y), po czym ukorzenione ro liny posadzono do doniczek w mieszanin torfu i perlitu (w stosunku 1:1) i aklimatyzowano do warunków szklarniowych. Testem biologicznym obj to: ro liny donorowe, kultywowane in vitro oraz aklimatyzowane w szklarni. U yto w tym celu ro liny wska nikowej Nicotiana tabacum Xanthi nc. w stadium 4-5 dobrze rozwini tych li ci. Li cie inokulowano sokiem z pobieranych próbek ka dej kombinacji. Pierwszy test biologiczny przeprowadzono na zregenerowanych w szkle ro linach (fot. 1), czyli po około 1 roku od zainicjowania kultur. Dla ro lin kultywowanych in vitro po 7 latach, a tak e zaaklimatyzowanych w szklarni, przeprowadzono testy biologiczny i serologiczny DAS ELISA z u yciem alkalicznej fosfatazy i surowic diagnostycznych przeciw ORSV (firma Loewe Biochemica GmbH). Absorbancj zmierzono fotometrem Labsystems Multiskan MS przy długo ci fali 405 nm. Próby powtarzano dwukrotnie dla ka dej z badanych ro lin. Wyniki i dyskusja Test biologiczny przeprowadzony po 1 roku od zainicjowania kultury cymbidium

196 PRÓBY ELIMINACJI WIRUSA PIER CIENIOWEJ PLAMISTO CI z merystemu apikalnego wykazał, e mimo dodatku do po ywki płynnej (w etapie namna ania protokormów) Virazolu, wszystkie zregenerowane ro liny były zainfekowane wirusem ORSV. Li cie tytoniu po 1 tygodniu od zaka enia ich sokiem testowanych ro lin wykazały reakcj w postaci drobnych, nekrotycznych plamek podobn do tej jak opisał PAUL [1975] charakteryzuj c N. tabacum jako ro lin wska nikow w infekcji ORSV. Tabela 1; Table 1 Wpływ długoletniej kultury in vitro oraz dawek Virazolu na ograniczenie infekcji ORSV u miesza ca Cymbidium w kolejnych latach kultury i aklimatyzacji w szklarni The effect of long-term culture and various Virazol doses on the ORSV infection limitation during subsequent years of in vitro culture and acclimatisation of Cymbidium hybrid Po ywka Medium Lata Years zdrowe* (szt./%) healtly (no./%) K 0 V 10 V 25 V 30 Z With ORSV (szt.; no.) zdrowe (szt./%) healtly (no./%) Z With ORSV (szt.; no.) zdrowe (szt./%) healty (no./%) Z With ORSV (szt.; no.) zdrowe (szt./%) healtly (no./%) Z With ORSV (szt.; no.) 7 42/ / / / / /64 9 7/ / / /62 8 6/ / / /63 7 4/ / / / /81 6 K 0? soli MS; MS salts, witaminy MS; MS vitamins, 5 g dm -3 sacharoza; 5 g dm -3 sucrose, 0,3 mg dm -3 IAA, 1,0 mg dm -3 KIN, 3 mg dm -3 w giel aktywowany; 3 mg dm -3 activated charcoal; 0.8% Difco agar V 10 K 0 z 10 ppm Virazolu; K 0 with 10 ppm Virazole V 25 K 0 z 25 ppm Virazolu; K 0 with 25 ppm Virazole V 30 K 0 z 30 ppm Virazolu; K 0 with 30 ppm Virazole * oparto na wynikach testu biologicznego i testu DAS-ELISA, w którym odczyty absorbancji osi gn ły warto ci w nast puj cych przedziałach: próby zdrowe 0,003-0,084, próby pora one 3,331-1,899, kontrole negatywne 0,011-0,023, kontrole pozytywne 2,873-3,008; based on results obtained following sap inoculation of indicator plants and enzyme linked immunosorbent assay (DAS-ELISA) in which the absorbance values reached appriopriate ranges: for healthy samples , for infected samples , for negative control , for positive control Niewielkie rozmiary pobieranych merystemów apikalnych, sprzyjaj ce osi ganiu wysokiego poziomu wolnych od wirusa protokormów u Cymbidium [MOREL 1960, 1964; WALKEY, WEBB 1968; MORI 1977; TOUSSAINT i in. 1983, 1984, 1993; LIM i in. 1993] oraz zastosowane Virazolu w dawce 25 ppm okazały si niewystarczaj ce dla uzyskania zdrowych ro lin. Nieskuteczno eliminacji wirusa po roku kultywacji mogła by zwi zana z siln systemiczn infekcj wirusow ro lin donorowych (towarzysz ca jej obecno innych patogenów m.in. grzybowych sprawiała ogromne trudno ci we wprowadzeniu tak silnie pora onych sto ków wzrostu w kultury in vitro). TOUSSAINT i in. [1993] otrzymali wprawdzie wszystkie wolne od wirusów ro liny Cymbidium, ale regenerowali je z wyselekcjonowanego, zdrowego protokormu. Uwolnienie cz ci meryklonów od ORSV nast piło w trakcie siedmioletniej kultury in vitro tab. 1. Stan odwirusowania czterech grup regeneratów miesza ca Cymbidium w kolejnych latach uprawy w szklarni przedstawia równie tab. 1. Umieszczono w niej wyniki testu biologicznego potwierdzone testem DAS-ELISA, w którym odczyty absorbancji osi gn ły warto ci w nast puj cych przedziałach: próby

197 220 A. Pindel, T. Cybularz-Urban zdrowe 0,003-0,084, próby chore 3,331-1,899, kontrole negatywne 0,011-0,023, kontrole pozytywne 2,873-3,008. W fazie do wiadczenia prowadzonego w warunkach in vitro efekt długotrwałej kultury był zbli ony w skutkach do tego, jaki dała dawka 25 ppm Virazolu (ponad 60% zdrowych ro lin); ni sze, a tak e wy sze st enie dało gorszy efekt odwirusowania, jakkolwiek nie były to du e ró nice (do 10%). Od 8-go roku ro liny rosły ju w szklarni, i jak wida z danych w tabeli niezbyt dobrze znosiły aklimatyzacj, gdy corocznie notowano znaczne wypady, spowodowane głównie du wra liwo ci młodych ro lin cymbidium na patogeny [TRELKA 2008], a tak e prawdopodobnym brakiem symbiontów korzeniowych [CHANG 2007]. Podobne zjawisko obserwowano zwłaszcza u chorych regeneratów storczyka z rodzaju Cattleya w kulturach in vitro i w czasie ich aklimatyzacji do warunków szklarniowych [CYBULARZ-URBAN, HANUS- FAJERSKA 2008]. W ko cowym etapie do wiadczenia wykazano, e najwy sza dawka Virazolu (30 ppm) zaskutkowała w pó niejszym rozwoju ro lin lepsz ich kondycj (prawie 81% zdrowych) i podobnie jak na po ywce kontrolnej, około 36% przetrwało do ko ca do wiadczenia. Wnioski 1. Wszystkie regeneranty uzyskane po roku prowadzenia kultury były pora one wirusem ORSV. 2. Długotrwałe kultury in vitro z wielokrotnymi pasa ami na po ywki bez dodatku Virazolu skutkowały ponad 60-procenow skuteczno ci odwirusowania ro lin regenerowanych z zainfekowanego materiału. 3. Dawka Virazolu wynosz ca 30 ppm pozwoliła uzyska około 80% zdrowych regenerantów miesza ca Cymbidium. Połow zdrowych ro lin otrzymano na po ywkach z tym antymetabolitem aplikowanym w najni szej dawce (10 ppm). Literatura ALBOUY J., FLOUZAT C., KUSIAK C., TRONCHET M Eradication of orchid viruses by chemotherapy from in vitro cultures of Cymbidium. Acta Hort. 234: BUTOWT R Plazmodesmy komórki ro linnej współczesne pogl dy na budow i funkcj. Wiadomo ci Botaniczne 41(2): CHANG D.C.N The screening of orchid mycorrizal fungi (OMF) and their application, w: Orchid biotechnology. W.H. Chen i H.H. Chen - red. World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd.: CYBULARZ-URBAN T., HANUS-FAJERSKA E The morphogenetic capability and the viability of regenerants in micropropagated orchid hybrids infected with viral pathogens. Folia Hort. 20(2): LIM S.T. WONG S.M., GOH C. J Elimination of Cymbidium mosaic virus and Odontoglossum ringspot virus from orchids by meristem culture and thin section culture with chemotherapy. Annals of Applied Biology 122(2): MOREL G Producing virus-free Cymbidiums. Am. Orchid Soc. Bull. 29: MOREL G Tissue culture - a new means of clonal propagation of orchids. Am.

198 PRÓBY ELIMINACJI WIRUSA PIER CIENIOWEJ PLAMISTO CI Orchid Soc. Bull. 31: MOREL G Clonal propagation of orchids by meristem culture. Cymbidium Soc. News 20: 3-11 MOREL G., MARTIN C Geurison des plantes atteintes de maladies a virus; par culture de meristemes apicaux. Report of XIV Intern. Hort. Congress, Netherlands: MORI K Localization of viruses in apical meristem and production of virus-free plants by means of meristem and tissue culture. Acta Hort. 78: MURASHIGE T., SKOOG F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: PAUL H.L Odontoglossum ringspot virus C.M.J / A.A.B. Description of Plant Viruses No TOUSSAINT A., DEKEGEL D., VANHEULE G Detection and localization of Odontoglossum ringspot virus in the cauline meristems of infected Cymbidium by electron microscopy. Archives Internationales de Physiologie et de Biochimie 91(4): TOUSSAINT A., DEKEGEL D., VANHEULE G Distribution of Odontoglossum ringspot virus in apical meristems of infected Cymbidium cultivars. Physiological Plant Pathology 25: TOUSSAINT A., KUMMERT J., MAROQUIN C., LEBURN A., ROGGEMANS J Use of Virazole to eradiate Odontoglossum ringspot virus from in vitro cultures of Cymbidium Sw. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 32: TRELKA T Cymbidium storczyk niedoceniany przez polskich producentów. Hasło Ogrodnicze 10: WALKEY D.G. A., WEBB M.J.W Virus in plant apical meristem. J. Gen. Virology 3: WIMBER D.E Clonal multiplication of Cymbidiums trough tissue culture of the shoot meristem. Am. Orchid Soc. Bull. 32: Słowa kluczowe: storczyki, Cymbidium, chemioterapia, Virazol, długoterminowe kultury in vitro Streszczenie Badano mo liwo odwirusowania pora onych wirusem pier cieniowej plamisto ci odontoglossun (ORSV) ro lin cymbidium w warunkach in vitro. Kultury zainicjowano z merystemów wierzchołkowych pobieranych z ro lin z bardzo silnymi objawami systemicznymi z potwierdzon infekcj. Zregenerowane z protokormów ro liny prowadzono przez 7 lat w warunkach in vitro wielokrotnie pasa uj c na po ywki, do których dodano 3 ró ne dawki Virazolu (10, 25 i 30 ppm). Zdrowotno ro lin po 1 roku kultury in vitro, po kolejnych 7 latach w szkle i w 4 nast pnych latach wzrostu w szklarni sprawdzano metod biologiczn oraz testem DAS ELISA. Najwi cej zdrowych ro lin otrzymano przy 30 ppm Virazolu (81%). A TRIAL AT Odontoglossum ringspot virus (ORSV) ELIMINATION FROM Cymbidium sp. CULTIVATED in vitro

199 222 A. Pindel, T. Cybularz-Urban Anna Pindel, Teresa Cybularz-Urban Department of Botany, Agricultural University, Kraków Key words: orchids, Cymbidium, DAS-ELISA, chemiotherapy, Virazol, longterm in vitro cultures Summary The possibilities of virus elimination from cymbidium plants infected with Odontoglossum ringspot virus (ORSV) were investigated under in vitro conditions. Cultures were initiated from shoot apical meristems obtained from plants exhibiting very strong systemic symptoms of virus infection. Plantlets regenerated from protocorms were cultured in vitro for 7 years and were repeatedly transferred on media containing three different doses of Virazol (10, 25 and 30 ppm). Health status of the examined plants was determined after 1 year of in vitro culture, after another 7 years of culture and finally after the next 4 years of growth under glasshouse conditions by using a biological method and DAS ELISA test. The highest number (81%) of healthy, virusfree plants was obtained when 30 ppm of Virazol was applied. Dr hab. Anna Pindel Dr Teresa Cybularz-Urban Katedra Botaniki Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołł taja al. 29 Listopada KRAKÓW apindel@ogr.ar.krakow.pl, tcybularz@ogr.ar.krakow.pl

200 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: INDUKCJA I NAMNA ANIE KALUSA W KULTURACH in vitro L D WIANU SIEWNEGO (Lathyrus sativus L.) ODMIANY DEREK Barbara Piwowarczyk, Anna Pindel Katedra Botaniki, Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołł taja w Krakowie Wst p Ograniczenie stosowania m czek kostnych jako białkowego składnika pasz zwierz cych wymogło zwrócenie uwagi na inne ródła białka, przede wszystkim na ro liny str czkowe. Jedn z takich ro lin jest l d wian siewny, w Polsce znany i uprawiany jedynie w rejonie Podlasia i Lubelszczyzny [MILCZAK i in. 2001; RYBI SKI 2003; RYBI SKI i in. 2005]. L d wian wyró nia si w ród innych ro lin motylkowatych przede wszystkim wysok tolerancj na rodzaj i ph gleby. Ponadto jest odporny na susz i okresowe zalewanie, jak równie na liczne choroby i szkodniki. Ta niezwykła odporno oraz wysoka zawarto białka w nasionach powoduj, e l d wian mo e sta si wa nym ródłem tego składnika w przyszło ci [CAMPBELL i in. 1994]. Poza niew tpliwymi zaletami l d wian posiada niekorzystne cechy, które nale y poprawi. Niezdeterminowany charakter wzrostu, podatno na wyleganie i pó ne dojrzewanie, substancje anty ywieniowe w nasionach ograniczaj upowszechnienie go w uprawie [RYBI SKI i in. 2005]. Wieloletni brak zainteresowania tym gatunkiem ze strony hodowców i rolników sprawił, e obecnie pula zmienno ci genetycznej l d wianu jest bardzo ograniczona [CICHY, RYBI SKI 2007]. Konwencjonaln hodowl mog silnie wesprze nowoczesne techniki biotechnologiczne, zwłaszcza kultury in vitro. Generowana w czasie prowadzenia kultur tkankowych, w szczególno ci tkanki kalusowej, zmienno somaklonalna mo e zosta w przyszło ci wykorzystana do tworzenia nowych, udoskonalonych odmian l d wianu [JAIN 2001]. Chitosan, powszechnie wyst puj cy w naturze biopolimer, jest z powodzeniem wykorzystywany w ró nych dziedzinach ycia, tak e w rolnictwie. W ostatnich latach stwierdzono, e nie tylko chroni ro liny przed infekcjami, ale tak e mo e mie pozytywny wpływ na wzrost i rozwój ro lin [UTHAIRATANAKIJ i in. 2007; LIMPANAVECH i in. 2008]. W zwi zku z trudno ciami regeneracji l d wianu in vitro postanowiono sprawdzi wpływ dodatku chitozanu do po ywek. Prezentowane badania s pierwszymi prowadzanymi na polskiej odmianie l d wianu siewnego. Celem ich było ocenienie zdolno ci tej ro liny do tworzenia i

201 224 B. Piwowarczyk, A. Pindel namna ania tkanki kalusowej. Praca ta prezentuje wyniki uzyskane z próbnych kultur. Materiał i metody W badaniach wykorzystano jedn z dwóch istniej cych na polskim rynku odmian l d wianu siewnego Derek, której nasiona uzyskano od doc. dr. hab. Wojciecha Rybi skiego z Instytutu Genetyki Ro lin PAN w Poznaniu. Eksplantaty pochodziły z siewek rosn cych w warunkach in vitro. Po standardowej sterylizacji, nasiona wykładano do słoików na po ywk wg Murashige i Skoog (MS) pozbawion witamin z dodatkiem 20 g dm -3 sacharozy i zestalon 1,0% agarem technicznym. Słoiki z nasionami umieszczano w fitotronie na wietle (fotoperiod: 16 h dzie i 8 h noc). Z 21-dniowych siewek pobierano trzy rodzaje eksplantatów: fragmenty korzeni (dł. 2-3 mm, 1-2 mm), fragmenty mi dzyw li (dł. 4 mm, 2-3 mm) oraz fragmenty ogonków li ciowych (dł. 2 mm, szer. 2 mm). Po 5 eksplantatów wykładano do kolbek z po ywk MS z dodatkiem 2 mg dm -3 NAA, 2 mg dm -3 kinetyny, 2 mg dm -3 2,4-D (MSI) oraz na po ywk z takim samym zestawem regulatorów wzrostu plus 15 mg dm -3 chitozanu (MSch). Kultury kalusa prowadzone były na wietle i w ciemno ci. Ze wzgl du na ograniczony dost p do materiału ro linnego i wst pny charakter bada, kombinacje zało ono w 2 powtórzeniach. Po 4, 8 i 14 tygodniach oceniano przyrost masy kalusa, jego struktur i barw, wykonano dokumentacj fotograficzn. Na otrzymanych wynikach przeprowadzono analiz statystyczn w programie komputerowym STATISTICA. Wyniki Wysoki procent zaka e bakteryjnych na pocz tku do wiadczenia wymógł wydłu enie czasu sterylizacji nasion w sublimacie do 45 minut, co skutecznie ograniczyło wyst powanie infekcji. Kalus pojawił si na wszystkich eksplantatach po ok. 15 dniach kultury zarówno na wietle, jak i w ciemno ci. Indukcja tkanki kalusowej była bardzo wydajna i wynosiła 100% dla wszystkich rodzajów eksplantatów. Powstaj ca na wietle tkanka miała barw od jasnozielonej do ciemnozielonej i pocz tkowo zbit struktur, która w trakcie kolejnych pasa y stawała si bardziej krucha i grudkowata. W ciemno ci tworzył si kremowy i ółty kalus o zbitej strukturze. Badane eksplantaty ró niły si znacz co od siebie przyrostem masy kalusa, co potwierdziły obliczenia statystyczne. Stwierdzono bardzo du y wpływ warunków wietlnych na proliferacj tkanki kalusowej. Zdecydowanie najwi ksz mas kalusa po 14 tygodniach zanotowano dla fragmentów mi dzyw li kultywowanych na wietle zarówno na po ywce MS z dodatkiem chitozanu, jak i bez, odpowiednio (1112,9 mg i 1133,8 mg). Równie na ogonkach li ciowych i fragmentach korzeni kalus intensywniej przyrastał na wietle (tab. 1). Przyrost masy kalusa trzech badanych eksplantatów przedstawiono na rys. 1. Nie stwierdzono statystycznie istotnych ró nic we wpływie chitozanu na tym etapie namna anie kalusa. Po 14 tygodniach w kalusie kultywowanym na wietle obserwowano pojawienie si ciemnozielonych grudkowatych rejonów (fot. 1).

202 INDUKCJA I NAMNA ANIE KALUSA W KULTURACH in vitro Rys. 1. Przyrost masy kalusa (mg) a) na wietle, b) w ciemno ci w kolejnych tygodniach kultury Fig. 1. Increase of callus weight (mg) a) in light, b) in dark in successive weeks of culture Przyrost masy (mg) kalusa po 14 tygodniach kultury (litery oznaczaj statystycznie istotne ró nice przy =0,05) Increase of callus weigth (mg) after 14 weeks of culture Tabela 1; Table 1

203 226 B. Piwowarczyk, A. Pindel Eksplantat Explant (letters mark significant difference at =0.05) Po ywka Medium Warunki Condition Przyrost masy kalusa Increase of callus weight Mi dzyw le; Internode MSI wiatło; light 1133,8 a Mi dzyw le; Internode MSch wiatło; light 1112,9 a Ogonek; Petiole MSch wiatło; light 508,0 b Ogonek; Petiole MSI wiatło; light 442,2 bc Korze ; Root MSI wiatło; light 352,8 cd Korze ; Root MSch wiatło; light 308,6 d Korze ; Root MSch ciemno ; darkness 183,0 e Ogonek; Petiole MSI ciemno ; darkness 133,1 e Ogonek; Petiole MSch ciemno ; darkness 109,4 e Mi dzyw le; Internode MSch ciemno ; darkness 83,6 e Korze ; Root MSI ciemno ; darkness 80,3 e Mi dzyw le; Internode MSI ciemno ; darkness 63,8 e Fot. 1. Photo 1. Kalus kultywowany przez 14 tygodni na wietle (strzałki - kalus grudkowaty) Callus after 14 weeks of culture in light (arrows nodular callus) Dyskusja W przeprowadzonym do wiadczeniu indukcja kalusa nast powała po ok. 2 tygodniach bez wzgl du na warunki wietlne kultury. Podobne rezultaty uzyskiwano równie dla innych genotypów i rodzajów eksplantatów l d wianu [GHARYAL, MAHESHWARI 1983; ROY i in. 1992; ZAMBRE i in. 2002]. Pomimo, e wiele wcze niejszych bada w kulturach in vitro wskazywało na lepsz proliferacj kalusa w ciemno ci, w przypadku niniejszej pracy kultywacja na wietle dawała znacznie lepsze wyniki. Uzyskane wyniki znajduj potwierdzenie w publikacjach innych badaczy, którzy tkank kalusow l d wianu równie namna ali na wietle [GHARYAL, MAHESHWARI 1983; ROY i in. 1992; ZAMBRE i in. 2002]. Zastosowana w niniejszych do wiadczeniach po ywka MS z dodatkiem NAA, 2,4-D i kinetyny dała bardzo dobre rezultaty w przypadku kalusogenezy. Jakkolwiek cytowani wy ej autorzy u yli, równie z dobrym skutkiem, po ywki podstawowej B5, z innymi kombinacjami regulatorów wzrostu, jednak dla innych odmian i eksplantatów. Potwierdza si wi c konieczno indywidualnego

204 INDUKCJA I NAMNA ANIE KALUSA W KULTURACH in vitro doboru po ywki i zestawu regulatorów wzrostu dla poszczególnych genotypów ro lin, a nawet rodzajów eksplantatów. W prezentowanym do wiadczeniu zdecydowano si zastosowa jako dodatek do po ywki chitozan. Sugeruje si, e zwi zek ten pobudza wzrost i ró nicowanie tkanek w kulturach in vitro [UDDIN i in. 2004], w kulturach Vitis vinifera L. powodował lepszy wzrost ro lin [BARKA i in. 2004]. Stymulował równie powstawanie podobnych do protokormów struktur w kulturach storczyków [NGE i in. 2006]. W naszym przypadku nie stwierdzono istotnego wpływu chitozanu na indukcj kalusa. Mo e by to wynikiem le dobranego st enia, jak równie zbyt krótkim czasem działania czynnika. Po kilku pasa ach w kalusie na wietle pojawiły si ciemnozielone skupienia grudkowatej tkanki, które najprawdopodobniej były tworz cymi si centrami merystematycznymi wiadcz cymi o mo liwo ci organogenezy kalusa w przyszło ci. ZAMBRE i in. [2002] uzyskali podobn tkank z p ków na po ywce B5 wzbogaconej w TDZ i IAA, z której po przeniesieniu na po ywk ró nicuj c, z powodzeniem regenerowali ro liny. Wnioski 1. Na wszystkich badanych rodzajach eksplantatów l d wianu siewnego odmiany Derek wyst piła 100% indukcja kalusa. 2. Silniejszy przyrost masy kalusa obserwowano na wietle. 3. Na obecnym etapie bada nie stwierdzono wyra nego wpływu chitozanu na namna anie tkanki kalusowej l d wianu. Literatura BARKA E.A., EULLAFFROY P., CLEMENT C., VERNET G Chitosan improves development, and protects Vitis vinifera L. against Botrytis cinerea. Plant Cell Rep. 22: CAMPBELL C.G., MEHRA R.B., AGRAWAL S.K., CHEN Y.Z., ABD EL MONEIM A.M., KHAWAJA H.I.T., YADOV C.R., TAY J.U., ARAYA W.A Current status and future strategy in breeding grasspea (Lathyrus sativus). Euphytica 73: CICHY H., RYBI SKI W Ocena zdolno ci plonowania wybranych mutantów l d - wianu siewnego (Lathyrus sativus L.) w do wiadczeniach polowych. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 522: GHARYAL P.K., MAHESHWARI S.C Genetic and physiological influences on differentiaion in tissue cultures of a legume, Lathyrus sativus. Theor. Appl. Genet. 66: JAIN S.M Tissue culture-derived variation in crop improvement. Euphytica 118: LIMPANAVECH, P., CHAIYASUTA, S., VONGPROMEK, R., PICHYANGKURA, R., KHUNWASI, C., CHADCHAWAN, S., LOTRAKUL, P., BUNJONGRAT, R., CHAIDEE, A., AND BANGYEEKHUN T Chitosan effects on floral production, gene expression, and anatomical changes in the Dendrobium orchid. Scientia Horticulturae 116: MILCZAK M., PEDZINSKI M., MNICHOWSKA H., SZWED-URBAS K., RYBI SKI W Creative breeding of grasspea (Lathyrus sativus L.) in Poland. Lathyrus Lathyrism Newsletter 2:

205 228 B. Piwowarczyk, A. Pindel MURASHIGE T., SKOOG F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 18: NGE K.L., NEW N., CHANDRKRACHANG S., STEVENS W.F Chitosan as a growth stimulator in orchid tissue culture. Plant Sci. 170: ROY P.K., BARAT G.K., MEHTA S.L In vitro plant regeneration from callus derived from root explants of Lathyrus sativus. Plant Cell, Tiss. and Organ. Cult. 29: RYBI SKI W Mutagenesis as a tool for improvement of traits in grasspea (Lathyrus sativus L.). Lathyrus Lathyrism Newsletter 3: RYBI SKI W., PIETRUSZEWSKI S., KORNARZY SKI K Wpływ synergistycznych traktowa polem magnetycznym i chemomutagenem (MNU) na zmienno cech struktury plonu l d wianu siewnego (Lathyrus sativus L.). Acta Agrophysica 5(1): UDDIN A.F.M.J., HASHIMOTO F., SHIMIZU K., SAKATA Y Monosaccharides and chitosan sensing in bud growth and petal pigmentation in Eustoma grandiflorium (Raf.) Shinn. Sci. Horti. 100: UTHAIRATANAKIJ A., TEIXEIRA DA SILVA J.A., OBSUWAN K Chitosan for improving orchid production and quality. Orchid Science and Biotechnology 1: 1-5. ZAMBRE M., CHOWDHURY B., KUO Y.-H., VAN MONTAGU M., ANGENON G., LAMBEIN F Prolific regeneration of fertile plants from green nodular callus induced from meristematic tissues in Lathyrus sativus L. (grass pea). Plant Science 163: Słowa kluczowe: chitozan, eksplantaty, kultury in vitro, l d wian siewny Streszczenie L d wian siewny jest mało znan w Polsce, grubonasienn ro lin str czkow, charakteryzuj c si du zawarto ci białka w nasionach. Spo ród innych ro lin str czkowych wyró nia si niezwykł tolerancj na rodzaj i ph gleby oraz odporno ci na susz i choroby. Zaniedbany jednak e przez hodowców l d wian wymaga poprawienia pewnych niekorzystnych cech, takich jak: du a podatno na wyleganie, niezdeterminowany charakter wzrostu czy substancje o charakterze anty ywieniowym. Pomocne w tworzeniu nowych odmian tego gatunku mog si okaza techniki in vitro. W badaniach oceniano wpływ: rodzaju eksplantatu (korzenie, mi dzyw la, ogonki li ciowe), warunków prowadzenia kultury ( wiatło, ciemno ) oraz chitozanu na indukcj i wzrost kalusa. Po około 15 dniach kultury kalus pojawił si na wszystkich rodzajach eksplantatów zarówno na wietle, jak i w ciemno ci. Najwi kszy przyrost masy tkanki kalusowej obserwowano na po ywce zarówno z dodatkiem, jak i bez chitozanu na mi dzyw lach kultywowanych na wietle. CALLUS INDUCTION AND PROLIFERATION IN in vitro CULTURE OF GRASSPEA (Lathyrus sativus L.) DEREK Barbara Piwowarczyk, Anna Pindel Department of Botany, Agricultural University, Kraków Key words: chitosan, explants, grasspea, in vitro culture

206 INDUKCJA I NAMNA ANIE KALUSA W KULTURACH in vitro Summary Grasspea is a grain legume with high content of protein in seeds. It is not well known in Poland. It shows high tolerance to the type kind and ph of soils as well as resistance to drought and diseases that is extraordinary among legumes. Neglected by plants breeders grasspea needs improving some undesirable features such as: prostrate plant habit, indeterminate growth and antinutritional substances in seeds. In vitro techniques may be helpful in creating new varieties of this species. The influence of different explants (roots, internodes, petioles), culture conditions (light, dark) and chitosan on the induction and proliferation of callus was investigated. The induction of callus took place after 15 days of culture in light or in dark. The biggest increase in the weight of callus was observed on the internodes in the medium both with and without chitosan cultivated in light. Mgr in. Barbara Piwowarczyk Katedra Botaniki Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołł taja al. 29 Listopada KRAKÓW piwowarczykb@ogr.ar.krakow.pl

207 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: WST PNE BADANIA NAD KULTUR in vitro IZOLOWANEGO BIELMA PRZEDSTAWICIELI RODZAJU Triticum L. Marzena Popielarska-Konieczna 1, Izabela Marci ska 2, Piotr Nowakowski 1 1 Zakład Cytologii i Embriologii Ro lin, Uniwersytet Jagiello ski w Krakowie 2 Instytut Fizjologii Ro lin im. F. Górskiego PAN w Krakowie Wst p Bielmo (endosperma) jest tkank o ró nym pochodzeniu i ploidalno ci, pełni c funkcj od ywcz dla zarodka. U wi kszo ci rozmna aj cych si płciowo taksonów Angiospermae powstaje w wyniku podwójnego zapłodnienia, przy zachowanym stosunku genomów matczynych do ojcowskich 2:1, a genom ma wielko 3C. Eksperymenty z zapłodnieniem in vitro izolowanej komórki jajowej i komórki centralnej, w wyniku których uzyskano niezale ny rozwój zarodka i bielma wykazały, e bielmo mo e si rozwija poza obr bem tkanek matecznych i bez obecno ci zarodka [KRANZ, KUMLEHN 1999]. Dodatkowo, izolowane niedojrzałe i dojrzałe bielmo ró nych gatunków ro lin w kulturach in vitro ulega proliferacji i ró nicowaniu, a wiele spo ród zregenerowanych organów i ro lin posiada genom 3C [THOMAS, CHATURVEDI 2008]. Celem praktycznym kultur in vitro izolowanego bielma jest uzyskanie ro lin triploidalnych, wa nych ekonomicznie, z omini ciem procesu krzy owa mi dzy taksonami o ró nym stopniu ploidalno ci. Spo ród kilkudziesi ciu gatunków ro lin okrytonasiennych, u których udało si uzyska proliferacj bielma, ro liny jednoli cienne stanowi bardzo nieliczn grup i jedynie w przypadku ry u (Oryza sativa) zanotowano regeneracj ro lin [NAKANO i in. 1975]. W prezentowanej pracy przedstawiono wyniki wst pnych bada nad kultur in vitro izolowanego bielma zró nicowanych pod wzgl dem ploidalno ci przedstawicieli rodzaju Triticum L. Materiał ro linny Materiały i metody W do wiadczeniu wykorzystano ziarniaki pszenicy (tab. 1) uzyskane z Instytutu Fizjologii Ro lin PAN w Krakowie, Instytutu Hodowli i Aklimatyzacji Ro lin (IHAR) w Radzikowie oraz w Krakowie, a tak e z Weizmann Institute of Science w Rehovot (Izrael). Ro liny wykorzystane w do wiadczeniu były hodowane w wazonach wypełnionych gleb o składzie: 3:2:1 (ziemia ogrodnicza:torf:piasek), umieszczonych w komorze szklarniowej do fazy kwitnienia, w temperaturze 20/17 C (dzie /noc), przy fotoperiodzie 16 h/8 h (dzie /noc). W badaniach testowano dojrzałe i niedojrzałe bielmo

208 232 M. Popielarska-Konieczna, I. Marci ska, P. Nowakowski ziarniaków. Dojrzałe bielmo izolowano z prawidłowo wykształconych ziarniaków, za niedojrzałe - z ziarniaków w 5 do 12 dni po zapyleniu (DAP, ang. days after pollination). Gatunki i odmiany pszenicy u yte w do wiadczeniu Species and cultivars of wheat used in experiment Tabela 1; Table 1 Gatunek (poziom ploidalno ci, liczba chromosomów) Taxon (ploidy level, chromosome number) T. monococcum L. (diploid, 2n=2 =14) T. durum DESF. (tetraploid, 2n=4 =28) T. aestivum L. (heksaploid, 2n=6 =42) Kultury in vitro Odmiany jare Spring wheat linie; lines: TMM14 TMM25 Khapli, Vernal Jasna, Hewilla, Torka, Cytra Odmiany ozime Winter wheat Tonacja, Grana, Kobra Pochodzenie ziarniaków Source of grains Instytut Nauki Weizmanna w Izraelu Weizmann Institute of Science, Izrael IHAR w Radzikowie i Krakowie; Plant Breeding and Acclimatization Institute - Radzików, Kraków IHAR w Radzikowie i Krakowie; Plant Breeding and Acclimatization Institute - Radzików, Kraków Instytut Fizjologii Ro lin im. F. Górskiego PAN w Krakowie; Institute of Plant Physiology of Polish Academy of Sciences, Kraków Dojrzałe bielmo pochodziło z trzech odmian heksaploidalnej pszenicy (Triticum aestivum), dwóch jarej ( Jasna, Torka ) i jednej ozimej ( Tonacja ). Ziarniaki były sterylizowane przez 10 min w 50% roztworze ACE, płukane czterokrotnie steryln wod destylowan i pozostawiane w wodzie przez 24 h. Nast pnie z ziarniaków izolowano bielmo. W czasie izolacji usuwano perykarp i zarodek. Niedojrzałe bielmo pochodziło z czterech odmian jarej i dwóch odmian ozimej pszenicy T. aestivum, dwóch jarych odmian T. durum oraz dwóch linii T. monococcum. Niedojrzałe ziarniaki sterylizowano przez 15 min w 15% roztworze ACE. Odcinano mikropylarn cz ziarniaka (zawieraj c zarodek), usuwano błoniasty nucelus i perykarp. Eksplantaty wykładano na po ywki zestalone agarem na płytki Petriego o rednicy 60 mm. Po ywka podstawowa MS [MURASHIGE, SKOOG 1962] zawieraj ca 3% sacharoz, wzbogacona była regulatorami wzrostu: thidiazuronem (TDZ), 2,4-D i kinetyn, w st eniach od 1 do 5 mg dm -3 oraz homobrassinolidem (HBL) o st eniu 0,005 mg dm -3 (tab. 2). Kultury były prowadzone na wietle (16/8 h, dzie /noc, wiatło fluorescencyjne białe, mol fotonów m -2 s -1 ) lub w ciemno ci, w temp. 26 ±3 C. Pasa przeprowadzano co 3 tygodnie. Analiza histologiczna w mikroskopie wietlnym i skaningowym Ziarniaki i fragmenty bielma z kultur utrwalano w 5% glutaraldehydzie (roztwór w 0,1 M buforze fosforanowym, ph=7,2). Eksplantaty zatopione w ywicy syntetycznej Technovit 7100 krojono na skrawki półcienkie i barwiono bł kitem toluidyny. Eksplantaty przeznaczone do obserwacji w mikroskopie skaningowym (SEM) suszono w punkcie krytycznym, napylano złotem (Jeol JFC-1100 E) i obserwowano w mikroskopie skaningowym (HITACHI S-4700).

209 WST PNE BADANIA NAD KULTUR in vitro IZOLOWANEGO BIELMA Kultury in vitro Wyniki i dyskusja Ogółem wyizolowano bielmo z 670 ziarniaków: 610 niedojrzałych i 60 dojrzałych. Nie obserwowano reakcji eksplantatów w przypadku bielma izolowanego z dojrzałych ziarniaków oraz z niedojrzałych ziarniaków, izolowanych w czasie DAP. Bielmo pozostawało białe, nie powi kszało si. Wokół eksplantatów obserwowano jedynie otoczk powstał z wypływaj cej skrobi. Te wyniki potwierdzaj hipotez, e warstwy skrobiono ne dojrzałego bielma zbó s tkank martw, a zmiany fizjologiczne uniemo liwiaj ce podj cie proliferacji nast puj ju pocz wszy od ok. 12 DAP [LOPES, LARKINS 1993]. Reakcj na warunki kultury młodszego bielma, izolowanego w czasie 5-8 DAP, obserwowano ju po 4-7 dniach kultury. Fragmenty eksplantatów (bardzo rzadko całe eksplantaty), powi kszały si, a na ich powierzchni były widoczne struktury przypominaj ce kalus (fot. 1A-D). Rejony proliferuj cego bielma wyra nie odró niały si od obszarów tkanki, która nie reagowała na warunki kultury. Najwy szy procent induk-cji uzyskano w przypadku eksplantatów pochodz cych z odmian ozimych T. aestivum, hodowanych w ciemno ci, na po ywce MS zawieraj cej 1 mg dm -3 2,4-D i TDZ (tab. 2). Te dwa regulatory wzrostu bardzo efektywnie indukowały proliferacj dojrzałego bielma Actinidia deliciosa. W badaniach GÓRALSKIEGO i in. [2005] zastosowanie do po ywki TDZ wywoływało regeneracj p dów przybyszowych z kalusa bielmowego kiwi. Obecno 2,4-D oraz kinetyny w po ywce w czasie kultury niedojrzałego bielma ry u [NAKANO i in. 1975] powodowało namna anie tkanki kalusowej oraz regeneracj ro lin. Jednak w przypadku bielma ry u, oprócz wymienionego zestawu regulatorów wzrostu, do po ywki dodano tak e ekstrakt z dro d y, który mógł by czynnikiem decyduj cym o powodzeniu eksperymentu.

210 234 M. Popielarska-Konieczna, I. Marci ska, P. Nowakowski Tabela 2; Table 2 Indukcja proliferacji w kulturach 560 bielm izolowanych w czasie 5-10 DAP; 1 - liczba wyło onych na po ywk eksplantatów; 2 - liczba eksplantatów daj cych odpowied (%) Proliferation induction in the culture of 560 isolated endosperms isolated 5-10 DAP; 1 - number of explants placed on the medium (%); 2 - number of responded explants (%) Gatunek i odmiana lub linia Taxon and cultivar or line Regulatory wzrostu; Plant growth regulators 2 mg dm -3-2,4-D +5 mg dm -3 - kinetyna; kinetin 1 mg dm -3 2,4-D +1 mg dm -3 TDZ 0,005 mg dm -3 HBL T. aestivum cv. Grana (42,5) - - T. aestivum cv. Kobra (67,5) (73) 45 - T. aestivum cv. Cytra (30) - - T. aestivum cv. Hewilla 10 1 (10) 20 3 (15) - - T. aestivum cv. Jasna (4) - - T. aestivum cv. Torka (30) - - T. durum cv. Khapli 15 6 (40) (32) - - T. durum cv. Vernal (42) (46) - - T. monococcum linia TMM14 T. monococcum line TMM14 T. monococcum linia TMM25 T. monococcum line TMM

211 WST PNE BADANIA NAD KULTUR in vitro IZOLOWANEGO BIELMA Fot. 1. Photo 1. Wyizolowane bielmo T. aestivum L. odmiany Grana (A, B) i Kobra (C-D) po 7-14 dniach kultury na po ywce zawieraj cej 1 mg dm -3 2,4-D i TDZ; widoczne rejony bielma, które uległy proliferacji (strzałki) oraz bielmo bez widocznych zmian od chwili izolacji (gwiazdki). Podziałka: 200 m Isolated endosperm of T. aestivum L. cv. Grana (A, B) and Kobra (C-D) after 7-14 days of culture on medium supplemented with 1 mg dm -3 2,4-D +1 mg dm -3 TDZ; proliferating endosperm areas (arrows); non-proliferating endosperm (asterisks). Bar: 200 m Z trzech wykorzystanych gatunków pszenicy, najlepsze wyniki indukcji proliferacji bielma uzyskano w przypadku niedojrzałego bielma heksaploidalnego taksonu T. aestivum, przy czym lepsz odpowied eksplantatów stwierdzono u odmian ozimych (73% u odmiany Kobra ) ni u jarych (najwy sza u odmiany Torka, 30%). Znacznie słabsza odpowied miała miejsce w przypadku T. durum (46% reaguj cych bielm u odmiany Vernal ), a w izolowanym niedojrzałym bielmie T. monococcum nie odnotowano adnej odpowiedzi. W przypadku kultury niedojrzałych bielm T. aestivum i T. durum prowadzonych na wietle, nawet w obecno ci HBL nie stwierdzono adnej reakcji.

212 236 M. Popielarska-Konieczna, I. Marci ska, P. Nowakowski Analiza histologiczna w mikroskopie wietlnym i skaningowym Preparaty histologiczne z ziarniaków pobieranych ju w czasie 6 DAP ujawniły obecno bielma komórkowego (fot. 2A), co jest zgodne z doniesieniami MARESA i in. [1973]. Jedynie w centralnej cz ci bielma stwierdzono pojawienie si niekompletnych jeszcze cian komórkowych. Podczas obserwacji bielma wyizolowanego i utrzymywanego w kulturze in vitro wykazano ró nice w wygl dzie tkanek. Rejony powi kszone były zło one z komórek zwakuolizowanych, przypominaj cych kalus oraz z komórek wypełnionych obficie ziarnami skrobi (fot. 2B-D). Interesuj ce wydaje si spostrze enie, e komórki bielma, które kontynuowały rozwój i stawały si komórkami skrobiono nymi, były zlokalizowane tylko w rodkowej cz ci rosn cych fragmentów bielma. Nie obserwowano tego typu komórek na powierzchni eksplantatu. Zgodnie z doniesieniem BECRAFT [2001], mo e to sugerowa, e tak e w kulturze in vitro los komórek bielma jest uzale niony od ich poło enia. W obszarach, które nie kontynuowały proliferacji, były widoczne niewielkie komórki bielma (fot. 2B, D). Małe komórki, niekiedy obkurczone, obserwowano równie na powierzchni komórek, które podj ły rozwój (fot. 2C). Ró nicowanie niedojrzałych komórek bielma w kierunku komórek wypełnionych ziarnami skrobi obserwowano tak e w kulturach bielma ry u [NAKANO i in. 1975].

213 WST PNE BADANIA NAD KULTUR in vitro IZOLOWANEGO BIELMA

214 238 Fot. 2. Photo 2. M. Popielarska-Konieczna, I. Marci ska, P. Nowakowski Obrazy preparatów w mikroskopie wietlnym (A-D) i skaningowym (E-H). Fragment ziarniaka 6 DAP (A) z widocznym bielmem komórkowym (b), nucelusem (n) i perykarpem (p). Bielmo wyizolowane w czasie 6 DAP, po 7 dniach kultury na po ywce zawieraj cej 1 mg dm -3 2,4-D+1 mg dm -3 TDZ (B-D); widoczne proliferuj ce fragmenty bielma (du e strzałki), bielmo bez widocznych zmian od momentu inokulacji (gwiazdki), komórki wypełnione ziarnami skrobi (s), zwakuolizowane komórki (k) oraz zniszczone i obkurczone komórki bielma (małe strzałki). Eksplantat po 10 dniach kultury na po ywce zawieraj cej 1 mg dm -3 2,4- D+1 mg dm -3 TDZ (E-H); komórki (k) pokryte macierz zewn trzkomórkow (m), komórki po podziale (mała strzałka), proliferuj ce fragmenty bielma (du e strzałki) oraz obszary bielma bez widocznej reakcji (gwiazdki). Podziałka: 20 m (A); 50 m (C, F-H); 100 m (E); 200 m (B, D) Analysis in light (A-D) and scanning electron microscopy (E-H). Part of grain 6 DAP (A) with cellular endosperm (b), nucellus (n) and pericarp (p). Isolated endosperm on 6 DAP, after 7 days of culture on medium supplemented with 1 mg dm -3 2,4-D+1 mg dm -3 TDZ (B-D); visible part of proliferating endosperm (big arrows), nonproliferating endosperm (asterisks), cells containing starch grains (s), vacuolized cells (k) and shrinken endosperm cells (small arrows). Explant after 10 days of culture on medium containing 1 mg dm -3 2,4-D+1 mg dm -3 TDZ (E-H); cells (k) covered with extracellular matrix (m), cells after division (small arrows), part of proliferating endosperm (big arrows) and non-proliferating endosperm (asterisks). Bars: 20 m (A); 50 m (C, F-H); 100 m (E); 200 m (B, D) Obserwacje eksplantatów w SEM wykazały obecno wypukłych miejsc, odpowiadaj cych powi kszonym fragmentom bielma (fot. 2E). W nabrzmiałych rejonach były widoczne p kni cia powierzchni bielma, w których obserwowano du e komórki, przypominaj ce komórki kalusa. Na powierzchni obserwowano struktur przypominaj c macierz zewn trzkomórkow (fot. 2E, F). Podobna struktura o budowie włókienkowej, granularnej lub błoniastej jest spotykana w kulturach in vitro innych tkanek ro linnych [POPIELARSKA i in. 2006; POPIELARSKA-KONIECZNA i in. 2008a, b]. Jednak nie mo na wykluczy, e w tym przypadku macierz nie jest wytworem rosn cych komórek, a pozostało ci po zniszczonym bielmie. W miejscach, gdzie proliferacja została zahamowana, obserwowano obkurczone komórki o pofałdowanej powierzchni (fot. 2H). Podzi kowania Autorzy dzi kuj za udost pnienie ziarniaków ró nych gatunków i odmian pszenicy Profesorowi Januszowi Zimnemu z Instytutu Hodowli i Aklimatyzacji Ro lin w Radzikowie, Doktorowi Józefowi Pilchowi z Instytutu Hodowli i Aklimatyzacji Ro lin w Krakowie oraz Profesorowi Moshe Feldmanowi z Weizmann Institute of Science w Rehovot (Izrael). Literatura BECRAFT W.B Cell fate specification in the cereal endosperm. Cell & Develop. Biol. 12: GÓRALSKI G., POPIELARSKA M., LESAK H., SIWI SKA D., BATYCKA M Organogenesis in endosperm of Actinidia deliciosa cv. Hayward cultured in vitro. Acta Biol. Cracov.

215 WST PNE BADANIA NAD KULTUR in vitro IZOLOWANEGO BIELMA Ser. Bot. 47: KRANZ E., KUMLEHN J Angiosperm fertilization, embryo and endosperm development in vitro. Plant Sci. 142: LOPES M.A., LARKINS B.A Endosperm origin, development, and function. The Plant Cell. 5: MARES D.J., NORSTOG K., STONE B.A Early Stages in the development of wheat endosperm. I. The change from free nuclear to cellular endosperm. Aust. J. Bot. 23: MURASHIGE T., SKOOG F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15: NAKANO H., TASHIRO T., MAEDA E Plant differentiation in callus tissue induced from immature endosperm of Oryza sativa L. Pflanzenphysiol. 76: POPIELARSKA-KONIECZNA M., KOZIERADZKA-KISZKURNO M., WIERCZY SKA J., GÓRALSKI G., LESAK H., BOHDANOWICZ J. 2008a. Ultrastructure and histochemical analysis of extracellular matrix surface network in kiwifruit endosperm-derived callus culture. Plant Cell Rep. 27: POPIELARSKA-KONIECZNA M., KOZIERADZKA-KISZKURNI M., WIERCZY SKA J., GÓRALSKI G., LESAK H., BOHDANOWICZ J. 2008b. Are extracellular matrix surface network components involved in signalling and protective function? Plant Signalling and Behavior 3(9): POPIELARSKA M., LESAK H., GÓRALSKI G Histological and SEM studies on organogenesis in endosperm-derived callus of kiwifruit (Actinidia deliciosa cv. Hayward). Acta Biol. Cracov. Ser. Bot. 48: THOMAS T.D., CHATURVEDI R Endosperm culture: a novel method for triploid plant production. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 93: Słowa kluczowe: pszenica, bielmo, proliferacja, in vitro, mikroskop skaningowy Streszczenie W prezentowanej pracy podj to prób indukcji podziałów komórkowych w izolowanym bielmie wybranych przedstawicieli rodzaju Triticum L. (pszenica) w kulturze in vitro oraz zbadano na poziomie komórkowym zmiany zachodz ce w trakcie kultury. Eksplantaty były zró nicowane pod wzgl dem stopnia ploidalno ci (w zale no ci od ploidalno ci ro liny donorowej) oraz stopnia wykształcenia bielma (dojrzałe i niedojrzałe bielmo). Powi kszanie fragmentów lub całych eksplantatów obserwowano tylko w przypadku kultur niedojrzałych bielm T. aestivum i T. durum izolowanych od 5 do 10 DAP na po ywkach MS w obecno ci 1 mg dm -3 2,4-D i kinetyny oraz 1 mg dm -3 2,4-D i TDZ. Analiza histologiczna wykazała, e rosn ce rejony bielma s zło one z komórek przypominaj cych kalus oraz komórek obficie wypełnionych ziarnami skrobi.

216 240 M. Popielarska-Konieczna, I. Marci ska, P. Nowakowski PRELIMINARY STUDIES ON ISOLATED ENDOSPERM OF SELECTED WHEAT (Triticum L.) SPECIES CULTURED in vitro Marzena Popielarska-Konieczna 1, Izabela Marci ska 2, Piotr Nowakowski 1 1 Department of Plant Cytology and Embryology, Jagiellonian University, Kraków 2 Institute of Plant Physiology of Polish Academy of Sciences, Kraków Key words: wheat, endosperm, proliferation, in vitro, scanning electron microscopy Summary In presented paper the preliminary studies on cell proliferation of isolated endosperm of wheat cultured in vitro combined with histological analysis were described. Experiments were conducted on mature and immature endosperms isolated from grains of heksaploid (T. aestivum), tetraploid (T. durum) and diploid (T. monococcum) plants. Only 5-10 DAP-old immature endosperm of T. aestivum and T. durum proliferated on MS medium supplemented with 1 mg dm -3 2,4-D and kinetin or 1 mg dm -3 2,4-D and TDZ. Histological analysis revealed that swollen regions were consisted of callus cells and cells containing starch grains.

217 WST PNE BADANIA NAD KULTUR in vitro IZOLOWANEGO BIELMA Dr Marzena Popielarska-Konieczna Zakład Cytologii i Embriologii Ro lin Instytut Botaniki Uniwersytet Jagiello ski ul. Grodzka KRAKÓW m.popielarska-konieczna@uj.edu.pl

218

219 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: ELICYTACJA GRZYBÓW I BAKTERII PRZEZ OLIGO- I POLISACHARYDY 1 Marian Saniewski 1, Alicja Saniewska 1, Henryk Urbanek 2 1 Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa im. Szczepana Pieni ka w Skierniewicach 2 Katedra Fizjologii i Biochemii Ro lin, Uniwersytet Łódzki w Łodzi Wst p Ró ne oligo- i polisacharydy mog pełni w ro linach rol molekularnych sygnałów zwanych elicytorami, które reguluj wzrost i rozwój ro lin poprzez oddziaływanie na wiele procesów fizjologicznych i biochemicznych [ALDINGTON i in. 1991; FARMER i in. 1991; DARVILL i in. 1992; CÔTE, HAHN 1994; CREELMAN, MULLET 1997; EBEL, MITHÖFER 1998]. Oligosacharydy lub polisacharydy jako elicytory s to najcz ciej fragmenty cian komórkowych ro lin uwalnianych poprzez enzymatyczne działanie mikroorganizmów lub fragmenty cian komórkowych mikroorganizmów np. oligochitozan, oligoglukany, uwalniane poprzez działanie enzymów pochodzenia ro linnego [NAMDEO 2007]. Natur elicytorów posiada wiele innych oligosacharydów i polysacharydów, np. glukomannany, oligomery alginianów, chitozan, glukany. Tego typu elicytory indukuj lub stymuluj produkcj ró nych metabolitów wtórnych u wielu gatunków ro lin. Wiele polisacharydów grzybów lub bakterii, a nawet ich całe ciany komórkowe s u ywane do elicytacji metabolitów wtórnych u ro lin wy szych, zwłaszcza w zawiesinach komórkowych tych ro lin [NAMDEO 2007]. Szczególne znaczenie ma zastosowanie elicytorów do stymulacji w ro linach wy szych produkcji metabolitów wtórnych o wła ciwo ciach leczniczych [BRUNI, SACCHETTI 2005; NAMDEO 2007]. Wiele prac w literaturze jest po wi conych antygrzybowej aktywno ci chityny i chitozanu i zastosowaniu tych zwi zków do przedłu ania trwało ci owoców i warzyw poprzez obni enie infekcji przez patogeny [ALLAN, HADWIGER 1979; BHASKARA i in. 2000]. Nale y tutaj podkre li, e niektóre oligo- i polisacharydy, to tylko jedna grupa elicytorów spo ród znanych wielu innych elicytorów o ró nej naturze chemicznej [BRUNI, SACCHETTI 2005; DELATTRE i in. 2005; NAMDEO 2007]. O ile bogata jest literatura o elicytacji metabolitów wtórnych i innych procesów w ro linach wy szych przez ró ne elicytory [ZHAO i in. 2005], w tym o charakterze oligo- i polisacharydów, to niewiele jest danych o elicytacji ró nych procesów biochemicznych 1 Praca wykonana w ramach projektu badawczego Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wy szego Nr N N

220 244 M. Saniewski, A. Saniewska, H. Urbanek w grzybach i bakteriach. W pracy tej omawiamy dotychczasowe badania nad elicytacj ró nych procesów u grzybów i bakterii przez oligo- i polisacharydy. Grzyby i bakterie bogatym ródłem metabolitów wtórnych Metabolitami wtórnymi okre la si zwi zki o ró nej budowie chemicznej, które powstaj w wyniku ubocznych szlaków przemian metabolitów pierwotnych, natomiast nie uczestnicz w podstawowym metabolizmie organizmów, które je syntetyzuj. Pierwotnie uwa ano, e metabolity wtórne wyst puj tylko u ro lin, u których odgrywaj wa n rol w przystosowaniu si do rodowiska i w interakcjach z innymi organizmami. S wa nymi czynnikami w reakcjach obronnych ro lin przeciw fitopatogenom, szkodnikom i abiotycznym warunkom stresowym oraz w procesach zapylania i symbiozy. Zwi zki te wykazuj cz sto du aktywno biologiczn i st d znajduj powszechne zastosowanie w lecznictwie, kosmetyce i w produkcji ywno ci [BRIMBLE i in. 1999; DELATTRE i in. 2005; BRUNI, SACCHETTI 2005]. Obecnie, wytwarzanie metabolitów wtórnych stwierdza si równie u innych organizmów, a zwłaszcza u grzybów i bakterii, maj u nich, podobnie jak w przypadku ro lin, znaczenie obronne przed innymi organizmami i odgrywaj wa n rol w interakcjach ekologicznych. Działaj one cz sto toksycznie na ro liny, zwierz ta i mikroorganizmy [ZHAO i in. 2005] i s czynnikami patogeniczno ci i wirulencji grzybów i bakterii w procesie pora ania organizmów- ywicieli. Ich toksyczne wła ciwo ci wykorzystuje si do niszczenia chwastów i selekcji ro lin odpornych na choroby [FRISVAD i in. 2007; BERESTETSKIY 2008]. Najwi ksze jednak zainteresowanie metabolitami wtórnymi grzybów wi e si z mo liwo ci ich stosowania w lecznictwie i kosmetyce [ADRIO, DEMAIN 2003; LONGO, SANROMAN 2006]. Niektóre metabolity wtórne s charakterystyczne dla poszczególnych gatunków grzybów i wytwarzanie ich jest zwi zane z okre lonymi stadiami rozwoju, szczególnie jest ono intensywne w stadium sporulacji. Wyst powanie ich w postaci zwi zków barwnych ułatwia wykorzystywanie jako markerów w chemotaksonomii; barwniki melaninowe nadaj cz sto barw sporom, apresoriom i sklerocjom. Wi kszo bli ej poznanych metabolitów wtórnych grzybów to: terpenoidy, głównie z grupy seskwiterpenów trichoteceny, aristocheny, fuzykokcyna; polyketydy fumonyzyny, cerwulina, cerosporyna, patulina, citrinina, aflatoksyny, alternariol; polypeptydy cykliczne wiktoryna, tentatoksyna, sirodesmina, enniatyna; ponadto wykrywane s oligosacharydy, naftochinony, alkaloidy. Kluczowe znaczenie ma badanie enzymów uczestnicz cych we wtórnym metabolizmie grzybów, s to odpowiednio: syntazy poliketydowe, cyklazy terpenowe, syntetazy peptydowe. Liczba wykrytych metabolitów wtórnych grzybów jest bardzo du a, lecz tylko niektóre z nich byly obiektem dokładniejszych bada. Szczegółowsze badania dotyczyły rodzajów: Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Phoma, Phytophthora, Rhizoctonia, Sclerotinia, Stachybotrys, Trichoderma. Najwi cej uwagi po wi cono produkcji antybiotyków. Utrzymuje si, e grzyby prowadz ce zarówno saprofityczny, jak i paso ytniczy lub symbiotyczny tryb ycia s bogatym ródłem metabolitów wtórnych, które s tylko w niewielkim stopniu poznane i intensyfikacja bada mo e doprowadzi do wykrycia nowych zwi zków [SCHULTZ i in. 2002; MENDENTSEV i in. 2005; YU, KELLER 2005; LIU i in. 2007]. Metabolity wtórne grzybów jako wa ne ródło bioaktywnych substancji dla farmakologii i rolnictwa s cz sto obiektem bada maj cych na celu poszukiwanie czynników stymuluj cych ich biosyntez. Ró ne strategie s stosowane w celu zwi kszenia wydajno ci metabolitów wtórnych. Regulacja wtórnego metabolizmu u

221 ELICYTACJA GRZYBÓW I BAKTERII PRZEZ OLIGO- I POLISACHARYDY 245 grzybów jest zale na od składu podło a ródła azotu, fosforu, w gla i jonów metali, temperatury, wiatła, ph. Ostatnio du e nadzieje budzi indukcja syntezy metabolitów wtórnych za pomoc elicytorów. Zwi zek chemiczny, okre lany jako elicytor, wprowadzony do organizmu, wywołuje zmiany metaboliczne podobne do powodowanych przez czynniki stresowe. Biosynteza metabolitów wtórnych aktywowana jest przewa nie przez warunki stresowe, w zwi zku z czym produkcja ich mo e by zwi kszona przez elicytory. Wpływ oligo- i polisacharydów na morfologi kultur grzybów Cebule tulipanów zainfekowane przez Fusarium oxysporum f.sp. tulipae produkuj do du e ilo ci etylenu, który indukuje tworzenie si gum nie tylko w cebulach pora onych, ale równie cebulach zdrowych. Zjawisko gumozy wcebulach tulipana mo na tak e indukowa poprzez ich traktowanie etylenem lub etefonem (kwas chloroetanofosfonowy), jako ródło etylenu [SANIEWSKI i in. 2007]. Głównym składnikiem gum tulipana jest glukuronoarabinoksylan o ci arze cz steczkowym około 700 kda [SANIEWSKI i in. 2000; SKRZYPEK i in. 2005]. W literaturze wysuwana jest hipoteza, e tworzenie si gum w ro linach w wyniku infekcji przez patogeny lub erowanie owadów mo e stanowi reakcj obronn. Znane jest, e infekcja przez patogeny i erowanie owadów powoduj zwi kszon produkcj etylenu i jasmonianów [SANIEWSKI i in. 2002]. Powstało pytanie, jak oddziałuj gumy indukowane przez F. oxysporum f.sp. tulipae na wzrost i rozwój tego patogena. Wykazano, e dodatek gum do po ywki agarowo-ziemniaczano-glukozowej (PDA), agarowo-maltozowej (MEA) i mineralnej Czapka zestalonej agarem (CzDA) wpłyn ł silnie stymuluj co na wzrost i zarodnikowanie grzybni F. oxysporum f.sp. tulipae w porównaniu do kultur kontrolnych wzrastaj cych na podło ach bez dodatku gum [SANIEWSKA 2002a, b]. Mechanizm stymuluj cego działania gum tulipana na wzrost i zarodnikowanie F. oxysporum f.sp. tulipae nie jest znany. Mo na przypuszcza, e polisacharyd, glukuronoarabinoksylan, wyst puj cy w gumach tulipana, oddziałuje jako elicitor i reguluje niektóre procesy zwi zane ze wzrostem i zarodnikowaniem grzybni tego patogena. Obecnie, nie mo na całkowicie wykluczy, e polisacharyd gum tulipana stanowi cz ciowo substrat do wzrostu grzybni. Gumy tulipana zawieraj tak e wiele innych niezidentyfikowanych zwi zków i by mo e wywieraj stymuluj cy wpływ na wzrost i zarodnikowanie grzybni F. oxysporum f.sp. tulipae. Z kolei badano wpływ gum indukowanych w cebulach tulipana przez F. oxysporum f.sp. tulipae na wzrost i rozwój form specjalnych Fusarium oxysporum niepatogenicznych dla tulipanów, form, u których nieznane jest zjawisko indukcji gum w tkankach swoich ywicieli [SANIEWSKA 2002c]. Dodatek gum w ilo ci 5 mg cm -3 do po ywki mineralnej Czapka zestalonej agarem (CzDA) nie wpłyn ł stymuluj co na przyrost liniowy grzybni Fusarium oxysporum f.sp. callistephi i Fusarium oxysporum f.sp. narcissi, ale badane kultury wyró niały si bardziej obfit w strz pki, watowat grzybni powietrzn w porównaniu do kultur kontrolnych. Kultury grzybni Fusarium oxysporum f.sp. callistephi i f.sp. narcissi wzrastaj ce na po ywce CzDA z dodatkiem gum tulipana zarodnikowały kilkakrotnie obficiej w porównaniu do kultur kontrolnych inkubowanych na po ywce CzDA [SANIEWSKA 2002c]. RADMAN i in. [2004a] badali zmiany morfologiczne i zarodnikowanie w kulturach płynnych Penicillium chrysogenum P2 (syn. Penicillium notatum) pod wpływem kilku oligosacharydów dodanych do po ywki. Jako elicytory zostały u yte pochodne oligosacharydy otrzymane z alginianu sodu i gum pochodz cych z nasion Ceratonia siliqua (szara czyn str kowy, chleb wi toja ski), drzewa wyst puj cego w warunkach naturalnych w regionie ródziemno-

222 246 M. Saniewski, A. Saniewska, H. Urbanek morskim. Guma z nasion Ceratonia siliqua, zwana gum karobow lub chlebem wi toja skim, jest galaktomannanem i jest u ywana jako substancja zag szczaj ca w przemy le spo ywczym. Z alginianu sodu poprzez cz ciowo kwa n hydroliz otrzymano oligomannuronian (OM) i oligoguluronian (OG), a z gum Ceratonia siliqua poprzez hydroliz enzymatyczn wypreparowano oligosacharydy mannanowe (MO). Elicytory te w st eniu 150 mg dm -3 były dodawane do po ywki w czasie inokulacji zarodnikami. Dodatek OG hamował kiełkowanie zarówno zarodników P. chrysogenum o około 30%, jak równie wydłu anie strz pek kiełkuj cych zarodników, natomiast OM i MO nie wpływały na te procesy. Interesuj ce jest, e wszystkie u yte elicytory wpływały na zwi kszenie liczby strz pek wierzchołkowych (OG - 19%, OM - 29%, MO - 47%), powierzchni grzybni (OG - 23%, OM - 32%, MO - 59%) i zarodnikowanie. Zwi kszona liczba strz pek pod wpływem OG, OM i MO jest zwi zana z silniejszym rozgał zianiem strz pek i ich zwi kszon powierzchni. Z drugiej strony wiadomo, e produkcja metabolitów wtórnych ma miejsce głównie w wierzchołkach strz pek nitkowatych grzybów [RADMAN i in. 2004a], st d poznanie zmian morfologicznych u grzybów pod wpływem elicytorów jest bardzo wa ne. Wykazano, e chitozan indukował wewn trzkomórkowe i morfologiczne zmiany u Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, zwi kszon wakuolizacj, dezorganizacj komórek, agregacj cytoplazmy i odkładanie substancji bogatych w chityn w plazmalemie i cianach komórkowych [BENHAMOU 1995]. Sk pe s dane o wpływie elicytorów natury w glowodanowej na kultury bakterii. AKIYAMA i in. [1992] stwierdzili, e dodatek enzymatycznie depolimeryzowanych alginianów do pi ciu kultur Bifidobacteria stymulował wzrost komórek we wszystkich kulturach, najprawdopodobniej poprzez działanie elicytorowe alginianów, a nie jako ródło w gla. Elicytacja metabolitów wtórnych przez oligosacharydy w grzybach i bakteriach Próby indukcji metabolitów wtórnych w kulturach grzybów i bakterii prowadzone s stosunkowo od niedawna, zwłaszcza na Uniwersytecie Westminster w Anglii. Interesuj ce s badania nad wpływem ró nych oligosacharydów na produkcj penicyliny w kulturach Penicillium chrysogenum [ARIYO i in. 1997, 1998; GANG i in. 2001; TRAMERLER i in. 2001]. ARIYO i in. [1997] wykazali, e oligomannuronian (OM) i oligoguluronian (OG) stymuluj produkcj penicyliny G w około 50% w kulturach Penicillium chrysogenum P2 szczepu produkuj cego du e ilo ci penicyliny, i w około 150% w kulturach P. chrysogenum NRRL 1951 szczepu wytwarzaj cego małe ilo ci peniciliny. Oligosacharydy mannanowe (MO) otrzymane z gum Ceratonia siliqua w około 69% zwi kszaj wytwarzanie penicyliny G w kulturach Penicillium chrysogenum P2, jak równie jednego z metabolitów w biosyntezie penicyliny - -(L- -aminoadipyl)- L-cysteinylo-D-waliny [ARIYO i in. 1998]. W dalszych badaniach udokumentowano, e pod wpływem oligoguluronianu, oligomannuronianu i oligosacharydów mannanowych nast piło zwi kszone wydzielanie izopeniciliny N w kulturach Penicillium chrysogenum P2 [TRAMERLER i in. 2001]. GANG i in. [2001] sugeruj, e zastosowane oligosacharydowe elicytory (oligoguluronian i oligomannuronian) indukuj transkrypcj trzech genów u Penicillium chrysogenum bior cych udział w biosyntezie penicyliny, pcbab, pcbc i pende. Oligosacharydy stymuluj produkcj chrysogeniny w kulturach Penicillium hrysogenum [ASILONU i in. 2000; NAIR i in. 2005a, b]. ASILONU i in. [2000] wykazali, e

223 ELICYTACJA GRZYBÓW I BAKTERII PRZEZ OLIGO- I POLISACHARYDY 247 oligosacharydy otrzymane poprzez kwa n hydroliz alginianu sodu (oligomannuronian OM i oligoguluronian - OG) i trzy oligosacharydy otrzymane z pektyn drog enzymatycznej hydrolizy, stymuluj produkcj chrysogeniny w kulturach Penicillium chrysogenum w około 30-40%. Oligosacharydy mannanowe równie wzmagaj biosyntez chrysogeniny w kulturach Penicillium chrysogenum [NAIR i in. 2005a, b]. Chrysogenina to ółty barwnik wytwarzany przez Penicillium chrysogenum, ale o nieznanej biologicznej funkcji i nie w pełni poznanej strukturze chemicznej. Oligosacharydy jako elicytory silnie stymuluj produkcj bacitraciny A w kulturach Bacillus licheniformis [MURPHY i in. 2007a, b, 2008]. MURPHY i in. [2007a] po raz pierwszy wykazali, e elicytory oligosacharydowe oligosacharydy mannanowe (MO), oligomannuronian (OM) i oligoguluronian (OG) wzmagaj produkcj bacitraciny w płynnych kulturach Bacillus licheniformis. Oligosacharydy te w optymalnych st eniach ka dego z nich, tj. OG mg dm -3, MO mg dm -3 i OM mg dm -3, dodawane do 24-godz. kultur, stymuluj produkcj bacitraciny A odpowiednio w 29%, 27% i 16%. Kilkakrotne dodawanie oligosacharydów (OG i MO) do kultur Bacillus licheniformis w du o wi kszym procencie podwy sza produkcj bacitracyny A [MURPHY i in. 2007b]. Wzmo ona biosynteza bacitracyny A przez oligosacharydy (OG, MO, OM) w kulturach Bacillus licheniformis jest zwi zana ze zwi kszon transkrypcj kluczowych genów (bacabc) bior cych udział w biosyntezie bacitracyny A [MURPHY i in. 2007b, 2008]. Bacitracyna wytwarzana przez Bacillus licheniformis i niektóre szczepy Bacillus subtilis jest antybiotykiem polipeptydowym, aktywnym przeciwko bakteriom Gram-dodatnim i niektórym Gram-ujemnym. Poszczególne bacitracyny (A, B, F) ró ni si składem tylko jednego aminokwasu [MURPHY i in. 2007a]. SUH i SHIN [2000] wykazali, e filtraty Saccharomyces cerevisiae dodane do płynnej po ywki z kultur grzyba Monascus purpureus J101 stymulowały proliferacj poprzez zwi kszone zarodnikowanie i reprodukcj komórek. Komórki Monascus w kokulturze z filtratami Saccharomyces cerevisiae zawierały około 4 razy wi cej lipidów ogółem, głównie kwasu linolowego i kwasu oleinowego w porównaniu do kultur Monascus bez tej kokultury. Dodatek egzogennych kwasów tłuszczowych powodował wzrost masy komórek. Stwierdzono równie istotne zmiany jako ciowe i ilo ciowe w ekspresji białek w komórkach Monascus w kokulturze Saccharomyces cerevisiae. Nale y tutaj doda, e Monascus purpureus wytwarza osiem ró nych barwników o charakterze polyketydów, o barwie od ółtej do gł boko czerwonej, a niektóre z tych barwników s stosowane do barwienia produktów spo ywczych w krajach azjatyckich [RADMAN i in. 2003]. Oligosacharyd wytwarzany w li ciach kapusty i rzepaku zaka onych grzybem Alternaria brassicicola indukuje w kiełkuj cych sporach tego fitopatogena AB-toksyn, działaj c toksycznie na pora ane ro liny. Ci ar cz steczkowy AB-toksyny jest okre lony na około 35 kda na podstawie elektroforezy na SDS- elu poliakrylamidowym [OKA i in. 2005]. W ostatnio prowadzonych badaniach stwierdzono obecno strz pek i liczne mikro- i makrokonidia F. oxysporum f.sp. tulipae zarówno na powierzchni, jak i wewn trz płynnych wycieków gum indukowanych przez tego patogena w cebulach tulipana. Strz pki penetruj ce półpłynne gumy były zabarwione na czerwono, a po dłu szym czasie cała masa gum przybierała ró owoczerwone zabarwienie z rozrastaj c si w nich grzybni F. oxysporum f.sp. tulipae. Wodny roztwór gum, w których indukowano mikrokonidia F. oxysporum f.sp. tulipae, zmieniał zabarwienie na kolor czerwony z licznie kiełkuj cymi zarodnikami, podczas gdy zawiesina zarodników inkubowana w wodzie lub z dodatkiem sacharozy lub glukozy (bez dodatku gum) była bezbarwna ze sporadycznie kiełkuj cymi zarodnikami [SANIEWSKI i in. 2008]. Obecnie prowadzona jest

224 248 M. Saniewski, A. Saniewska, H. Urbanek identyfikacja metabolitów wtórnych wytwarzanych przez grzybni F. oxysporum f.sp. tulipae indukowanych przez gumy tulipana powstaj ce pod wpływem patogena. Wpływ oligosacharydów na aktywno enzymów w grzybach i bakteriach SANIEWSKA i in. [2005] badali wpływ gum indukowanych w cebulach tulipana przez F. oxysporum f.sp. tulipae na wydzielanie niektórych enzymów hydrolitycznych przez tego patogena do płynnej po ywki Czapek-Dox-Agar (CzDA), zawieraj cej sacharoz lub do mineralnej po ywki CzDA bez dodatku sacharozy (m-czda). Patogen F. oxysporum f.sp. tulipae, rosn cy na po ywce płynnej CzDA zawieraj cej sacharoz, nie wydzielał do po ywki wszystkich badanych enzymów, tj. -1,4- glukozydazy, -1,4-galaktozydazy, -ksylozydazy, -1,4-galaktozydazy, -1,4- glukuronidazy, -1,4-ksylozydazy, -1,4-D-arabinozydazy, -1,4-L-arabinozydazy, - L-arabinozydazy, -1,4-mannozydazy, -1,4-ramnozydazy, -1,4-polygalakturonidazy (poligalakturonazy). Jednak e na po ywce CzDA zawieraj cej sacharoz i dodatek gum tulipana F. oxysporum f.sp. tulipae wydzielał do po ywki -1,4-glukozydaz, -1,4-galaktozydaz, -ksylozydaz i polygalakturonidaz. Inkubacja F. oxysporum f.sp. tulipae na mineralnej po ywce CzDA powodowała wydzielanie do po ywki -1,4-glukozydazy, -1,4-galaktozydazy i poligalakturonazy, a uzupełnienie tej po ywki gumami z tulipana silnie zwi kszało aktywno tych enzymów i powodowało sekrecj -ksylozydazy. Tak wi c dodanie do po ywek gum tulipana jako ródła w gla aktywuje enzymy lub ich syntez w F. oxysporum f.sp. tulipae; zatem produkcja niektórych enzymów u tego patogena jest konserwatywna, enzymy s wytwarzane je li s potrzebne. Oligosacharydy mannanowe (MO) jako elicytory otrzymane z gum Ceratonia siliqua, zastosowane pojedynczo, jak i ł cznie z kwasem ferulowym, silnie stymulowały aktywno lakkazy w płynnych kulturach Pycnoporus sanguineus, Coriolopsis polyzona i Pleurotus ostreatus, nale cych do Basidiomycetes. Gatunki te charakteryzuj si zdolno ci do enzymatycznej degradacji lignin [VANHULLE i in. 2007]. MO w st eniu 150 mg dm -3 powodował 88-krotny wzrost aktywno ci lakkazy w kulturach Pycnoporus sanguineus w porównaniu do kultur kontrolnych. Kwas ferulowy zastosowany pojedynczo równie wzmagał poziom lakkazy w tym grzybie, ale nie stwierdzono wyra nego synergizmu tego kwasu z MO w produkcji lakkazy. Oligosacharydy mannanowe w st eniu 150 mg dm -3 powodowały wzrost poziomu aktywno ci lakkazy w kulturach Coriolopsis polyzona 2-krotnie, a w kulturach Pleurotus ostreatus 3-krotnie [VANHULLE i in. 2007]. Nale y tu doda, e lakkazy pełni wielorak rol, oprócz degradacji lignin, bior udział m.in. w tworzeniu melanin, w morfogenezie grzybów tworzeniu zarodników i dyferencjacji grzybów. PETRUCCIOLI i in. [1999] wykazali, e oligomannuronian (OM) i oligoguluronian (OG), oligosacharydy o stopniu polymeryzacji 7, otrzymane z alginianianu sodu, w st eniu 100 mg dm -3, w około 70% stymulowały produkcj oksydazy glukozy (GOD) w kulturach Penicillium variabile P16, ale bez wpływu na biomas grzybni. Równie sam alginian sodu izolowany z Laminaria hyperborea w st eniu 100 i 200 mg dm -3 w około 30-51% stymulował aktywno oksydazy glukozy w Penicillium variabile P16. Gumy z Ceratonia siliqua w st eniu 100 mg dm -3 w około 33% wpływały na wzrost aktywno ci oksydazy glukozy u P. variabile P16 [PETRUCCIOLI i in. 1999]. Oksydaza glukozy produkowana przez grzyby stanowi mechanizm obronny i ma wła ciwo ci antymikrobiologiczne. Enzym ten jest dobr alternatyw dla tradycyjnego stosowania traktowa chemicznych i fizycznych ywno ci w celu przedłu enia trwało ci [PETRUCCIOLI i in. 1999].

225 ELICYTACJA GRZYBÓW I BAKTERII PRZEZ OLIGO- I POLISACHARYDY 249 Mechanizmy elicytacji grzybów i bakterii Mimo du ego zainteresowania i intensywnych bada dotycz cych indukcji wytwarzania metabolitów wtórnych u ro lin wy szych przez ró ne elicytory (mi dzy innymi przez zwi zki o strukturze w glowodanów, peptydy i ró ne zwi zki proste), mechanizm elicytacji nie został dokładnie wyja niony. Badania wpływu zwi zków chemicznych jako elicytorów na wytwarzanie metabolitów wtórnych u mikroorganizmów s stosunkowo nieliczne i wiedza o mechanizmie indukcji ich biosyntezy jest bardzo sk pa. Sugerowany przebieg indukcji u bakterii i grzybów oparty jest na modelu, według którego mo e ona nast powa u ro lin po działaniu biotycznych elicytorów [ZHAO i in. 2005; NAMDEO 2007]. Elicytor mo e bezpo rednio jako ligand reagowa z receptorem błony komórkowej, b d uwalnia endogenny elicytor. W wyniku rozpoznania elicytora przez odpowiedni receptor błony komórkowej i poł czenia si z nim nast puje aktywacja efektorów: otwarcie kanałów jonowych, aktywacja kinaz białkowych i fosfataz. W ich aktywacji wa n rol spełniaj białka G, uczestnicz one w przekazywaniu sygnałów z receptorów błonowych do efektorów, ich obecno stwierdzono u grzybów. Rozpoczyna si proces przenoszenia informacji z receptora do miejsca transkrypcji, nazywany transdukcj sygnałów, co prowadzi do ekspresji genów odpowiedzialnych za biosyntez metabolitów wtórnych. Elementami transdukcji sygnałów s wtórne przeka niki informacji: cykliczne nukleotydy, trójfosforan inozytolu, diacyloglicerol, jony wapnia i kalmodulina. Kluczow rol w aktywacji transkrypcji odgrywa fosforylacja i defosforylacja białek przez kinazy aktywowane mitogenem. Utrzymuje si, e biosynteza okre lonych zwi zków jest kontrolowana przez kompleksy (klastry) genów. Transdukcja sygnałów mo e ró ni si w zale no ci od elicytora. Zwykle pierwsz reakcj wykrywan u ro lin, powodowan przez elicytory, jest nadprodukcja reaktywnych form tlenu (RFT). Stres oksydacyjny, powoduj cy nadmiern akumulacj RFT, uszkadza struktury komórkowe. Okresowo jednak wzrastaj ce generowanie RFT, a szczególnie zwi kszenie zawarto ci H 2 O 2 w komórce ro linnej, mo e pełni funkcj sygnału w aktywacji genów. RFT jako wtórne cz steczki sygnałowe mog uczestniczy w regulacji specyficznych biologicznych procesów, w tym jako kluczowy induktor metabolizmu wtórnego. U mikroorganizmów nie potwierdzono jednak dodatniej korelacji mi dzy stymulacj wytwarzania metabolitów wtórnych i zwi kszonym generowaniem RFT. Odwrotnie, akumulacja RFT zmniejszała si, gdy wytwarzanie metabolitów wtórnych było stymulowane przez oligosacharydy. Oligosacharydy mannanowe wywierały bardziej hamuj cy wpływ na tworzenie si RFT ni oligoguluroniany w kulturach płynnych Penicillium chrysogenum [RADMAN i in. 2004b]. W dalszych badaniach udokumentowano, e hamowanie produkcji RFT przez ró ne oligosacharydy, najsilniej przez oligosacharydy mannanowe, jest silnie skorelowane ze stymulacj produkcji metabolitów wtórnych w mikroorganizmach Streptomyces rimosus i Penicillium chrysogenum [RADMAN i in. 2006]. Literatura ADRIO J.L., DEMAIN A.L Fungal biotechnology. Int. Microbiol. 6: AKIYAMA H., ENDO T., NAKAKITA R., MURATA K., YONEMOTO Y., OKAYAMA K Effect of depolymerized alginates on the growth of Bifidobacteria. Biosci. Biotech. Biochem. 56:

226 250 M. Saniewski, A. Saniewska, H. Urbanek ALDINGTON S., MCDOUGALL J., FRY S.C Structure-activity relationship of biologically active oligosaccharides. Plant Cell and Environment 14: ALLAN C.R., HADWIGER L.A The fungicidal effect of chitosan on fungi of varying cell composition. Exp. Mycol. 3: ARIYO T.A., BUCKE C., KESHAVARZ T Alginate oligosaccharides as enhancers of penicillin production in cultures of Penicillium chrysogenum. Biotech. Bioeng. 53: ARIYO T.A., TRAMERLER C., BUCKE C., KESHAVARZ T Enhanced penicillin production by oligosaccharides from batch cultures of Penicillium chrysogenum in stirrer-tank reactors. FEMS Microbiol. Lett. 166: ASILONU E., BUCKE C., KESHAVARZ T Enhancement of chrysogenin production in cultures of Penicillium chrysogenum by uronic acid oligosaccharides. Biotechnol. Lett. 22: BENHAMOU N Elicitor-induced resistance in tomato plants against fungal pathogens: Ultra and cytochemistry of the induced response. Seanning Microsc. 9: BERESTETSKIY A.O A review of fungal phytotoxins: from basic studies to practical use. Appl. Biochem. Microbiol. 44: BHASKARA R.M.V., BELKACEMI K., CORCUFF R., COSTAIGNE F., ARID J Effect of preharvest chitosan sprays on post-harvest infection by Botrytis cinerea and quality of strawberry fruit. Postharvest Biol. Technol. 20: BRIMBLE M.A., DUNCALF L.J., NAIRN M.R Pyaranonaphthoquinone antibiotics isolation, structure and biological activity. Natl. Prod. Rep. 16: BRUNI R., SACCHETTI G Micro-organism-plant interactions as influencers of secondary metabolism, in medicinal plants. Minerva Biotecnologica 17: CÔTE F., HAHN M.G Oligosaccharins: structures and signal transduction. Plant Mol. Biol. 26: CREELMAN R.A., MULLET J.E Oligosaccharins, brassinolides, and jasmonates: Nontraditional regulators of plant growth, development, and gene expression. Plant Cell 9: DARVILL A., AUGUR C., BERGMANN C., CARLSON R.W., CHEONG J.-J., EBERHARD S., HAHN M.G., LO V.-M., MARFE V., MEYER B., MOHNEN D., O NEILL M.A., SPIRO M.D., VAN HAL- BEEK H., YORK W.S., ALBERSHEIM P Oligosaccharides that regulate, development and defence responses in plants. Glycobiology 2: DELATTRE C., MICHAUD P., COURTOIS B., COURTOIS J Oligosaccharides engineering from plants and algae applications in biotechnology and therapeutics. Minerva Biotecnologica 17: EBEL J., MITHÖFER A Early events in the elicitation of plant defence. Planta 206: FARMER E.E., MOLOSHOK T.D., SAXTON M.J., RYAN C.A Oligosaccharides signaling in plants. Specificity of oligouronide-enhanced plasma membrane protein phosphorylation. J. Biol. Chem. 266: FRISVAD J.C., ANDERSEN B., THRANE U The use of secondary metabolite profiling in chemotaxonomy of filamentous fungi. Mycol. Res. 112: GANG L., CASQUEIRO J., GUITIERREZ S., KOSALKOVA K., CASTILLO N.-I., MARTIN J.F Elicitation of penicillin biosynthesis by alginate in Penicillium chrysogenum, exerted on pcbab, pcbc and pende genes at the transcriptional level. J. Microbiol. Biotechnol. 11: LIU C., XU W., LIU F., JIANG S Fumonisins production by Fusarium proliferatum

227 ELICYTACJA GRZYBÓW I BAKTERII PRZEZ OLIGO- I POLISACHARYDY 251 strains isolated from asparagus crown. Mycopathologia 164: LONGO M.A., SANROMAN M.A Production of food aroma compounds: Microbial and enzymatic methodologies. Food Technol. Biotechnol. 44: MENDENTSEV A.G., ARINBASAROVA A.YU., AKIMENKO V.K Biosynthesis of naphthoquinone pigments by fungi of the genus Fusarium. Appl. Biochem. Microbiol. 41: MURPHY, T., PARRA R., RADMAN R., ROY I., HARROP A., DIXON K., KESHAVARZ T. 2007a. Novel application of oligosaccharides as elicitors for the enhancement of bacitracin A production in cultures of Bacillus licheniformis. Enzyme and Microbial Technology 40: MURPHY T., ROY I., HARROP A., DIXON K., KESHAVARZ T. 2007b. Effect of oligosaccharides elicitors on bacitracin A production and evidence of transcriptional level control. J. Biotechnol. 131: MURPHY T., ROY I., HARROP A., DIXON K., KESHAVARZ T Elicitation effects of oligosaccharides on the transcriptional level of bacitracin ABC transporter genes in Bacillus licheniformis. Biotechnol. Lett. 30: NAIR R., RADMAN R., ROY I., BUCKE C., KESHAVARZ T. 2005a. Towards unravelling the elicitation mechanism in cultures of Penicillium chrysogenum: Chrysogenin elicitation. Chem. Eng. Trans. 6: NAIR R., RADMAN R., ROY I., KESHAVARZ T., BUCKE C. 2005b. Elicitor effects on chrysogenin in liquid cultures Penicillium chrysogenum using mannan oligosaccharides. AIDIC 7: NAMDEO A.G Plant cell elicitation for production of secondary metabolites: a review. Pharmacognosy Reviews 1: OKA K., AKAMATSU H., KODAMA M., NAKAJIMA H., KAWADA T., OTANI H Host-specific AB-toxin production by germinating-spores of Alternaria brassicicola is induced by a host-derived oligosaccharide. Physiol. Mol. Plant Pathol. 66: PETRUCCIOLI M., FEDERICI F., BUCKE C., KESHAVARZ T Enhancement of glucose oxidase production by Penicillium variabile P16. Enzyme Microb. Technol. 24: RADMAN R., BLAND E.J., SANGWORACHAT N., BUCKE C., KESHAVARZ T Effects of oligosaccharides and polysaccharides on the generation of reactive oxygen species in different biological systems. Biotechnol. Appl. Biochem. 44: RADMAN R., BUCKE C., KESHAVARZ T. 2004a. Elicitor effects of Penicillium chrysogenum morphology in submerged culture. Biotechnol. Appl. Biochem. 40: RADMAN R., BUCKE C., KESHAVARZ T. 2004b. Elicitor effects on reactive oxygen species in liquid cultures of Penicillium chrysogenum. Biotechnol. Lett. 26: RADMAN R., SAEZ T., BUCKE C., KESHAVARZ T Elicitation of plants and microbial systems. Biotechnol. Appl. Biochem. 37: SANIEWSKA A. 2002a. The effect of gums induced by Fusarium oxysporum Schlecht. f.sp. tulipae Apt. in tulip bulbs on the mycelium growth and development of the pathogen in vitro. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 481: SANIEWSKA A. 2002b. The role of gum induced by Fusarium oxysporum Schlecht. Snyd. et Hans. f.sp. tulipae Apt. in tulip bulbs on growth and development of the pathogen. Plant Protection Science (Special Issue 2) 38: SANIEWSKA A. 2002c. Wpływ gum indukowanych w cebulach tulipana przez Fusarium oxysporum f.sp. tulipae na wzrost i rozwój in vitro form specjalnych Fusarium oxys-

228 252 M. Saniewski, A. Saniewska, H. Urbanek porum niepatogenicznych dla tulipanów. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 488: SANIEWSKA A., SANIEWSKI M., URBANEK H The effect of gums induced by Fusarium oxysporum f.sp. tulipae in tulip bulbs on in vitro growth of the pathogen and its production of gum degrading enzymes. Acta Hortic. 669: SANIEWSKI M., MIYAMOTO K., OKUBO H., SANIEWSKA A., PUCHALSKI J., UEDA J Gummosis in tulip (Tulipa gesneriana L.): Focus on hormonal regulation and carbohydrate metabolism. Floriculture and Ornamental Biotechnology 1: SANIEWSKI M., SANIEWSKA A., URBANEK H Wytwarzanie metabolitów wtórnych przez grzybni Fusarium oxysporum f.sp. tulipae pod wpływem gum indukowanych przez tego patogena w cebulach tulipana. VIII Polskie Sympozjum: Proekologiczne Pestycydy, Uniwersytet Wrocławski, Wydział Chemii, VI 2008, Suche k. Poronina, Streszczenie: 27. SANIEWSKI M., UEDA J., MIYAMOTO K., HORBOWICZ M Gum induction by methyl jasmonate in tulip stem: Relevance to its chemical composition. Acta Hortic. 515: SANIEWSKI M., UEDA J., MIYAMOTO K., URBANEk H Relationship between jasmonates and ethylene in regulation of some physiological processes in plants under stress conditions. Zeszyty Problemowe Post pów Nauk Rolniczych z. 481: SCHULZ B., BOYLE C., DRAEGER S., RÖMMERT A.-K., KROHN K Endophytic fungi: a source of novel biologically active secondary metabolites. Mycological Research 106: SKRZYPEK E., MIYAMOTO K., SANIEWSKI M., UEDA J Jasmonates are essentials factors inducing gummosis in tulips: Mode of action of jasmonates focusing on sugar metabolism. J. Plant Physiol. 162: SUH J.-H., SHIN C.S Physiological analysis on novel coculture of Monascus sp. J 101 with Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Lett. 190: TRAMERLER C., ARIYO B., BUCKE C., KESHAVARZ T Effect of mannan and alginate oligosaccharides on production in bioreactors of penicillin G and its biosynthetic intermediates. Ann. Microbiol. 51: VANHULLE S., RADMAN R., PARRA R., CUI T., BOLS C.-M., TRON T., SANNIA G., KESHAVARZ T Effect of mannan oligosaccharide elicitor and ferulic acid on enhancement of laccases production in liquid cultures of basidiomycetes. Enzyme and Microbial Technology 40: YU J.-H., KELLER N Regulation of secondary metabolism in filamentous fungi. Annu. Rev. Phytopathol. 43: ZHAO J., DAVIS L.C., VERPOORTE R Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites. Biotechnology Advances 23: Słowa kluczowe: elicytacja, bakterie, grzyby, metabolity wtórne, oligosacharydy, polisacharydy Streszczenie Badania nad elicytacj metabolitów wtórnych i innych procesów metabolicznych

229 ELICYTACJA GRZYBÓW I BAKTERII PRZEZ OLIGO- I POLISACHARYDY 253 w ro linach wy szych przez ró ne elicytory s szeroko prowadzone w wielu o rodkach naukowych na wiecie. Niektóre metabolity wtórne stanowi wa ne ródło bioaktywnych substancji w przemy le farmaceutycznym, znajduj zastosowanie w przemy le spo ywczym jako dodatki do ywno ci, zwi zki zapachowe i w wielu innych gał ziach przemysłu. W ostatnich latach opublikowano kilka prac przegl dowych o elicytacji metabolitów wtórnych w komórkach ro lin wy szych i mechanizmach tego procesu, tj. transdukcji sygnałów. Sk pe s dane o elicytacji procesów biochemicznych doprowadzaj cych do wzmo onej produkcji metabolitów wtórnych w kulturach grzybów i bakterii. Badania nad elicytacj grzybów i bakterii s głównie prowadzone na Uniwersytecie Westminster w Anglii. W tej pracy dokonano przegl du bada dotycz cych elicytacji ró nych procesów u grzybów i bakterii przez oligo- i polisacharydy. Niektóre w glowodanowe elicytory, głównie otrzymane z alginianów i gum z nasion Ceratonia siliqua (chleb wi toja ski, szara czyn str kowy) stymuluj wzrost, produkcj metabolitów wtórnych i aktywno enzymów w kulturach grzybów i bakterii.

230 254 M. Saniewski, A. Saniewska, H. Urbanek ELICITATION OF BACTERIA AND FUNGI BY OLIGO- AND POLYSACCHARIDES Marian Saniewski 1, Alicja Saniewska 1, Henryk Urbanek 2 1 Research Institute of Pomology and Floriculture, Skierniewice 2 Department of Plant Physiology and Biochemistry, University of Lodz, Łód Key words: elicitation, bacteria, fungi, secondary metabolites, oligosaccharides, polysaccharides Summary The enhanced production of the secondary metabolites from plant cell cultures through the elicitation opened up a new area of research which could bring important economical benefits such as pharmaceuticals, food additives, flavors, and other industrial materials. Several aspects of elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites was recently summarized in review papers. Literature on the elicitation in fungal and bacterial cultures untill now is not numerous. Studies in this field are mostly conducted at University of Westminster in the United Kingdom. This mini-review summarizes available data on the elicitation of microbial cell systems. Some carbohydrates elicitors, mostly derived from sodium alginate and gum of locustbean (Ceratonia siliqua), enhanced growth, production of secondary metabolites and enzyme activities in fungal and bacterial cultures. Prof. dr hab. Marian Saniewski, czł. koresp. PAN Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa im. Szczepana Pieni ul. Pomologiczna SKIERNIEWICE Marian.Saniewski@insad.pl ka

231 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: THE INFLUENCE OF SELENIUM COMPOUNDS ON THE PERMEABILITY OF PLASMA MEMBRANES OF WHEAT CALLUS CELLS Apolonia Sieprawska, El bieta Rudolphi-Skórska, Jolanta Płoskonka Institute Biology, Pedagogical University of Cracow Introduction Selenium belongs to non-metallic elements with chemical characteristics similar to sulphur. In nature it occurs in the soil as impurity with sulphur and sulphur ore. Selenium displays a metalloid character and occurs in several different oxidation states as selenide (Se 2 ), elemental selenium (Se 0 ), selenite (Se 4+ ) and selenate (Se 6+ ) [FOSTER et al. 1986; WHITE et al. 2004]. In the cell it binds to amino acids, cysteine (selenocysteine) and methionine (selenomethionine) [GUNTHER 1986; MARTENS, SUAREZ 1997; XUE, HARTIKAINEN 2000; XUE et al. 2001]. Due to its anti-oxidative, properties, selenium is an essential element for all animals, including humans, however, its content in the human diet in several countries is very poor [TAYLOR, ALBANES 1998; DHILLON, DHILLON 2003]. To remedy this dietary Se deficiency, strategies to develop crops with enhanced Se content were used. The uptake of Se by plants is influenced by the chemical form and concentration of Se in the soil solution, soil redox conditions, ph and the presence of competing ions such as sulphate [WHITE et al. 2004]. Selenium can be taken up by plant root cells as selenate (SeO 4 2- ), selenide (SeO 3 2- ) or as organoselenium compounds through sulphate transporters in the plasma membranes [WHITE et al. 2003]. However, excessive accumulation of Se can be toxic for both plant and animal cells. The aim of the presented experiments was to compare the effect of selenium administered as selenate (SeO 4 2- ), and as organoselenium compounds on the membrane properties of wheat cells. The experiments were carried out on callus cultures which helped to draw conclusions concerning the direct effect of selected substances on the plasma membrane. The effects of the long-term treatment, measured as the fresh mass increment of callus tissue cultured on nutrient media supplemented with these compounds, and the short-term treatment (30 min), measured as the electrolyte efflux from cells, were determined. Material and methods

232 256 A. Sieprawska, E. Rudolphi-Skórska, J. Płoskonka Preparation of material for analyses Winter wheat seeds cv. Kamila were germinated in sterile containers filled with pearlite moistened with Hoagland nutrient medium. Vernalization was conducted in a cool chamber at 5 C for 9 weeks. Then plants were transferred into containers filled with a mixture soil:peat:sand (3:2:1; v/v/v) and placed in a greenhouse at 20/17 C (day/night), a 16 h/8 h (day/night) photoperiod, where they were grown till the first anthers were developed. Immature seeds were chosen as material for in vitro cultures. Seeds were sterilized with 70% ethanol for 1 minute and then with detergent (10% Domestos) for 15 minutes. After sterilization the material was rinsed five times with distilled water. Immature embryos were isolated from the sterile seeds and transferred onto Petri dishes containing MURASHIGE and SKOOG medium [1962] supplemented with auxin 2,4-D. Callus induction was carried out in the dark at 25 C for 2 months. During that period callus was transferred onto fresh medium every 3 weeks. After that period callus was trasfered onto Murashige and Skoog medium (control, 0) and onto the nutrient media supplemented with selenium ions at the following concentrations: 1 mol dm -3 Na 2 SeO 4, (SeO4 2- ), 1 mol dm -3 3-(4 -metoksyfenylo)-2-seleno-5-cynamylidenotiazolidyno-4-on (S-120) and 1 mol dm -3 3-butylo-2 seleno-5-cynamylideno-tiazoldyno-4-on (S-071), (Fig. 1). The callus was grown on those media for 2 weeks. 3-(4 -metoksyfenylo)-2-seleno-5-cynamylidenotiazolidyno-4-on (S-120) 3-butylo-2 seleno-5-cynamylideno-tiazoldyno-4-on (S-071) Fig. 1. Chemical structures of organic selenium derivatives which were used in the experiments Rys. 1. Struktura chemiczna organicznych pochodnych selenu u ytych w eksperymentach The fresh mass increment for the callus was estimated after 2 weeks of culture and calculated as a mean (±SE) of 3 independent experiments. In each experiment about 50 callus samples were examined.

233 THE INFLUENCE OF SELENIUM COMPOUNDS ON THE PERMEABILITY Measurements of the electric conduction The eflux of ions in the presence of selenium compounds was determined on the basis of electric conduction measurements. Callus tissue (about 1 gram) grown on the control medium (0) was rinsed twice in 0.6 M mannitol solution (5 cm 3 ), (the osmotic pressure equilibrium) in order to remove the remaining nutrient medium ions. Then, callus was transferred into 3 ml of 0.6 mol dm -3 mannitol solution containing additionally selenium ions at the concentrations: 1 mol dm -3 Na 2 SeO 4, (SeO 2-4 ), 1 mol dm -3 (S-120) and 1 mol dm -3 (S-071), and shaken for 30 minutes. The control calli were transferred into the medium containing only 0.6 mmol dm -3 mannitol. After that time callus was removed via filtering and the filtrate was used for the membrane permeability measurements. The filtered calli were put in 3 cm 3 of 0.6 M mannitol solution and heated to 100 C in order to disintegrate the plant membranes. The results obtained for heated solutions were added to those obtained after 30-minute-long shaking in order to calculate the total amount of electrolytes in the cells. The electric conduction was measured with a conductometer Microcomputer Conductivity Metre CC 317 (ELMETRON). Measurements were carried out at 20 C after 3-minute-long stabilisation of the electrode. Before each measurement the conduction was estimated for solutions containing only the tested selenium compounds. ph measurements were carried out with a ph-meter (WTW inolab ph/ion 735). Hydrogen content was estimated at 20 C. Before the measurement ph of solutions containing only selenium compounds was determined. The concentration of hydrogen ions was calculated as -log [H + ] on the basis of the ph value. Redox potential measurements were done with the redox electrode connected to a voltmeter (Axon Pobe Instr.) at 20 C. The results are presented as a percentage of the total content of ions in the cell (relative values) and represent a mean (±SE) of 5 independent repetitions. Results After 2 weeks of culture on the control medium the increment of the mass was about 13 g (Fig. 2). The highest increment was observed for the callus grown on the medium containing non-organic selenium ions. It was higher even in comparison with the control. However, for the media containing S-120 and S-071, the fresh mass increment was significantly lower in comparison with the control by about 0.11 g for S- 120 and by about 0.6 g for S-071. Relative conduction of electrolytes for callus grown on MS medium and shaken for 30 minutes in a solution without selenium ions (0), calculated in relation to the total ion content in the cells, was about 32% (relative efflux), (Fig. 3). In solutions containing selenium compounds the relative effluxes of electrolyte were similar to that of the control (0). A lower efflux was only observed in the presence of S-071 (by about 5% in comparison with the control).

234 258 A. Sieprawska, E. Rudolphi-Skórska, J. Płoskonka Fig. 2. The average increment of the mass wheat calli after 2 weeks of culture on MS (0) medium and on the media additionally containing Se ions. Bars indicate the average from 3 independent experiments (n=50, ±SE) Rys. 2. Przyrost masy (g) po 2 tygodniach hodowli kalusów pszenicy na po ywkach MS (0) oraz wzbogaconych przez jony selenu. rednie z 3 niezale nych eksperymentów (n=50, ±SE) Fig. 3. The relative efflux (in %) of electrolytes (efflux after 30 minutes/total efflux) for calli incubated with Se. Bars indicate the average from 3 independent experiments (n=50, ±SE) Rys. 3. Wzgl dny wypływ elektrolitu (%) po 30 minutach inkubacji w roztworach selenu liczony wzgl dem całkowitego wypływu elektrolitu z tkanek kalusa pszenicy. rednie z 3 niezale nych eksperymentów (n=50, ±SE)

235 THE INFLUENCE OF SELENIUM COMPOUNDS ON THE PERMEABILITY Fig. 4. The relative concentration (in %) of hydrogen ions calculated as the efflux of hydrogen ion H + in relation to the total content of ions in cells. Bars indicate the average from 3 independent experiments (n=50, ±SE); see Material and Methods Rys. 4. Wzgl dne st enie (%) jonów wodorowych wypływaj cych z komórek kalusów pszenicy inkubowanych w obecno ci selenu obliczane wzgl dem całkowitej zawarto ci jonów H +. rednie z 3 niezale nych eksperymentów (n=50, ±SE) Fig. 5. Redox potential of substances leakaged from callus cells after shaking with selenium derivatives. Bars indicate the average from 3 independent experiments (n=50, ±SE) Rys. 5. Potencjał redoks elektrolitu wypływaj cego z komórek kalusów pszenicy inkubowanych w obecno ci selenu. rednie z 3 niezale nych eksperymentów (n=50, ±SE) The content of hydrogen ions leaking from wheat cells, calculated in relation 2- to the total proton content in cells, was similar for cells shaken in the presence of SeO 4 and S-071, but a little lower than for those shaken in the solution 0 (Fig. 4). The

236 260 A. Sieprawska, E. Rudolphi-Skórska, J. Płoskonka addition of Se-120 to wheat cells caused a considerable increase in the hydrogen ions efflux in comparison with the control. The redox potential of the solution leaking from the control cells and in the presence of the tested selenium compounds was similar (Fig. 5). A small, about 20 mv, increase in comparison with the control was observed only in the presence of S-120 introduced into the wheat cell suspension. Discussion The presented results show the influence of non-organic and organic selenium compounds during a short- and long-term treatment of wheat cell callus. Changes in the mass increment (the inhibiting effect on the growth) and a significant (about 50%) increase in the efflux of electrolyte from tissues [ARIF at al. 1995; SUN at al. 2009] are a measure of the stress-inducing action of selenium compounds. On the basis of the presented data it is possible to conclude that short-term action of the tested compounds did not influence significantly the permeability of wheat cell membranes. However, even after such short treatment (30 minutes) in the presence of Se-120 a small increase in the efflux was observed which points to the increase in the permeability of the membranes. Contrary, in the presence of Se-070 a decrease in the efflux was noticed as a result of the decrease in the permeability of the membranes. Those small changes were enhanced after 2 weeks of treatment with those selenium derivatives. Three or four times lower fresh mass increment for the calli in comparison with the control was due to the stressinducing action of those substances. Therefore, even those small changes in the permeability of the membranes observed after the short-term treatment of the cells could provide information about the activation of protection mechanisms against stressinducing factors such as supplementing nutrient media with Se-120 and Se-071. The decrease in the efflux in the presence of Se-071 correlated with the smaller negative effect on the increment of the tissue mass not only in comparison with the control, but also in comparison with Se-120 and may suggest that the decrease in the permeability enabled a decrease in the absorption of this substance by the cells. A decrease in the permeability of the membranes and the dependent increase in the saturation of fatty acids was observed in conditions involving various stress-inducing factors [PILIPOWICZ, FILEK 2000]. It is important to emphasise that the two tested organic molecules differed from each other only by the presence of either an aliphatic or aromatic ligand. On the basis of the obtained results it is possible to conclude that the differences in the chemical structure are important for the transport processes to/from the cell. The action of the non-organic selenium derivative was different in comparison with organic selenium compounds. Not only it did not only effected changes in the membrane permeability during a short-term incubation, but also caused a significant mass increment in comparison with the control. A slight decrease in the content of 2- hydrogen ions leaking from tissues in the presence of SeO 4 can be a result of the inhibition of those ions efflux in order to maintain ion balance. This is supported by the results obtained for the redox potential. In the presence of organic derivatives of Se a higher content of hydrogen ions resulted in higher values of the redox potential. However, this parameter (redox potential) pointing to changes in the equilibrium between the presence of oxidated and reduced molecules seems not to change significantly in the presence of selenium compounds. Acknowledgement The authors would like to thank Dr. Waldemar Tejchman for the synthesis and puri-

237 THE INFLUENCE OF SELENIUM COMPOUNDS ON THE PERMEABILITY fication of the organic selenium compounds. References ARIF I., NEWMAN I.A., KEENLYSIDE N Proton flux measurements from tissues in buffered solution. Plant Cell Environ. 18: DHILLON K.S., DHILLON S.K Distribution and management of seleniferous soils. Advances in Agronomy 79: FOSTER S., KRAUS R., GUNTHER H The metabolism of selenomethionine, Se-methylselenocysteine, their selenonium derivatives, and trimethylselenonium in the rat. Arch. Biochem. Biophys. 251: GUNTHER H Pathways of selenium metabolism including respiratory excretory products. J. Am. Coll. Toxicol. 5: 1-5. MARTENS D.A., SUAREZ D.L Mineralization of selenium containing amino acids in two California soils. Soil Science Society of America Journal 61: MURASHIGE T., SKOOG F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: PILIPOWICZ M., FILEK M Effect of cadmium presence in medium on changes of ion leakage from callus cells of Acer pseudoplatanus L. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 473: SUN J., CHEN S., DAI S., WANG R., LI N., SHEN X., ZHOU X., LU C., ZHENG X., HU Z., ZHANG Z., SONG J., XU Y NaCl - induced alternations of cellular and tissue ion fluxes in roots of salt-resistant and salt-sensitive poplar species. Plant Physiology 149: TAYLOR P., ALBANES D Selenium, vitamin E, and prostate cancer - ready for the prime time. Journal of the National Cancer Institute 90 (Aug. 19): WHITE P.J., BOWEN H.C., PARMAGURU P., FRITZ M., SPRACKLEN W.P., SPIBY R.E., MEACHAM M.C., MEAD A., HARRIMAN M., TRUEMAN L.J., SMITH B.M., THOMAS B., BROADLEY M.R Interaction between selenium and sulphur nutrion in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 55: WHITE P.J., SWARUP K., ESCOBAR-GUTIÉRREZ A.J., BOWEN H.C., WILLEY N.J., BROADLEY M.R Selecting plants to minimise radiocaesium in the food chain. Plant and Soil 249: XUE T., HARTIKAINEN H Association of antioxidative enzymem with the synergistic effect of selenium and UV irradiation in enhancig plant growth. Agricultural Food Science in Finland Vol 9: XUE T., HARTIKAINEN H., PIIRONEN V Antioxidative and growth-promoting effect of selenium on senescing lettuce. Plant and Soil 237: Key words: selenium, electrolyte efflux, wheat callus, stress-inducing Summary Selenium (Se) is an important for plants microelement participating in the antioxidative processes. Its effect on plant cells depends on the chemical character of selenium compound. The aim of the studies was to establish short-term (30 min) and long-term (2 weeks) effects of selenium compounds on cells of wheat callus. Selenate (SeO 4 2- ) and two organic compounds: 3-(4 -metoksyfenylo)-2-seleno-5-

238 262 A. Sieprawska, E. Rudolphi-Skórska, J. Płoskonka cynamylidenotiazolidyno-4-on, (Se-120) and 3-butylo-2 seleno-5-cynamylidenotiazoldyno-4-on (Se-071) which differ from one another due to the presence of an aliphatic or aromatic ligant were chosen for the experiments. The effect of the long-term treatment was measured as a change in the increment of callus fresh mass, while the effect of the short-term treatment was established by measuring the ion efflux (conductometer) with a focus on hydrogen ions and redox compounds. On the basis of the obtained data it is possible to conclude that non-organic selenate administered at the same concentration as organic selenium compounds stimulated the growth of callus tissue while the organic derivatives exhibited a stresslike influence inhibiting the mass increment. This stress-induced effect was observed after 30-minute-long treatment with the tested selenium compounds as changes in the permeability of the plasma membrane (electrolytes efflux). The efflux of hydrogen ions and redox compounds seems to be of less importance for the interaction of selenium compounds with the plasma membrane of wheat cells. Among the organic compounds, the derivative containing the aliphatic chain seems to have less toxic effect than the derivative containing the aromatic group. WPŁYW ZWI ZKÓW SELENU NA PRZEPUSZCZALNO BŁON KOMÓREK KALUSA PSZENICY Apolonia Sieprawska, El bieta Rudolphi-Skórska, Jolanta Płoskonka Instytut Biologii, Uniwersytet Pedagogiczny, Kraków Słowa kluczowe: selen, wypływ elektrolitów, kalus pszenicy, indukcja stresu Streszczenie Selen (Se) jest wa nym mikroelementem uczestnicz cym w procesach antyoksydacyjnych, jednak jego działanie na komórki ro linne zale y od chemicznego charakteru zwi zku w jakim wyst puje. Celem bada było okre lenie krótkookresowego (30 min) i długookresowego (2 tygodnie) działania pochodnych selenu na komórki kalusów pszenicy. Jako zwi zki selenu wybrano selenian (SeO 2-4 ) oraz dwa zwi zki organiczne (Se-120 i Se-071) ró ni ce si obecno ci alifatycznego i aromatycznego podstawnika. Efekt długookresowego działania badano poprzez okre lenie zmian w przyro cie wie ej masy kalusów, natomiast krótkookresowe traktowanie komórek pszenicy okre lano poprzez pomiar wypływu jonów (konduktometr), ze szczególnym uwzgl dnieniem zawarto ci jonów wodorowych oraz zwi zków redoks. Na podstawie uzyskanych danych mo na wnioskowa, i selenian nieorganiczny, podany w tym samym st eniu jak jego organiczne zwi zki, działał stymuluj co na wzrost tkanek kalusowych, podczas gdy organiczne pochodne wykazały efekt stresogenny, znacz co hamuj c przyrost masy. To stresogenne działanie mogło by ju wykazane po 30 min traktowaniu komórek badanymi zwi zkami selenu, jako zmiany w przepuszczalno ci błon (wypływ elektrolitów). Wypływ jonów wodorowych oraz substancji redoks wydaje si mie mniejsze znaczenie w oddziaływaniach zwi zków selenu z błonami komórek pszenicy. Spo ród zwi zków organicznych, pochodna zawieraj ca ła cuch alifatyczny wydaje si wywiera mniejszy toksyczny efekt ni pochodna zawieraj ca grup aromatyczn. Mgr Apolonia Sieprawska

239 THE INFLUENCE OF SELENIUM COMPOUNDS ON THE PERMEABILITY Instytut Biologii Uniwersytet Pedagogiczny ul. Podbrzezie KRAKÓW apolonia.sieprawska@gmail.com

240 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: PRÓBA ZWI KSZENIA AKUMULACJI KWASÓW FENOLOWYCH W KULTURACH in vitro Melittis melissophyllum L. OPRACOWANIE WYNIKÓW METOD LICZB ROZMYTYCH Ewa Skrzypczak-Pietraszek 1, Jacek Pietraszek 2 1 Katedra i Zakład Botaniki Farmaceutycznej, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagiello ski w Krakowie 2 Instytut Informatyki Stosowanej, Politechnika Krakowska w Krakowie Wst p Miodownik melisowaty (Melittis melissophyllum L.) jest bylin z rodziny Lamiaceae, rosn c w rozproszonych stanowiskach w lasach li ciastych Europy. Ziele miodownika (Herba Melittidis) mo e mie ró norodne zastosowanie w medycynie ludowej ze wzgl du na działanie moczop dne, przeciwzapalne, antyseptyczne, uspokajaj ce, przeciwskurczowe [MADAUS 1938]. Działanie lecznicze zwi zane jest z wyst powaniem w ro linie zwi zków chemicznych, m.in. z grupy irydoidów, flawonoidów, kwasów fenolowych, polisacharydów [ WI TEK, CHYBOWSKI 1982; SKRZYPCZAK-PIETRASZEK, HENSEL 2000]. Od roku 2001 miodownik został obj ty cz ciow ochron. Ro linne kultury in vitro mog by ródłem cennych metabolitów wtórnych, alternatywnym w stosunku do ro lin gruntowych. W celu zwi kszenia biosyntezy zwi zków chemicznych w hodowlach tkankowych mo na zastosowa ró ne metody, takie jak np. modyfikowanie składu po ywki, dodatek elicytorów, dodatek prekursorów, immobilizacja lub agregacja komórek [MALEPSZY 2001]. Celem niniejszej pracy była próba zwi kszenia akumulacji wolnych kwasów fenolowych w tkance kalusowej hodowanej w kulturach wytrz sanych Melittis melissophyllum L. po podaniu L-fenyloalaniny jako prekursora. L-fenyloalanina jest wa nym produktem po rednim szlaku biogenetycznego kwasu szikimowego. W wyniku deaminacji tego aminokwasu powstaje kwas cynamonowy oraz inne jego hydroksypochodne o charakterze fenolokwasów [KOHLMÜNZER 2007]. Uzyskane wyniki zostały opracowane statystycznie przy zastosowaniu metody liczb rozmytych dla próbek małolicznych. Kultury in vitro Materiały i metody Materiałem wyj ciowym była kultura kalusowa Melittis melissophyllum L. prowadzona w temp. 25 C ±2 C przy ci głym o wietleniu ok. 900 lx na po ywce MS [MURASHIGE, SKOOG 1962] zestalonej agarem, uzupełnionej BAP (1 mg dm -3 ), NAA (0,5 mg dm -3 ) i GA 3 (0,25 mg dm -3 ). Kultura została pierwotnie wyprowadzona z nasion

241 266 E. Skrzypczak-Pietraszek, J. Pietraszek otrzymanych z europejskich ogrodów botanicznych (Marburg, Triest, Berno, Zürich, Halle, Padwa). Tkanka kalusowa miała kolor ciemnozielony i wykazywała pewien stopie zró nicowania. W celu przeprowadzenia do wiadczenia zało ono hodowl płynn, wytrz san (masa pocz tkowa: po 4 g tkanki kalusowej na kolb Erlenmeyera) o identycznym składzie po ywki jak dla kultury wyj ciowej. Przebieg do wiadczenia Prekursor dodawano do po ywki po dwutygodniowym okresie wzrostu hodowli. W celu okre lenia wła ciwej ilo ci prekursora przeprowadzono dwa do wiadczenia. W pierwszym zastosowano roztwory L-fenyloalaniny (L-FA) o st eniach 50 i 100 mg w przeliczeniu na dm 3 po ywki. Tkank kalusow zbierano po 5, 8 i 11 dniach od momentu dodania prekursora do po ywki. W do wiadczeniu drugim do hodowli dodano roztwory L-FA o st eniach 200 i 600 mg na dm 3 po ywki. Tkank zbierano po 6 i 24 godzinach od momentu dodania prekursora. W obu do wiadczeniach zbierano równie po ywk, któr zamra ano i liofilizowano. Zebrane tkanki kalusowe wysuszono i zwa ono. Analiza zawarto ci kwasów fenolowych Badany materiał poddano ekstrakcji wrz cym metanolem. Wyci gi zag szczono, a nast pnie oczyszczano metod SPE (kolumny: C18 i Quaternary Amine) w celu uzyskania frakcji wolnych kwasów fenolowych (metoda wg [GŁOWNIAK i in. 1996]). Przeprowadzono analiz HPLC (jako ciow i ilo ciow ) otrzymanych frakcji (metoda wg [GŁOWNIAK i in. 1996]). Analizy prowadzono z wykorzystaniem aparatu Merck Hitachi (detektor UV L-7400, kolumna Purospher RP-18e) Warunki analizy HPLC: =254 nm; faza ruchoma metanol-woda 25:75 v/v z1% dodatkiem kwasu octowego; substancje wzorcowe (Fluka, Sigma), czasy retencji (min): L-fenyloalanina (prekursor) RT=3,77, kwas chlorogenowy RT=8,68, ferulowy RT=28,24, galusowy RT=3,44, 4- hydroksybenzoesowy RT=12,19, kawowy RT=11,31, m-kumarowy RT=32,31, o- kumarowy RT=47,62, p-kumarowy RT=24,16, syryngowy RT=14,90, wanilinowy RT=11,83. Analiza statystyczna Badane próbki charakteryzowały si niewielk liczno ci : w przypadku próbek kontrolnych wynosiła ona 2, w przypadku próbek z zawarto ci prekursora wynosiła ona 3. Bezpo rednie zastosowanie rutynowych metod analizy statystycznej [SZYDŁOWSKI (red.) 1981] prowadzi do uzyskania przedziałów ufno ci charakteryzuj cych si bardzo du ym rozrzutem. Przy zało eniu 95% poziomu ufno ci, dla próby kontrolnej jest to ponad 25-krotno odchylenia standardowego, a dla próbek z zawarto ci prekursora jest 9-krotno odchylenia standardowego. Tak pesymistyczne podej cie jest zwi zane z zało eniem o normalno ci rozkładu i mał liczno ci prób. Przeprowadzanie nieparametrycznego testu normalno ci [ZIELI SKI 1972] nie ma jednak sensu, gdy przy małej liczno ci prób test zgodno ci z dowolnym rozkładem da odpowied pozytywn. Alternatywnym w stosunku do probabilistycznego podej ciem do analizy małych prób jest zastosowanie liczb rozmytych [ZIMMERMAN 2001], a w szczególno ci ich wariantów trójk tnych i trapezoidalnych [GRZEGORZEWSKI 2002, 2003]. Opracowano ju

242 PRÓBA ZWI KSZENIA AKUMULACJI KWASÓW FENOLOWYCH metody analizy danych w przypadku rozmytego opisu niepewno ci [GRZEGORZEWSKI 2006]. W przypadku ogólnym rozwa a si trzy człony podlegaj ce rozmyciu: dane, statystyki opisowe oraz warunki dodatkowe. W rozwa anym przypadku rozmyciu podlegaj wył cznie dane. Krzywe regresyjne s opracowane w wariancie wielomianów pasmowych ujmuj cych odpowiednio: warto ci maksymalne, median i warto ci minimalne. W przypadku próby kontrolnej mediana jest wyznaczana jako warto rednia z warto ci skrajnych. Wyniki i dyskusja Po przeprowadzeniu pierwszego do wiadczenia (L-FA o st eniu 50 i 100 mg na dm 3 po ywki) w otrzymanych frakcjach stwierdzono obecno kilkunastu zwi zków o charakterze kwasów fenolowych. Zidentyfikowano dziesi z nich. Dla sze ciu fenolokwasów (kwasy: kawowy, galusowy, p-kumarowy, m-kumarowy, o-kumarowy, 4-hydroksybenzoesowy) i dla prekursora wykonano analiz ilo ciow. Pozostałe zidentyfikowane zwi zki (kwasy: wanilinowy, syryngowy, ferulowy, chlorogenowy) wyst powały w ilo ciach ladowych. Badano równie zliofilizowan po ywk nie stwierdzono w niej obecno ci kwasów fenolowych. W wyniku przeprowadzonej analizy nie stwierdzono istotnego statystycznie wpływu dodania prekursora na zwi kszenie akumulacji kwasów fenolowych w tkance kalusowej Melittis melissophyllum L. hodowanej w kulturach wytrz sanych (rys. 1 na przykładzie kwasu p-kumarowego; warto ci odchyle dla próbek badanych nie wykraczaj poza górny zakres odchyle dla próby kontrolnej). W zwi zku z tym kontynuowano badania i przeprowadzono drugie do wiadczenie. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, e nast pił wyra ny, istotny statystycznie (rys. 2 na przykładzie kwasu p-kumarowego; warto ci odchyle dla próbek badanych s powy ej górnego zakresu odchyle dla próby kontrolnej) wzrost biosyntezy fenolokwasów po dodaniu prekursora o st eniu 200 i 600 mg na dm 3 po ywki (tab. 1, wyj tkiem był kwas galusowy, który uzyskano w ilo ciach ladowych). Zauwa ono, e zwi kszenie biosyntezy pod wpływem prekursora nie jest jednakowe dla ka dego kwasu. Najwi kszy wzrost akumulacji uzyskano dla próbek pobranych po 6 godzinach od momentu dodania prekursora (tab. 1). Dla kwasu o-kumarowego stwierdzono 11,6- krotny (L-FA 600 mg dm -3 ) i 7,2-krotny (L-FA 200 mg dm -3 ), a dla kwasu p- kumarowego 7,5-krotny (L-FA 600 mg dm -3 ) wzrost biosyntezy w porównaniu z próbami kontrolnymi. Jednocze nie, badaj c zawarto kwasu o-kumarowego po 24 godz. od momentu dodania prekursora, nie stwierdzono zwi kszenia jego akumulacji. Zaobserwowano 2 4 krotny wzrost zawarto ci pozostałych fenolokwasów. Nie stwierdzono istotnego statystycznie wpływu dodania prekursora na przyrost biomasy przy adnym z zastosowanych st e L-FA.

243 268 E. Skrzypczak-Pietraszek, J. Pietraszek Rys. 1. Analiza metod liczb rozmytych dla próbek małolicznych na przykładzie kwasu p-kumarowego odchylenia zawarto ci kwasu fenolowego w próbkach badanych (prekursor: 50 i 100 mg dm -3 ) w porównaniu z prób kontroln Fig. 1. Fuzzy number analysis for small amount samples, e.g. for p-coumaric acid deviation of phenolic acid content in the investigated samples (precursor: 50 and 100 mg dm -3 ) in comparison to the control sample W dost pnej literaturze nie znaleziono doniesie dotycz cych fenolokwasów w kulturach in vitro Melittis melissophyllum L. i prób zwi kszenia ich biosyntezy. Z danych literaturowych znany jest fakt zwi kszenia akumulacji kwasów fenolowych w kulturach in vitro Salvia officinalis L. po dodaniu L-fenyloalaniny do hodowli [MALEPSZY 2001]. Aminokwas ten mo e by równie prekursorem metabolitów wtórnych nale cych do innych grup chemicznych, np. alkaloidów, kumaryn, lignanów, flawonoidów [KOHLMÜNZER 2007]. L-FA jest prekursorem N-benzoylofenyloizoseryny, stanowi cej boczne odgał zienie w cz steczce taksolu. Dodatek tego aminokwasu do kultury Taxus cuspidata zwi kszał produkcj cytostatyka. W przypadku kultury zawiesinowej Datura stramonium L. wprowadzenie do po ywki L-FA oraz L-ornityny spowodowało wzrost biosyntezy alkaloidów tropanowych i indolowych [MALEPSZY 2001].

244 PRÓBA ZWI KSZENIA AKUMULACJI KWASÓW FENOLOWYCH Rys. 2. Analiza metod liczb rozmytych dla próbek małolicznych na przykładzie kwasu p-kumarowego odchylenia zawarto ci kwasu fenolowego w próbkach badanych (prekursor: 200 i 600 mg dm -3 ) w porównaniu z prób kontroln Fig. 2. Fuzzy number analysis for small amount samples, e.g. for p-coumaric acid deviation of phenolic acid content in the investigated samples (precursor: 200 and 600 mg dm -3 ) in comparison to the control sample L-FA jest podstawowym prekursorem fenolokwasów pochodnych kwasu cynamonowego [KOHLMÜNZER 2007]. Zaobserwowano, e po dodaniu L-FA do hodowli Melittis melissophyllum L. biosynteza kwasów fenolowych powstaj cych na pocz tku tego szlaku metabolicznego mo e zwi ksza si ju w pierwszych godzinach po dodaniu prekursora (np. kwas o- i p-kumarowy po 6 godz. tab. 1). Jest to proces dynamiczny, gdy zwi zki przekształcane s w dalsze pochodne. W zwi zku z tym ich zawarto mo e pó niej male (np. te same kwasy po 24 godz. tab. 1).

245 270 E. Skrzypczak-Pietraszek, J. Pietraszek Tabela 1; Table 1 Zawarto kwasów fenolowych w kulturach in vitro Melittis melissophyllum L. po dodaniu prekursora Content of phenolic acids in in vitro cultures of Melittis melissophyllum L. after the administration of the precursor Kwas fenolowy Phenolic acid kontrola control Zawarto kwasów fenolowych (mg g -1 s.m.) Content of phenolic acids (mg g -1 DM) po 6 godz.; after 6 h L-fenyloalanina L-phenylalanine kontrola control po 24 godz.; after 24 h L-fenyloalanina L-phenylalanine 200 mg dm mg dm mg dm mg dm -3 Kawowy; Caffeic 0, , , , , ,05590 p-kumarowy; p-coumaric 0, , , , , ,00319 m-kumarowy 0, , , , , ,03650 m-coumaric o-kumarowy; o-coumaric 0, , , , , , hydroksybenzoesowy 4-hydroxybenzoic 0, , , , , ,00224 Z kwasu cynamonowego i jego pochodnych w wyniku kilkuetapowej przemiany mog powsta zwi zki aromatyczne, np. pochodne kwasu benzoesowego [KOHLMÜNZER 2007]. By mo e to jest przyczyn, e w pierwszej dobie po dodaniu L-FA do po ywki kwas galusowy mo na oznaczy jedynie w ilo ciach ladowych. W tym przypadku pobranie próbek po kilku dniach byłoby celowe. Planowana jest kontynuacja bada nad optymalizacj zwi kszenia biosyntezy fenolokwasów w kulturach in vitro Melittis melissophyllum L. z zastosowaniem L-fenyloalaniny jako prekursora. Wnioski W tkance kalusowej Melittis melissophyllum L. hodowanej w kulturach wytrz sanych nast puje zwi kszenie biosyntezy kwasów fenolowych po dodaniu L-fenyloalaniny w ilo ci mg na dm 3 po ywki. Dodatek prekursora w ilo ci mg dm -3 nie wpływa na przyrost biomasy badanej kultury in vitro. Literatura GŁOWNIAK K., ZGÓRKA G., KOZYRA M Solid-phase extraction and reversed-phase high performance liquid chromatography of free phenolic acids in some Echinacea species. Journal of Chromatography 730: GRZEGORZEWSKI P Nearest interval approximation of a fuzzy number. Fuzzy Sets and Systems 130: GRZEGORZEWSKI P Trapezoidal approximation of fuzzy sets, w: Fuzzy Sets and Systems IFSA T. Bolgiç (red.). Lecture Notes in Artificial Intelligence 2715:

246 PRÓBA ZWI KSZENIA AKUMULACJI KWASÓW FENOLOWYCH GRZEGORZEWSKI P Wspomaganie decyzji w warunkach niepewno ci. Metody statystyczne dla nieprecyzyjnych danych. AOW Exit, Warszawa: 324 ss. KOHLMÜNZER S Farmakognozja. Wyd. Lekarskie PZWL, Warszawa: 670 ss. MADAUS G Lehrbuch der Biologischen Heilmittel. Bd I, Georg Thieme Verlag, Leipzig: 640. MALEPSZY S Biotechnologia ro lin. PWN, Warszawa: 607 ss. MURASHIGE T., SKOOG F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: SKRZYPCZAK-PIETRASZEK E., HENSEL A Polysaccharides from Melittis melissophyllum L. herb and callus. Pharmazie 55(10): SZYDŁOWSKI H. (red.) Teoria pomiarów. Wyd. PWN, Warszawa: 442 ss. WI TEK L., CHYBOWSKI J Identyfikacja niektórych składników chemicznych w Melittis melissophyllum L. Annales Universitatis Mariae Curie-Skłodowska Lublin. 37(20): ZIELI SKI R Tablice statystyczne. PWN, Warszawa: 392 ss. ZIMMERMAN H.J Fuzzy set theory and its applications. Kluwer Academic Publishers, Boston-Dordrecht-London: 514 ss. Słowa kluczowe: kwasy fenolowe, Melittis melissophyllum L., kultury kalusowe, L-fenyloalanina Streszczenie W pracy próbowano zwi kszy akumulacj wolnych kwasów fenolowych w tkance kalusowej w kulturach wytrz sanych Melittis melissophyllum L. po dodaniu L-fenyloalaniny jako prekursora. Kultury prowadzono w po ywce MS uzupełnionej BAP (1 mg dm -3 ), NAA (0,5 mg dm -3 ), GA 3 (0,25 mg dm -3 ). L-fenyloalanina była dodawana do po ywki w 14. dniu od zało enia hodowli. Ekstrakty metanolowe z tkanek kalusowych były oczyszczane za pomoc SPE. Analizy kwasów fenolowych prowadzono metod HPLC. St enia L-fenyloalaniny 50 i 100 mg na litr po ywki nie miały adnego znacz cego wpływu na akumulacj kwasów fenolowych. Wy sza zawarto prekursora (200 i 600 mg dm -3 ) wyra nie zwi kszyła biosyntez wolnych kwasów fenolowych w kulturach kalusowych Melittis melissophyllum L. Uzyskane wyniki zostały opracowane statystycznie przy zastosowaniu metody liczb rozmytych dla próbek małolicznych. ATTEMPT AT STIMULATION THE PHENOLIC ACIDS ACCUMULATION IN in vitro CULTURES OF Melittis melissophyllum L. Ewa Skrzypczak-Pietraszek 1, Jacek Pietraszek 2

247 272 E. Skrzypczak-Pietraszek, J. Pietraszek 1 Chair and Department of Pharmaceutical Botany, Collegium Medicum, Jagiellonian University, Kraków 2 Institute of Applied Computer Science, Cracow University of Technology, Kraków Key words: phenolic acids, Melittis melissophyllum L., callus cultures, L-phenylalanine Summary The aim of the present investigation was an attempt at increasing the accumulation of free phenolic acids in Melittis melissophyllum L. callus tissue in agitated cultures after the addition of L-phenylalanine as the precursor. Cultures were maintained in the MS medium supplemented with BAP (1 mg dm -3 ), NAA (0.5 mg dm -3 ), GA 3 (0.25 mg dm -3 ). L-phenylalanine was added to the medium on the 14 th day after inoculation. Methanol extracts from callus tissues were purified by means of SPE. The analyses of phenolic acids were conducted by the HPLC method. Concentrations of L- phenylalanine of 50 and 100 mg per one dm 3 of medium had no significant influence on the accumulation of phenolic acids. Higher amounts of the precursor (200 and 600 mg dm -3 ) significantly increased the biosynthesis of free phenolic acids in the callus cultures of Melittis melissophyllum L. Results obtained were statistically developed by fuzzy number method for small amount samples. Dr Ewa Skrzypczak-Pietraszek Katedra i Zakład Botaniki Farmaceutycznej Collegium Medicum Uniwersytet Jagiello ski ul. Medyczna KRAKÓW pmpietra@cyf-kr.edu.pl

248 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: WPŁYW WYBRANYCH CZYNNIKÓW NA INDUKCJ ANDROGENEZY OWSA (Avena sativa L.) 1 Edyta Skrzypek, Agata Stawicka, Ilona Czyczyło-Mysza, Marta Pilipowicz, Izabela Marci ska Instytut Fizjologii Ro lin im. Franciszka Górskiego PAN w Krakowie Wst p Sposób uzyskiwania podwojonych haploidów na drodze androgenezy, czyli stymulacji do rozwoju komórek mikrospor w hodowli ro lin uzale niony jest od wydajno ci zastosowanej metody, tzn. od produkcji du ej liczby haploidalnych ro lin i efektywnego podwajania chromosomów. U zbó haploidalne ro liny otrzymywane s metodami kultur pylnikowych, izolowanych mikrospor lub krzy owa oddalonych. Za najbardziej wydajn i najprostsz do realizacji uznawana jest metoda kultur pylnikowych, stosowana na skal masow w produkcji haploidów pszenicy. Praktyczne zastosowanie ró nych metod uzyskiwania haploidów w hodowli ro lin ci gle ograniczone jest bardzo nisk indukcj embriogennych struktur zarodkowych i regeneracj ro lin. Owies jest jednym z gatunków zbó najbardziej opornych na androgenez. Do tej pory brak jest metody uzyskiwania haploidów owsa na du skal. Tylko nieliczne haploidy owsa dotychczas uzyskano w kulturach izolowanych pylników [RINES 1983; KIVIHARJU i in. 1997; KIVIHARJU, PEHU 1998; KIVIHARJU, TAURIAINEN 1999; KIVIHARJU i in. 2000, 2005], a tak e poprzez krzy owanie z kukurydz [RINES, DAHLEEN 1990; MATZK 1996; RIERA-LIZARAZU i in. 1996; RINES i in. 1997; SIDHU i in. 2006]. Otrzymanie struktur androgenicznych i regeneracja haploidów uzale nione s od wielu czynników, np. genotypu ro lin donorowych, traktowania wst pnego wiech, składu po ywek czy warunków prowadzenia kultury. Celem bada było opracowanie efektywnej metody uzyskiwania podwojonych haploidów owsa (Avena sativa L.) na drodze androgenezy. Do realizacji zało onego celu wybrano kultur pylnikow. Porównano wpływ długo ci czasu chłodzenia wiech, rodzaju i wła ciwo ci fizycznych po ywki oraz zag szczenia kultury pylników na indukcj embriogennych struktur kalusowych i regeneracj haploidalnych ro lin wybranych genotypów owsa. 1 Badania finansowane z dotacji MRiRW nr HORhn-4040dec-13/08.

249 274 E. Skrzypek i inni Materiał i metody Materiał ro linny do uzyskania ro lin haploidalnych stanowiło 25 genotypów owsa: F 1 136, F 1 144, F 1 145, F 1 164, F 1 241, F /1, F 2 301, F 2 306, F 2 308, F 2 310, F 2 364, F 2 375, F 2 376, F 2 398, Fl. stern Chwat, Santor Chwat, 3/20/2/1, 3/20/8/1, 3/20/9/1, 4/6/3/1, 4/6/20/1, 4/6/4/1, Chwat, Lisbet i Aslak. Ro liny donorowe (5 do 20 ro lin na genotyp) rosły w klimatyzowanej szklarni, w temperaturze 21-25/18 C (dzie /noc). W dni pochmurne oraz po zapadni ciu zmroku ro liny do wietlano lampami sodowymi (16/8 h dzie /noc, nat enie napromieniowania ok. 250 mol(fotonów) m 2 s -1 PAR). Raz w tygodniu ro liny zasilano po ywk Hoaglanda [HOAGLAND, ARNON 1938]. Po około 6-7 tygodniach wzrostu ro lin cinano wiechy (ok. 5 wiech z jednej ro liny), owijano foli i umieszczano na okres 1-3 tygodni w temperaturze 4 C, w ciemno ci, w po ywce Hoaglanda zawieraj cej 0,05% kwasu hydroksynikotynowego. Nast pnie wiechy dezynfekowano, a pylniki wykładano do 5- cm płytek Petriego z po ywk W14 [OUYANG i in. 1989] z obni on do połowy zawarto ci składników mineralnych oraz na po ywk C17 [WANG, CHEN 1983]. Pylniki indukowano w temperaturze 32 C, w ciemno ci przez okres od 5 dni. Nast pnie kultury prowadzono w temperaturze 28 C i w ciemno ci. Po 6-8 tygodniach kultury okre lano liczb tworz cych si androgenicznych struktur zarodkowych oraz ywotno pylników wg 4-stopniowej skali, gdzie 4 oznacza czarne pylniki i obumarłe mikrospory, 3 ciemnobr zowe pylniki i ok. 25% ywych mikrospor, 2 jasnobr zowe pylniki i ok. 50% ywych mikrospor, 1 zielone pylniki i ok. 75% ywych mikrospor. Androgeniczne struktury zarodkowe wykładano na zestalon Phytagelem po ywk W14, zawieraj c 2 mg dm -3 NAA, 0,05 mg dm -3 kinetyny i 20 g dm -3 sacharozy. Po ok. 2-4 tygodniach zregenerowane ro liny pasa owano na po ywk MS [MURASHIGE, SKOOG 1962] zawieraj c połow składników mineralnych. Po 3 tygodniach ro liny przenoszono do pojemników wypełnionych perlitem zwil onych po ywk Hoaglanda. Po kolejnych 2 tygodniach ro liny przenoszono do doniczek z ziemi ogrodnicz w celu ich lepszego ukorzenienia. Ro liny kolchicynowano w wodnym roztworze zawieraj cym 1 g dm -3 kolchicyny, 40 g dm -3 DMSO, 3 g dm -3 Tweenu i 0,025 g dm -3 GA 3 przez okres 7,5 h, w temperaturze 25 C i o wietleniu mol(fotonów) m 2 s -1 PAR. Po kolchicynowaniu korzenie ro lin płukano w bie cej wodzie przez 48 h. Po tym czasie ro liny ponownie umieszczano w doniczkach z gleb. Nast pnie sprawdzano ploidalno zregenerowanych ro lin za pomoc cytometru przepływowego. Ro liny rosły w szklarni a do uzyskania pełnej dojrzało ci nasion. Wyniki i dyskusja Uzyskiwanie podwojonych haploidów owsa opisywane jest w literaturze jako bardzo trudne w porównaniu z innymi zbo ami. W ostatnich latach pojawiło si tylko kilka doniesie literaturowych na temat regeneracji owsa drog androgenezy. Tworzenie si kalusa w kulturach pylnikowych owsa zostało po raz pierwszy opisane w latach 80-tych przez CHUNG [1980] oraz RINES i MCCOY [1981]. CHUNG [1980] udowodnił, e kalus ten pochodził z mikrospor. Pierwsz haploidaln ro lin owsa (i jedyn ) oraz dwie diploidalne uzyskał RINES [1983] prowadz c kultury pylnikowe odmiany Stout. Badania te pokazały, e mo liwe jest uzyskanie ro lin owsa drog androgenezy. POLSONI [1991] obserwował tworzenie si kalusa w kulturach pylnikowych owsa, ale bez regeneracji ro lin. Dwana cie zielonych regenerantów i jeden albinotyczny nieoplewionego owsa A. nuda uzyskał SUN i in. [1991]. Na trzy ro liny, które prze yły, dwie były haploidalne, a jedna euploidalna. Równie KIVIHARJU i in. [1997]

250 WPŁYW WYBRANYCH CZYNNIKÓW NA INDUKCJ ANDROGENEZY OWSA zregenerowali pi ro lin owsa metod kultur pylnikowych, z czego jedna była haploidalna, dwie diploidalne i dwie albinotyczne. W kolejnych eksperymentach KIVIHARJU i in. [1998] przebadali 44 genotypy A. sativa pod wzgl dem ich podatno ci na androgenez. Trzydzie ci genotypów produkowało kalus, a tylko u siedmiu z nich uzyskano struktury zarodkowe na pojedynczych pylnikach (na 1-8 pylnikach). Jednak struktury te nie regenerowały ro lin. Natomiast z 15 badanych genotypów A. sterilis cztery produkowały struktury zarodkowe, z których uzyskano 40 haploidalnych ro lin. Po skrzy owaniu A. sativa z A. sterilis uzyskano tylko jedn ro lin haploidaln [KIVIHARJU i in. 2000]. Silna zale no genotypowa androgenezy owsa została kolejny raz potwierdzona w badaniach LUSARKIEWICZ-JARZINA i PONITKA [2007], które otrzymały zielone ro liny tylko z 2 genotypów spo ród 15 testowanych. W badaniach własnych z 25 genotypów, 16 indukowało kalus, z 8 otrzymano regeneranty, a z 2 uzyskano podwojone haploidy (tab. 1). Stres, jakiemu poddawane s ro liny donorowe (niska/wysoka temperatura, stres głodowy lub kombinacja wymienionych czynników) jeszcze przed zało eniem kultury mo e stymulowa przej cie mikrospor na drog androgenezy. U owsa wst pne traktowanie temperatur 4 C lub 30 C zwi kszało produkcj kalusa, ale nie miało wpływu na regeneracj ro lin [KIVIHARJU, PEHU 1998]. W obecnej pracy chłodzenie wiech w 4 C przed izolacj pylników zwi kszało ywotno kultur, lecz nie miało wpływu na regeneracj (rys. 1A). Decyduj c rol w procesie androgenezy odgrywa równie skład i rodzaj po ywek. Aktywnym czynnikiem po ywki s auksyny lub ich analogi oraz cytokininy. Najcz ciej stosuje si 2,4-D i kinetyn. St enie i wzajemny stosunek tych dwóch składników jest zmienny w zale no ci od gatunku, odmiany, rodzaju i płynno ci po ywki oraz innych czynników. Modyfikacja składu podło a hodowlanego polega równie na odpowiednim dobraniu rodzaju i st enia zwi zków azotowych oraz cukrów. Wysokie st enia (5 i 8 mg dm -3 ) 2,4-D i po ywka W14 stymulowały tworzenie struktur zarodkowych owsa [KIVIHARJU, TAURIAINEN 1999; KIVIHARJU i in. 2000]. W badaniach własnych tworzenie struktur zarodkowych nie było zale ne od płynno ci po ywki, a najwi ksz ywotno pylników obserwowano na po ywce stałej (rys. 1B). Podobnie LUSARKIEWICZ-JARZINA i PONITKA [2007] pomimo braku istotnych statystycznie ró nic w ilo ci otrzymanych struktur embriogennych w zale no ci od płynno ci po ywki, obserwowały wi ksz indukcj struktur embriogennych na po ywce stałej w porównaniu z płynn i dwuwarstwow. W naszych do wiadczeniach regeneracj obserwowano nie tylko na po ywce W14, ale i na C17 (rys. 1C). Równie zag szczenie kultur (ilo pylników na ilo po ywki) równie mo e mie wpływ na odpowied androgeniczn kultur. Jednak e w przeprowadzonym do wiadczeniu nie obserwowano ró nic w ywotno ci pylników i pó niejszej regeneracji w zale no ci od ilo ci pylników wyło onych na szalk (rys. 1D).

251 276 E. Skrzypek i inni

252 WPŁYW WYBRANYCH CZYNNIKÓW NA INDUKCJ ANDROGENEZY OWSA Tabela 1; Table 1 Liczba ro lin, wiech i pylników owsa u ytych do indukcji androgenezy oraz liczba uzyskanych kalusów/struktur zarodkowych i zregenerowanych ro lin The number of oat plants, panicles and anthers used for androgenesis induction and the number of obtained calluses/embryo structures and regenerated plants Genotyp Genotype Liczba ro lin No. of plants Liczba wiech No. of panicles Liczba pylników No. of anthers Liczba kalusów/ struktur zarodkowych; No. of calluses/embryo structures Liczba regeneratów No. of regenerants Liczba ro lin po kolchicynowaniu No. of plants after colchicine treatment F F F F F F / F F F F F F F F Fl. stern Chwat Santor Chwat /20/2/ /20/8/ /20/9/ /6/3/ /6/20/ /6/4/ Chwat Lisbet Aslak Razem; Total Efektywno procesu androgenezy na po ywce W14, ilo uzyskanych zielonych ro lin haploidalnych, znacz co poprawiły równie warunki prowadzenia kultur in vitro, takie jak: temperatura, fotoperiod, jako i intensywno o wietlenia [KIVIHARJU i in. 2005]. Jednak e zale no ci tej nie obserwowano w badaniach własnych testuj c polskie genotypy owsa.

253 278 E. Skrzypek i inni Wnioski 1. Chłodzenie wiech owsa w temperaturze 4 C przez okres 1-2 tygodni przed izolacj pylników oraz zastosowanie po ywki W14B i C17 umo liwia indukcj i regeneracj w kulturach pylnikowych przy najdłu szej ywotno ci kultur. 2. Zag szczenie kultury pylników oraz stopie płynno ci po ywki nie wywieraj wpływu na indukcj i regeneracj kultur pylnikowych owsa. Literatura CHUNG S.W Anther culture in oats (Avena sativa L.). Ph.D. Thesis, McGill University, Canada. Diss. Abstr. 41: 2845-B. HOAGLAND D.R., ARNON D.I A water culture method for growing plants without soil. Circ. Univ. Calif., Agric. Exp. Stn. No KIVIHARJU E., LAURILA J., LEHTONEN M., TANHUANPÄÄ P., MANNINEN O Anther culture properties of oat x wild red oat progenies and a search for RAPD markers associated with anther culture ability. Agricultural and Food Science 13(1-2): KIVIHARJU E., MOISANDER S., LAURILA J Improved green plant regeneration rates from oat anther culture and the agronomic performance of some DH lines. Plant Cell Tiss Organ Cult. 81: 1 9. KIVIHRAJU E., PEHU E The effect of cold and heat pretreatment on anther culture response of Avena sativa and A. sterilis. Plant Cell Tiss Organ Cult. 54: KIVIHRAJU E., PUOLIMATKA M., PEHU E Regeneration of anther-derived plants of Avena sterilis. Plant Cell Tiss Organ Cult. 48(2): KIVIHRAJU E., PUOLIMATKA M., SAASTAMOINEN M., HOVINEN S., PEHU E The effect of genotype on anther culture response of cultivated and wild oats. Agricultural and Food Science in Finland 7: KIVIHRAJU E., PUOLIMATKA M., SAASTAMOINEN M., PEHU E Extension of anther culture to several genotypes of cultivated oats. Plant Cell Rep. 19: KIVIHRAJU E., TAURIAINEN A ,4-dichlorophenoxyacetic acid and kinetin in anther culture of cultivated and wild oats and their interspecific crosses: plant regeneration from Avena sativa L. Plant Cell Rep. 18: MATZK F Hybrid crosses between oat and Andropogoneae or Paniceae species. Crop Sci. 36: MURASHIGE T., SKOOG F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: OUYANG J.W., JIA S.E., ZHANG C., CHEN X., FENG G A new synthetic medium (W14) for wheat anther culture. Ann. Rep. Inst. Genet. Aca. Sinica, Beijing, China: POLSONI L The induction of microspore embryogenesis in anther culture of oats (Avena sativa L.). M.S. Thesis, University of Guelph, Canada: 126. RIERA-LIZARAZU O., RINES H.W., PHILLIPS R.L Cytological and molecular characterization of oat x maize hybrids. Theor Appl Genet. 93: RINES H.W Oat anther culture: Genotype effect on callus initiation and the production of haploid plant. Crop Sci. 23: RINES H.W., DAHLEEN L.S Haploid oat plants produced by application of maize pollen to emasculated oat florets. Crop Sci. 30:

254 WPŁYW WYBRANYCH CZYNNIKÓW NA INDUKCJ ANDROGENEZY OWSA RINES H.W., MCCOY T.J Tissue culture initiation and plant regeneration in hexaploid species of oats. Crop Sci. 21: RINES H.W., RIERA-LIZARAZU O., NUNEZ V.M., DAVIS D.W., PHILLIPS R.L Oat haploids from anther culture and from wide hybridizations, w: In vitro haploid production in higher plants. Jain S.M., Sopory S.K., Veilleux R.E. (red.). Kluwer Academic Publishers, The Netherlands, vol. 4: SHIDU P.K., HOWES N.K., AUNG T., ZWER P.K., DAVIES P.A Factors affecting oat haploid production following oat x maize hybrydization. Plant Breeding 125: SUN C.S., LU T-G., SONDAHL M.R Anther culture of naked oat and the establishment of its haploid suspension cell. Acta Bot. Sin. 33: LUSARKIEWICZ-JARZINA A., PONITKA A The effect of physical medium state on anther culture response in Polish cultivated oat (Avena sativa L.). Acta Biol. Cracov. 49(2): WANG P., CHEN Y Preliminary study on prediction of height of pollen H2 generation in winter wheat grown in the field. Acta Agron. Sin. 9: Słowa kluczowe: Avena sativa L., kultury pylników, wst pne chłodzenie, płynno po ywki Streszczenie Opracowano metod otrzymywania haploidów owsa metod izolowanych pylników. Materiał ro linny stanowiło 25 genotypów owsa. Ro liny donorowe rosły w warunkach szklarniowych, a kłosy cinano, gdy wi kszo mikrospor znajdowała si w fazie pó nojednoj drowej. Pylniki wykładano na po ywki ró ni ce si składem mikro-, makroelementów, witamin oraz st eniami regulatorów wzrostu. Po 6-8 tygodniach kultury okre lano liczb tworz cych si androgenicznych struktur zarodkowych oraz oceniano ywotno pylników. Po ok. 2-4 tygodniach zregenerowane haploidalne ro liny aklimatyzowano do warunków szklarniowych i podwajano liczb chromosomów. W wyniku przeprowadzonych do wiadcze stwierdzono, i indukcja i regeneracja w kulturach pylnikowych owsa jest mo liwa, je eli przed izolacj pylników wiechy chłodzono w 4 C przez okres 1-2 tygodni, a pylniki indukowano w temperaturze 32 C przez okres 5 dni, a nast pnie w 28 C, w ciemno ci, na po ywkach C17 i W14 z dodatkiem 5 mg dm -3 2,4-D, 0,5 mg dm -3 BAP, 50 mg dm -3 L-cysteiny, 500 mg dm -3 mioinozytolu i 20 mg dm -3 etefonu. Zag szczenie kultury i płynno po ywki nie miały statystycznie istotnego wpływu na indukcj i regeneracj kultur. Spo ród 25 testowanych genotypów owsa, 16 regenerowało embriogeniczne struktury kalusowe, z 8 otrzymano regeneranty, a tylko z 2 genotypów podwojone haploidy. THE INFLUENCE OF SELECTED FACTORS ON THE INDUCTION OF OAT (Avena sativa L.) ANDROGENESIS Edyta Skrzypek, Agata Stawicka, Ilona Czyczyło-Mysza, Marta Pilipowicz, Izabela Marci ska Institute of Plant Physiology Polish Academy of Sciences, Kraków

255 280 Key words: E. Skrzypek i inni Avena sativa L., anther culture, cold pretreatment, medium fluidity Summary The aim of the study was to elaborate the method for oat haploid production using anther cultures. Donor plants of 25 oat genotypes grew in the greenhouse conditions, and panicles were cut when most of microspores were at the late uninucleus stage. Anthers were placed on media which differed in micro- and macroelements, vitamins and growth regulators. After 6-8 weeks of the culture the number of androgenic structures and vitality of culture were evaluated. Than, 2-4 weeks later, the regenerated haploids were acclimated to the greenhouse conditions and chromosomes were doubled. It was shown that the induction and regeneration of oat anther culture was possible if panicles were cooled at 4 C for 1-2 weeks before the anther isolation, and anthers were induced at 32 C for 5 days, and next at 28 C, in the dark, on C17 and W14 media with 5 mg dm -3 2,4-D, 0.5 mg dm -3 BAP, 50 mg dm -3 L-cysteine, 500 mg dm -3 mioinositol and 20 mg dm -3 ethephone. Culture density and media fluidity had not statistically significant effect on the culture induction and regeneration. Among 25 tested oat genotypes, 16 regenerated callus structures, 8 regenerated plantlets, but doubled haploids were obtained only from 2 genotypes. Dr in. Edyta Skrzypek Instytut Fizjologii Ro lin im. F. Górskiego PAN ul. Niezapominajek KRAKÓW skrzypek@ifr-pan.krakow.pl

256

257 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: WPŁYW SUBSTANCJI PRZECIWUTLENIAJ CYCH W PO YWKACH NA NAMNA ANIE W KULTURACH in vitro PRZYLASZCZKI POSPOLITEJ (Hepatica nobilis SCHREB.) Bo ena Szewczyk-Taranek, Zbigniew Pindel Katedra Ro lin Ozdobnych, Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołł taja w Krakowie Wst p Przylaszczka pospolita (Hepatica nobilis SCHREB.) z rodziny jaskrowatych (Ranunculaceae) jest jedn z najbardziej warto ciowych bylin wczesnej wiosny. W Polsce znajduj si jej liczne stanowiska w lasach li ciastych i mieszanych. Pozyskiwanie przylaszczki ze stanowisk naturalnych do ozdoby ogrodów przydomowych spowodowało, e od 2004 roku obj ta została całkowit ochron gatunkow [PI KO - MIRKOWA, MIREK 2006]. Walory ozdobne przylaszczki, takie jak: efektowne fioletowoniebieskie kwiaty, dekoracyjne, zimotrwałe ulistnienie, cieniozno no oraz długowieczno czyni z niej cenn bylin. Liczne odmiany ogrodowe (o pełnych, ró owych lub białych kwiatach, ozdobnych li ciach) zwi kszaj zainteresowanie t ro lin [PINDEL 1998]. Mimo to przylaszczka pozostaje bylin niszow, wyj tkowo drog i rzadko znajduje si w asortymencie szkółek. Podstawow przeszkod w jej rozpowszechnieniu s problemy z rozmna aniem. Mno enie z nasion jest procesem długotrwałym, poniewa ro liny zakwitaj po 3 latach od wysiewu [INGHE, TAMM 1985]. Rozmna anie generatywne nie mo e by wykorzystane dla szczególnie atrakcyjnych odmian pełnokwiatowych, których kwiaty s płonne. Tradycyjne rozmna anie wegetatywne (podział ro lin i sadzonki kł czowe) jest natomiast mało wydajne [SZEWCZYK-TARANEK, PINDEL 2008]. By zwi kszy wydajno rozmna ania przylaszczki i pokona ograniczenia w rozmna aniu metodami tradycyjnymi, podj to prób opracowania sposobu mno enia przylaszczki metod in vitro [SZEWCZYK, PINDEL 2004]. We wst pnych do wiadczeniach rozmna ania w kulturach in vitro przylaszczki zauwa ono zjawisko czernienia po ywki, spowodowane wydzieleniem si z eksplantatów produktów utleniania fenoli. By je ograniczy testowano ró ne substancje przeciwutleniaj ce, stosowane tak e w kulturach in vitro innych gatunków z rodziny jaskrowatych. Materiał i metody Badania przeprowadzono w latach w laboratorium kultur tkankowych Katedry Ro lin Ozdobnych Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie. Materiał ro linny do bada pochodził z ro lin uprawianych w warunkach polowych. Eksplantatami pierwotnymi do inicjacji kultur przylaszczki były p ki wierzchołkowe rozet pobierane w czerwcu 2003 roku. Nast pnie umieszczano je pod bie c wod wodoci gow na 2

258 282 B. Szewczyk-Taranek, Z. Pindel godziny. Przed procesem odka ania eksplantaty pierwotne płukano wst pnie w 70% alkoholu etylowym przez 30 sekund. Zastosowano sposób dezynfekcji powierzchniowej w roztworze 15% Domestosu (zawarto podchlorynu sodu i wodorotlenku sodu poni ej 5%), przez 7 minut, nast pnie 3-krotnie płukano w sterylnej wodzie destylowanej. Po dezynfekcji p ki wykładano na po ywki w cało ci, pozbawiaj c dolnych li ci łuskowatych okrywaj cych p k, uszkodzonych przez rodek odka aj cy. Odka one cz ci ro lin wykładano pojedynczo do probówek na po ywk podstawow MS według MURASHIGE i SKOOG A [1962] zestalon agarem firmy Difco- Bacto w st eniu 0,7%, zawieraj c 30 g dm -3 sacharozy i wzbogacon w regulatory wzrostu: BA 5,0 M i NAA 0,5 M. Odczyn po ywki ustalono przed dodaniem agaru na poziomie ph 5,8. Po ywk autoklawowano przez 20 minut, w temperaturze 121 C i ci nieniu 0,1 MPa. Kultury inicjalne umieszczono w fitotronie w temperaturze 20 C, wilgotno ci wzgl dnej 80%, przy 16-godzinnym dniu, PPFD 30 mol m -2 s -1. Po 4 tygodniach eksplantaty przeniesiono na wie e po ywki. Do do wiadczenia pobierano p ki uzyskane na etapie inicjacji, przez pobudzanie do rozwoju p ków k towych. Eksplantaty wykładano po 7 sztuk do 100 ml kolbek Erlemayera zawieraj cych 20 ml po ywki, które zamkni to foli aluminiow. Zastosowano po ywk podstawow MS wzbogacon w regulatory wzrostu: BA (2,0 M) i NAA (0,2 M). Do po ywki dodano odpowiedni substancj przeciwutleniaj c : PVP (250 lub 1000 mg dm -3 ) przed autoklawowaniem, natomiast roztwory kwasu askorbinowego (50 i 200 mg dm -3 ) oraz azotanu srebra (AgNO 3 50 lub 200 mg dm -3 ) dodano do po ywki po autoklawowaniu sterylizuj c je uprzednio przez filtracj. Kultury umieszczono w fitotronie w warunkach 20 C, 80% wilgotno ci wzgl dnej, 16- godzinnego dnia i PPFD 30 mol m -2 s -1. Do wiadczenia zało ono w 8 powtórzeniach, gdzie jedno powtórzenie stanowiła kolba z 7 eksplantatami. Co 6 tygodni przeprowadzano pasa e oraz obserwacje biometryczne i obliczano: procent regeneruj cych ro lin, współczynnik namna ania p ków liczony według wzoru: liczba nowopowstałych p ków dzielona przez liczb regeneruj cych eksplantatów. Obserwowano tak e jako zregenerowanych p ków: barw i kształt li ci, pojawienie si anomalii i witryfikacji. Liczono eksplantaty regeneruj ce korzenie przybyszowe. Dane z do wiadczenia opracowano statystycznie metod analizy wariancji, a istotno ró nic oceniono testem Duncana na poziomie =0,05. Wyniki Substancje przeciwutleniaj ce dodane do po ywki namna ajacej MS (2 M BA+0,2 M NAA), w badanych st eniach (kwas askorbinowy 50 i 100 mg dm -3, AgNO 3 50 i 200 mg dm -3, PVP 250 i 1000 mg dm -3 ), nie wpłyn ły pozytywnie na regeneracj eksplantatów przylaszczki i jako nowopowstałych p ków k towych przylaszczki, z wyj tkiem po ywki zawieraj cej 250 mg dm -3 PVP (tab. 1). Procent eksplanatatów regeneruj cych p ki k towe na po ywkach z antyutleniaczami nie ró nił si istotnie od wyniku uzyskanego na po ywce kontrolnej, niezawieraj cej tych zwi zków. Tabela 1; Table 1 Wpływ substancji przeciwutleniaj cych w po ywce na regeneracj przylaszczki pospolitej in vitro Effect of antioxidands in the medium on regeneration of Hepatica nobilis in vitro

259 WPŁYW SUBSTANCJI PRZECIWUTLENIAJ CYCH Po ywka MS (2 M BA i 0,2 M NAA) z dodatkiem antyoksydantów MS medium containing (2 M BA and 0.2 M NAA) supplemented with antioxidants Eksplantaty regeneruj ce p ki k towe (%) Explants regenerating axilary buds (%) Eksplantaty regeneruj ce korzenie (%) % of explants regenerating adventitous roots (%) Liczba korzeni na eksplantat z korzeniami Number of roots per explant Witryfikacja (%) Vitryfication (%) Kontrola; Control 80,1 a* Kwas askorbinowy 50 mg dm -3 78,6 a % Ascorbic acid 50 mg dm -3 Kwas askorbinowy 100 mg dm -3 81,5 a % Ascorbic acid 100 mg dm -3 AgNO 3 50 mg dm -3 77,8 a 24 1,7 60% AgNO mg dm -3 82,9 a 30 1,6 98% PVP 250 mg dm -3 87,0 a % PVP 1000 mg dm -3 71,7 a % * rednie oznaczone t sam liter nie ró ni si istotnie przy =0,05. Do oblicze u yto testu Duncana; means followed by the same letter do not differ significantly at =0.05, Duncan test Rys. 1. Współczynnik namna ania przylaszczki na po ywkach wzbogaconych w substancje przeciwutleniaj ce Fig. 1. Multiplication rate of Hepatica nobilis explants on the medium supplemented with different antioxidants substances Dodatek do po ywki substancji maj cych ograniczy utlenianie si zwi zków fenolowych, powodował obni enie współczynnika namna ania p ków k towych (rys. 1). Na po ywce zawieraj cej PVP obserwowano mniejsze czernienie po ywki, a na po ywce z PVP 250 mg dm -3 powstałe ro liny były lepsze jako ciowo, ciemnozielone i prawidłowo wykształcone. Gdy po ywka zawierała PVP w koncentracji 250 mg dm -3,

260 284 B. Szewczyk-Taranek, Z. Pindel współczynnik namna ania p ków k towych pozostał na podobnym poziomie jak w przypadku po ywki kontrolnej (MS+2 M BA+0,2 M NAA) i wynosił 2,9 p ków k towych/regeneruj cy eksplantat (rys. 1). Wy sza koncentracja tego zwi zku w po ywce (1000 mg dm -3 ) hamowała namna anie p dów. Po ywki zawieraj ce azotan srebra wpłyn ły na obni enie współczynnika namna ania do 1,0 i 0,8 p ków k towych/regeneruj cy eksplantat, oraz powodowały szklisto materiału ro linnego (60% przy st eniu 50 mg dm -3 AgNO 3 i 98% przy 200 mg dm -3 AgNO 3 ). Ponadto na po ywkach z AgNO 3 (50 i 200 mg dm -3 ) odpowiednio 24% i 30% eksplantatów regenerowało pojedyncze korzenie przybyszowe (tab. 1). Dodatek kwasu askorbinowego (50 lub 100 mg dm -3 ) tylko nieznacznie obni ył współczynnik namna ania (2,2 2,3 p ków k towych/regeneruj cy eksplantat), ale nie poprawił jako ci ro lin in vitro (tab. 1). Dyskusja Znanym problemem w kulturach in vitro gatunków ro lin z rodziny Ranunculaceae jest pojawianie si substancji fenolowych w po ywce i wokół eksplantatów. Zjawisko to obserwowano w kulturach in vitro ciemiernika białego [CERVELLI 1987], podczas namna ania jaskra [LIM, KITTO 1995] oraz na po ywkach tojadu mocnego [WATAD i in. 1995; KOCHBA i in. 1997]. Ciemnienie po ywki w kulturach in vitro powodowane przez utlenianie zwi zków fenolowych zmniejsza wydajno fotosyntezy, blokuje transport asymilatów, stymuluje utlenianie auksyn, co ogranicza wzrost eksplantatów oraz mo e powodowa anomalie w ich rozwoju [CERVELLI 1987; MARASEK, ORLIKOWSKA 1996]. Ro liny w naturze syntetyzuj zwi zki fenolowe podczas stresu, do ochrony przed infekcjami lub w celu wywołania zjawiska allelopatii [STRZAŁKA 2005]. Podczas masowego namna ania p ków k towych przylaszczki pospolitej obserwowano ciemnienie i br zowienie po ywki oraz silne jej czernienie wokół p ków k towych, powodowane (według doniesie z literatury) przez utlenianie substancji fenolowych wydzielanych przez eksplantaty [KUCHARSKA, ORLIKOWSKA 1997]. Wielu badaczy, by przeciwdziała br zowieniu po ywki i towarzysz cemu cz sto zahamowaniu ro lin we wzro cie dodawało do po ywek substancje przeciwutleniajace, takie jak: kwas cytrynowy (0,1 M) i PVP (poliwinylopyrolidon 500 mg dm -3 ) [CERVELLI 1987], kwas askorbinowy (150 ppm lub 50 mg dm -3 ) i kwas cytrynowy (150 ppm) oraz PVP (500 ppm lub 0,5 2%) [GIRI i in. 1993; LIM i KITTO 1995]. By zwi kszy wydajno namna ania i unikn hamuj cego wpływu produktów utleniania fenoli na namna anie sprawdzono wpływ substancji przeciwutleniajacych, takich jak: PVP, kwas askorbinowy, AgNO 3. Badane st enia kwasu askorbinowego (50 lub 100 mg dm -3 ) i azotanu srebra (50 lub 200 mg dm -3 ) nie ograniczyły utleniania fenoli oraz nie wpłyn ły korzystnie na wzrost i rozwój przylaszczki in vitro. Dodatkowo azotan srebra powodował liczne witryfikacje i ukorzenianie eksplantatów, podobnie jak w kulturach piwonii [KUCHARSKA, ORLIKOWSKA 1997]. Jedynie PVP (250 mg dm -3 ) ograniczył ciemnienie po ywki wokół eksplantatów i podwy szył ich jako, nie obni aj c współczynnika namna ania. PVP (1000 mg dm -3 ) i kwas askorbinowy (50 lub 100 mg dm -3 ) obni yły współczynnik namna ania p ków k towych. Wnioski 1. P ki k towe przylaszczki namna ały si w kulturach in vitro na po ywce

261 WPŁYW SUBSTANCJI PRZECIWUTLENIAJ CYCH podstawowej zawieraj cej makro- i mikroelementy według Murashige i Skooga (1962) oraz regulatory wzrostu BA (2,0 M) i NAA (0,2 M). 2. Dodatek do po ywki substancji przeciwutleniaj cych, takich jak: AgNO 3, kwas askorbinowy i PVP 250 mg dm -3, nie ograniczył zjawiska czernienia po ywki powodowanego przez utlenianie substancji fenolowych i obni ył współczynnik namna ania p ków k towych. 3. Eksplantaty najlepszej jako ci uzyskano na po ywce podstawowej wzbogaconej w PVP w koncentracji 250 mg dm -3. Literatura CERVELLI R In vitro propagation of Aconitum noveboracense and Aconitum napellus. Hort Sci 22(2): GIRI A., AJUHA P.S., AJAJ KUMAR P.V Somatic embryogenesis and plant regeneration from callus cultures of Aconitum heterophyllum Wall. Plant Cell Tissue Org. Cult. 32: INGHE O., TAMM C.O Survival and flowering of perennial herbs. IV. The behaviour of Hepatica nobilis and Sanicula europaea on permanent plots during Oikos 45: KOCHBA M., GABA V., NISSIM A., WATAD A. A., LILIEN- KIPNIS H., BOROCHOV A., HALEY A. H An efficient in vitro clonal propagation method for Aconitum napellus. Proceedings of the Seventh International Symposium on Flower Bulbs, Herzliya, Israel, III Acta Horticulture 430: KUCHARSKA D., ORLIKOWSKA T Regeneracja i rozmna anie Paeonia mlokosewitschii w kulturach in vitro. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 318: LIM C. C., KITTO S. L Micropropagation of Helleborus orientalis Lam. and Aconitum uncinatum Linn. (Ranunculaceae). Hort Sci. 30(4): MARASEK A., ORLIKOWSKA T Organogeneza w kulturach Paeonia mlokosewitschii i P. tenuifolia. Materiały konferencji Aktualne kierunki bada w biochemii i biotechnologii. Łód, XII 1996: MURASHIGE T., SKOOG F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: PI KO -MIRKOWA H., MIREK Z Flora Polski. Ro liny chronione. Oficyna Wydawnicza Multico. Warszawa: 304. PINDEL Z Warunki glebowe i wietlne stanowisk naturalnego wyst powania przylaszczki pospolitej (Hepatica nobilis Schreb.). Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 461: STRZAŁKA Zwi zki fenolowe, w: Fizjologia ro lin. Praca zbiorowa - Kopcewicz J., Lewak S. (red.). Wyd. Nauk. PWN, Warszawa: SZEWCZYK B., PINDEL Z Wpływ chłodzenia eksplantatów przylaszczki pospolitej (Hepatica nobilis Schreb.) na wzrost w warunkach in vitro. Folia Universitatis Agriculturae Stetinensis, Agricultura 236(94): SZEWCZYK-TARANEK B., PINDEL Z Rozmna anie przylaszczki pospolitej (Hepatica nobilis Schreb.) za pomoc sadzonek kł czowych. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 525: WATAD A. A., KOCHBA M., NISSIM A., GABA V Improvement of Aconitum napellus

262 286 B. Szewczyk-Taranek, Z. Pindel micropropagation by liquid culture on floating membrane rafts. Plant Cell Rep. 14: Słowa kluczowe: Hepatica nobilis, przylaszczka pospolita, mikrorozmna anie, fenole, antyoksydanty Streszczenie W przeprowadzonych do wiadczeniach badano wpływ substancji przeciwutleniajacych w po ywce (kwas askorbinowy 50 i 100 mg dm -3, AgNO 3 50 i 200 mg dm -3, PVP 250 i 1000 mg dm -3 ) na organogenez przylaszczki pospolitej (Hepatica nobilis SCHREB.). Podstawowa po ywka do namna ania p ków k towych zawierała makro- i mikroelementy według Murashige i Skooga (1962) oraz regulatory wzrostu BA (2,0 M) i NAA (0,2 M). Stwierdzono, e dodatek do po ywki azotanu srebra lub kwasu askorbinowego, niezale nie od st enia, hamował namna anie p ków k towych przylaszczki. Ponadto na po ywkach zawieraj cych AgNO 3 obserwowano liczne witryfikacje i deformacje ro lin oraz formowanie korzeni przybyszowych. Na po ywce zawieraj cej PVP obserwowano zahamowanie czernienia po ywki, a powstałe ro liny były lepsze jako ciowo, ciemnozielone i prawidłowo wykształcone. Gdy po ywka zawierała PVP w koncentracji 250 mg dm -3, współczynnik namna ania p ków k towych pozostał na podobnym, jak w przypadku po ywki kontrolnej, poziomie, podczas gdy wy sza koncentracja tego zwi zku w po ywce hamowała namna anie p dów. INFLUENCE OF ANTIOXIDANTS IN MEDIA ON THE MULTIPLICATION in vitro OF NOBLE LIVERLEAF (Hepatica nobilis SCHREB.) Bo ena Szewczyk-Taranek, Zbigniew Pindel Department of Ornamental Plants, Agricultural University, Kraków Key words: Hepatica nobilis, noble liverleaf, miropropagations, phenolic compounds, antioxidants The present experiments aimed at examining the effect of antioxidant substances in the medium (ascorbic acid mg dm -3, AgNO mg dm -3, PVP mg dm -3 ) on the organogenesis of liverwort (Hepatica nobilis SCHREB.). Basic medium for the multiplication of auxiliary buds contained macro- and microelements according to Murashige and Skoog (1962) and growth regulators: BA (2.0 M) and NAA (0.2 M). It was found that medium supplemented with silver nitrate or ascorbic acid, independently of the concentrations, inhibited the multiplication of shoot buds of liverwort. Moreover, plants cultured on AgNO 3 -supplemented media showed numerous vitrifications and deformations, and the formation of adventitious roots. When plants were cultured on the PVP-supplemented medium blackening was inhibited and plants were of better quality, dark green and well developed. When the medium contained PVP at a concentration of 250 mg dm -3, shoot bud multiplication coefficient remained at a similar level as in the control medium, while its higher concentration in the medium suppressed bud multiplication.

263 Dr Bo ena Szewczyk-Taranek Katedra Ro lin Ozdobnych Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołł taja al. 29 Listopada KRAKÓW WPŁYW SUBSTANCJI PRZECIWUTLENIAJ CYCH

264 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: WPŁYW CYTOKININ NA MIKROPROPAGACJ Arnica montana L. Alina Trejgell, Magdalena Michalska, Andrzej Tretyn Zakład Biotechnologii, Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Wst p Arnica montana jest bylin (hemikryptofitem) posiadaj c krótkie, grube kł cze i p d nadziemny osi gaj cy 60 cm wysoko ci, u podstawy którego znajduje si rozeta li ci. W górnej cz ci łodyga rozgał zia si, a odgał zienia w liczbie od 1 do kilku zako czone s pojedynczymi koszyczkami o rednicy 5-8 cm. Kwiaty brze ne (j zyczkowate) s e skie, a rodkowe (rurkowate) s obupłciowe. Wszystkie kwiaty w koszyczku s barwy złocisto- ółtej. Gatunek kwitnie od czerwca do sierpnia i zapylany jest przez owady, ale wyst puje te samozapylenie [PI KO -MIRKOWA, MIREK 2003]. Owocem jest niełupka z wie cem ółtych włosków puchu kielichowego na szczycie, ułatwiaj cym rozsiewanie nasion przez wiatr [POLAKOWSKI 1995]. A. montana wyst puje w zachodniej i rodkowej cz ci Europy, na północ si ga a do Skandynawii, a na południu do Półwyspu Iberyjskiego, północnych cz ci Półwyspu Bałka skiego i Apeni skiego. W Polsce najliczniej wyst puje w Sudetach, natomiast rozproszone stanowiska zlokalizowano w Karpatach, na Wy ynie Małopolskiej, w Górach wi tokrzyskich, na Nizinie Sandomierskiej, w Wielkopolsce i na Pomorzu Zachodnim [PI KO -MIRKOWA, MIREK 2003]. A. montana jest gatunkiem o wła ciwo ciach leczniczych. Zawiera liczne zwi zki chemiczne: garbniki, aminy, fitosterole, kwasy organiczne, karetonoidy, flawonoidy, olejek eteryczny (0,15%) i glikozyd arnicyn. Do celów leczniczych stosowane s kwiatostany zbierane na pocz tku okresu kwitnienia. Preparaty otrzymane z arniki górskiej stosowane s zewn trznie: na stłuczenia, obrz ki pourazowe, krwiaki, oparzenia, owrzodzenia jamy ustnej i dzi seł [ANTKOWIAK 1998; KOO i in. 2000]. Stosowane s równie doustnie w zaburzeniach wie cowego i mózgowego kr enia krwi. Maj działanie przeciwzapalne, wzmagaj wydzielanie ółci, soku oł dkowego i produkcj moczu [WEREMCZUK-JE YNA i in. 2006]. Przyczyn tendencji regresywnych A. montana mo emy doszukiwa si w naturalnych zjawiskach sukcesji ekologicznej. Ponadto zmniejszenie liczby stanowisk i wielko ci populacji tego gatunku wynika z pozyskiwania du ej ilo ci materiału zielarskiego z naturalnych stanowisk. Oprócz obj cia A. montana cisł ochron gatunkow prowadzi si prace nad wprowadzeniem tego gatunku do uprawy [LUIJTEN i in. 1996] oraz namna aniem w kulturach in vitro [BUTIUC-KEUL, DELIU 2001]. Celem przedstawionej pracy było opracowanie efektywnego systemu regeneracji dla A. montana ze sterylnych 10-dniowych siewek.

265 290 A. Trejgell, M. Michalska, A. Tretyn Materiały i metody Materiałem wyj ciowym do bada były 10-dniowe sterylne siewki Arnica montana L. Nasiona sterylizowano w 70% (v/v) EtOH przez 30 s, a nast pnie 20% (v/v) NaOCl (Domestos) przez 20 min, po czym płukano steryln wod destylowan. Wysterylizowane powierzchniowo nasiona kiełkowano na zmodyfikowanej po ywce MURASHIGE i SKOOG [1962] z dodatkiem kwasu giberelinowego (GA 3 ) w st eniu 1 mg dm -3 i zestalonej 0,7% (w/v) agarem. Eksplanty siewek: wierzchołki wzrostu z w złem li cieniowym, fragmenty li cieni (długo ci 3-4 mm), hypokotyli (1 mm) i korzeni (3-4 mm) izolowano i wykładano na po ywki MS uzupełnione 3% (w/v) sacharoz, 0,7% (w/v) agarem i ró nymi cytokininami: 6-benzyloaminopuryn (BA) w st eniach: 0,5; 1,0 i 3,0 mg dm -3, zeatyn (Zea) w st eniu 1,0 i 3,0 mg dm -3 i kinetyn (Kn) w st eniu 1,0 i 3,0 mg dm -3 w kombinacji z kwasem naftalenooctowym (NAA) w st eniu 0,1 mg dm -3 lub 0,05 mg dm -3 (dla BA w st eniu 0,5 mg dm -3 ), ph po ywki doprowadzono do 5,7 przed autoklawowaniem. Kultur prowadzono w temperaturze 26 ±1 C na ci głym wietle o nat eniu 40 M m-2 s -1. Po 4 tygodniach hodowli dokonano oceny zdolno ci morfogenetycznej eksplantów. Analizowano nast puj ce parametry: procent eksplantów zdolnych do organogenezy p dów/korzeni, liczb p dów/korzeni na eksplant oraz długo p dów. Uzyskane p dy rozdzielano i pasa owano na wie e po ywki co 4 tygodnie. Uzyskane w kolejnych pasa ach p dy ukorzeniano na poywkach bez dodatku auksyn z pełn (MS) lub ze zmniejszon do połowy ilo ci soli mineralnych ( MS), po 4 tygodniach przenoszono regeneranty do warunków ex vitro. Ukorzenione ro liny posadzono w doniczkach wypełnionych steryln mieszanin wermikulitu i piasku (1:1, v/v) i aklimatyzowano przez 2 tygodnie, a nast pnie przesadzono do ziemi z poletka do wiadczalnego (odczyn oboj tny) lub ziemi z domieszk kwa nego torfu w proporcji 2:1 (v/v), poniewa gatunek preferuje podło e o odczynie kwa nym. Upraw prowadzono w szklarni przez 4 tygodnie, po tym czasie ro liny przeniesiono do gruntu. Po sze ciu tygodniach od przeniesienia regenerantów do warunków ex vitro oraz po pierwszym roku wzrostu w gruncie zanalizowano wska nik prze ywalno ci. Do wiadczenia przeprowadzono trzykrotnie, 30 eksplantów/p dów stanowiło ka dy wariant do wiadczenia. Uzyskane wyniki zanalizowano przy u yciu metody ANOVA dla P < 0,05. Wyniki i dyskusja Organogenez p dów i korzeni obserwowano wył cznie na wierzchołkach p du na wszystkich zastosowanych po ywkach regeneracyjnych. Pozostałe typy eksplantów nie dawały odpowiedzi morfogenetycznej na adnym z podło y, obserwowano jedynie nieznaczn indukcj kalusa. U wielu gatunków ro lin wierzchołki p dów stanowi najlepszy materiał do regeneracji zarówno u Asteraceae np. Eclipta alba [DHAKA, KOTHARI 2005], Echinacea purpurea [ZHAO i in. 2006], jak i gatunków nale cych do innych rodzin: Myrtus communis [SCARPA i in. 2000], czy Saccharum sp. hybrids [GARCIA i in. 2007]. Ponadto w badaniach nad Arnica chamissonis wierzchołki p du stanowiły materiał donorowy do uzyskania ro lin w warunkach in vitro poprzez pobudzenie do rozwoju p ków bocznych na podło ach z dodatkiem GA 3 [CASSELLS i in. 1999]. Najwi ksz frekwencj organogenezy p dów (83%) obserwowano na po ywkach z BA w st eniu 3 mg dm -3 oraz NAA w st eniu 0,1 mg dm -3 i uzyskiwano rednio 2,5 p du

266 WPŁYW CYTOKININ NA MIKROPROPAGACJ Arnica montana L. 291 na eksplant (tab. 1). W wielu badaniach nad mikronamna aniem wykazano, e zastosowanie BA w po ywkach regeneracyjnych daje najlepsz odpowied morfogenetyczn. W przypadku Anthemis nobilis [ECHEVERRIGARAY i in. 2000], Echinacea purpurea [KORACH i in. 2002], Eclipa alba [BASKARAN, JAYABALAN 2005] czy Carlina acaulis [TREJGELL i in. 2009] na podło u z dodatkiem BA uzyskano najwy sz frekwencj organogenezy i wska nik namna ania. Natomiast BUTIUC-KEUL i DELIU [2001] donosz, e zeatyna i 2iP w st eniu 1 mg dm -3 były najefektywniejszymi cytokininami podczas mikropropagacji p dów A. montana z w złów izolowanych z 4-tygodniowych ro lin. W naszych badaniach nie potwierdzili my stymuluj cego efektu działania zeatyny (tab. 1). Cytokinina Cytokinin Wpływ st enia i rodzaju cytokininy na organogenez p dów i korzeni A. montana The effect of concentration and type of cytokinin on the shoot and root organogenesis from the explants of A. montana St enie Concentration (mg dm -3 ) % eksplantów; % of explants Organogeneza p dów Shoot organogenesis liczba/eksplant*; number/explant* długo (mm)* length (mm)* Tabela 1; Table 1 Organogeneza korzeni Root organogenesis % eksplantów % of explants liczba/eksplant* number/explant* BA 0,5 76 1,5 ± 0,3 ab 19,1 ± 1,0 bc 17 0,3 ± 0,1 b ,4 ± 0,4 ab 17,4 ± 1,7 c 15 0,2 ± 0,1 b ,5 ± 0,4 a 12,4 ± 0,8 d 0 0 b Zea ,1 ± 0,2 b 26,1 ± 1,7 a 72 2,4 ± 0,4 a ,9 ± 0,5 ab 17,8 ± 1,8 c 60 0,6 ± 0,2 ab Kn ,2 ± 0,3 ab 21,2 ± 1,3 ab 64 1,8 ± 0,3 a ,4 ± 0,3 ab 24,8 ± 1,7 a 24 0,3 ± 0,1 b * warto rednia, ± bł d standardowy, ró ne litery oznaczaj ró nice statystycznie istotne przy P<0,05; means, ± standard error, means with the different letters indicate significant differences at P<0.05 Obecno BA w podło u regeneracyjnym znacz co hamowała wzrost elongacyjny p du, rozwój blaszki li ciowej oraz proces ryzogenezy w porównaniu do zeatyny i kinetyny (tab. 1, fot. 1A i B). Hamowanie tych procesów było wprost proporcjonalne do st enia BA w podło u i ró nice utrzymywały si w kolejnych pasa ach. Obni enie st enia BA (0,5 mg dm -3 ), zachowuj c stosunek cytokinin do auksyn 10:1, ograniczyło hamuj cy wpływ BA na wzrost p dów (tab. 1). Podobne zjawisko obserwowano tak e podczas mikropropagacji u innych gatunków zarówno nale cych do rodziny Asteraceae, np. Saussurea obvallata [JOSHI, DHAR 2003], jak i innych Ricinus communis [SUJATHA, REDDY 1998] czy Rotula aquatica [MARTIN 2003]. POONAWALA i in. [1999] sugeruje, e ta cytokinina mo e by inhibitorem ryzogenezy. Tabela 2; Table 2 Wpływ zawarto ci soli mineralnych w po ywce na ukorzenianie p dów A. montana

267 292 A. Trejgell, M. Michalska, A. Tretyn po 4 tygodniach kultury The effect of mineral salt content in the medium on the rooting of A. montana shoots after 4 weeks of culture Rodzaj podło a Type of medium % ukorzenionych p dów % rooted shoots Liczba korzeni/p d* Number of roots/shoot* Długo korzenia (mm)* Length of root (mm)* MS 47,3 3,1 ±0,4 a 37,4 ±5,0 b MS 63,3 3,8 ±0,7 a 53,2 ±3,8 a * warto rednia, ± bł d standardowy, ró ne litery oznaczaj ró nice statystycznie istotne przy P<0,05; means, ± standard error, means with the different letters indicate significant differences at P<0.05 Fot. 1. Photo 1. Mikropropagacja Arnica montana, proliferacja p dów na po ywce z 1 mg dm -3 BA (A) i 1 mg dm -3 Zea (B) po 4 tygodniach hodowli, mikrop dy ukorzenione in vitro na po ywce MS (C), (odcinek = 10 mm) Micropropagation of Arnica montana, shoot proliferation on the medium supplemented with 1 mg dm -3 BA (A) and 1 mg dm -3 Zea (B) after 4 week of culture, microshoots rooted in vitro on MS medium (C), (bar = 10 mm) Nieukorzenione p dy uzyskane w kolejnych pasa ach rozdzielano i przenoszono na po ywk ukorzeniaj c bez dodatku auksyny, zawieraj c standardow (MS) lub zmniejszon do połowy ilo soli mineralnych ( MS). Zastosowanie po ywki? MS stymulowało proces ukorzeniania p dów w porównaniu do podło a z pełn ilo ci soli mineralnych. Zaobserwowano zarówno wi kszy odsetek ukorzenionych p dów (ponad 63%), jak i nieznacznie wi ksz liczb korzeni indukowanych na jednym p dzie, która jednak nie przekraczała rednio 4 korzeni na p d (tab. 2). Ponadto ograniczenie soli mineralnych w po ywce istotnie stymulowało wzrost elongacyjny korzenia (tab. 2, fot. 1C). Redukcja ilo ci soli mineralnych w po ywce silnie stymulowała powstawanie korzeni i ich wzrost elongacyjny tak e u wielu innych gatunków: Saussurea obvallata

268 WPŁYW CYTOKININ NA MIKROPROPAGACJ Arnica montana L. 293 [JOSHI, DHAR 2003], Bauhinia vahlii [BHATT, DHAR 2000], Tylophora indica [FAISAL i in. 2005], Mucuna pruriens [FAISAL i in. 2006] oraz Teucrium stocksianum [BOUHOUCHE, KSIKSI 2007]. Ostatnim poddanym analizie etapem mikronamna ania była aklimatyzacja A. montana do warunków uprawy gruntowej. Aklimatyzacja jest bardzo wa nym etapem mikrorozmna ania w warunkach in vitro, bowiem regeneranty uzyskane w kulturach in vitro rozwijaj si w specyficznym mikroklimacie : du a wilgotno, mniejsze nat enia wiatła i sterylne podło e wzbogacone w cukry. Te czynniki indukuj rozwój fenotypu, który uniemo liwia lub znacz co ogranicza ro linom prze ycie w warunkach ex vitro, gdy s bezpo rednio przeniesione do szklarni lub do uprawy w gruncie [HAZARIKA 2003]. Uzyskane regeneranty A. montana poddano procesowi aklimatyzacji, który pocz tkowo przebiegał w doniczkach wypełnionych sterylnym podło em (mieszanka wermikulitu z piaskiem w proporcji 1:1), przykrywanych przezroczystymi osłonami. Po 2-tygodniowym okresie aklimatyzacji ro liny przeniesiono do doniczek z ziemi ogrodnicz o odczynie oboj tnym lub z domieszk kwa nego torfu. Wska nik prze ywalno ci po 6 tygodniach hodowli w warunkach ex vitro wynosił odpowiednio 45% i 63,6%. Ro liny uprawiane na podło u o odczynie oboj tnym rozwijały si wolniej, obserwowano chloroz li ci, a wska nik prze ywalno ci po roku od aklimatyzacji wynosił 5,6%. Ro liny rosn ce na podło u wzbogaconym w torf rozwijały si prawidłowo, a wska nik prze ywalno ci wynosił 58,3%. W warunkach naturalnych A. montana wyst puje na kwa nych lub bardzo kwa nych podło ach, takich jak: wrzosowiska, kwa ne gleby brunatne, gleby bielicowe, brzegi lasów oraz ródle ne polany [PI KO -MIRKOWA, MIREK 2003], dlatego te dodatek kwa nego torfu okazał si niezb dnym składnikiem podło a ju na wczesnym etapie aklimatyzacji. Wnioski 1. Wierzchołki wzrostu 10-dniowych siewek A. montana s dobrym materiałem inicjalnym do namna ania p dów. 2. Benzyloaminopuryna stymuluje proliferacj p dów A. montana, ale hamuje ich wzrost elongacyjny i ukorzenianie. 3. Obni enie zawarto ci soli mineralnych w po ywce MS stymuluje ukorzenianie p dów A. montana, uzyskanych w warunkach in vitro. 4. Dodatek kwa nego torfu do podło a lub jego zakwaszenie jest niezb dnym zabiegiem podczas aklimatyzacji i uprawy w gruncie regenerantów A. montana. Literatura ANTKOWIAK L Ro liny lecznicze. Wydawnictwo AR im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu, Pozna : BASKARAN P., JAYABALAN N An efficient micropropagation system for Eclipta alba - a valuable medicinal herb. In Vitro Cell Dev. Biol. - Plant 41: BHATT I.D., DHAR U Combined effect of cytokinins on multiple shoot production from cotyledonary node explants of Bauhinia vahlii. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 62: BOUHOUCHE N., KSIKSI T An efficient in vitro plant regeneration system for the medicinal plant Teucrium stocksinum Boiss. Plant Biotechnol. Rep. 1:

269 294 A. Trejgell, M. Michalska, A. Tretyn BUTIUC-KEUL A.L., DELIU C Clonal propagation of Arnica montana L., a medical plant. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 37: CASSELLS A.C., WALSH C., BELIN M., CAMBORNAC M., ROBIN J.R., LUBRANO C Establishment of plantation from micropropagated Arnica chamissonis a pharmaceutical substitute for the endagered A. montana. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 56: DHAKA N., KOTHARI S.L Micropropagation of Eclipta alba (L.) Hassk an important medicinal plant. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 41: ECHEVERRIGARAY S., FRACARO F., ANDRADE L.B., BIASIO S., ATTI-SERAFINI L In vitro shoot regeneration from leaf explants of Roman Chamomile. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 60: 1 4. FAISAL M., SIDDIQUE I., ANIS M An efficient plant regeneration system for Mucuna pruriens L. (DC.) using cotyledonary node explants. In Vitro Cell Dev. Biol. - Plant. 42: FAISAL M., SINGH S., ANIS M In vitro regeneration and plant establishment of Tylophora indica (Burm. F.) Merrill: petiole callus culture. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 41: GARCIA R., CIDADE D., CASTELLAR A., LIPS A., MARIOLI C., CALLADO C., MENSUR E In vitro morphogenesis patterns from shoot apices of sugar cane are determined by light and type of growth regulator. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 90: HAZARIKA B.N Acclimatization of tissue-cultured plants. Curr. Sci. 85: JOSHI M., DHAR U In vitro propagation of Saussurea obvallata (DC.) Edgew. an endangered ethnoreligious medicinal herb of Himalaya. Plant Cell Rep. 21: KOO H., GOMES B.P.F.A., ROSALEN P.L., AMBROSANO G.M.B., PARK Y.K., CURY J.A In vitro antimicrobial activity of propolis and Arnica montana against oral pathogenes. Arch. Oral Biol. 45: KORACH A., JULIANI H.R., KAPTEYN J., SIMON J.E In vitro regeneration of Echinacea purpurea from leaf explants. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 69: LUIJTEN S.H., OOSTERMEIJER J.G.B., VAN LEEUWEN N.C., DEN NIJS H.C.M Reproductive success and clonal genetic structure of the rare Arnica montana (Compositae) in Netherlands. Plant System Evol. 201: MARTIN K.P Rapid in vitro multiplication and ex vitro rooting of Rotula aquatica Lour., a rare rhoeophytic woody medicinal plant. Plant Cell Rep. 21: MURASHIGE T., SKOOG F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: PI KO -MIRKOWA H., MIREK Z Atlas ro lin chronionych. Multiko Oficyna Wydawnicza, Warszawa: POLAKOWSKI B Ro liny chronione. Atlas. PWN, Warszawa: POONAWALA I.S., JANA M.M., NADGAUDA R.S Factors influencing bud break and rooting and mass-scale micropropagation of three Phragmites species: P. karka, P. communis and P. australis. Plant Cell Rep. 18: SCARPA G.M., MILIA M., SATTA M The influence of growth regulators on proliferation and rooting of in vitro propagated myrtle. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 62: SUJATHA M., REDDY T.P Different cytokinin effects on the stimulation of in vitro shoot proliferation from meristematic explants of castor (Ricinus communis L.). Plant Cell Rep. 17: TREJGELL A., D BROWSKA G., TRETYN A In vitro regeneration of Carlina acaulis

270 WPŁYW CYTOKININ NA MIKROPROPAGACJ Arnica montana L. 295 subsp. simplex from seedling explants. Acta Physiol. Plant. 31: WEREMCZUK-JE YNA I., KISIEL W., WYSOKI SKA H Tymol derivatives from hairy roots of Arnica montana. Plant Cell Rep. 25: ZHAO F.C., NILANTHI D., YANG Y.S., WU H Anther culture and haploid plant regeneration in purple coneflower (Echinacea purpurea L.). Plant Cell Tiss. Organ Cult. 86: Słowa kluczowe: Arnica, cytokininy, mikrorozmna anie, wierzchołki p dów Streszczenie Opracowano efektywy system regeneracji dla Arnica montana. Materiałem donorowym były 10-dniowe siewki. Wysterylizowane powierzchniowo nasiona kiełkowano na po ywce MS wzbogaconej GA 3 (1 mg dm -3 ). Eksplanty siewek (wierzchołki wzrostu p dów, fragmenty li cieni, hypokotyli i korzeni) izolowano i wykładano na po ywki regeneracyjne uzupełnione ró nymi cytokininami: BA (w st eniach: 0,5; 1,0 i 3,0 mg dm -3 ), zeatyn (1,0 i 3,0 mg dm -3 ) i kinetyn (1,0 i 3,0 mg dm -3 ) w kombinacji z NAA w st eniu 0,1 mg dm -3 lub 0,05 mg dm -3 (dla BA w st eniu 0,5 mg dm -3 ). Odpowied morfogenetyczn wykazywały jedynie wierzchołki wzrostu p dów. Najwi ksz frekwencj organogenezy p dów (83%) obserwowano na eksplantach traktowanych BA w st eniu 3 mg dm -3 i uzyskiwano rednio 2,5 p du na eksplant. Obecno BA w po ywkach regeneracyjnych hamowała wzrost elongacyjny p du, rozwój blaszki li ciowej oraz proces ryzogenezy. P dy były ukorzeniane na po ywkach MS i MS bez dodatku auksyn, zmniejszenie ilo ci soli mineralnych stymulowało proces ryzogenezy. Regeneranty po aklimatyzacji były przenoszone do gruntu, dodanie do ziemi kwa nego torfu w proporcji 2:1 zwi kszyło 10-krotnie wska nik prze ywalno ci. EFFECT OF CYTOKININS ON THE MIKROPROPAGATION OF Arnica montana L. Alina Trejgell, Magdalena Michalska, Andrzej Tretyn Department of Biotechnology, Institute of General and Molecular Biology, Nicolaus Copernicus University, Toru Key words: Arnica, cytokinins, mikropropagation, shoot tips Summary The aim of the study was to obtain an efficient method of Arnica montana regeneration. The donor material comprised 10-day-old seedlings. Surface sterilized seeds were germinated on MS medium supplemented with GA 3 (1 mg dm -3 ). Seedling explants (shoot tips, fragments of cotyledons, hypocotyls and roots) were excised and transferred on the proliferation medium supplemented with different concentrations of cytokinins: BA (0.5; 1.0 and 3.0 mg dm -3 ), zeatin (1.0 and 3.0 mg dm -3 ) and kinetin (1.0 and 3.0 mg dm -3 ) in combination with NAA (0.1 mg dm -3 ) or 0.05 mg dm -3 (for BA at

271 296 A. Trejgell, M. Michalska, A. Tretyn the concentration 0.5 mg dm -3 ). It was observed that only shoot tips exhibited morphogenetical responses. The highest frequency of shoot organogenesis (83%) was observed in the explants cultured on the medium supplemented with 3.0 mg dm -3 BA. On the average 2.5 shoots from one explants were obtained under these conditions. The presence of BA in the proliferation medium inhibited the elongation growth, development of leaf lamina and rhizogenesis. The individual shoots were rooted on MS and MS medium without auxin. Decreasing the amount of mineral salts in the rooting medium stimulated rhizogenesis process. Plantlets after acclimatization were transferred to the soil. Addition of the acid peat into the soil, in the ratio of 2:1, increased the survival rate by 10-times. Dr Alina Trejgell Zakład Biotechnologii Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej Uniwersytet Mikołaja Kopernika ul. Gagarina TORU trejgell@biol.uni.torun.pl

272 ZESZYTY PROBLEMOWE POST PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: LOKALIZACJA GRADIENTU AUKSYNY ORAZ ROZMIESZCZENIE BIAŁEK PIN W PROLIFERUJ CYM I RÓ NICUJ CYM SI TRANSGENICZNYM KALUSIE Arabidopsis thaliana 1 Justyna Wi niewska, Małgorzata Pietrzykowska, Bogumiła Szyndel, Andrzej Tretyn Zakład Biotechnologii, Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Wst p Auksyna kontroluje szeroki zakres procesów zachodz cych podczas ontogenezy ro liny, m.in.: stymulowanie podziałów komórkowych kambium, wzrost wydłu eniowy komórek, ró nicowanie si tkanek przewodz cych, tworzenie korzeni bocznych [DAVIES 2004]. Unikaln wła ciwo ci auksyny jest jej polarny transport, kontrolowany przez białka PIN odpowiedzialne za wypływ tego hormonu z komórki. Wykazano, i to one odgrywaj znacz c rol w asymetrycznym rozmieszczeniu st enia tego fitohormonu w ciele ro liny, co ma ogromne znaczenie zarówno podczas wzrostu i rozwoju ro liny ju na etapie zarodkowym, jak i podczas dalszych etapów ontogenezy [FRIML i in. 2002a, b; BENKOVÁ i in. 2003; FRIML i in. 2003b; VIETEN i in. 2005; TANAKA i in. 2006; WI NIEWSKA i in. 2006]. Prawidłowy przebieg rozwoju zarodkowego i tworzenia korzeni bocznych uwarunkowany jest dynamiczn zmian lokalizacji białek PIN [BENKOVÁ i in. 2003; FRIML i in. 2003b]. Wewn trz komórki istnieje stała pula kr cych białek PIN w endosomach, które pod wpływem ró nych czynników mog przemieszcza si z błony do cytoplazmy, przez to wpływaj c na kierunek i wydajno transportu auksyny [PACIOREK i in. 2005]. Auksyna odgrywa istotn rol w kulturach in vitro, gdy wraz z cytokininami indukuje bezpo redni organogenez [MANDAL, DUTTA GUPTA 2001; ŠUŠEK i in. 2002; BOLTENKOV, ZAREMBO 2005; TILKAT, ONAY 2009] oraz stymuluje namna anie kalusa i organogenez po redni korzenia i p du [SKOOG, MILLER 1957; KORACH i in. 2002] oraz somatyczn embriogenez [MONNIER 1990]. Wykorzystuj c w badaniach ro liny transgeniczne DR5rev::GFP, PIN1::GFP, PIN4::GFP, PIN7::GFP A. thaliana oraz mikroskop konfokalny okre lano, po rednio wykorzystuj c gen reporterowy GFP, lokalizacj gradientu auksyny i rozmieszczenie chimerycznych białek PIN1-GFP, PIN4- GFP i PIN7-GFP podczas wzrostu i ró nicowania si kalusa w warunkach in vitro, 1 Badania realizowano w ramach projektu badawczego finansowanego przez Fundacj na Rzecz Nauki Polskiej oraz Rektora UMK w Toruniu 484-B.

273 298 J. Wi niewska i inni który stanowi wa ny etap podczas regeneracji po redniej. Stworzenie ro lin transgenicznych DR5rev::GFP A. thaliana, zawieraj cych konstrukt składaj cy si z syntetycznego promotora DR5rev (dziewi ciokrotnie powtórzona odwrotna sekwencja TGTCTC, wchodz ca w skład promotora genów pierwotnej odpowiedzi na auksyn ) oraz genu reporterowego GUS lub GFP umo liwia ledzenie akumulacji aktywnej auksyny na poziomie pojedynczej komórki [FRIML i in. 2002a, b; BENKOVÁ i in. 2003; FRIML i in. 2003b; DE REUILLE i in. 2006]. Analiza poziomu ekspresji i zmian lokalizacji białek PIN przyczyni si do zrozumienia istoty mechanizmu ukierunkowanego transportu auksyny podczas wzrostu i ró nicowania si komórek kalusa, a nast pnie indukcji organogenezy korzenia i p du w warunkach in vitro u A. thaliana. Sterylizacja nasion A. thaliana Materiał i metody Nasiona ro lin transgenicznych DR5rev::GFP, PIN1::GFP, PIN4::GFP oraz PIN7::GFP A. thaliana (uzyskane od dr. J. Friml, Ghent University) sterylizowano w probówkach Eppendorfa 20% roztworem domestosu (NaOCl) przez 20 minut, kilkukrotnie wytrz saj c. Nast pnie w warunkach sterylnych płukano nasiona steryln wod destylowan, po czym odwirowywano w wirówce Eppendorf typ 5415R przez 10 sekund, stosuj c maksymalne obroty (1500 rpm). Czynno ci te powtarzano cztery razy. Wysterylizowane nasiona wykładano aseptyczn wykałaczk na sterylne szalki Petriego o rednicy 14 cm, zawieraj ce około 20 ml po ywki MS [MURASHIGE, SKOOG 1962]. Ro liny hodowano w komorze na ci głym wietle (40 M m -2 s -1 ), przez 7 dni w temperaturze C. Indukcja kalusa Sterylne, 7-dniowe siewki ro lin transgenicznych A. thaliana wykorzystano do zało enia kultury kalusa. 2-3 mm fragmenty hipokotyli wykładano horyzontalnie na szalki Petriego, zawieraj ce około 20 cm 3 po ywki CIM (ang. callus-inducing medium), indukuj cej tworzenie kalusa. Po ywka CIM zawierała 0,1 mg dm -3 kinetyny oraz 0,5 mg dm -3 2,4-D [FELDMANN, MARKS 1986]. Wszystkie czynno ci wykonywano w aseptycznych warunkach. Hodowl kalusa prowadzono w komorze hodowlanej na ci głym wietle (40 M m -2 s -1 ), w temperaturze C. Analiza lokalizacji gradientu auksyny oraz rozmieszczenia białek PIN Lokalizacj aktywnej auksyny oraz chimerycznych białek PIN1-GFP, PIN4-GFP i PIN7-GFP w kilkudniowym i 2-tygodniowym transgenicznym kalusie pochodz cym z hipokotyli ro lin DR5::GFP, PIN1:GFP, PIN4:GFP i PIN7:GFP A. thaliana analizowano po rednio, wykorzystuj c fluorescencj białka reporterowego GFP. W celu wizualizacji fluorescencji GFP w zakresie wiatła zielonego (508 nm) wzbudzano eksplanty wiatłem ultrafioletowym ( nm) i niebieskim ( nm), wykorzystuj c skaningowy mikroskop konfokalny Nikon Eclipse T300 z laserem helowo-neonowym. Przed obserwacj pod mikroskopem eksplanty inkubowano przez 5-10 minut w jodku propidyny (SIGMA P4567) (1:1000) [TAS, WESTERNENG 1981], a nast pnie płukano w wodzie destylowanej i umieszczano na szkiełku podstawowym w 5% glicerolu. Materiał badawczy przykrywano szkiełkiem nakrywkowym i dokonywano obserwacji. Dokumentacj fotograficzn wykonano wykorzystuj c

274 LOKALIZACJA GRADIENTU AUKSYNY ORAZ ROZMIESZCZENIE BIAŁEK PIN program EZ Viewer 2000 (Laboratory Imaging, Prague, Czech Republic). Wyniki i dyskusja Obecno komórek kalusa na obu ko cach fragmentów hipokotyli ro lin transgenicznych A. thaliana, na po ywce CIM stwierdzono ju po 4-6 dniach hodowli (dane nieprzedstawiane). Fluorescencj białka reporterowego GFP, odzwierciedlaj cego lokalizacj aktywnej auksyny, zaobserwowano tylko w młodych i intensywnie dziel cych si komórkach kalusa DR5rev::GFP (fot. 1A 1 ). Hormon ten zlokalizowano na terenie cytoplazmy komórek tkanki przyrannej (fot. 1B 1 ), a w niektórych komórkach auksyna wyst powała tak e na terenie j dra komórkowego (fot. 1C 1 ). Stwierdzono, i w cytoplazmie hormon ten jest rozmieszczony nierównomiernie, gdy w niektórych miejscach zaobserwowano wyra nie zwi kszony poziom fluorescencji białka reporterowego GFP (fot. 1B 1 i C 1 ). Wykazano, e egzogennie podana auksyna indukuje ekspresj zarówno DR5rev, jak i PIN [FRIML i in. 2003b; VIETEN i in. 2005]. Jak dot d brak doniesie naukowych, w jakich organellach komórki auksyna mogłaby by akumulowana. Najprawdopodobniej s to endosomy, w których zidentyfikowano białka AUX i PIN, odpowiedzialne za transport tego hormonu [GELDNER i in. 2001, 2003; PACIO- REK i in. 2005; KLEINE-VEHN i in. 2006; DHONUKSHE i in. 2007]. Obecno auksyny w j drze komórkowym tłumaczy fakt, i podwy szony poziom tego fitohormonu aktywuje geny wczesnej lub tzw. pierwotnej odpowiedzi na auksyn - Aux/IAA, SAUR i GH3, których ekspresj obserwowano po kilku minutach od traktowania ro lin tym hormonem [HAGEN, GUILFOYLE 2002]. Tylko w młodych i szybko proliferuj cych komórkach transgenicznego kalusa stwierdzono wysoki poziom ekspresji PIN1:GFP (fot. 1A 2 ) i PIN7:GFP (fot. 1A 3 ), nie zaobserwowano za ekspresji PIN4:GFP (dane nieprzedstawiane). Chimeryczne białka PIN1-GFP i PIN7-GFP były równomiernie rozmieszczone w błonie komórkowej i na terenie cytoplazmy obserwowanych komórek (fot. 1A 1 i A 3 oraz 1B 2 ). Najprawdopodobniej białka PIN1 i PIN7 uczestnicz w utrzymywaniu odpowiedniego gradientu auksyny w tego typu komórkach tkanki przyrannej, cho nie mo na wykluczy udziału pozostałych, nieuwzgl dnionych w badaniach białek PIN. Apolarna lokalizacja białek PIN1-GFP i PIN7-GFP w plazmalemmie komórek kalusa, najprawdopodobniej zwi zana jest z brakiem ukierunkowanego krótkodystansowego transportu auksyny w tych komórkach.

275 300 J. Wi niewska i inni Fot. 1. Photo 1. Lokalizacja gradientu auksyny oraz białek PIN1-GFP i PIN7-GFP w kilkudniowych komórkach kalusa. Fluorescencj białka reporterowego GFP (zielony kolor), a tym samym po rednio podwy szony poziom aktywnej auksyny zaobserwowano tylko w młodych i intensywnie dziel cych si komórkach kalusa DR5rev::GFP (A 1 ) na terenie cytoplazmy (B 1 ), a w niektórych przypadkach tak e w j drze komórkowym (C 1 ). Transgeniczne białka PIN1-GFP tak e zidentyfikowano tylko w młodych, intensywnie dziel cych si komórkach tkanki przyrannej (A 2 ) w plazmalemmie (B 2 ), a tak e na terenie cytoplazmy (C 2 ). PIN7-GFP stwierdzono w plazmalemmie młodych, intensywnie dziel cych si komórek tkanki przyrannej (A 3 ), a tak e najprawdopodobniej w endosomach, na terenie cytoplazmy (B 3 i C 3 ). A 1, A 2, A 3 - powi kszenie 40 ; B 1, B 2, B 3 - powi kszenie 60 ; C 1, C 2, C 3 - powi kszenie 120 Localization of auxin gradient and PIN-1, PIN7-GFP proteins in a few day old transgenic callus cells. Fluorescence of the GFP reporter protein (green color), and thus a higher level of active auxin, were observed only in young and intensively dividing callus of DR5rev::GFP (A 1 ), in the cytoplasm (B 1 ) and sometimes inside the nucleus (C 1 ). Transgenic PIN1-GFP proteins were also delected only in young and intensively dividing callus cells (A 2 ), in the plasmamembrane (B 2 ) and cytoplasm (C 2 ). PIN7-GFP proteins were localized in the plasmamembrane of young and intensively dividing callus cells (A 3 ) and also probably in endosomes and cytoplasm (B 3 i C 3 ). A 1, A 2, A 3 - magnification 40 ; B 1, B 2, B 3 - magnification 60 ; C 1, C 2, C 3 - magnification 120

276 LOKALIZACJA GRADIENTU AUKSYNY ORAZ ROZMIESZCZENIE BIAŁEK PIN Zaobserwowano, i w pojedynczych komórkach PIN7-GFP wyst powały tylko na terenie cytoplazmy, najprawdopodobniej w endosomach (fot. 1B 3 i C 2 ), za białka PIN1-GFP w plazmalemmie i na terenie cytoplazmy obserwowanych komórek (fot. 1B 2 i C 3 ), co sugeruje, i PIN1 odgrywa istotn rol w utrzymywaniu odpowiedniego gradientu auksyny w komórkach kalusa. BOUTTE i in. [2006] stwierdzili, i 10-30% zakumulowanych białek PIN w cytoplazmie jest zgromadzonych w aparatach Golgiego, natomiast wi kszo, bo a 70-90% akumulowana jest w endosomach. Białka PIN s syntetyzowane na retikulum szorstkim, a obróbka powstałych peptydów zachodzi w diktiosomach, z których s transportowane do błony komórkowej. Synteza, degradacja i transport tych białek s niezwykle wa ne w utrzymaniu ich stałej puli w plazmalemmie. Białka PIN s dynamicznie transportowane w obr bie komórki i istnieje stała pula kr cych białek PIN, które pod wpływem ró nych czynników mog przemieszcza si do odpowiedniej strony plazmalemmy w komórce (apikalnej, bazalnej b d lateralnej) i tym samym, jak wykazano, ukierunkowa przepływ auksyny [FRIML i in. 2002b; BENKOVÁ i in. 2003; FRIML i in. 2003a; WI NIEWSKA i in. 2006; SAUER i in. 2006]. W obserwowanych szybko dziel cych si komórkach kalusa nie zaobserwowano, aby białka PIN1-GFP czy PIN7-GFP wykazywały polarn lokalizacj (fot. 1C 2 i C 3 ). Nie stwierdzono w ród komórek kilkudniowego kalusa obszarów zró nicowanych, do których lub z których auksyna byłaby transportowana. Najprawdopodobniej na tym etapie wzrostu i rozwoju kalusa białka PIN1 i PIN7 nie wykazuj polarnej lokalizacji, determinuj cej kierunek przepływu auksyny. Wykazano, i podczas reakcji grawitropicznej korzenia polarna lokalizacja białek PIN odgrywa istotn rol w ukierunkowaniu transportu tego hormonu i prawidłowej odpowiedzi wzrostowej tego organu na bodziec siły ci enia [WI NIEWSKA i in. 2006]. Fot. 2. Ekspresja DR5::GFP i PIN1:GFP w 2-tygodniowym kalusie podlegaj cym procesom ró nicowania. Podwy szony poziom aktywnej auksyny (fluorescencj białka reporterowego GFP zielony kolor) zaobserwowano na terenie cytoplazmy komórek mi kiszowych ksylemu DR5::GFP (A 1 ). Obecno białek PIN1-GFP stwierdzono w plazmalemmie, po bazalnej stronie komórek mi kiszowych ksylemu (A 2 ). A 1, A 1 - powi kszenie 120 Photo 2. Expression of DR5::GFP and PIN1:GFP in the 2-week old callus cell, where the cell differentiation was observed. The higher level of active auxin (fluorescence of GFP reporter protein - green color) was observed in the cytoplasm of the parenchyma xylem cells DR5::GFP (A 1 ). Localization of PIN1-GFP was detected in the plasmamembrane, at the basal side of parenchyma xylem cells (A 2 ). A 1, A 1 - magnification 120 W trakcie wzrostu i rozwoju tkanki przyrannej nie stwierdzono fluorescencji białka reporterowego GFP w starszych komórkach transgenicznego kalusa DR-